專利名稱：：作為昆蟲防治劑的dsRNA的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在昆蟲物種中雙鏈RNA(dsRNA)介導基因沉默的領域。更具體地，本發(fā)明涉及設計用來表達針對新耙基因的dsRNA的遺傳構建體。這些構建體尤其可用于RNAi介導的植物害蟲防治。本發(fā)明還涉及防治昆蟲的方法，預防昆蟲侵害的方法以及使用RNAi下調(diào)昆蟲中基因表達的方法。本發(fā)明還涉;sjit昆蟲侵害具有抗性的轉基因植物。
背景技術：
：環(huán)境中充斥著許多害蟲，已有多種方法嘗試防治害蟲對植物的侵害。經(jīng)濟作物常常是昆蟲侵襲的目標。在過去的幾十年中，用于防治植物中昆蟲侵害的更有效方法和組合物的開發(fā)已獲得實質(zhì)性進展?；瘜W殺蟲劑對于根除蟲害非常有效。然而，4吏用化學殺蟲劑存在若干缺點。它們不僅對環(huán)境有潛在危害，而且它們是沒有選擇性的并對多種作物和非目標動物群有害。化學殺蟲劑在環(huán)境中持續(xù)存在，其通常即使發(fā)生代謝也十分緩慢。它們在食物鏈中特別是高等食肉動物中累積，在其中它們可作為誘變劑和/或致癌劑從而導致不可逆的以及有害的遺傳修飾。因此，對于使用化學殺蟲劑對抗作物害蟲存在持續(xù)的爭議。由于重復使用同樣的殺蟲劑或具有同樣作用模式的殺蟲劑，它們可以iSil地獲得針對這些殺蟲劑的抗性，并且由于累積也導致較高進化等級的物種中產(chǎn)生針對該殺蟲劑的抗性。防治重要農(nóng)作物的害蟲是非常重要的，尤其是損傷茄科(Solanaceaefamily)植物的害蟲，所述茄科植物特別是馬鈴薯(Solanumtuberosum)、番癡(Solanumlycopersicum)、蒜子(Solanummelongena)、辣椒(Solanumcapsicum)和蒜屬植物(例如，Solanumaculeastrum、S.bulbocastanum(一種野生馬鈴薯)、S.cardiophylhim、S.douglasii、歐白英(S.dulcamara)、S.lanceolatum、S.robustum和S.triquetrum),尤其要防治鞘翅目害蟲。使用印楝籽提取物進行生物防治已顯示出針對植物鞘翅目害蟲的效果?；谟￠氖惺蹥⑾x劑將印楝素作為主要的活性成分。這些殺蟲劑適用于廣i普的昆蟲。它們作為昆蟲生長調(diào)節(jié)劑；印楝素通過抑制產(chǎn)生昆蟲激素(蛻皮素)來阻礙昆蟲蛻皮。使用來自蘇云金芽孢桿菌擬步行甲變種(tenebrionis)和圣地亞哥(sandiego)變種的Cry3A蛋白以及衍生的殺蟲蛋白進行生物防治是化學防治的替代方案。所述Bt毒素蛋白對于防治馬鈴薯葉甲幼蟲是有效的，所述蛋白是作為噴灑于葉的制劑或者表M馬鈴薯的葉中。替代性生物制劑是dsRNA。在過去的幾年里，借助RNA干擾或"RNAi，，下調(diào)多細胞生物中的基因(也稱為"基因沉默")已成為^^p的技術。RNA干擾或"RNAi"是序列特異性下調(diào)基因表達的方法(也稱為"基因沉默"或"RNA介導的基因沉默，，)，其由序列互補于待下調(diào)乾基因區(qū)域的雙鏈RNA(dsRNA)起始(Fire,A.TrendsGenet.Vol.15,358-363,1999;Sharp,P.A.GenesDev.Vol.15,485-4卯，2001)。在過去的幾年里，借助RNA干擾(RNAi)下調(diào)多細胞生物的靼基因已成為成熟的技術?？蓞⒖紘H申請WO99/32619(卡內(nèi)基研究所)和WO00/01846(由本申請人申請)。DsRNA基因沉默可在許多不同的領域中應用，例如臨床應用(WO2004/001013)和植物中dsRNA介導的基因沉默。在植物中，還設計了用于基因沉默的dsRNA構建體，其被切割并加工成短干擾RNA(shortinterferingRNA，siRNA)。也已計劃將RNAi作為保護植物對抗植物寄生性線蟲的方法，即通過在植物中(例如在整個植物中，或植物的一部分、組織或細胞中)表達形成針對植物寄生性線蟲中乾基因的dsRNA片段的一種或多種核苷酸序列來實現(xiàn)，所述耙基因?qū)λ鼍€蟲的生長、繁殖和/或存活是必需的?？蓞⒖紘H申請WO00/01846(由申請人申請)和美國專利6,506,559(基于WO99/32619)。盡管在植物、秀麗隱桿線蟲(C.degans)和哺乳動物細胞領域中的RNAi技術已經(jīng)普遍知曉有數(shù)年了，然而迄今為止對于昆蟲中使用RNAi下調(diào)基因表達所知甚少。自從WO00/01846和WO99/32619申請的提交和公開以來，僅有極少數(shù)涉及使用RNAi保護植物對抗昆蟲的其它申請被7>開。這些包括國際申請WO01/37654(DNAPlantTechnologies)、WO2005/019408(BarHanuniversity)、WO2005/049841(CSIRO，BayerCropscience)、WO05/047300(UniversityofUtahResearchfoundation)和美國申請2003/00150017(Mesa等)。本發(fā)明提供了用于RNAi介導害蟲防治的耙基因和構建體，尤其防治植物的昆蟲病原體。本發(fā)明還提供了通過抑制、延遲或降低特定害蟲內(nèi)部靼基因的表M而防治害蟲侵害的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明描述了用于防治作物害蟲的基于非化合物、非蛋白質(zhì)的新方法。活性成分是核酸(雙鏈RNA,即dsRNA)，其可用作殺蟲制劑。在另一實施方案中，該dsRNA可在宿主植物、植物的一部分、植物細胞或種子中組成性地表達，從而保護該植物免受昆蟲尤其是鞘翅目(如甲蟲)的啃食。所述dsRNA的序列對應于昆蟲必需基因的一部分或完整基因，并通過RNA干擾(RNAi)導致昆蟲乾標的下調(diào)。由于mRNA的下調(diào)，所述dsRNA阻止了昆蟲靶蛋白的表達，并因此導致該昆蟲死亡、生長停滯或不育。本發(fā)明的方法可實際應用在需要抑制昆蟲的生存、生長、發(fā)育或繁殖或者降低昆蟲的致病性或侵染性的任何
技術領域：
。本發(fā)明的方法還可實際應用于需要特異性下調(diào)昆蟲中一種或多種耙基因表達的情形。尤其有用的實際應用包括但不限于保護植物免遭害蟲侵害。才艮據(jù)一個實施方案，本發(fā)明涉及防治昆蟲在細胞或生物體上生長的方法，或者阻止昆蟲侵害對昆蟲侵害敏感的細胞或生物體的方法，其包括將昆蟲與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條鏈包含與昆蟲乾基因核苷酸序列的至少一部分互補的核苷酸序列，所述雙鏈RNA被昆蟲才仏并因此控制生長或阻止侵害。因此，本發(fā)明提供了分離的新的昆蟲耙基因核苷酸序列，所述分離的核苷酸序列包含選自以下的至少一種核酸序列(i)如下任意序列SEQIDNO1'3,5.7,9.11.13,15,17,19,21,23,<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>173,178,183，化8,193,198，203,208,215,220,225,230,240至247,249,251.253,255,257,259,275至472'473,478,483,488，493,498,503,508至513,515，517,519,521,533至575,576,581,586，591,596.601,603,605，607，609,621至767,768,773,778，783，788,793,795,797,799,801,813至862,863,868，873,878,883,888,890,892,894,896,恥8至，040,1041，1046，1051,1056,1061,1066至1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109.11",1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602，1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637.1642,1647,1652,1657,1662,化67,1672,1677,1682，1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,16明，1700，1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085、2090,2095，2100,2102,2104,2106、2108，2120至2338，2339,2344,2349,2354,2鄉(xiāng)，2364,2366,2368，2370,2372,23B4至2460,2461,2466,2471，2476,2481或2486,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含以下任意序列中至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、卯8至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460,或其互補序列，所述核酸序列可用于制備本發(fā)明的用于控制昆蟲生長的雙鏈RNA。本發(fā)明使用的"防治害蟲"意指殺死害蟲，或阻止害蟲發(fā)育或生長，或阻止害蟲侵染或侵害。本文使用的防治害蟲還包括防治害蟲的后代(卵的發(fā)育)。本文使用的防治害蟲還包括抑制害蟲的存活、生長、發(fā)育或繁殖，或降低害蟲的致病性或侵染性。本文所述的化合物和/或組合物可用于維持生物的健康，并可以治療性、預防性或全身性地使用以防治害蟲或者阻礙害蟲生長或發(fā)育或侵染或侵害。本發(fā)明涉及的特定害蟲是植物病原性害蟲。因此，本文使用的"防治昆蟲，，還包括防治昆蟲的后代(如卵的發(fā)育)。本文使用的的防治昆蟲還包括抑制昆蟲的存活、生長、發(fā)育或繁殖，或者降^[氐昆蟲的致病性或^:染性。在本發(fā)明中，防治昆蟲可以抑制昆蟲中的生物活性，其導致一種或多種以下特征昆蟲進食減少，昆蟲生存力降低，昆蟲死亡，昆蟲分化和發(fā)育的抑制，以下各項能力的喪失或下降昆蟲的有性生殖、肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉運、細胞膜電勢的維持、M酸生物合成、M酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感受、觸角形成、翅形成、足形成、發(fā)育和分化、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經(jīng)傳遞、細胞分裂、能量代謝、呼吸、凋亡以及真核細胞的細胞骨架結構的任何成員(如肌動蛋白和孩i管蛋白)。本文所述的化合物和/或組合物可用于保持生物健康，并可以以治療性、預防性或全身性地使用以防治害蟲或者阻礙害蟲生長或發(fā)育或侵染或侵害。因此，本發(fā)明可以使先前敏感的生物對昆蟲的4曼害產(chǎn)生抗性。本文使用的表述"與……的至少一部分互補"是指所述核苷酸序列與靶標核苷酸序列在超過兩個核苷酸的長度上，例如至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個連續(xù)核苷酸的長度上完全互補。根據(jù)又一實施方案，本發(fā)明涉及用于下調(diào)昆蟲中耙基因表達的方法，其包括將所述昆蟲與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條鏈具有與待下調(diào)昆蟲耙基因的至少一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列，由此所述雙鏈RNA被昆蟲攝入并因此下調(diào)昆蟲把基因的表達。當"耙基因"沒有用量詞限定時，就是指"至少一種"乾基因。同樣地，靶標生物是指"至少一種"靶標生物，以及RNA分子或宿主細胞是指"至少一種"RNA分子或宿主細胞。這在后面還有詳述。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的方法依賴于昆蟲攝取其外部的雙鏈RNA(例如，通過喂食)，并且不需要在昆蟲細胞的內(nèi)部表達雙鏈RNA。另夕卜，本發(fā)明還包括如上所述的方法，其中所述昆蟲與含有雙鏈RNA的組合物接觸。本發(fā)明還提供了用于下調(diào)靶標生物(其能夠攝Wi物、植物的一部分、植物的細胞或種子)中至少一種耙基因表達的方法，其包括向乾標生物喂食植物、植物的一部分、植物的細胞或種子，其中所述植物、植物的一部分、植物的細胞或種子表達雙鏈RNA。在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了用于下調(diào)靶標生物(其能夠攝取宿主細胞，或其提取物)中至少一種耙基因表達的方法，其包括向靼標生物喂食宿主植物、植物的一部分、植物的細胞或種子，所述宿主植物、植物的一部分、植物的細胞或種子表達雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子包含互補于所述至少一種靶基因的至少一部分核苷酸序列的核苷酸序列或代表所述至少一種耙基因的至少一部分核苷酸序列的RNA等價物，因此靶標生物攝取宿主細胞、宿主植物、植物的一部分、植物的細胞或種子造成和/或?qū)е略撝辽僖环N耙基因表達的下調(diào)。本發(fā)明提供了本文所定義的植物、植物的一部分、植物的細胞或種子用于下調(diào)昆蟲乾基因表達的用途。更詳細地，本發(fā)明提供了本文所定義的宿主細胞和/或RNA分子用于下調(diào)耙基因表達的用途，所述RNA分子包含作為靶標生物靼基因的至少一部分核苷酸序列的RNA互補物或代表靼標生物靼基因至少一部分核苷酸序列的RNA等價物的核苷酸序列，其在植物、植物的一部分、植物的細胞或種子中通過核酸分子轉錄而產(chǎn)生，例如用于制造商品。本發(fā)明中合適的靼基因和靶標生物在后面將有詳細的討論。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的方法依賴于GMO方法，其中雙鏈RNA由被昆蟲侵害或?qū)ハx侵害敏感的細胞或生物來表達。優(yōu)選地，所述細胞^_植物細胞或者所述生物體是植物。因此，本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生對植物病原性昆蟲具有抗性的植物的方法，其包括-用重組構建體轉化植物細胞，所述重組構建體包含至少一個調(diào)節(jié)序列，其有效地連接與以下(a)或(b)中序列的至少一部分互補的序列，(a)選自以下的靶標昆蟲基因的核苷^列(i)與以下任意序列具有至少75%—致性的序列SEQIDMO1,3，5,7,9,11,13，15,17'19,21,23，49至158,159，160-163,168,173，178,183,化8,193,198,203,208,215,220,225，230，247,249,251,253,255,257，259'275至472,473,478,483,488，493,498,503,513'515'517,519,521,533至575'576,581，586,591,596，601，603,605,607,609,621至767,768,773,778，783,788,793,795,797,799，801，813至862,863，868,873,878.883,888,890，892,894，896，908至1040，1041,1046,1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,湖，1083,1085,1087,1089,訓，1093,1095,1097,1099,"01,1103、1105,1107,1109,1111,1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1啦，1657,1662，1667'1672，1677,1682，1684,1686,1688，化90，1692,1694,化96'1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050，2055,2060，2065,2D70,2075,2080,2085,2090,2095,2識2102,2104,2識2線2120至2338,2339,2344，2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，(ii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNOl、3,5,7,9,11,13,15,17'19,21,23,49至158，159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,247,249,251,253，255，257，259,275至472，473,478,483,488，493,柳，503,513,515,517，519,521，533至575,576,581,586，591，596,601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788.793，795,797,799,801,813至B62,863,86B,873,878，883,88&,890,892,894,896'908至1040,1041,1046,1051,1056，1061,1071,1073，1075,1077,1079,1081,1083'1085,1087，1089，1091,1093,1095，1097,10的，1101,1103'1105,"07,1109'1111,1113，"61至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647'1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684，化86，1688,1690,1692'1694,1696,1698,1700,1702,1704'1730至2039'2040,2045,2050,2055,2060,2065，2070,2075'2080,2085,2090,2095,2100，2102,2104,2化6，2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366，2368,2370,2372,2384至2460,2461，2466,2471,2476或2481,或其互^卜序列，以及(iii)包含含有(i)中核苷酸序列的有義鏈和含有(i)所述核苷酸序列之互補序列的反義鏈的序列，其中由所述核苷酸序列編碼的轉錄物能夠形成雙鏈RNA，或(b)作為包含以下任意序列中至少17個連續(xù)核苷酸之基因的昆蟲直系同源物的核苷酸序列SEQIDNo49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互補序列；-從已轉化植物細胞再生植物；以及-在適于表達所述重組構建體的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉化的植物，所述培養(yǎng)的轉化植物與未經(jīng)轉化的植物相比對植物病原性昆蟲具有抗性。所述昆蟲可以是任何昆蟲，意指屬于動物界、更具體為節(jié)肢動物門、更具體為昆蟲綱或蛛形綱的任何生物。本發(fā)明的方法適用于所有昆蟲，它們對通過RNA干擾進行的基因沉默是敏感的，并且能夠內(nèi)化來自它們緊鄰環(huán)境的雙鏈RNA。本發(fā)明還適用于處于發(fā)育任何階段的昆蟲。因為昆蟲具有無生命的外骨骼，所以它們不能以均勻的速率生長，而是通過周期性蛻落其外骨骼進行分階段生長。該過程稱作蛻皮。蛻皮之間的階段稱作"齡"，并且這些階段可以作為本發(fā)明的耙標。同時，昆蟲的卵或活的初生幼蟲也可作為本發(fā)明的靶標。發(fā)育周期中的所有階段(包括有翅昆蟲中的變態(tài))均可以作為本發(fā)明的靶標。因此，單獨的階段(如幼蟲、蛹、若蟲等發(fā)育階段)均可以作為靶標。