專利名稱：一種昆蟲(chóng)拒食劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲(chóng)拒食劑，進(jìn)一步涉及這種昆蟲(chóng)拒食劑的用途。
這類線蟲(chóng)是以感染期蟲(chóng)態(tài)(infective juveniles，IJ)隨寄主食物或從昆蟲(chóng)的自然開(kāi)口(如肛門、氣孔)、節(jié)間膜進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)，隨后釋放腸腔中攜帶的Xenorhabdus屬(目前與斯氏科線蟲(chóng)共生)或Photorhabdus屬(目前與異小桿科線蟲(chóng)共生)的共生細(xì)菌。線蟲(chóng)以及共生細(xì)菌分泌的毒素(毒性因子)導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。
原先，科學(xué)家們認(rèn)為，Xenorhabdus屬或Photorhabdus屬的共生細(xì)菌只有被線蟲(chóng)攜帶或注射進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)時(shí)才發(fā)揮殺蟲(chóng)作用[Akhurst(1980)Journal of General Microbiology121，303-309；Bedding(1984)Annals of Applied Biology 104，117-120；Forst & Nealson(1996)Microbiological Review 60，21-43]。最近發(fā)現(xiàn)，共生細(xì)菌可通過(guò)口服單獨(dú)致死昆蟲(chóng)[李素春等(1995)第六屆全國(guó)殺蟲(chóng)微生物學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集p.43；Jarrett et al.(1998)PCT PatentApplication No.98/08388；Ragni et al.(1998)PCT Patent Application No.98/05212]，從共生菌中可分離出蛋白質(zhì)毒素[Ensign et al.(1997)PCT Patent Application No.97/17432；Bowen et al.(1998)Science 280，2129-2132；Ensign et al.(2000)US Patent，Application No.072264]，因此，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生細(xì)菌在蟲(chóng)害防治方面的應(yīng)用也受到重視。殺蟲(chóng)蛋白毒素的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研制新型微生物農(nóng)藥以及創(chuàng)建防蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物提供了新的途徑。所有已發(fā)表或公開(kāi)的文獻(xiàn)指出，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的共生細(xì)菌或共生細(xì)菌分泌的殺蟲(chóng)蛋白對(duì)昆蟲(chóng)有毒殺作用(toxicactivity)，但未發(fā)現(xiàn)這類細(xì)菌對(duì)昆蟲(chóng)的拒食作用。
本發(fā)明的一種昆蟲(chóng)拒食劑，選自人工培養(yǎng)的Xenorhabdus或Photorhabdus屬細(xì)菌的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液或細(xì)菌培養(yǎng)液中濾渣的水稀釋液。
本發(fā)明所公開(kāi)Xenorhabdus和Photorhabdus屬細(xì)菌分離自斯氏科Steinernematidae斯氏屬Steinernema與異小桿科Heterorhabditidae異小桿屬Heterorhabditis昆蟲(chóng)病原感染期線蟲(chóng)，目前在分類上歸屬于Enterobacteriaceae科。Xenorhabdus屬細(xì)菌目前經(jīng)描述的種有Xenorhabdus nematophilus、X.poinarii、X.bovienii、X.beddingii或X.kushidaii。Photorhabdus屬細(xì)菌目前經(jīng)描述的種有P.luminescens。這些細(xì)菌的分類地位以后的可能改變并不會(huì)影響本發(fā)明的限制范圍。
Xenorhabdus屬細(xì)菌選自Xenorhabdus nematophilus、X.poinarii、X.bovienii、X.beddingii或X.kushidaii種細(xì)菌。Photorhabdus屬細(xì)菌有P.luminescens種細(xì)菌。
濾渣中包含有滅活菌體、滅活菌體的片段以及其他固體物質(zhì)。