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述昆蟲可以屬于以下目蜱螨目(Acari)、掩蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、彈尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、網(wǎng)翅目(Dictyoptera)、雙尾目(Diplura)、雙翅目(Diptera)、紡足目(Embioptera)、蛘蝣目(Ephemeroptera)、愛蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymen叩tera)、等翅目(Isoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、長翅目(Mecoptera)、脈翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(O池optera)、竹節(jié)蟲目(Phasmida)、積翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、嚙蟲目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、纓尾目(Thysa證a)、掄翅目(Strepsiptera)、纓翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)和缺翅目(Zoraptera)。在本發(fā)明優(yōu)選但非限制性實施方案和方法中，所述昆蟲選自植物害蟲，例如但不僅限于褐飛虱屬(Nilaparvataspp.)(例如，褐飛虱(N.lugens))、灰飛虱屬(Laodelphaxspp.)(例如，灰飛虱(L.striatellus))、，黑尾葉蟬屬(Nephotettixspp.)(例如，二點黑尾葉蟬(N.virescens))，或黑尾葉蟬(N.cincticeps)，或二條黑尾葉蟬(N.nigropictus))、白背飛氛屬(Sogatellaspp.)(例如，白背飛虱(S.furcifera))、桿長蜂屬(Blissusspp.)(例如,美洲谷桿長蝽(B.leucopterus))、黑棒屬(Scotinophoraspp.)(例如，稻黑棒(S.vermidulate))、綠椿屬(Acrosternumspp.)(例如，稻子蝽(」./^7"^))、稻弄蝶屬(/\ir"araspp.)(例如，直紋稻弄蝶(戶.g"加to))、禾草螟屬(Chilospp.)(例如，二化螟(C.suppressalis)、臺灣稻螟(C.auricius)或黑頭螟(C.polychrtsus))、禾糸螟屬(Chilotreaspp.)(例如稻桿螟(C.polychrysa))蛀莖夜蛾屬(^sfl柳/"spp.)(例如，稻蛀莖夜蛾(5"./"/Me船))、蛀禾螟屬(T^/^o;ztfspp.)(例如，白稻螟(Z/wwCfl似)或三化螟(Z/m""m/"s))、縱巻葉野螟屬(C"op/m/ocroc/sspp.)(例如，稻縱巻葉野螟(C附eW"flfc))、潛蠅屬(Jgw附y(tǒng)zflspp.)(例如，日本稻潛蠅(Aoo^fle)或玉米潛繩(A/fln^w附's))、軒草螟屬spp.)(例如，小蔗螟(".)或西南玉米桿草螟(D.gnm&V^e〃"))、稻螟蛉屬(7Vflf7i"gflspp.)(例如，雙帶夜蛾(TV."e"Mc^w))、黃夜蛾屬(A:"w^w^^spp.)(例如，犁紋黃^j^蛾(Unmsv^^i))、灰翅夜蛾屬(spp.)(例如，草地貪夜蛾(5*./ra^^n/")、甜菜夜蛾(51.d/gw")、?；页嵋苟?&/Z加ra/k)或51./7me/cfl)、秘夜蛾屬(柳幼/附w"spp.)(例如,Afy幼附wfl「i^Mflf"/Wa)、J^/cmw/mspp.(例如，谷實夜域)、CV/fls/;/s1spp.(例如，C16,膽)、稻水象屬(她spp.)(例如，稻7jc象甲(￡."^>/7A//mS))、稻象屬(^E"cA/鼎cw棚msSpp.)(例如，稻象(JE"S■《Mfl附<W))、D/c/W/s/mspp.(例如，Z)."r附/^m)、禾谷負泥蟲屬(spp.)(例如，7jc稻負泥蟲("，，))、米象屬(幼—7,pp.)(例如，米象(5".，，))、i^c/y;鄉(xiāng)/aw'sspp.(例如，稻瘦蚊(尸.))、水蠅屬(/0^^//z'"spp.)(例如，麥葉毛眼水竭(漢gWs^/")或日稻毛眼水蠅(Eww"A:z7))、CM^y/^spp.(例如，稻桿潛埯(C.wj;zfle))、葉甲屬("/"6wft'cflspp.)(例如，玉米才艮葉甲(i).vzV^y^flv/rg(^ra)、巴氏才艮葉甲(A6"f"6en')、黃瓜十一星葉甲(D.Mw^fedwp"wctotoArw"n//)、D.v/rg一fl卿e、D.6fltoto)、桿野螟屬(0欲/w/flspp.)(例如，玉米螟(aww緒"/Zs))、地虎屬(々、spp.)(例如，小地老虎(A《》油w))、五/fls附o/wi/;w/sspp.(例如，南美玉米苗斑螟())、梳爪叩頭蟲屬(M^/fl/io似sspp.)(搶轉血矛線蟲)、圓頭犀金龜屬(Q;c/oc印/i"/flspp.)(例如,C^m,/s或Cl/附附flcw/fl似)、弧麗金龜屬(戶o/漁Vispp.)(例如，日本瓜麗金龜(戶.力/ww/cfl))、(C7^etocwe附"spp.)(例如，玉米銅色淑L甲(C.))、龍頸象屬(5^/^wc^/iwwsspp.)(例如，玉米長味象(51附wVfc))、縊管蜂屬(及/rop"/0W》/wi附spp.)(例如，玉米辨附fl/Ws))、圓尾對屬(Jwwni/7/r/sspp.)(例如，A附fl/^VYi^c/s)、黑蝗屬(Me/flwo/;/wsspp.)(例如，紅足黑蝗(Af./e附wfrw6m附))、特異黑埴(Af.rf斷腦《/函)或遷飛黑埴(M細wVi—s))、種竭屬(母/e附戸spp.)(例如，種蝸(E//fl似n)r))、呆薊馬屬(Jmi/7/^/if7》sspp.)(例如，黃呆薊馬do&m/ms))、5Wewo/7sisspp.(例如,5*.)、31葉螨屬(rwm"yc/^sspp.)(例如，二點葉螨(r."w/a^)、朱砂葉螨(t;dwwfl辦""ViMS)、spp.(例如，谷實夜蛾或棉鈴蟲(丑"fTM^er"))、7to/w。/;/^"spp.(例如，紅鈴麥蛾)、金剛鉆屬spp.)(例如，翠紋鉆夜蛾(五.v/船/Z"))、實夜蛾屬(好d/W/i/"pp.)(例如，煙芽夜蛾(汪viV^cews))、花象屬(爿w^wwo附MSspp.)(例如，棉鈴象甲(Agmwrf/s))、jPs^^"to附^"fespp.(例如,棉偽斑腿盲蝽(戶.Mf/"似s))、結翅粉虱屬(7Wfl/e"w&sspp.)(例如，結翅粉虱(1"6Mft7(weMs)、5顯室粉氛(r.v"/7onw7V^7/附))、'J、粉IL屬(i^w/wVspp.)(例如，銀葉粉虱(及Wg^l^/b/Z/))、辨屬(^7/H、Spp.)(例如，棉圻(Agossip//))、草盲棒屬(Ij，gMSspp.)(例如，美國牧草盲蝽(￡./紐eo/"r/s)或丄.Am/ww)、美洲蝽屬(Emsc/wWwsspp.)(例如，斑點美洲蜂(五.c州spe簡s))、C/r/o麼/i/wspp.(例如，賽氏蝽(Cl，/))、綠蝽屬(7V^"mspp.)(例如，稻綠棒(WnV/w/"))、薊馬屬(77^>sspp.)(例如，煙薊馬(7:似Z^"'))、花薊馬屬(FmAiA:///^//"spp.)(例如，煙褐薊馬(F./wscfl)或西方花薊馬(_F.ocdrf^ito"s))、馬鈴薯葉甲屬(i^/7ft'"otoraflspp.)(例如,馬鈴薯葉甲(丄.、偽馬鈴薯葉曱(Z.y"wc似，falsepotatobeetle,FPB)或Z，toc"/i")、合爪負泥蟲屬(丄e附"Spp.)(例如，三條負泥蟲(Z.加7/"Cfl/fl))、茄跳甲屬(￡/7/紅&spp.)(例如，美國馬鈴薯跳甲(￡cwcw附e"'s)、煙草跳甲(_E.Mr^^/m/s)或塊莖跳甲(￡m&n's))、豆芫菁屬(五/m'c"W"spp.)(例如，北美豆完寄(Ev/加似))、猿葉甲屬(」PAtfe^mspp.)(例如，辣根猿葉甲(/>."c/i/eflnV^))、食植狐蟲屬(五/H7flc/m"spp.)(例如，墨西哥豆胍蟲(￡vflr/ve"/s))、spp.(例如，美洲墦蟀(A.domesticus))、綠小葉蟬屬(五附/^flsospp.)(例如，蠶豆小綠葉蟬(E/Wfle))、瘤蚜屬(Af，sspp,)(例如，桃椅(Af.戸s/c"e))、薯個木虱屬(i^r欣/乖spp.)(例如，馬鈴薯木虱(i."d^M///))、Oworfw附spp.(例如，C/fl///或C.ves/7eW,7iws)、麥蛾屬(尸/i幼w/柳fleflspp.)(例如，馬鈴薯麥蛾c/7m*w/e//fl))、長管辨屬(Af"cmw]pAw附spp.)(例如，大戟長管辨(iV/.e"/;A^/"e))、T7y;flw,flspp.(例如,Z)、麥蛾屬(P緣wz歸eflspp.)(例如,馬鈴薯麥蛾(戶.))、spp,(例如，谷實夜蛾)、JT"y^n'flspp,(例如，L(v"/7em'"〃")、(掄轉血矛線蟲)、Ma/^mc"spp.(例如，煙草天蛾(AT.^x似)或番茄天蛾(7W:《w/"《we艦cw/她))、斑潛竭屬(Z/"V/w，spp.)(例如，蔬菜斑潛竭(Z.)、三葉草斑潛蠅(丄.加yi///)或南美斑潛錄(丄./m/^^^粘/s))、果錄屬(Z>nwc>/7M/flspp.)(例如，黑腹果錄(D.膨/"'wgfl他f)、D.戸紐6"、擬暗果錄(D./7m/^o6scwni)或擬果竭(2).s/腦tos))、步曱屬(Cara6wsspp.)(例如，粒步甲(C.gnm"/"似s))、搖蚊屬(C7wVwio附msspp.)(例如，搖蚊(C.^itoWM))、辨首蚤屬(spp.)(例如，貓櫛首蚤(C./e//s))、非耳味象屬(Z)/"/;r印Mspp.)(例如，才艮象鼻蟲(Afl/^rev/"似s))、齒小橐屬(加spp.)(例如，美松齒小蠹(/;wVi/))、4以谷盜屬(TW^/Zw附spp.)Oj如,赤4以谷盜(r.cflstowew/m))、舌繩屬(G7oss/"flspp.)(例如，刺舌繩(G.))、按蚊屬(Jwo^/^/esspp.)(傘j如,甘比亞按蚊(j.gfl附W"e))、^^//covefyflspp.(食'J如,棉鈴蟲(^T.ar附/gera))、Jqv"/ioM》/^mspp.(例如，豌豆蜂(爿./7/swiw))、蜜蜂屬(J/7/sspp.)(例如,意大利蜜蜂(j.附^/^yi))、/T(fwi"/cwfccflspp.(例如，琉璃葉蟬(丑coflgw/flte))、寸尹蚊屬(J^fesspp.)(例如，埃及斑紋(Afl^v/^'))、^"蛾屬(丑o附^;cspp.)(例如，家蠶(及附w'))、飛埴屬(丄0O/WflSpp.)(例如，飛埴(丄.附&f"tor/"))、牛蜱屬(spp.)(例如，微小牛蜱(必./mVrop/ws))、^4c"w幼os^/mVispp.(例如，J.gO附eW'flWfl))、D《》/0/7tefflSpp.(侈'j如，太平'洋4斤翅蠊(D./7MW"fl似))、袖蝶屬(/Te/ZcwwTisspp.)(例如，瓦氏袖蝶(好.或詩神袖蝶(丑*))、象蟲屬(spp.)(例如，歐洲櫟象(Cg/flW必"/M))、尸/wfe,/tfspp.(例如,小菜蛾(尸.))、鈍S艮蜱屬(J柳^vo附w"spp.)(侈'J如，茅j飾花蜂(J.vflf7'c^"似附))、拃蠶屬(J/^/ier"^ispp.)(命j如，))和阿蚊屬(jfm/gw^spp.)(例如，騷擾阿蚊(A5w6a幼她s1))。本發(fā)明優(yōu)選的植物病原性昆蟲是選自以下的植物害蟲馬鈴薯葉曱屬(例如，馬鈴薯葉甲(科羅拉多馬鈴薯甲蟲)、偽馬鈴薯葉甲(丄.y""""，falsepotatobeetle,FPB)或丄.)、褐飛亂屬(例如，褐飛虱)、灰飛虱屬(例如，灰飛虱)、黑尾葉蟬屬(例如，二點黑尾葉蟬，或黑尾葉蟬，或二條黑尾葉蟬)、白背飛虱屬(例如，白背飛虱)、禾草螟屬(例如，二化螟、臺灣稻螟或Cl/7o(vc/iow^)、蛀莖夜蛾屬(例如，稻蛀莖夜蛾)、蛀禾螟屬(例如，r./朋oto似或三化螟)、花象屬(例如，棉鈴象甲)、猿葉甲屬(例如，辣根猿葉曱)、食植胍蟲屬(例如，墨西哥豆瓢蟲)、擬谷盜屬(例如，赤擬谷盜)、D/fl6w"'cflspp.(例如，玉米根葉甲、巴氏根葉曱、黃瓜十一星葉甲、D.Ww^m^ie)、桿野螟屬(例如，玉米螟)、呆薊馬屬(例如，黃呆薊馬)、iV"Z朋/7/^r"spp.(例如，紅鈴麥蛾)、實夜蛾屬(例如，煙芽夜蛾)、結翅粉虱屬(例如，結翅粉虱、溫室粉虱)、小粉虱屬(例如，銀葉粉虱)、對屬(例如，棉枒)、草盲蝽屬(例如，美國牧草盲椿或Z./^S/7WS)、美洲蝽屬(例如，斑點美洲蝽)、C7^fw/m^spp.(例如，賽氏蝽)、綠棒屬(例如，稻綠蝽)、薊馬屬(例如，煙薊馬)、花薊馬屬(例如，煙褐薊馬或西方花薊馬)、Jc/iCflspp.(例如，美洲蟋蟀)、瘤對屬(例如，桃奸)、長管坊屬(例如，大戟長管奸)、桿長蝽屬(例如，美洲谷桿長蝽)、綠蝽屬(例如，擬綠蝽)、禾草螟屬(例如，CI戶(vc力o^)、稻水象屬(例如，稻水象曱)、縊管辨屬(例如，玉米對)和圃尾蜂屬(例如，A附fl/力V"rf/"、)。根據(jù)一個更具體的實施方案，本發(fā)明的方法適用于馬鈴薯葉甲屬。馬鈴薯葉甲屬屬于葉甲科(Chrysomelidae)。葉曱(如跳甲和玉米根蟲)和象甲(如苜蓿葉象甲)是特別重要的害蟲。跳曱包括多種小型食葉甲蟲，其以多種草、谷類和草本植物的葉為食。跳曱包括多個屬(例如，Attica、Apphthona、Argopistes、Disonycha、茄浪fe甲屬(Epitrix)、長廚t淑^曱屬(Longitarsus)、Prodagricomela、Systena和黃#"浪匕曱屬(Phyllotreta))。蘿卜菜跳甲(Phyllotretacruciferae)(也叫作RapeFleaBeetle)是特別重要的害蟲。玉米才艮蟲包括葉甲屬的物種(例如，D.undecimpunctataundecimpunctata、黃瓜十一星葉甲(D.undecimpunctatahowardii)、D.longicornis、玉米才艮葉甲(D.virgifera)和D.balteata)。玉米才艮蟲對玉米和瓜類(curcubit)造成廣泛地破壞。西方斑點黃瓜甲蟲(WesternSpottedCucumberBeetle,D.undecimpunctataundecimpunctata)在美國A^類害蟲。苜蓿葉象甲(亦稱三葉草象甲)屬于葉象屬(紫苜蓿葉象(H.postica)、埃及苜蓿葉象(H.brunneipennis)、H.nigrirostris、三葉草葉象(H.punctata)和H.meles)，并JU人為其是重要的豆類害蟲。埃及苜蓿象曱(H.brunneipennis)在美國是重要的苜蓿害蟲。馬鈴薯葉甲屬物種多于30種。因此，本發(fā)明包括用于防治馬鈴薯葉曱屬物種的方法，更具體地用于殺死昆蟲，或阻礙馬鈴薯葉甲屬昆蟲發(fā)育或生長，或者防止昆蟲侵染或侵害。本發(fā)明所防治的特定馬鈴薯葉曱屬物種包括馬鈴薯葉甲(ColoradoPotatoBeetle,CPB)(馬鈴薯葉曱(Say)和偽馬鈴薯葉曱(Say))。CPB對于我們本國的馬鈴薯，其它栽培和野生的有塊莖和無塊莖的馬鈴薯物種(例如，S.demissum、S.phurejaa.o.)以及其它茄屬植物物種是(嚴重的)害蟲，這些物種包括(a)作物物種番茄(幾種番茄屬物種)、茄子、胡椒(幾種辣椒屬物種)、煙草(幾種煙草屬物種，其包括觀賞植物)和醋栗(酸漿屬)；(b)雜草/草本植物物種，北美刺龍葵(S.carolinense)、歐白英(S.dulcamara)、顛茄(顛茄屬)、曼陀羅(曼陀羅屬)、天仙子(天仙子屬)和黃花刺蕩(S.rostratum)。FPB主要發(fā)現(xiàn)于北美刺龍葵上，也發(fā)生在歐白英(commonnightshade)、醋栗(groundcherry)和酸漿(husttomato)(酸漿屬)上。術語"昆蟲，，包括所有類型以及所有發(fā)育階段的昆蟲，包括卵、幼蟲或若蟲、蛹和成蟲階段。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是馬鈴薯葉甲，所述植物是馬鈴薯、茄子、番茄、胡椒、煙草、醋栗或者稻、玉米或棉花。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是辣根猿葉甲，所述植物是芥菜、大白菜、蕪著、羽衣甘藍或小白菜。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是墨西哥豆瓢蟲，所述植物是豆類、蠶豆、四季豆、食莢菜豆、利馬豆、綠豆、青豆、牛眼豆、絨毛豆、大豆、豇豆、木豆、三葉草或苜蓿。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是棉鈴象曱，所述植物是棉花。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是赤擬谷盜，所述植物是以貯存谷物的形式，如面粉、谷類、粗粉、餅干、豆類、調(diào)味品、面食、點心粉、干的寵物食品、干花、巧克力、堅果、種子甚至干的博物館樣品。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是桃蚜，所述植物^_樹木如李屬(TV"""",特別是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫蘆科的蔬菜作物，其包括但不限于朝鮮薊、蘆筍、豆類、甜菜、青花菜、抱子甘藍、巻心菜、胡蘿卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉米、黃瓜、茴香、無頭甘藍、大頭菜、蕪菁、茄子、萵苣、芥菜、菜秋葵、歐芹、歐洲防風草、豌豆、胡椒、馬鈴薯、蘿卜、菠菜、南瓜、番茄、蕪菁、豆瓣菜和西瓜；農(nóng)作物例如但不限于煙草、糖用甜茱和向日葵；開花作物或其它觀賞植物。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是褐飛虱，所述植物是稻類植物。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是二化螟，所述植物是稻類植物、大麥、高粱、玉米、小麥或草。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是小茱蛾，所述植物是蕓苔屬的，例如但不限于巻心菜、大白菜、抱子甘藍、無頭甘藍、油菜、青花菜、花椰菜、蕪菁、芥菜或蘿卜。本發(fā)明包括如本文所述的方法，其中所述昆蟲是美洲蟋蟀，所述植物是本文所述的任何植物或任何有機體。受益于本發(fā)明的"敏感生物"包括任何對害蟲侵害敏感的生物。優(yōu)選地，植物可受益于本發(fā)明，而免遭植物害蟲的侵害。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述敏感生物是植物，所述害蟲是植物病原性昆蟲。在該實施方案中，通過在被植物病原性害蟲侵害或?qū)η趾γ舾械闹参?、植物的一部分、植物的細胞或種子中表達dsRNA分子使所述昆蟲與RNA分子接觸。在本文中，術語"植物，，包括期望被處理從而防止或降低昆蟲生長和/或昆蟲4曼害的任何植物材料。這包括整沐&物、幼苗、增殖或繁殖材料(如種子、插條、接穗、外植體等)，以及植物細胞和組織培養(yǎng)物等等。所述植物材料應該表達RNA分子或者具有表達RNA分子的能力，所述RNA分子包含至少一種核苷M列，所述核苷^f列是害蟲至少一種耙基因的有義鏈核普酸序列的至少一部分的RNA互補序列或代表其RNA等價物，從而所述RNA分子通過植物與害蟲的相互作用被害蟲吸收，所述RNA分子能夠通過RNA干擾抑制粑基因或者下調(diào)耙基因的表達。所述乾基因可以是本文所述的任何靼基因，例如對于害蟲的生存、生長、發(fā)育或繁殖是必需的耙基因。本發(fā)明涉及昆蟲中可被下調(diào)的任何目的基因(在此可稱作"乾基因")。術語"下調(diào)基因表達"和"抑制基因表達，，可互換地使用，其指在靼基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和/或mRNA產(chǎn)物水平上可測量的或可觀察的基因表達減少或者完全消除可檢測的基因表達。優(yōu)選地，所述下調(diào)不顯著地直接抑制昆蟲其它基因的表達。與正常的基因表勤目比時，dsRNA對基因表達的下調(diào)效果可計算為至少30。/。、40%、50%、60%，優(yōu)選70%、80%，甚至更優(yōu)選卯％或95%。根據(jù)耙基因的性質(zhì)，可通過對細胞或整只昆蟲進行表型分析或者通過使用分子技術測量mRNA或蛋白質(zhì)的表達來驗證昆蟲細胞中基因表達的下調(diào)或抑制，所述分子技術如RNA溶液雜交、PCR、核酸酶保護實驗、Northern雜交、逆轉錄、用微陣列監(jiān)測基因表達、抗體結合、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡、ii射免疫測定、(RIA)、其它免疫測定或熒光激活細胞分析(FACS)。"把基因"可以是期望被抑制的幾乎任何基因，因為其干擾昆蟲的生長或致病性或4曼染性。例如，如果本發(fā)明的方法用于阻礙昆蟲生長和/或4曼害，則優(yōu)選地選擇對于昆蟲的生存力、生長、發(fā)育或繁殖是必需的靼基因，或者涉及昆蟲的致病性或侵染性的任何基因，使得對靼基因的特異性抑制導致致死表型或者降低或阻止昆蟲侵害。根據(jù)一個非限制性的實施方案，所述耙基因是當4吏用本發(fā)明的方法下因。認為這類耙基因是昆蟲生存所必需的，其稱作必需基因。因此，本發(fā)明包括本文所述的方法，其中所述靼基因是必需基因。根據(jù)又一非限制性的實施方案，所述耙基因是當使用本發(fā)明的方法將其下調(diào)時昆蟲的侵害或侵染、昆蟲造成的破壞和/或昆蟲侵害或侵染宿主生物和/或?qū)е逻@樣的破壞的能力被降低的基因。一般地，術語"侵害"和"侵染"始終可互換使用。認為這類靶基因參與昆蟲的致病性或侵染性。因此，本發(fā)明延及本文所述的方法，其中所述靶基因涉及昆蟲的致病性或侵染性。選擇后一類型靶基因的優(yōu)勢在于阻斷了昆蟲侵染其它植物或植物部分，并且抑制其形成后代。根據(jù)一個實施方案，耙基因是保守基因或者昆蟲特異性基因。另外，在本發(fā)明的方法中可以使用能夠指導RNAi或RNA介導的基因沉默或者抑制昆蟲把基因的任何適當?shù)碾p鏈RNA片段。在另一實施方案中，選擇事實上涉及害蟲(如昆蟲)生長、發(fā)育和繁殖的基因。示例性的基因包括但不限于核糖體蛋白的結構亞基和p-外被體基因(如CHD3基因)。核糖體蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是參與蛋白質(zhì)生物合成的核糖體的結構組分，并且是胞漿小核糖體亞基的組分，核糖體蛋白如L9和L19是參與蛋白質(zhì)生物合成的核糖體的結構組分，并且定位于核糖體。秀麗隱桿線蟲中的P-外被體基因編碼形成膜泡包被的多聚復合體的亞基蛋白質(zhì)。已在多種生物中發(fā)現(xiàn)類似的序列，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、黑腹果錄(Drosophilamelanogaster)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在多種生物中發(fā)現(xiàn)相關的序列，如馬鈴薯葉甲、辣根猿葉甲、墨西哥豆胍蟲、棉鈴象甲、赤擬谷盜、桃蚜、褐飛虱、二化螟、小菜蛾和美洲蟋蟀。本發(fā)明使用的其它耙基因可包括例如在生存、生長、發(fā)育、繁殖和侵染性中扮演重要角色的基因。這些靼基因包括例如持家基因、轉錄因子和害蟲特異性基因或者在線蟲或果蠅中的致死敲除突變。本發(fā)明使用的乾基因還可以是來自另一些生物的基因，例如來自昆蟲或蛛形綱(例如，馬鈴薯葉甲屬、猿葉甲屬、食植胍蟲屬、花象屬、擬谷盜屬、瘤蚜屬、褐飛虱屬、禾草螟屬、戶/她〃fl屬或Jc/lCfl屬)。優(yōu)選的靼基因包括表1A中具體列出的基因以及來自另一些靶標生物(如來自另一些害蟲生物)的直系同源基因。在本發(fā)明的方法中，使用dsRNA抑制昆蟲生長或干擾昆蟲的致病性或侵染性。因此，本發(fā)明涉及包含退火互補鏈的分離的雙鏈RNA,其中一條鏈包含與昆蟲靼基因靶標核苷酸序列的至少一部分互補的核苷酸序列。所述靶基因可以是本文所述的任何把基因，或者發(fā)揮同樣功能的所述基因一部分。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了包含退火互補鏈的分離的雙鏈RNA，其中一條鏈包含與昆蟲耙基因核苷酸序列的至少一部分互補的核苷酸序列，其中所述耙基因包含選自以下的序列(i)與以下任意序列具有至少75。/。一致性的序列SEQIDNO1,3,5,7,9,",13,15,17,19,21,23,49至15B,159,柳-163,168,173,178,化3,188'193,198,203，208,215，220，225,230'247，249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,488，493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,581,586，591.596,601.603,605,607,609,621至767,768，773，778,783,788,793,795,797,7的，801,813至862,863,868,873,878,883,888,890,892'894，896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085'1087,1089,1091,1093,1095,化97，1099,1101,濯,"05,"07,1109,1111,"13,"61至1571,1572,1577,1582，1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,化27,1632,1637,1642、1647f1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688'1690,1692,1694,1696.1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070，2075,20&0,2085,2090,2095,2100,2102,2諷2106，2108,2120至2338,2339,2344，2349,2354,2359，2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，以及(ii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核普酸的序列SEQIDNOl、9,11,13，15,17,19，21,23,49至158'159，160-163，168,173,178,183,188,193,198,203,208，215,220'225,230,247,249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576，581，586,591，596,601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801,813至862,863,868,873,878,883,888,890,892，894,896,908至1040'化41，1046,1051,1056，1061,化71,1073,"I075'1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093，1095,1097,1099,1101,1103,1105,"07,"09,1111，1113，1161至1571,1572,1577,1582，1587'1592,1597，1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637、1642,1647,1652,1657,1662,1667，1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,化98'1700,1702,1704,1730至2039'2040'2045'2050,2D55,2060,2065,2070，2075,2080，2085，2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338，2339,2344,2349,2354,2359'2364,2366,2368,2370,2372,2384至24即，2461,2466,2471,2476或2481.或其互補序列，或者,其中所述昆蟲靼基因是包含以下任意序列至少17個連續(xù)核苷酸的基因的昆蟲直系同源物SEQIDN049至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460或其互補序列。取決于用于測量基因沉默的測定，與已用對照dsRNA處理的害蟲相比，生長抑制可被定量為大于約5%、10%，更優(yōu)選約20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%,最優(yōu)選約卯％、95%或約99%。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了分離的雙鏈RNA，其中至少一條所述退火互補鏈包含以下任意序列中至少一種核苷酸序列的RNA等價物SEQIDNOl、3、5、7,9,11,13,15，17,19'21,23,49至158,159'160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225.230,247，249,251,253,255,257,259.275至472,473,478,483,488,493,498,503,513,515.517,519,521，533至575,576,581'586,591,596，601'603,605,607,609,621至767,768,773'778'783,788,793,795,797，7的，801,813至挑2,863,868,873,878,883,888，890,892,894,896,908至1040,1041,1046,訓，化56,1061,化71,1073,1075,1077,1079，1081，1083,1085,1D87,1089.1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103，1105,1107，"09,1111,1113,1161至1571，1572,1577，1582,1587,1592,化97,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632，1637,1642,1647,1652'1S57,1662,1667,1672,1677，1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700，1702,1704,簡至2039，2040,2045,2050,2055,2060.2065,2070，2075,2080,2085,2090,2095,2100，2102,2104,2106.2108,2120至2338,2339'2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481，或者其中至少一條所述退火互補鏈包含長度為至少17個堿基對的片段的其RNA等價物，優(yōu)選其長度為至少18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個v^JJ^t。如果本發(fā)明的方法用于在宿主細胞或宿主生物中或者對宿主細胞或宿主生物進行特異性防治特定昆蟲的生長或侵害，則優(yōu)選雙鏈RNA不與任何宿主基因具有任何顯著的同源性，或者至少不與宿主的任意必需基因具有任何顯著的同源性。在本文中，優(yōu)選雙鏈RNA與宿主細胞任意基因的核酸序列一致性低于30%，更優(yōu)選低于20%,更優(yōu)選低于10%，甚至更優(yōu)選低于5%。序列一致性百分比應該跨越全長雙鏈RNA區(qū)域計算。如果可獲得宿主生物的基因組序列數(shù)據(jù)，則可以使用標準生物信息學工具來交叉校驗與雙鏈RNA的序列一致性。在一個實施方案中，dsRNA和宿主序列之間沒有超過21個連續(xù)核苷酸的序列一致性，這表明在本文中優(yōu)選dsRNA的21個連續(xù)>5^對不存在于宿主生物的基因組中。在另一實施方案中，dsRNA與宿主物種的任意核苷酸序列在超過24個連續(xù)核苷酸的長度上序列一致性低于約10%或低于約12.5%。所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一a包含對應于待下調(diào)耙基因靶標核苷酸序列的核苷酸序列。該雙鏈RNA的另一條漣能夠與所述第一"fr^a基配對。昆蟲靼基因的"靶區(qū)域"或"靶標核苷M列"可以是該基因的任何合適區(qū)域或核苷酸序列。所述靶區(qū)域應包含乾基因的至少17、至少18或至少19個連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選至少20或至少21個核苷酸，并且更優(yōu)選所述耙基因的至少22、23或24個核苷酸。優(yōu)選(至少部分的)所述雙鏈RNA與昆蟲靼基因的耙區(qū)域具有100%的序列一致性。然而應當理解的是，在全長雙鏈區(qū)域上具有100%的序列一致性不是功能性RNA抑制的必要條件。還發(fā)現(xiàn)相對于耙序列來說帶有插入、缺失和單點突變的RNA序列對RNA抑制是有效的。術語"對應于，，或"互補于"在本文可互換使用，并且當這些術語用于指雙鏈RNA和靼基因靶區(qū)域之間的序列對應性時，應理解為并非絕對需要100%的序列一致性。然而，雙鏈RNA和靼區(qū)域之間的序列一致性百分比通常為至少80%或85%—致，優(yōu)選至少卯。/。、95%、96%,或者更優(yōu)選至少97。/。、98%,更優(yōu)選至少99%。當兩條核酸鏈的g對至少85%—致時，它們是"基本上互補的"。本文使用的術語"互補的，，既代表DNA-DNA互補又代表DNA-RNA互補。類似地，術語"RNA等價物，，實際上指在DNA序列中威基"T，，可以被通常存在于核糖核酸中的對應4^"U"所替代。盡管dsRNA包含對應于耙基因靶區(qū)域的序列，然而整個dsRNA都對應于靶區(qū)域的序列卻不是絕對必需的。例如，所述dsRNA可包^^位于耙標特異性序列側翼的短的非靼序列，只要該序列不實質(zhì)性影響dsRNA在抑制RNA方面的性能即可。所述dsRNA可包含一種或多種替代>54^從而優(yōu)化RNAi的作用。對于本領域技術人員來說，如何依次改變dsRNA的每個堿基并測試所得dsRNA的活性(例如，在合適的體外測試系統(tǒng)中)從而優(yōu)化給定dsRNA的作用是顯而易見的。所述dsRNA還可以包含DNA堿基、非天然威基或非天然骨架連接或糖-磷酸骨架修飾，從而例如增強儲存期間的穩(wěn)定性或者增強對核酸酶降解的抗性。先前已有報道，對于有效的基因沉默來說,形成約21bp的短干擾RNA(siRNA)是理想的。然而，在申請人的各項應用中已顯示dsRNA的最小長度優(yōu)選至少約80-100bp以便于某些害蟲有效吸收。有跡象表明，在無脊推動物(如自由生活的秀麗隱桿線蟲或植物寄生的南方根結線蟲)中，這些較長的片段在基因沉默中更加有效，這可能由于無脊推動物攝取這些較長的dsRNA更為有效所致。最近還有提示認為，與常規(guī)的21聚體siRNA相比，由27聚體平端組成的合成RNA雙鏈體或者具有29bp莖和2-nt3，突出端的短發(fā)夾(shorthairpin，sh)RNA是RNA干擾的更強誘導物。因此，基于以上鑒定靼標并且作為27聚體平端或具有29bp莖和2-nt3，突出端的短發(fā)夾RNA的分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，在一個實施方案中，所述雙鏈RNA片段(或區(qū)域)本身的長度優(yōu)選為至少17bp，優(yōu)選長18或19bp,更優(yōu)選至少20bp，更優(yōu)選長至少21bp，或至少22bp，或至少23bp，或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp。"雙鏈RNA片段"或"雙鏈RNA區(qū)域"是指對應于(部分)靼基因的雙鏈RNA小實體。通常，所述雙鏈RNA優(yōu)選約17-1500bp，更優(yōu)選約80-1000bp，最優(yōu)選約17-27bp或約80-250bp;如雙鏈RNA區(qū)域約為17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、卯0bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或1500bp。雙鏈RNA長度的上限可能取決于i)昆蟲吸收dsRNA的需要，以及ii)dsRNA在細胞內(nèi)部加工成指導RNAi的片段的需要。所選長度還可受RNA合成方法和向細胞遞送RNA的模式的影響。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中所使用的雙鏈RNA的長度將小于10,000bp，更優(yōu)選1000bp或更小，更優(yōu)選500bp或更小，更優(yōu)選300bp或更小，更優(yōu)選100bp或更小。對于任何給定的耙基因和昆蟲來說，dsRNA進行有效抑制的最佳長度可通過實驗來測定。所述雙鏈RNA可以是完全或部分雙鏈。如果所述RNA仍能被昆蟲吸收并指導RNAi的話，則部分雙鏈RNA在雙鏈部分一端或兩端可包含短單鏈突出端。所述雙鏈RNA還可包含內(nèi)部非互補區(qū)。本發(fā)明的方法包括向同一昆蟲同時或依次提供兩種或更多種不同的雙鏈RNA或RNA構建體，從而實現(xiàn)下調(diào)或抑制多個耙基因或者更有效地抑制單個靼基因?；蛘?，所提供的命中多個靼序列的一種雙鏈RNA可命中多個靶標，并且多于一個拷貝的對應于耙基因的雙鏈RNA片段可更有效地抑制該單靶標。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述雙鏈RNA構建體包含多個dsRNA區(qū)域，每個dsRNA區(qū)域的至少一條鏈包含與昆蟲耙基因耙標核苷酸序列的至少一部分互補的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，所述RNA構建互補于來自相同或不同昆蟲物種的靶標。術語"命中"表明dsRNA的至少一條鏈互補于把基因或核苷酸序列并因此可以與之結合。在一個實施方案中，所述雙鏈RNA區(qū)域包含多拷貝的與乾基因互補的核苷酸序列?；蛘?，所述dsRNA命中同一耙基因的多于一種耙序列。因此，本發(fā)明包括分離的雙鏈RNA構建體，其包含至少兩拷貝的與昆蟲靶標的核苷酸序列至少一部分互補的所述核苷酸序列。在本文中，本發(fā)明的術語"多種(個)"意指至少2種(個)、至少3種(個)、至少4種(個)、至少5種(個)、至少6種(個)等。"又一乾基因，，或"至少一種其它耙基因，，指例如第二、第三或第四種耙基因等。在本發(fā)明的方法中開發(fā)和使用了命中多于一種上述靶標的dsRNA或者針對不同上述耙標的不同dsRNA的組合。因此，本發(fā)明涉及分離的雙鏈RNA構建體，其包含至少兩拷貝的以下至少一種核苷酸序列的RNA等價物SEQIDNO1,3,5,7,9,11,13,15，17.19,21,23,49至158,化9,160-163.