本發(fā)明的一種昆蟲(chóng)拒食劑的制備方法即培養(yǎng)方法，是將所屬細(xì)菌經(jīng)分離、純化后，以人工培養(yǎng)基(如蛋白胨水培養(yǎng)基或其它能夠培養(yǎng)這類細(xì)菌的培養(yǎng)基)體外培養(yǎng)，包括以發(fā)酵罐或反應(yīng)器系統(tǒng)培養(yǎng)，所獲得的菌液可直接或經(jīng)分離、提取和提純，得到的有效組分用做昆蟲(chóng)拒食劑。
本發(fā)明的這種昆蟲(chóng)拒食劑的用途是將其應(yīng)用于植物表面或地下部分、生長(zhǎng)環(huán)境中，可阻止世界性的蔬菜主要害蟲(chóng)小菜蛾(Plutella xylostella)取食植物體。特別是將其應(yīng)用于十字花科的蔬菜的表面或地下部分、生長(zhǎng)環(huán)境中，特別能阻止世界性的蔬菜主要害蟲(chóng)小菜蛾(Plutellaxylostella)取食十字花科的蔬菜。
施用量和施用次數(shù)根據(jù)小菜蛾的發(fā)生期、發(fā)生數(shù)量以及氣候條件等而定。這些拒食劑可通過(guò)不同的劑型如水劑、可濕性粉劑、顆粒劑和濃縮劑等配置，首選水劑，既經(jīng)濟(jì)又方便；也可加入輔助劑如吸附劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑、粘著劑、引誘劑、保護(hù)劑和增效劑等使用。
實(shí)例一按下列方法分別分離Xenorhabdus和Photorhabdus初生型共生細(xì)菌昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)感染的大蠟螟末齡(七齡)幼蟲(chóng)Galleria mellonella，置于25℃下，昆蟲(chóng)死亡后(一般2至4天)，以70％酒精體表消毒死蟲(chóng)，然后用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)蟲(chóng)體，取血淋巴劃營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱平板。根據(jù)Akhurst(1980)(Journal of General Microbiology 121，303-309)描述的方法鑒定線蟲(chóng)共生細(xì)菌。從S.carpocapsae A24線蟲(chóng)中分離出X.nematophilus共生菌；從H.bacteriophora線蟲(chóng)中分離出P.luminescens共生菌。
取二個(gè)500ml三角瓶中，分別加入100ml液體培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％ NaCl)，121℃下高壓消毒30分鐘。然后分別接入從S.carpocapsae A24和H.Bacteriophora H06線蟲(chóng)中分離出的X.nematophilus和P.luminescens初生型共生菌(5×108菌體)，置于25℃、150rpm下?lián)u床分別培養(yǎng)48小時(shí)，所獲得的培養(yǎng)菌液作為昆蟲(chóng)拒食劑，采用葉蝶法分別測(cè)定二種菌液對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用
用打孔器(直徑＝2cm)將椰菜葉作成葉蝶，將其浸泡在不同的菌液中(50ml菌液中加入3滴高壓消毒的甘油)5秒鐘，取出并涼干葉蝶，將其放入墊有2層無(wú)菌中速濾紙(新華)的培養(yǎng)皿中(直徑＝7.5cm)。實(shí)驗(yàn)分兩種方法處理一、選擇性測(cè)定每培養(yǎng)皿加兩片葉蝶，一片浸泡菌液的葉蝶和另一片對(duì)照葉蝶(不浸泡菌液，僅浸泡加入高壓消毒的甘油的無(wú)菌水)，然后往每個(gè)培養(yǎng)皿中接入3齡小菜蛾幼蟲(chóng)10頭。每處理設(shè)3個(gè)平板的重復(fù)。置于25℃下。試驗(yàn)后24，48和72小時(shí)，檢查葉蝶被取食的面積。
二、非選擇性測(cè)定每培養(yǎng)皿加兩片浸泡菌液的葉蝶，另設(shè)對(duì)照葉蝶(不浸泡菌液，僅浸泡加入高壓消毒的甘油的無(wú)菌水)放于另一培養(yǎng)皿(對(duì)照培養(yǎng)皿)中，然后往每個(gè)培養(yǎng)皿中接入3齡小菜蛾幼蟲(chóng)10頭。每處理設(shè)3個(gè)平板的重復(fù)。置于25℃下。試驗(yàn)后24，48和72小時(shí)，檢查葉蝶被取食的面積。
實(shí)驗(yàn)證明，用X.nematophilus和P.luminescens培養(yǎng)的菌液無(wú)論是在選擇性測(cè)定或非選擇性測(cè)定中，對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)均具有拒食作用。72小時(shí)后，在選擇性測(cè)定平板中，未經(jīng)菌液處理的菜葉已被小菜蛾幼蟲(chóng)吃光，但經(jīng)菌液處理的菜葉面積仍完好；在非選擇性測(cè)定中，經(jīng)菌液處理的菜葉面積完好，未被小菜蛾幼蟲(chóng)破壞，即使小菜蛾幼蟲(chóng)由于饑餓而死亡也不取食菜葉。由此可見(jiàn)，X.nematophilus和P.luminescens培養(yǎng)的菌液對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)均具有強(qiáng)烈拒食作用。