化8,173,178,183,188>193,198'203,208,215,220,225,230,247,249,251,253,255，257,259,275至472,473,478,483'488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,581,586,591，596,601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,801,813至862,863，868，873,878,883,888,890，的2，894,896,908至1040，1041,1046,1051,1056,1061,1071，1073,1075,1077,1079,1081,1083，1085，1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101,"03,1105、"07,1109,"11,1113,湘至1571,1572,1577,1582,1587，1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642，1647,1652，1657,1662,1667'1672,1677，1682,1684，1686,1688，1690,1692,1694,1696,16981700,1702,1704,1730至2039'2040,2045,2050,2055,206Q,2065,2070,2075,20B0,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108，2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460，2461,2466,2471,2476或2481，或者其長度至少為17個>5^^,優(yōu)選其長度至少為18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個^JJt之片段的RNA等價物的至少兩個拷貝。優(yōu)選地，所述雙鏈RNA包含核苷酸序列SEQIDNO159或160的RNA等價物，或者其長度為至少17，優(yōu)選至少18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個>5^^的片段。在又一實施方案中，本發(fā)明涉及分離的雙鏈RNA構建體，其包含至少兩拷貝的核苷酸序列SEQIDNO159或160的RNA等價物。因此，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互補鏈，其中一條鏈包含與昆蟲耙基因靶標核苷酸序列的至少一部分互補的核苷酸序列，并且其包含彼此獨立選擇的至少兩種核苷酸序列的RNA等價物。在一個實施方案中，所述dsRNA包含獨立選自以下序列的至少兩種，優(yōu)選至少三種、四種或五種核苷酸序列的RNA等價物SEQ1DNO1,3,5,7,9,11，13'15,17,19,21,23,49至158,159,160-163,168,173，178.183,188,193,198,203,208,215,220,225,230，247,249，251,253,255,257,259，275至472,473,478,483，488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,5&1，586,591,596,601,603，605,607,609'621至767,768,773,778，783,788.793,795,797，799，801,813至862,863,868，873,878，883,888,890,892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1071，1073，1075,1077，1079，1081,1083,1085,10&7，1089,1091,1093,1095,1097,1099,"01,1103,1105,1107,1109,1111,1113,1161至1571,1572，1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642，1647,1652,1657,1662，1667、1672,1677,1682,1684'1686'1688,1690,1692,1694,化96,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040，2045,2050,2D55,2060,2065，2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104，2106,2108，2120至2338，2339,2344,2349'2354,2359,2364,2366,2368，2370,2372,2384至2460，2461,2466,2471,2476或2481，或者其長度為至少17個g對的片段，優(yōu)選其長度為至少18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個^aiJt的片段。所述至少兩種核苷酸序列可以來源于本文所述的靶基因。才艮據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述dsRNA命中至少一種對于昆蟲生存、生長、發(fā)育或繁殖是必需的耙基因，并且命中至少一種涉及上文所述的致病性或侵染性的基因。或者，所述dsRNA命中屬于同一種類的多種基因，例如所述dsRNA命中至少兩種必需基因或至少兩種參與同一細胞功能的基因。根據(jù)又一實施方案，所述dsRNA命中至少兩種乾基因，該耙基因涉及不同的細胞功能。例如，所述dsRNA命中參與蛋白質(zhì)合成(例如核糖體亞基)、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸、細胞核mRNA剪接或參與表1A中所述功能之一的兩種或更多種基因。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述昆蟲靼基因包含選自以下的序列(i)與以下任意序列具有至少75。/。一致性的序列SEQIDNO1，3,5,7,9,11,13,15，17,19,21,23,49至158,159,化0-163，1幼，173,178,183,188,193，1明，203,208,215,220,225'230,247,249,251,253,255,257，259,275至472'473,478,483'488,493,498,503,513，515,517,519,521，533至575,576，581,586,591,596，601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788,793,795,7S7,7的，801,813至862,863，868,873,878,883,888,890,的2,894，896，908至1040,1041,1046,1051,1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079，1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,，，1風"05,"07,"09,"",1113,1161至1571,1572.1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632，1637，1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700，1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100'2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339，2344,2349，2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461，2466.2471,2476或2481,或其互補序列，以及(ii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNOl、3、5、7、9,11，13，15,17,19,21，23，49至158,159,160.163,168,173,178,183,188，193,198,203,208,215，220,225，230.247,249,251'253,255，257,259,275至472,473,478,483,4幼，493，498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,581,586,591,596,601,603,605,607,609,621至767，768,773，778,783,788,793,795,797,799，801,813至862,863,868,873,878，883,888,890,的2，894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1071,1073，1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087'1089,1091,1093,1095，1097,1099,1101,1103,1105'1107,1109,1111,"13,"61至1571,1572,1577,1582，1587,1592,1597,1602,1607，1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642，1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700，1702,1704'1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060'2065,2070,2075,2080，2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106、2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354，2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461，2466,2471,2476或2481，或其互補序列，或者其中所述昆蟲耙基因是包含以下任意序列中至少17個連續(xù)核苷酸的基因的昆蟲直系同源物SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460或其互補序列。所述雙鏈RNA中的dsRNA區(qū)域(或片段)可如下進行組合a)當組合耙向單個靼基因的多個dsRNA區(qū)域時，在RNA構建體中可以以原始的順序(即，該區(qū)域在耙基因中出現(xiàn)的順序)對它們進行組合，b)或者，可以不管所述片段的原始順序如何，將它們隨機或有意地以任何順序組合成雙鏈RNA構建體，c)或者，單個片段可以在所述dsRNA構建體中重復若干次，例如1~10次，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或者d)所述dsRNA區(qū)域(靶向單個或不同的靶基因)可以以有義或反義的方向進行組合。另外，所述待組合的乾基因可選自一種或多種如下類型的基因e)上述的"必需"基因或"致病性基因"包括對于一種或多種靶標昆蟲來說很關鍵，并且被沉默時導致致死或嚴重的(例如，進食、繁殖、生長)表型的基因。選擇強致死乾基因?qū)е掠行У腞NAi作用。在本發(fā)明的RNA構建體中，耙向相同或不同(非常有效的)致死基因的多個dsRNA區(qū)域可以進行組合以進一步增強RNAi作用在防治害蟲中的效力、功效或速度。f)"弱，，基因包括在本文所述的細胞途徑之一中具有特別關注的功能，但是當其被單獨沉默時導致弱的表型作用的靼基因。在本發(fā)明的RNA構建體中，靼向單個或不同的弱基因的多個dsRNA區(qū)域可以進行組合從而獲得更強的RNAi作用。g)"昆蟲特異性"基因包括在非昆蟲生物中沒有顯著的同源性對應物的基因，其可以通過生物信息同源性搜索進行測定，例如通過BLAST搜索。選擇昆蟲特異性乾基因使得RNAi作用具有物種特異性，而在非靶標生物中沒有作用或沒有顯著的(有害)作用。h)"保守基因，，包括在靶標生物和非靶標生物之間(在氨基酸水平)保守的基因。為了降低對于非靶標物種的可能的作用，分析這些有效但保守的基因，并且選擇來自這些保守基因可變區(qū)域的靼序列被RNA構建體中的dsRNA區(qū)域所靶向。此時，在核酸序列水平上評估保守性。因此，在核酸序列水平上，這些可變區(qū)域包含保守乾基因中的最不保守部分。i)"保守途徑，，基因包括參與同樣生物學途徑或細胞過程的基因，或者包括在不同昆蟲物種中具有相同功能的基因，其導致特異性且有效的RNAi作用并更有效地防治昆蟲；j)或者，本發(fā)明的RNA構建體靶向多個來自不同生物學途徑的基因，其導致更廣泛的細胞RNAi作用并更有效地防治害蟲。根據(jù)本發(fā)明，所有雙鏈RNA區(qū)域包含至少一條與本文所述任何耙基因至少一部分核苷酸序列互補的鏈。然而，如果其中一個雙鏈RNA區(qū)域包含至少一條與本文所述任一乾基因的核苷酸序列一部分互補的鏈，則其它雙鏈RNA區(qū)域可包含至少一條與任何其它昆蟲耙基因(包括已知的靶基因)的一部分互補的鏈。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了本文所述的分離的雙鏈RNA或RNA構建體，其還包含至少一種附加序列以及任選地包含接頭。在一個實施方案中，所述附加序列選自(i)有利于大,生產(chǎn)dsRNA構建體的序列；(ii)導致所述dsRNA穩(wěn)定性增加和降低的序列；(iii)允許蛋白質(zhì)或其它分子的結合從而有利于昆蟲吸收所述RNA構建體的序列；(iv)適體序列Uptamer)，其結合昆蟲表面上或細胞質(zhì)中的受體或分子，從而有利于昆蟲的攝取、M和/或轉胞吞；或者(v)催化dsRNA區(qū)域加工的其它序列。在一個實施方案中，所述接頭是條件性自切割RNA序列，優(yōu)選pH敏感性接頭或疏7JC敏感性接頭。在一個實施方案中，所述接頭是內(nèi)含子。在一個實施方案中，所述雙鏈RNA構建體的多個dsRNA區(qū)域通過一個或多個接頭進行連接。在另一實施方案中，所述接頭存在于RNA構建體中的某位點，其將所述dsRNA區(qū)域與另一目的區(qū)域分隔開。本發(fā)明提供了dsRNA構建體的不同接頭類型。在另一實施方案中，所述雙鏈RNA構建體的多個dsRNA區(qū)域在不使用接頭的情況下連接。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述接頭可用于在害蟲中拆分成多個較小的dsRNA區(qū)域。有利的是，在此情況下，所述接頭序列可以在特定的條件下促使將長的dsRNA分成較小的dsRNA區(qū)域，這導致在這些條件下釋放出分開的dsRNA區(qū)域并通過這些較小dsRNA區(qū)域?qū)е赂行У幕虺聊?。適當?shù)臈l件性自切割接頭的實例是在高pH條件下自切割的RNA序列。這些RNA序列的適當實例由Borda等(NucleicAcidsRes.2003May15;31(10):2595-600)描述，該文獻通過參考并入本文中。這些序列源于錘頭核酶HH16的催化核心。在本發(fā)明的另一方面，接頭定位于RNA構建體中的位點，這使得dsRNA區(qū)域與另一(例如其它的)目的序列分隔，所述另一序列優(yōu)選地向所述RNA構建體提供了某種另外的功能。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的dsRNA構建體具有適體從而有利于昆蟲攝取該dsRNA。設計所述適體使之結合被昆蟲所吸收的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)可以來自昆蟲或植物。一個具體的適體實例是結合跨膜蛋白(例如，昆蟲的跨膜蛋白)的適體?；蛘撸鲞m體可以結合昆蟲吸收的(植物)代謝物或營養(yǎng)物。或者，所述接頭在內(nèi)涵體中進行自我切割。這在本發(fā)明的構建體通過胞吞作用或轉胞吞作用被昆蟲吸收并因此在昆蟲的內(nèi)涵體中被區(qū)室化時可能是有利的。所述內(nèi)涵體可以具有低pH環(huán)境，導致所述接頭的切割。當用于經(jīng)由細胞壁轉運從一個細胞轉運到另一個細胞時，例如當穿過害蟲細胞壁時，在疏水條件中自切割的上述接頭對于本發(fā)明的dsRNA構建體尤其有用。內(nèi)含子也可用作接頭。本文使用的"內(nèi)含子"可以是信使RNA的任何非編碼RNA序列。用于本發(fā)明的構建體的特別適合的內(nèi)含子序列為(1)富含U(35-45%);(2)平均長度為lOObp(在約50和約500bp之間變化)，可隨機選擇其^對或者可以基于已知的內(nèi)含子序列；(3)在5，端以-AG:GT-或-CG:GT-起始，和/或(4)在其3'端為-AG:GC-或-AG:AA。非互補的RNA序列(約1個^^JJt至約10,000個v4i^)也可用作接頭。不希望拘泥于任何具體的理論或機制，人們認為昆蟲從其直接環(huán)境吸收長的雙鏈RNA。然后，吸收iiAJ^道并轉移至腸上皮細胞的雙鏈RNARNA(siRNA))。然后，得到的siRNA通過形成多組分的RNA酶復合物(稱為RISC或RNA干擾性沉默復合物)來介導RNAi。為了實現(xiàn)在昆蟲細胞內(nèi)下調(diào)耙基因，加至細胞壁外部的雙鏈RNA可以是任何可被吸收進入細胞然后在細胞內(nèi)加工成siRNA的dsRNA或dsRNA構建體，然后所述siRNA介導RNAi，或者加至細胞外部的RNA可以本身是可被吸收進入細胞并由此指導RNAi的siRNA。siRNA通常是短的雙鏈RNA，其長度范圍為19~25個4^jj寸，或20~24個>5^對。在一些優(yōu)選的實施方案中，可使用對應于待下調(diào)耙基因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、24或25個>^對，尤其是21或22個;i^對。然而，本發(fā)明不意在限于這些siRNA的用途。siRNA可以在雙鏈部分兩側的一端或兩端包含單鏈突出端。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述siRNA可包含3，突出的核苷酸，優(yōu)選兩個3，突出的胸苷(dTdT)或尿苷(UU)。如果緊接所述dsRNA雙鏈部分所包含序列上游的耙基因序列是AA，則在siRNA中可包含3，TT或UU突出端。這使得siRNA中的突出端TT或UU與靼基因雜交。盡管所述siRNA的另一端也可包含3，TT或UU突出端，然而所述siRNA雙鏈部分所包含序列的下游靼序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA嵌合體形式的siRNA也涵蓋其中。這些嵌合體包括這樣的siRNA,其中包含帶有3，0人>5^突出端(例如，dTdT)的雙鏈RNA(如上所述)，以及其中一個或多個RNA堿基或核糖核苷酸、或者甚至整條鏈上所有的核糖核苷酸被替換為DNA堿基或脫氧核糖核普酸的多核苷酸形式的雙鏈RNA。所述dsRNA可由通過(非共價)堿基配對一起退火的兩個獨立的(有義和反義)RNA鏈形成。或者，所述dsRNA可具有折回的莖-環(huán)或發(fā)夾結構，其中所述dsRNA的兩條退火鏈是共價連接的。在該實施方案中，所述dsRNA的有義和反義鏈由部分自我互補的單個多核苷酸分子的不同區(qū)域形成。如果dsRNA欲通過體內(nèi)表達(例如如下所述在宿主細胞或生物中)或通過體外轉錄進行合成，則具有該結構的RNA是適宜的。除了不應該削弱所述分子的雙鏈部分介導RNAi的能力以外，連接兩條RNA鏈的"環(huán)"的精確性質(zhì)和序列通常對于本發(fā)明不重要。用于RNAi中的"發(fā)夾"或"莖-環(huán)"RNA的特征通常是本領域已知的(參見，例如CSIRO名下的WO99/53050，其內(nèi)容通過參考并入本文中)。在本發(fā)明的另一些實施方案中，所述環(huán)結構可以包^^接頭序列或如上所述的另一些序列。本發(fā)明的另一方面是本文公開的昆蟲耙基因的靶標核苷酸序列。所述耙標核苷酸序列對于設計本發(fā)明的dsRNA構建體尤其重要。這些把標核苷酸序列的長度優(yōu)選至少17,優(yōu)選至少18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個核苷酸。優(yōu)選靼標核苷酸序列的非限制性實例在實施例中給出。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了編碼如上所述的雙鏈RNA或雙鏈RNA構建體的分離的核苷,列。才艮據(jù)一個更具體的實施方案，本發(fā)明涉及由以下任意序列組成的分離的核酸序列SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460,或者其至少17，優(yōu)選至少18、19、20或21,更優(yōu)選至少22、23或24個核苷酸的片段。本領域技術人員能夠認識到，也可以找到這些耙基因的同源物并且這些同源物也可用于;^發(fā)明的方法。如果蛋白質(zhì)或核苷酸序列顯示"顯著"水平的序列相似性或更優(yōu)選地序列一致性，則它們可能是同源的。真正同源的序列通過從共同的祖先基因趨異從而具有相關性。序列同源物可以有兩種類型(i)當同源物存在于不同物種中時，它們被稱為直系同源物(orthologue)。例如，小鼠和人中的a-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物(paralogue)是在一個物種內(nèi)部的同源基因，例如小鼠中的a-和P-珠蛋白基因是旁系同源物。優(yōu)選的同源物是包含與選自以下的序列具有至少約85%或87.5%，更優(yōu)選約卯％，更優(yōu)選至少約95%以及最優(yōu)選至少約99%—致性的基因SEQIDNO1，3,5,7,9,11,13,15,17，19,21'23,49至158,159,160-163,168,173,178，183,188,193,198,203，208,215,220.225,230,247'249、251，253，255,257,259,275至472,473,478,483，488,493,498,503>513,515,517,519,521,533至575,576,581,586,591.596,601,603,605，607,609，621至767,768,773,778,783,788,7的，795,797,799,801.813至862,863，868,873,B78,883,B88,890,892,的4'B96,恥8至"1040,化41,1046,1051,1056,1061,1071，1073,1075，1077'1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091，1093,化的，1097,1099,11D1,1103.1105'1107,"09,11",1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597，1602,1607,1612'1617,1622,1627'1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080'2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106，2108,2120至2338，2339，2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2線2471,2476或2481，或其互補序列。用于測定序列一致性的方法是本領域常規(guī)技術，其包括使用Blast軟件和五MSOS^軟件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)，Rice.P.Longden，I.andBleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276-277)。本文使用的術語"一致性"是指多個序列在核苷酸水平上的關系。通過使用比較窗對最優(yōu)比對的序列(例如，兩條或更多)進行比較來確定"一致性百分比"，其中比較窗中的序列部分與用于最優(yōu)序列比對的參考序列相比可包含插入或缺失。所述參考序列不包含插入或缺失。所述參考窗選自至少10個連續(xù)的核苷酸至約50、約100或者至約150個核苷酸，優(yōu)選在約50和150個核苷酸之間。然后，通過測定所述窗中序列之間一致的核苷酸數(shù)并將一致的核苷酸數(shù)除以所述窗中的核普酸數(shù)并乘以100來計算"一致性百分比"。另一些同源物是包含以下任意序列之基因的等位基因SEQIDNO1,3,5,7，9,",13,15，17,19，21,23,49至158,159,160-163,168，173,178，183，188,193，198,203,208,215,220,225'230,247、249,251,253,255,257，259,275至472,473，478,483,488,493,498,503,513,515,517'519,521,533至575,576,581,586,591,596,601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788,793,795,797,799，801，813至862,863.868,873，878,883,888，890,的2,894,896,90&至1040,10",1046,1051,1056，1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,"07,1109,11",1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602，1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1明7,1672,1677,1682,1684'1686.1688,16恥，1692,1694,1696'1698,1700,1702,1704,1730至2039'2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2化0,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339，2344'2349，2354.2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481。另一些優(yōu)選的同源物是與包含以下任意序列的基因相比包含至少一個單核普酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNIP)的基因SEQIDNO1,3,5,7，9,11,13,15,17,19,21,23,49至158,159,化0-163,168,173,178,183,188,193,198,203，208,215,220,225,230,247,249,251，253,255.257,259'275至472,473，478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576.581,586,591,596,601,603,605,607,609,621至767，768,773,778,783,788,793,795'797,799,813至862,863,868,873,878,8&3,838,的O,892,894,896,908至1040,1041，1046,1051,1056,1061.1071,1073,1075，1077,1079,10B1,1083,1085，1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,"07,1109,11","13,1161至1571,1572.1577，1582,1587,1592,1597，1602,1607,1612,1617,1622,1627，1632'1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,化86,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045，2050,2055,2060,2065，2070,2075,2080,2085,2090,2095，2100,2102，2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366'2368,2370,2372,2384至2460，2461,2466,2471,2476或2481.根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明包括包含以下任意核香^列的基因的昆蟲直系同源物靼基因SEQIDNO1,3.5,7,9,11,13,15,17，19,21,23,49至158，159,"160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208.215,220,225,230,247，249,251,253,255,257,259,275至472'473，478,483,4幼，493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,581,586,591，596,601,603,605,607,609,621至767,76B，773,778，783，788,793,795,797，799,801,813至862,863,868,873,878,883，888,890,892,894,B96,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061，1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097，1099,"01,"03，"05,1107,1109'1111,1113，1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597'1602,"I607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686，1688,1690,1692,1694，1696.1698,1700,1702,，704'1730至2039,2040,2045，2050,2055,2060.2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372，2384至2460，2461，2466,2471,2476或2481。舉例來說，直系同源物可包括以下任意核苷^f列SEQIDNO49至123、275至434、533至562、621至738、813至852、卯8至1010、1161至1437、1730至1987、2120至2290和2384至2438，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸的片段。表4中給出包含本發(fā)明序列之一的至少一個17bp片段的昆蟲或蛛形綱直系同源物基因或序列的非限制性列表。根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明包括包含以下任意核苷酸序列的基因的線蟲直系同源物耙基因1、3、5,7,9,11,13,15.17,19,21,23,49至158,159,160-163,168,173,178,"183,188,193,198,203,208,215，220，225,230,247，249,251,253'255,257,259,275至472,473,478,483,488,493498,503,513，515'517,519,521,533至575,576，581,586,591,596'601,603,6D5,607,609,621至767,768，773,778，783,788,793,795,797,799,801,813至862,863,868,873,878,883,888,890,892,894，896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1071,1073'1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101."03,1105'1107,1109,1111,1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,化12'1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,化52,1657,1662,1667,1672,1677，1682,1684,化86,1688,1690,1692,1694,1696,1698，1700'1702,1704,1730至2039,2040，2045,2050，2055,2060,2065,2070，2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366，2368,2370'2372,2384至2460,2461，2466,2471,2476或248。舉例來說，線蟲直系同源物可包含以下任意核苷酸序列SEQIDNO124至135、435至446、563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或2440，或者其至少17、18、19、20或21個核苷酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明因此包括本文所述的用于防治線蟲在生物中生長或者用于防止線蟲侵害對線蟲侵染敏感的生物的任何方法，該方法包括使線蟲細胞與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條鏈具有與包含以下任意序列的至少17、18、19、20或21個核苷酸之片段的耙基因核苷^f列之至少一部分互補的核苷酸序列SEQIDNO124至135、435至446、563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或2440，所述雙鏈RNA被線蟲吸收并因此防治生長或防止侵害。本發(fā)明還涉及包含以下任意序列的至少17、18、19、20或21個核普酸之片段的線蟲抗性轉基因植物SEQIDNO124至135、435至446、563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或2440。表5中給出包含本發(fā)明序列之一的至少一個17bp片段的線蟲直系同源物基因或序列的非限制性列表。根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明包括包含以下任意核苷酸序列的基因的真菌直系同源物耙基因1，3,5,79,11,13，15,17,19'21,23,49至158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208，215，220,225,230,247,249,251,253,255，257,259,275至472,473,478，483,488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,5B1,5郎，591,5恥，601,603,605,607,609,621至767,768.773,778,783'788，793,795,797,799,801,813至862，863,86B,873,878,883,888,890,892,894，896,908至1040,1041,1046,1051.1056,1061，1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087'1089,1091，1093、1095,1097,1099,1101,"03,"05,"07,1109,1111,1113，1161至1571.1572,1577'1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622'1627,1632,1637,1642,化47,1652,1657，1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702，1704,1730至2039,2040,2045，2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106，2108,2120至2338，2339.2344.2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2鄰0,2461,2466，2471.2476或2481。舉例來說，真菌直系同源物可包含以下任意核普酸序列SEQIDNO136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460,或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸的片段。根據(jù)另一方面，本發(fā)明因此包括本文所述的用于防治真菌在細胞或生物上生長或者用于防止真菌侵害對真菌感染敏感的細胞或生物的任何方法，該方法包括將真菌細胞與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條鏈包含與包含以下任意序列的至少17、18、19、20或21個核苷酸之片段的耙基因核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列SEQIDNO136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460，所述雙鏈RNA被真菌吸收并因此防治生長或防止侵害。本發(fā)明還涉及包含以下任意序列的至少17、18、19、20或21個核苷酸之片段的真菌抗性轉基因植物SEQIDNO136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460。表6中給出包含本發(fā)明序列之一的至少一個17bp片段的真菌直系同源物基因或序列的非限制性列表。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述dsRNA可通過宿主細胞或宿主生物表達(例如，在其中進行轉錄)，所述宿主細胞或生物是對昆蟲侵:害敏感或易受其攻擊的生物。在該實施方案中，RNAi介導的昆蟲中一種或多種靶基因的基因沉默可用作防治宿主生物中或宿主生物上生長的昆蟲和/或防止或降低昆蟲侵害所述宿主生物的機制。因此，在宿主生物的細胞內(nèi)表達所述雙鏈RNA可賦予對特定昆蟲或者一類昆蟲的抗性。如果所述dsRNA命中多于一種昆蟲粑基因，則所述雙鏈RNA在宿主生物細胞內(nèi)的表達可賦予對多于一種昆蟲或者多于一類昆蟲的抗性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述宿主生物是植物，所述昆蟲是植物病原性昆蟲。在該實施方案中，通過在植物或植物細胞中表達雙鏈RNA而使所述昆蟲與雙鏈RNA接觸，所述植物或植物細胞被所述植物病原性昆蟲侵害或?qū)υ撉趾γ舾?。在本文中，術語"植物"包括期望對其進行處理從而防止或降低昆蟲生長和/或昆蟲侵害的任何植物材料。這包括整#物、幼苗、增殖或繁殖材料(如種子、插條、接穗、外植體等)等以及植物細胞和組織培養(yǎng)物。所述植物材料應該表達或者有能力表達對應于所述昆蟲一種或多種乾基因的dsRNA。因此在另一方面，本發(fā)明提供了表達或能夠表達至少一種雙鏈RNA的植物(優(yōu)選轉基因植物)或(轉基因)植物的增殖或繁殖材料或植物細胞培養(yǎng)物，其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一條鏈具有與昆蟲耙基因靶標核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列，從而所述雙鏈RNA通過植物-昆蟲的相互作用被昆蟲吸收，所述雙鏈RNA能夠通過RNA干擾抑制所述把基因或者下調(diào)所述乾基因的表達。所述把基因可以是本文所述的任何乾基因，例如對昆蟲的生存、生長、發(fā)育或繁殖必需的耙基因。在該實施方案中，所述昆蟲可以是任何昆蟲，然而優(yōu)選植物病原性昆蟲。優(yōu)選的植物病原性昆蟲包括但不限于以上所列出的昆蟲。本發(fā)明的方法中使用的植物或者本發(fā)明的轉基因植物包括任何植物，然而優(yōu)選對植物病原性昆蟲侵害敏感的植物。