實(shí)例二按實(shí)例一同樣的方法從S.carpocapsae A24線蟲(chóng)中分離出X.nematophilus共生菌；從H.bacteriophora線蟲(chóng)中分離出P.luminescens共生菌，并分別制備X.nematophilus和P.luminescens的培養(yǎng)菌液，所獲得菌液經(jīng)14000rpm，10分鐘離心分離，上清液以0.2μm孔徑的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，濾渣(菌體)則以等量無(wú)菌水替代上清液稀釋，分別以上清液和濾渣(菌體)水稀釋液作為昆蟲(chóng)拒食劑，然后也按實(shí)施例一的葉蝶法測(cè)定其對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用。
實(shí)驗(yàn)證明，X.nematophilus和P.luminescens培養(yǎng)的菌液，無(wú)論是上清液還是菌體水稀釋液，無(wú)論是在選擇性測(cè)定或非選擇性測(cè)定中，對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)均具有強(qiáng)烈拒食作用。
權(quán)利要求
1.一種昆蟲(chóng)拒食劑，其特征在于選自人工培養(yǎng)的Xenorhabdus或Photorhabdus屬細(xì)菌的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液或細(xì)菌培養(yǎng)液中濾渣的水稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲(chóng)拒食劑，其特征在于Xenorhabdus屬細(xì)菌選自選自Xenorhabdus nematophilus、X.poinarii、X.bovienii、X.beddingii或X.kushidaii種細(xì)菌；Photorhabdus屬細(xì)菌有P.luminescens種細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲(chóng)拒食劑，其特征在于Xenorhabdus屬細(xì)菌目前經(jīng)描述的包括Xenorhabdus nematophilus、X.poinarii、X.bovienii、X.beddingii和X.kushidaii。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲(chóng)拒食劑，其特征在于Photorhabdus屬細(xì)菌目前經(jīng)描述的種類有P.luminescens。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲(chóng)拒食劑的用途，其特征在于將其應(yīng)用于植物體表面或地下部分、生長(zhǎng)環(huán)境中，可阻止世界性的蔬菜主要害蟲(chóng)小菜蛾(Plutella xylostella)取食植物體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種昆蟲(chóng)拒食劑的用途，其特征在于其應(yīng)用于十字花科的蔬菜的表面或地下部分、生長(zhǎng)環(huán)境中時(shí)，特別能阻止世界性的蔬菜主要害蟲(chóng)小菜蛾(Plutellaxylostella)取食十字花科的蔬菜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種昆蟲(chóng)拒食劑及其用途,它選自人工培養(yǎng)的Xenorhabdus或Photorhabdus屬細(xì)菌的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液或培養(yǎng)液中濾渣的水稀釋液;將其應(yīng)用于植物體特別是十字花科的蔬菜的表面或地下部分、生長(zhǎng)環(huán)境中時(shí),可阻止世界性的蔬菜主要害蟲(chóng)小菜蛾(Plutella xylostella)取食植物體。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1372798SQ01130078
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2001年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月14日
發(fā)明者韓日疇, 劉秀玲, 曹莉, 李秋劍, 陳鏡華 申請(qǐng)人:廣東省昆蟲(chóng)研究所