因此，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述植物選自以下植物(或作物)苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、、油梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、青花菜、抱子甘藍、巻心菜、卡諾拉油菜(caiiola)、胡蘿卜、木薯、花椰菜、谷類(acereal)、芽菜、櫻桃、柑桔、克萊蒙汀小柑橘(clemintine)、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、桉樹、無花果、葡萄、葡萄柚、花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、萊姆酸橙、松樹、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麥(mitaot)、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐芽、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、大豆(soy)、大豆(soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、橘子、茶樹、煙草、番茄、藤本植物、西瓜、小麥、山藥以及密生西葫聲。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述植物是馬鈴薯，所述靼基因是來自選自下列的昆蟲的基因馬鈴薯葉甲屬(例如，馬鈴薯葉甲、偽馬鈴薯葉甲或丄.、合爪負泥蟲屬(例如，三條負泥蟲)、茄跳甲屬(例如，美國馬鈴薯跳曱或塊莖跳甲)、豆芫菁屬(例如，北美豆芫菁)、猿葉甲屬(例如，辣根猿葉曱)、綠小葉蟬屬(例如，蠶豆小綠葉蟬)、瘤蜂屬(例如，桃蜂)、薯個木虱屬(例如，馬鈴薯木虱)、桿野螟屬(例如，玉米螟)、Omo^nisspp.(例如，C./fl肌或CVM/7eW/s)和麥蛾屬(例如，馬鈴薯麥蛾)；j另一實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述植物是番茄，所述靼基因是來自選自下列的昆蟲的基因長管奸屬(例如，大戟長管蚜)、瘤蜂屬(例如，桃辨)，結翅粉虱屬(例如，溫室粉虱或結翅粉虱)、小粉虱屬(例如，銀葉粉虱)、花薊馬屬(例如，西方花薊馬)、馬鈴薯葉甲屬(例如，馬鈴薯葉曱、偽馬鈴薯葉甲或Z.teJCfl"fl)、茄跳甲屬(例如，煙草跳甲)、草盲椿屬(例如，美國牧草盲蝽或丄./r^^n/s)、美洲蝽屬(例如，斑點美洲蝽)、綠棒屬(例如，稻綠蝽)、77!""似spp.(例如，r./^///^v/rews)、麥蛾屬(例如，馬鈴薯麥蛾)、HW/cm^pflspp.(例如，谷實夜蛾)、i"y^/"spp.(例如，LfyC0/7^W'"http://fl)、灰翅夜蛾屬(例如，甜菜夜蛾或又/7ni^Cfl)、丄/附ow/"sspp.(搶轉血矛線蟲)、地虎屬(例如,小地老虎)、spp.(例如，煙草天蛾或番茄天蛾)、斑潛蠅屬(例如，蔬菜斑潛蠅(LS^VM)、三葉草斑潛錄(￡.加yi肌)或南美斑潛錄(丄./m,V/Wre/is/s))和薯個木虱屬(例如，馬鈴薯木虱)；在另一實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述植物是玉米，所述耙基因是來自選自下列的昆蟲的基因D/Mn^/aispp.(例如，玉米才艮葉甲、巴氏根葉甲、黃瓜十一星葉甲、2).v/^(^mze"e、2X^/^i似)、桿野螟屬(例如，玉米螟)、地虎屬(例如，小地老虎)、Ke/Zonw/mspp.(例如，谷實夜蛾)、灰翅夜蛾屬(例如，草地貪夜蛾)、D/^meflspp.(例如，西南玉米桿草螟或小蔗螟)、E/"s附opa/pwsspp.(例如，南美玉米苗斑螟)、梳爪叩頭蟲屬(掄轉血矛線蟲)、圓頭犀金龜屬(例如，C./附/fi"cw/flto)、弧麗金龜屬(例如，日本弧麗金龜)、跳甲屬(例如，玉米銅色跳甲)、龍頸象屬(例如，玉米長味象)、縊管辨屬(例如，玉米辨)、圓尾椅屬(例如，A附"/J/rarf/"、)、桿長蝽屬(例如，美洲谷桿長蝽)、黑蝗屬(例如，紅足黑蝗、遷飛黑蝗)、種蠅屬(例如，種蠅)、潛蠅屬(例如，A戸n^ww/s)、呆薊馬屬(例如，黃呆莉馬)、iSV/e/io/w/sspp.(侈'J如,X.)和葉螨屬(T^^Ymyc/iwsspp.)(例如，二點葉螨(z:虹,/c"e);在另一實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述植物是棉花，所述耙基因是來自選自下列的昆蟲的基因He//cov^*/7flspp.(例如，谷實夜蛾)、i^"/"o^/^mspp.(例如，紅鈴麥蛾)、J^/Zcmwp"spp.(例如，棉鈴蟲)、金剛鉆屬(例如，翠故鉆夜蛾)、實夜蛾屬(例如，煙芽夜蛾)、灰翅夜蛾屬(例如，甜菜夜蛾)、花象屬(例如，棉鈴象甲)、/^^^""附0^/&spp.(例如，棉偽斑腿盲蝽)、結翅粉虱屬(例如，結翅粉虱、溫室粉虱)、小粉虱屬(例如，銀葉粉虱)、奸屬(例如，棉圻)、草盲蝽屬(例如，美國牧草盲蝽或丄.力m/7erws)、美洲棒屬(例如，斑點美洲棒)、C7r/owc/iw"spp.(例如，賽氏蝽)、綠蝽屬(例如，稻綠蝽)、薊馬屬(例如，煙薊馬)、花薊馬屬(例如，煙褐薊馬或西方花薊馬)、黑蝗屬(例如，紅足黑蝗、特異黑蝗)和葉螨屬(例如，朱妙、葉螨或二點葉螨)；在另一實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中所述植物是稻，靼基因是來自選自下列的昆蟲的基因褐飛虱屬(例如，褐飛虱)、灰飛亂屬(例如，灰飛虱)、黑尾葉蟬屬(例如，二點黑尾葉蟬，或黑尾葉蟬或二條黑尾葉蟬)、白背飛虱屬(例如，白背飛虱)、桿長蝽屬(例如，美洲谷桿長蝽)、黑蝽屬(例如，&Mf7mV/M/fl&)、綠蝽屬(例如，擬綠蝽)、稻弄蝶屬(例如，直紋稻弄蝶)、禾草螟屬(例如，二化螟、臺灣稻螟或C戸/k/"^"s)、禾草螟屬(例如，c./^(v"o^fl)、蛀莖夜蛾屬(例如，稻蛀莖夜蛾)、蛀禾螟屬(例如，r.//im似to)、蛀禾螟屬(例如，三化螟)、縱巻葉野螟屬(例如，稻縱巻葉野螟)、潛蠅屬(例如，日本稻潛蠅)、"/fl&fle"spp.(例如，小蔗螟)、iV腦，spp.(例如，7V:"^jmc)、黃夜蛾屬(例如，犁紋黃夜蛾)、灰翅夜蛾屬(例如，草地貪夜蛾)、秘夜蛾屬(例如，「i^M^l/Wfl)S^peffl似)、Spp.(例如，谷實夜蛾)、CWfls/7/sspp.(例如，C6ra"/iM)、稻水象屬(例如，稻水象甲)、稻象屬(例如,稻象)、D/c/orf/s/7flspp.(例如，D.w附/g^"")、^^負泥蟲屬(例如，水稻負泥蟲)、米象屬(57似/7/w7wsspp.)(例如，米象(51.oo^m))、戶flc/^^^wZsspp.(例如，稻癭蚊)、水蠅屬(例如，麥葉毛眼水蝸)、CMw"/wspp.(例如，稻桿潛蠅)和水蠅屬(例如，日稻毛眼水錄)。本發(fā)明的轉基因植物延及所有如上具體所述的植物種類，其對各自如上具體所述的昆蟲物種有抗性。優(yōu)選的轉基因植物(或者轉基因植物的繁殖或增殖材料，或者培養(yǎng)的轉基因植物細胞)是包含選自以下核酸序列的植物(或者轉基因植物的繁殖或增殖材料，或者培養(yǎng)的轉基因植物細胞)(i)與以下任何序列具有至少75%—致性的序列SEQIDNO1,3'5,7,9,11,13,15,17,19，21,23,49至158'159,16CM63,168,173,178,183'188,193,198,203,208,215,220,225,230'247,249,251,253,255'257,259,275至472,473,478,483,488，493,498,503,513,515,517,519,521'533至575,576,581,586,591,596,601,603,605'607,609，621至767,768,773'778,783,788,793'795,797,799,8D1.813至B62,868,873,878,883,888,890,892,894,8挑，9D8至1040,1041,1046,1051,1056,1061，1071,1073,1D75,1077,1079,1081,1083,1085，1087,1089,1091,1093，1095,1097，1099,1101,1103,1105，1107，1109,1111,1113,"61至1571,1572,1577，1582,1587,1592，1597，1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647，1652,1657,1662,1667,1672,1677，1682,1684，1686，1688，1690'1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050.2055，2060'2065,2070，2075,2080,2085，2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460'2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列,以及(ii)包含以下任何序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDN01、3、5、7、9,11，13,15,17,19'21，23,49至158,159,160-163,168,173,178'183，188,193,198,203,208,215,220,225'230，247,249,251,253，255，257,259,275至472,473,478,483，488,493,498,503,513，515,517,519,521,533至575,576,581，586,591,596,601,603,605,607,609,621至767,768，773,778,783,788,793,795,797,799,801，813至862,863,868，873,878,883,888，890,892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056，1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109,"11，1113,1161至1571,1572,1577,1582，1587，1592,1597,1602,1607,1612，1617,1622,1627,1632,1637'1642，1647，1652,1657,1662,1667，1672,1677,1682，1684,1686,1688,1690,1692，1694,1明6，1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040，2045,2050，2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100，2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，或者其中所述核^A包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的昆蟲直系同源物SEQIDN049至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互補序列。本發(fā)明還包括表達或能夠表達至少一種本發(fā)明核苷酸的植物(或者轉基因植物的殖或增殖材料，或者培養(yǎng)的轉基因植物細胞)，所述至少一種本發(fā)明核苷酸例如至少一種以下任意核苷酸序列SEQIDNO1,3'5,7,9,11，13，15，17,19，21'23,49至158,159,16諸3,湖，"3,，78，183,188,193,198,203,208,215，220,225，230,240至247，249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,488，493,498,503,508至513,5化，517，519.521,533至575,576,581,586,591,5挑，601，603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788,793,795,797,799，801,813至862，863,868，873,878,883,888,890,892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1066至1071'1073，1075,1077,1079，1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109,11"，"13,1161至1571,1572,1577'1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652.1657,1662,1667,1672，1677,1682,1684,1686,1688'1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702，1704,1730至2039,2040,2045,2050，2055，2060,2065,2070,2075，2080,2085,2090，2095,2100,2102,2化4，2106,2108，2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476,2481或2486,或其互補序列，或者包括包含其至少17，優(yōu)選至少18、19、20或21，更優(yōu)選至少22、23或24個核苷酸的片段。所述植物可以以下述形式提供，其中它在一種或多種細胞、細胞類型或組織中活躍表達(轉錄)所述雙鏈RNA。或者，所述植物可以"能夠表達"，意指其被編碼所需dsRNA的轉基因進行了轉化，但是當提供該植物時(以及在提供該植物的形式中)該轉基因在所述植物中沒有活性。因此，根據(jù)另一實施方案，提供一種重組DNA構建體，其包含編碼本發(fā)明的dsRNA或dsRNA構建體的核苷酸序列，該核苦酸序列有效地與至少一種調(diào)節(jié)序列連接。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)序列選自如下所述的組成性啟動子或組織特異性啟動子。所述乾基因可以是本文所述的任何靼基因。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)元件是在植物細胞中具有活性的調(diào)節(jié)元件。更優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)元件源自植物。術語"調(diào)節(jié)序列，，應作廣義理解，并且指能夠?qū)崿F(xiàn)與其有效連接的序列表達的調(diào)節(jié)性核酸。上述術語中包括激活或增強核酸表達的啟動子和核酸或其合成的融合分子或^f^生物，稱為激活子(activator)或增強子。本文^f吏用的術語"有效地連接"是指在啟動子序列和目的基因之間的功能性連接，使得所述啟動子序列能夠起始目的基因的轉錄。舉例來說，可將編碼所述雙鏈RNA的轉基因核苷酸序列置于誘導型或者生長或發(fā)育階段特異性的啟動子的控制下，通過加入針對誘導型啟動子的誘導物或者到達特定的生長或發(fā)育階段時，該啟動子允許起始dsRNA轉錄?；蛘?，編碼所述雙鏈RNA的轉基因置于例如選自包括任何以下的強組成性啟動子的控制下CaMV35S啟動子、雙CaMV35S啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子、GOS2啟動子、玄參花葉病毒(FMV)34S啟動子、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子(VerdaguerB.etal,PlantMolBiol.199837(6):1055-67)?；蛘?，編碼所述雙鏈RNA的轉基因置于選自任何以下的組織特異性啟動子的控制下編碼III型PsMTA幾丁質(zhì)酶基因的根特異性啟動子、光合組織特異性啟動子(如cabl和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LS1蛋白的啟動子)、JAS啟動子、查耳酮合酶啟動子以及來自草莓RJ39的啟動子。在另一實施方案中，編碼所述雙鏈RNA的轉基因置于昆蟲誘導型啟動子的控制下，例如馬鈴薯蛋白酶抑制因子II(PinII)啟動子(DuanXetal，NatBiotechnol.1996，14(4):494-8);或愈傷豫導型啟動子，例如茉莉酸和乙烯誘導型啟動子、PDF1.2啟動子(MannersJMetal.,PlantMolBiol.1998,38(6):1071-80);或者置于防御相關的啟動子控制下，例如7JOj^酸誘導型啟動子和植物致瘤相關蛋白(PR蛋白)啟動子(PR1啟動子(CorndissenBJetal"NucleicAcidsRes.1987,15(17):6799畫811))，COMT啟動子(ToquinVetal，PlantMolBiol.2003,52(3):495-509)。另外，當使用本發(fā)明的方法用于開發(fā)對昆蟲具有抗性的轉基因植物時，將編碼本發(fā)明所述雙鏈RNA的核酸置于組織特異性啟動子的控制下可能是有利的。為了改善所述dsRNA從植物細胞向害蟲的轉移，所述植物可優(yōu)選在植物害蟲首先接觸或破壞的植物部分表達所述dsRNA。對于植物病原性昆蟲來說，優(yōu)選的表達所述dsRNA的組織是葉、莖、根和種子。因此，在本發(fā)明的方法中，可4吏用植物組織特異性啟動子，如葉特異性啟動子、莖特異性啟動子、韌皮部特異性啟動子、木質(zhì)部特異性啟動子、根特異性啟動子或種子特異性啟動子(蔗糖轉運蛋白基因AtSUC啟動子(BaudSetal.,PlantJ.2005，43(6):824-36)、小麥高分子量麥谷蛋白基因啟動子(RobertLSetal.，PlantCell.1989,1(6):569畫78.))。根特異性啟動子的適當實例是PsMTA(Fordam國Skdton,A.P.,etal"1997PlantMolecularBiology34:659-668.)和III型幾丁質(zhì)酶啟動子。葉和莖特異性或光合組織特異性的啟動子(其也被光活化)的實例是來自糖用甜菜的兩種葉綠素結合蛋白(cabl和cab2)(StahlD.J.,etal.，2004BMCBiotechnology20044:31)、rbcS編碼的核酮糖-二磷酸羧化酶(Rubisco)(NomuraM.etal"2000PlantMol.Biol.44:99-106)、葉綠體甘油醛-3-磷^t氳酶的A(gapA)和B(gapB)亞基(ConleyT.R.etal.1994Mol.CellBiol.19:2525-33;KwonH.B.etal.1994PlantPhysiol.105:357-67)的啟動子，編碼葉和莖特異性(ST-LS1)蛋白的馬鈴薯基因的啟動子(ZaidiM.A.etal.,2005TransgenicRes.14:289-98)、畫調(diào)節(jié)性、防御i秀導型基因啟動子，如JAS啟動子(專利>^開號20050034192/US-A1)。花特異性啟動子的實例例如查耳酮合酶啟動子(FaktorO.etal.1996PlantMol.Biol.32:849)以及果實特異性啟動子的實例例如來自草莓的RJ39(WO9831812)。在本發(fā)明的另一些實施方案中，使用對表達dsRNA有用的另一些啟動子，其包括但不限于來自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的啟動子。這些啟動子通常用于體外產(chǎn)生dsRNA，然后將所述dsRNA包含在抗殺蟲劑中，例如在抗殺蟲劑液體、噴霧或粉末中。因此，本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生任何本發(fā)明的雙鏈RNA或RNA構建體的方法。該方法包括以下步驟a.將本發(fā)明的分離的核酸或重組DNA構建體與無細胞組分進行接觸；或者b.將本發(fā)明的分離的核酸或重組DNA構建體引入(例如，通過轉化、轉染或注射)到細胞中，以上步驟在允許所述核酸或重組DNA構建體轉錄從而產(chǎn)生所述dsRNA或RNA構建體的糾下進行。任選地，還可以將一種或多種轉錄終止序列加入到本發(fā)明的重組構建體中。術語"轉錄終止序列"包含轉錄單元末端的控制序列，其指示原初轉錄物的3，加工和聚腺苷酸化以及轉錄終止。所^達構建體中還可引入另一些調(diào)節(jié)元件(如轉錄或翻譯增強子)。本發(fā)明的重組構建體還可包括復制起點，其是在特定細胞類型中維持和/或復制所需的。一個實例是在需要表i^Kl建體作為細胞中游離型遺傳元件(例如，質(zhì)?；蛘沉７肿?維持在細菌細胞中。優(yōu)選的復制起點包括但不限于fl-ori和colElori。所述重組構建體任選地可包^it擇標記基因。本文使用的術語"選擇標記基因"包括賦予細胞表型的任何基因，其中它與本發(fā)明的表#建體一起表達以利于鑒定和/或選擇其轉染或轉化的細胞。適當?shù)倪x擇標記的實例包括抗氨節(jié)青霉素的基因(Ampr)、抗四環(huán)素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗草丁膦的基因和抗氯霉素的基因(CAT)。另一些適當?shù)臉擞浕蛱峁┝舜x性狀，例如manA。還可使用可見的標記基因，其包括例如P-葡糖醛酸酶(GUS)、熒光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)。已用編碼所述dsRNA的轉基因穩(wěn)定轉化的植物可以以并不主動表達所述dsRNA但具有該能力的種子、繁殖材料、增殖材料或細胞培養(yǎng)材料的形式提供。因此，本發(fā)明包括植物(例如，稻)或種子(例如，稻種)或細胞(例如細菌細胞或植物細胞)，其包含如上所述的至少一種雙鏈RNA或至少一種雙鏈RNA構建體；或者如上所述的至少一種核苷酸序列或至少一種重組DNA構建體；或者如上所述的至少一種植物細胞。本發(fā)明還包括植物(例如，苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆*、油梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、青花菜、抱子甘藍、巻心菜、卡諾拉油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、谷類、芽菜、櫻桃、柑桔、克萊蒙汀小柑橘(clemintine)、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、桉樹、無花果、葡萄、葡萄柚、花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、萊姆酸橙、松樹、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麥、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐萍、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、大豆(soy)、大豆(soybean)、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、橘子、茶樹、煙草、番茄、藤知ji物、西瓜、小麥、山藥或密生西葫蘆；優(yōu)選馬鈴薯、茄子、番茄、胡椒、煙草、醋栗、稻米或棉花植物)，或者種子或塊莖(例如，苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆筍、油梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、青花菜、抱子甘藍、巻心菜、卡諾拉油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、谷類、芽菜、櫻桃、柑桔、克萊蒙汀小柑橘、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、桉樹、無花果、葡萄、葡萄柚、花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、萊姆酸橙、松樹、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麥、菜秋葵、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、大豆、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、橘子、茶樹、煙草、番茄、藤#物、西瓜、小麥、山藥或密生西葫蘆；優(yōu)選馬鈴薯、茄子、番茄、胡椒、煙草、醋栗、稻、玉米或棉籽或塊莖)，或細胞(例如，細菌細胞或植物細胞)，其包含本文所述的至少一種雙鏈RNA或至少一種雙鏈RNA構建體；或者本文所述的至少一種核苷酸序列或至少一種重組DNA構建體。優(yōu)選地，這些植物或種子或細胞包含重組構建體，其中編碼本發(fā)明的dsRNA或dsRNA構建體的核苷酸序列與如上所述的至少一種調(diào)節(jié)元件有效連接。所述植物可以以如下形式提供，其中它在一種或多種細胞、細胞類型或組織中主動表達(轉錄)所述RNA分子?；蛘?，所述植物可以"能夠表達"，意指其被編碼期望RNA分子的轉基因所轉化，但是當提供植物時(以及在提供植物的形式中)該轉基因在所述植物中沒有活性。在一個具體的實施方案中，提供了重組的(表達)構建體用于在植物中或在植物細胞中表達RNA分子，所述植物或植物細胞中包含與核酸分子有效地連接的至少一種調(diào)節(jié)序列，所述核酸分子包含以下序列的至少14、15、16、17、18、19、20、21、22等個核苷酸，直至所有核苷酸SEQIDNO1,3,5,7,9,11,13,15,17'19,21,23,49至158,159,160-163,168,173,178,183,化8,193，198,203，208,215,220,225,230,240至247,249,251'253'255,257,259,275至472,473,478,483，488,493,498，503,508至513,515,517,519,521,533至575,576，581,586,591,596,601,603,605，607,609,621至767,768,773，778,783，788,793,795,797,799,801,813至862,863,868,873,878,883,888，8恥，892,894,896,908至1040,1041,1046,1051，1056,1061,1066至1071,1073.1075,1077.1079,1081,1083,1085'1087,1089,1091,1093,1095，1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109,1111,1113,1161至1571,1572,1577,1582.1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647，1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686，1688,1690,1692,1694,1696.1698,1700,1702,1704,1730至2039.2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364，2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,24胡,2471,2476,2481或2486，或者包含來自不同耙標物種的直系同源核酸分子序列的至少14、15、16、17、18、19、20、21、22個等直至所有的核苷酸。很多載體可用于此目的，適當載體的選擇將主要取決于待插入該栽體的核酸的大小以及待用該載體轉化的特定宿主細胞。用于為RNAi目的而在植物中表達外源雙鏈RNA的一般性技術在本領域是已知的(參見BaulcombeD,2004,Nature.431(7006):356-63.RNAsilencinginplants,其內(nèi)容通過參考并入本文中)。更具體地，用于為在植物害蟲(如線蟲或昆蟲)中下調(diào)基因表達目的而在植物中表達雙鏈RNA的方法也是本領域已知的?？梢砸灶愃频姆绞綉妙愃频姆椒ǎ瑥亩鵀樵谥参锊≡岳ハx中下調(diào)乾基因表達的目的而在植物中表達雙鏈RNA。為了實現(xiàn)該效果，僅僅需要所述植物在直接接觸昆蟲的植物部分表達(轉錄)所述雙鏈RNA，從而所述雙鏈RNA可以被昆蟲吸收。取決于昆蟲及其與宿主植物的關系，dsRNA的表達可以發(fā)生在植物的細胞或組織內(nèi)，其中所述昆蟲在其生活史中也存在于所述植物的細胞或組織中，或者所述RNA可分泌ii^細胞間空間(如質(zhì)外體)，其被昆蟲在生活史中所占據(jù)。另夕卜，所述dsRNA可位于植物細胞中(例如在細胞溶膠中)，或者在植物細胞的細胞器(如葉綠體、線粒體、液泡或內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中。或者，所述dsRNA可通過植物細胞和通過植物被分泌至植物外部。從而，所述dsRNA可在植物表面上形成保護層。另一方面，本發(fā)明還提供了用于防止或保護植物免遭害蟲侵害的方法與組合物的組合。例如，一種方法提供使用植物轉基因策略，其組合了使用表達dsRNA分子的方法以及使用表達所述Bt殺蟲蛋白質(zhì)的方法。因此，本發(fā)明還涉及本文所述的方法或者植物細胞或植物，其中表達所述RNA分子的植物細胞或植物包含或表達選自以下的殺蟲劑馬鈴薯塊莖貯藏蛋白(patatin)、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌(J^"oWfl^/"s)殺蟲蛋白、光桿狀菌(/V^^7m6rfMS)殺蟲蛋白、側孢芽孢桿菌(必fl"7/"5/fltero5/wrows)殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌(Afl"7/wss/7/^^,V"s)殺蟲蛋白。優(yōu)選地，所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白選自Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元殺蟲蛋白CryET33和CryET34、二元殺蟲蛋白CryET80和CryET76、二元殺蟲蛋白TIC100和TIC101以及二元殺蟲蛋白PS149B1。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于防治昆蟲生長和/或防止或降低昆蟲侵害的組合物，該組合物包括至少植物的一部分、植物細胞、植物組織或種子，其包含至少一種雙鏈RNA,其中所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中一g具有與昆蟲耙基因核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列。任選地，所述組合物還至少包括一種適當?shù)妮d體、賦形劑或稀釋劑。所述耙基因可以是本文所述的任何耙基因。優(yōu)選地，所述昆蟲靼基因是昆蟲生存、生長、發(fā)育或繁殖所必需的。另一方面，本發(fā)明涉及如上所述的組合物，其中所述昆蟲耙基因包含與選自以下的任意序列具有至少75%,優(yōu)選至少80%、85%、90%,更優(yōu)選至少95%,98%或99%—致性的序列SEQIDNO1,3,5,7'9，"，13,15'17,19,21,23,49至158,159,16(M63.168，173,178,183,188,193,198.203,208'215,220,225,230,240至247，249,251,253,255.257,259,275至472，473,478,483,488,493,498,503,508至513,515,517,519,521，533至57S,576,581,586,591,596,601.603,605,607,609,621至767.768,773,778,783,788,793,795,797.799,801,813至862,863,868,873,878,883,888,890,的2,894,896.908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1066至1071,1073,1075，1077,1079，1081,1083,1085,1087，1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,"03,"05,1107,1109,"11,1113,"61至f571,1572,1577，1582,1587,1592,1597，f602,1607,1612,1617,t622,1627,1632,1637,化42,1647,1652,1657,1662,1667,1672'1677,1682,簡,1686,1688，1690,16921694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,20552065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2識2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2364,2359，2364,2366,2368,2370'2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476,2481或2486,或其互補序列，或者其中所述昆蟲耙基因是包含以下序列中至少17個連續(xù)核苷酸的基因的昆蟲直系同源物SEQIDN01,3,5、7,9,",13，is，17'19,21,23'49至158,159,160-163,168，173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230.240至247,249,251,253,255,257,259,275至472'473,478,483,488,493,49B,503t50B至513，515,517'519,521,533至575.576,5W,586,591，596，601,603，605.607，609,621至767,768,773,778，783,788,793,795,797,799,801,813至862'秘3，868,873,878,883，888,890,892，894,896,908至104D,湖，1D銀1056,106"),1066至1071,1073,1075,1077,化79,1081，1083,化85,1087,1089，1091.1093，1095,1097,1099'1101,1103，1105,1107,1109,1111,1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672，1677,1682,1684.1686,1688,1690,1692,1694,1696，1698,1700,1702,1704，1730至2039,2040'2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108，2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366，2368，2370,2372，2384至2460,2461,2466,2471,2476，2481或2486，或其互補序列。根據(jù)又一實施方案，本發(fā)明提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括以可表達的形式向植物引入本文所述的任何核苷酸序列或重組DNA構建體。該方法涉及的植物如前所述。參考以下非限制性實施例將進一步理解本發(fā)明。附圖和附表說明圖l-LD:用dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲的存活。用50nl表面施加dsRNA(靶標或gfp對照)溶液處理的飼料喂食第二幼蟲期的昆蟲。7天后，將飼料替換為包含表面施加dsRNA的新鮮飼料。在第2、5、7、8、9和13天評估存活昆蟲數(shù)。相對于笫0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。把標LD006:(SEQIDNO178);靶標LD007(SEQIDNO183);乾標LD010(SEQIDNO188);靶標LDOll(SEQIDNO193);耙標LD014(SEQIDNO198);gfpdsRNA(SEQIDNO235)。圖2-LD:用dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉曱的存活。用50nl表面施加dsRNA(靶標或gfp對照)溶液處理的祠料喂食第二幼蟲期的昆蟲。在7天后將飼料替換為僅僅新鮮飼料。在第2、5、6、7、8、9、12和14天評估存活昆蟲數(shù)。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。靶標LDOOl(SEQIDNO163);靶標LD002(SEQIDNO168);靼標LD003(SEQIDNO173);LD015(SEQIDNO215);靶標LD016(SEQIDNO220);gfpdsRNA(SEQIDNO235)。圖3-LD:在用dsRNA處理的馬鈴薯葉圓片喂食的馬鈴薯葉甲幼蟲的平均重量。用20pi表面施加dsRNA(靶標LD002或gfp)溶液(10ng/pl)處理的葉圓片喂食第二幼蟲期的昆蟲。2天后，每天將昆蟲轉移至未經(jīng)處理的葉上。圖4-LD:用較短形式的乾標LD014dsRNA和串聯(lián)體dsRNA處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲的存活。用經(jīng)50nl表面施加dsRNA(靶標或gfp對照)溶液處理的飼料艱食第二幼蟲期的昆蟲，在第3、4、5、6和7天評估存活昆蟲數(shù)。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。圖5-LD:用不同濃度的dsRNA(乾標LD002(a)、把標LD007(b)、乾標LD010(c)、乾標LDOll(d)、靶標LD014(e)、靶標LD015(f)、LD016(g)和把標LD027(h))處理的人工飼料喂食的馬鈴薯葉甲幼蟲的存活。用經(jīng)50pi表面施加dsRNA溶液處理的飼料喂食第二幼蟲期的昆蟲。7天后，將飼料替換為包含表面施加dsRNA的新鮮飼料。定期評估存活昆蟲數(shù)。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。圖6-LD.用dsRNA處理的馬鈴薯葉圓片喂食的馬鈴薯葉甲成蟲的存活。開始兩天用經(jīng)雙鏈RNA處理的葉圓片喂食年幼成蟲，然后將其置于未經(jīng)處理的馬鈴薯葉上。定期評估存活昆蟲數(shù)；活的并且看起來運動正常的昆蟲記錄為活動的昆蟲；活的但似乎有病并且運動緩慢的昆蟲記錄為瀕死的昆蟲-一旦將其背部朝下，這些昆蟲不能自己翻身。靶標LD002(SEQIDNO168);靼標LD010(SEQIDNO188);乾標LD014(SEQIDNO198);耙標LD016(SEQIDNO220);gfpdsRNA(SEQIDNO235)。圖7-LD.喂食轉基因馬鈴薯植林的馬鈴薯葉甲的死亡率和存活幼蟲的生長/發(fā)育遲滯。用包含LD002構建體()、空栽體(▲)的轉基因馬鈴薯同胞(sibling)或野生型V系植物(■)喂食7只CPBLI幼蟲7天。死亡率以百分比表示，平均幼蟲重量以mg計。圖1-PC:攝取的靶標dsRNA對辣根猿葉曱幼蟲的存活和生長的影響。用經(jīng)25pi表面施加0.1ng/pldsRNA(靶標或gfp對照)溶液處理的油菜葉圓片喂食初生幼蟲。2天后，將昆蟲轉移至新鮮的經(jīng)dsRNA處理的葉圃片上。在第4天，收集針對每次處理來自一次重復的幼蟲，并置于含有未經(jīng)處理的新鮮油菜葉的培養(yǎng)臟中。在第2、4、7、9和11天評估所述昆蟲。(a)用dsRNA處理的油菜葉圓片喂食的墨西哥豆瓢蟲幼蟲的存活。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比，(b)用經(jīng)dsRNA處理的油菜葉圃片喂食的辣根猿葉甲幼蟲的平均重量。一起稱重來自每個重復的昆蟲，確定每只幼蟲的平均重量。誤差線代表標準偏差。靶標1:SEQID473;耙標3:SEQIDNO478;靼標5:SEQIDNO483;靼標10:SEQIDNO488;把標14:SEQID493;乾標16:SEQIDNO498;靼標27:SEQIDNO503;gfpdsRNA:SEQIDNO235。圖2-PC:用經(jīng)不同濃度的dsRNA(a)靶標PC010和(b)靶標PC027處理的油菜葉圓片喂食的辣根猿葉甲的存活。將初生幼蟲置于經(jīng)25pl表面施加dsRNA溶液處理的油菜葉圓片上。在第2天，將昆蟲轉移至經(jīng)處理的新鮮葉圓片上。在第4天(對于耙標PC010)和第5天(對于靶標PC027),將昆蟲轉移至未經(jīng)處理的葉子。在第2、4、7、8、9和11天(對于PC010)和第2、5、8、9和12天(對于PC027)評估昆蟲的存活數(shù)。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。圖l-EV:用經(jīng)dsRNA處理的豆葉圓片喂食的墨西哥豆瓢蟲幼蟲的存活。用25pl表面施加1jug/pidsRNA(耙標或gfp對照)溶液處理的豆葉圓片喂食初生幼蟲。2天后，將昆蟲轉移至經(jīng)dsRNA處理的新鮮葉圓片上。在第4天，收集來自一個處理的幼蟲，并置于含有未經(jīng)處理的新鮮豆葉的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天評估昆蟲的死亡率。相對于第O天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。靶標5:SEQIDNO576;靶標10:SEQIDNO586;耙標15:SEQIDNO591;乾標16:SEQIDNO596;gfpdsRNA:SEQIDNO235。圖2-EV:攝取的靶標dsRNA對墨西哥豆瓢蟲成蟲之存活的影響以及對食莢菜豆葉的蟲害的抗性。(a)用經(jīng)dsRNA處理的豆葉喂食的墨西哥豆胍蟲成蟲的存活。用經(jīng)75nl表面施加O.l[ig/pldsRNA(乾標或gfp對照)溶液處理的豆葉圓片喂食成蟲。24小時后，將昆蟲轉移至經(jīng)dsRNA處理的新鮮葉圓片上。再過24小時后，收集來自一個處理的成蟲，并置于含有盆栽未處理的新鮮的整林豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、7、8和ll天評估昆蟲的死亡率。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。靼標10:SEQIDNO586;耙標15:SEQIDNO591;乾標16:SEQIDNO596;gfpdsRNA:SEQIDNO235。(b)dsRNA對墨西哥豆胍蟲成蟲所造成豆葉損傷的抗性。在第9天目測檢查包括來自一個處理(參見(a))的昆蟲的整林植物中的葉損傷。(i)靶標10;(ii)靶標15;(iii)靼標16;(iv)gfpdsRNA;(v)未處理的。圖1-TC:用dsRNA(乾標14)處理的人工飼料喂食的赤擬谷盜幼蟲的存活。用基于含lmgdsRNA(靶標14)的面粉/奶混合物的飼料喂食初生的幼蟲。對照是含水(不含dsRNA)飼料。對于每個處理，進行4個重復，每個重復4吏用10只1齡幼蟲。在第6、17、31、45和60天評估昆蟲的存活作為百分比平均數(shù)。相對于第0天(測定開始時)計算存活幼蟲的百分比。誤差線代表標準偏差。乾標TC014:SEQIDN0878。圖l-MP:攝取的乾標27dsRNA對桃蜂若蟲存活的影響。將1齡昆蟲置于包含50pl液態(tài)飼料(含有2照/nldsRNA(靶標27或gfpdsRNA對照))的喂料室中。對于每個處理，設立5個^室，其中每個"^室包括10只昆蟲。在生物測定開始后的第8天評估存活數(shù)。誤差線代表標準偏差。乾標MP027:SEQIDNO1061;gfpdsRNA:SEQIDN0235。圖l-NL:用經(jīng)dsRNA處理的液體人工飼料喂食的褐飛虱的存活。在獨立的生物測定中用補充有2mg/mldsRNA靶標溶液的飼料喂食第一至第二幼蟲期的若蟲(a)NL002、NL003、NL005、NL010;(b)NL009、NL016;(c)NL014、NL018;(d)NL013、NL015、NL021。將用僅僅飼料和含同樣濃度gfpdsRNA對照的飼料哏食的昆蟲存活與用耙標喂食的昆蟲存活進行比較。每兩天將飼料替換為含有dsRNA的新鮮飼料。每天評估存活昆蟲數(shù)。圖2-NL:用不同濃度的耙標dsRNANL002處理的液體人工飼料喂食的褐飛虱的存活。用補充有l(wèi)、0.2、0.08和0.04mg/ml(終濃度)NL002的飼料喂食第一至第二幼蟲期的若蟲。每兩天將飼料替換為含有dsRNA的新鮮飼料。每天評估存活昆蟲數(shù)。實施例實施例l:高通量篩選中在秀麗隱桿線蟲(d/gg^ts)中沉默秀麗隱桿線蟲乾基因在pGN9A載體中兩個相同的T7啟動子和終止子之間制備秀麗隱桿線蟲基因組廣泛文庫(WO01/88121),通過IPTG進行誘導在T7聚合酶表達的情況下所述啟動子和終止子驅(qū)動其正向和反向表達。在96孔板形式中，將此文庫轉化入細菌菌林AB301-105(DE3)。對于基因組范圍的篩選，將這些細菌細胞喂食l^核酸酶缺乏的秀麗隱桿線蟲騰-JJ林。在96孔板形式中按照下述步驟將在細菌菌林AB301-105(DE3)中產(chǎn)生的dsRNA喂食給秀麗隱桿線蟲(V392義將nuc-l卵轉移到不同的板中，并使之在20。C下同時孵化以使得L1代同步化。將包含IPTG的100微升液體培養(yǎng)^入到96孔板中，并加入10微升OD6。。l帶有秀麗隱桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細菌細胞培養(yǎng)物，該文庫每個栽體帶有用于表達dsRNA的秀麗隱桿線蟲基因組片段。將4只同步化的Ll線蟲加入到每個孔中，在25。C孵育至少4至5天。這些實驗一式四份進行。在所述篩選中，使用6個對照-pGN29-陰性對照，野生型-pGZl-顔c-2扣顫搐型表型-pGZ18-幾丁質(zhì)合酶胚胎致死-pGZ25-;ws-h胚胎致死-0259=6//"/)=急性致死-ACC-乙酰輔酶A羧化酶^急性致死5天后，將用產(chǎn)生dsRNA的細菌喂食的秀麗隱桿線蟲m/c-7J和用空載體(pGN29)及用其它對照喂食的線蟲的表型進行比較。針對親代(PQ)的致死性(急性或幼蟲)、子一代(Fl)的致死性(胚胎)或者針對Po的生長i^按照如下所述對用所述dsRNA喂食的線蟲進行篩選(i)P。急性致死Ll不發(fā)育且死亡，此表型不產(chǎn)生后代，所述孔看上去十分空曠；(ii)Po(幼蟲)致死P。在比Ll更晚的階段死亡，此表型也不產(chǎn)生后代。在孔中發(fā)現(xiàn)死亡的幼蟲或死亡的成蟲；(iii)Fl致死Ll發(fā)育至成蟲期并仍然存活。此表型不產(chǎn)生后代。這可能是由于不育、胚胎致死(孔底部有死亡的卵)、胚胎停滯或幼蟲停滯(最終以致死結束)；(iv)生長停滯及生長遲^/延遲與帶有正常發(fā)育和正常后代數(shù)的孔進行比較。對于表1A中所示的耙序列，所得結論為線蟲中(例如秀麗隱桿線蟲)dsRNA介導的秀麗隱桿線蟲耙基因沉默對線蟲的生長和存活具有重大影響。接著上述dsRNA沉默實驗，在24孔板中以高通量形式對秀麗隱桿線蟲進行了更細致的表型實驗。按照如下步驟，將如上所述細菌菌林AB301-105(DE3)中產(chǎn)生的dsRNA文庫喂食給24孔板中的秀麗隱桿線蟲(^392j將nuc-l卵轉移到不同的板中，并使之在20。C下同時孵化以使得L1代同步化。然后，將100只同步化的L1線蟲浸泡于500微升S完全喂食培養(yǎng)基以及500孩史升秀麗隱桿線蟲dsRNA文庫的OD6001AB301-105(DE3)細菌細胞培養(yǎng)物中，所述培養(yǎng)基包含5樣i克/毫升膽固醇、4微升/毫升PEG和lmMIPTG，所述dsRNA文庫每個都帶有含表達dsRNA的秀麗隱桿線蟲基因組片段的栽體。將所浸泡的Ll線蟲在25'C轉動孵育2小時。在離心并除去950微升上清后，將所剩的5^t升及重懸的沉淀(包含約10至15只線蟲)轉移到24孔;tl每個孔的中部，加入一層瓊脂LB液體培養(yǎng)基。將所接種的板在25'C下孵育2天。在成蟲期，挑出l只成蟲，在25匸下孵育2天用于檢查其后代。在最初的24孔板原位檢查其它的成蟲。一式四份進行這些實驗。用第二批孵化的線蟲重復此詳細表型篩選，唯一的區(qū)別在于第二批孵化的線蟲在20。C孵育3天。對用秀麗隱桿線蟲dsRNA喂食的線蟲之表型和用空載體喂食的秀麗隱桿線蟲(^392J"^型進行比較。才艮據(jù)此實驗，得出結論為如表1A中所示的秀麗隱桿線蟲靼基因的沉默對于線蟲的生長和存活具有重大的影響，以及所述靼基因?qū)τ诰€蟲的存活是必要的。因此這些基因是用于通過dsRNA介導的基因沉默防治(殺傷或阻止其生長)線蟲之理想耙基因。因此本發(fā)明包含上述秀麗隱桿線蟲耙基因的線蟲直系同源物用于防治線蟲侵害(例如植物的線蟲侵害)的用途。實施例2:鑒定黑腹果竭(Z).柳g/fl朋gflyfe"直系同源物如實施例1中所述，鑒定了許多秀麗隱桿線蟲的致死序列，其可用于鑒定其它種屬中的直系同源物。例如，秀麗隱桿線蟲致死序列可用于鑒定直系同源的黑腹果蠅序列。也就是說，每個秀麗隱桿線蟲序列可用于在公共數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)中搜索黑腹果蠅中的直系同源物。選擇具有高度序列同源性的(E值優(yōu)選小于或等于1E-30)潛在黑腹果蠅直系同源物，所述序列是blast相互最佳命中(hit)的，后者意指來自不同生物(例如秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅)的序列是彼此的最高blast命中。例如，使用BLAST比較來自秀麗隱桿線蟲的序列C和黑腹果蠅中的序列。如果序列C具有黑腹果錄序列D作為最佳命中，而D與所有其它秀麗隱桿線蟲序列相比也是序列C作為最佳命中，那么D和C是相互最佳命中。此標準經(jīng)常用于定義直系同源物，意指不同物種的具有相似功能的相似序列。黑腹果蠅序列標識示于表1A。實施例3:馬鈴薯葉曱(Z^/7&7i她rs"flfece///weflto，Coloradopotatobeetle,CPB，科羅拉多馬鈴薯葉曱)A.克隆來自馬鈴薯葉曱的部分基因序列從4個不同幼蟲期馬鈴薯葉甲(馬鈴薯葉甲；來源JeroenvanSchaik,EntocareCVBiologischeGewasbescherming,Postbus162，6700ADWageningen,theNetherlands)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照使用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照使用說明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含LD001,LD002,LD003,LD006,LD007,LDOIO，LD011,LD014,LD015,LD016,LC018和LD027基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照4吏用說明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-LD中給出，其顯示了包含引物序列和所得cDNA序列的馬鈴薯葉甲靼基因。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、55。C1分鐘和72°C1分鐘，然后是72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，將其克隆入pCR8/GW/topo載體(Cat.Nr.K250020,Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-LD中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指部分序列。分別通過如表3-LD中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分M酸序列，其中讀碼框的起點以方括號表示。B.產(chǎn)生馬鈴薯葉甲基因的dsRNA寸吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。^兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的耙序列。對于每個耙基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個耙序列有義模板的各個引物的序列在表8-LD中給出。PCR反應的條件如下95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95'C30秒、55。C30秒和72°C1分鐘，然后是72。C10分鐘。4吏用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上勤目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個乾基因反義模板的各個引物序列在表8-LD中給出。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaCK)4沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個耙基因的dsRNA有義鏈在表8-LD中給出。表8-LD顯示了用于制備馬鈴薯葉甲乾序列和串聯(lián)體序列(concatemersequence)的dsRNA片段的序列，其中包含引物序列。C.將馬鈴薯葉曱基因克隆進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾的機制通過dsRNA片^^作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的靼基因的乾核苷酸序列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記物。使用含attL入門克劇見實施例1)和含attR終點載體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物栽體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)i義獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的i兌明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)ii行重組反應。這些克隆實騶得到了LD002、LD006、LD007、LDOIO、LDOll、LD014和LD016基因各自的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，或者啟動子-反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-有義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化it才艮癌農(nóng)桿菌(J.似/i^/flde";s)。對于LD002和LDOIO，對克隆進pCR8/GW/t叩o的LD002使用限制性酶BsoBI和Pvul進行雙消化(見實施例3A)。對于LD006、LD007、LDOll、LD014、LD016和LD027,4吏用限制性酶BsoBI對克隆進pCR8/GW/topo的LD006進行消化(見實施例3A)。使用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少1個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進Topl0化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。發(fā)夾構建物的完整序列是-LD002(反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-有義)在SEQIDNO240中表示；-LD006(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDN0241中表示；-LD007(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO242中表示；-LD010(反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-有義)在SEQIDNO243中表示；-LD011(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDN0244中表示；-LD014(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO245中表示；-LD016(反義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-有義)在SEQIDNO246中表示；-LD027(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO2486中表示；表9-LD提供了每個發(fā)夾構建物的完整序列。D.使用人工飼料針對抗馬鈴薯葉甲活性篩選dsRNA靶標按照下述(修改自Gelmanefal，2001,J.Ins.Sc.,vol.1，no.7,1-10)制備用于馬鈴薯葉曱的人工祠料對水和瓊脂高壓滅菌，當溫度降至55。C時加入余下成分(如下文表A所示)。在此溫度下，完全混合所述成分，然后將所述飼料以每孔1毫升的量等分至24孔板(Nunc)。人工飼料允許在室溫下冷卻固化。飼料在4。C下保存最多3周。表A:人工飼料的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>將濃度為1毫克/毫升的50微升dsRNA溶M面施加到多孔板孔內(nèi)的固體人工飼料上。所述飼料在層流拒中千燥。每個處理，測試24只馬鈴薯葉甲幼蟲(2期)，每孔兩只昆蟲。在昆蟲詞養(yǎng)室中保存所逸tl，務降為25士2。C，60%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。每l、2或3天評估所述甲蟲是活還是死。在7天后，對于耙標LD006、LD007、LDOIO、LD011和LD014，用表面施加了相同濃度(1毫克/亳升)dsRNA的新鮮飼料替換所述飼料；對于LDOOl、LD002、LD003、LD015和LD016，僅僅用新鮮飼料替換所述飼料。針對僅僅飼料或者帶有表面施加dsRNA的飼料比較dsRNA耙標，所述dsRNA對應于GFP(greenfluorescentprotein，綠色熒光蛋白)編碼序列(SEQ1DN0235)的片段。將含有完好棵dsRNA的人工飼料喂食給馬鈴薯葉甲幼蟲導致幼蟲的死亡率顯著增加，如兩個獨立的生物測定中所顯示的(圖1LD-2LD)。所有測試dsRNA7至14天后最終導致100%死亡率。在整個所述生物測定中，用帶有或不帶GFPdsRNA的飼料維持所述昆蟲時死亡率很小或無死亡。通常，在所有所觀察的測定中，用帶有或不帶dsRNA的飼料正常喂食CPB2期幼蟲2天，所述幼蟲蛻殼成為3期幼蟲。在此新的幼蟲期，觀察到CPB顯著減少或完全停止進食，結果伴隨死亡率提高。E.使用馬鈴薯葉圓片進行dsRNA靶標抗馬鈴薯葉甲活性的生物測定應用了使用馬鈴薯葉材料而非人工飼料作為CPB食物來源的替代生物測定方法。用合適尺寸的穿孔器從2至3周齡的馬鈴薯植物葉子上切下約1.1厘米直徑的圓片(或約0.95平方厘米)。通過施加20微升10納克/微升靶標LD002dsRNA或?qū)φ誫fpdsRNA溶液到近軸葉表面制備所處理的葉圓片。允許葉圓片干燥并分別單獨放置在24孔板(Nunc)的24個孔中。將單只第2幼蟲期幼蟲CPB放置于每個孔中，然后用吸水紙和多孔板塑料蓋將其覆蓋。在28'C下將含有昆蟲和葉圓片的板保持在昆蟲室中，光周期為16小時光照/8小時黑暗。允許所述昆蟲食用葉圃片2天，之后將所述昆蟲轉移到含有新鮮的處理葉圓片的新平板中。之后，每天將所述昆蟲轉移到含有未處理葉圓片的平板，直至第7天。"^己錄昆蟲死亡率和重量得分。用表面施加了靶標LD002完好棵dsRNA的馬鈴薯葉圓片喂食馬鈴薯葉甲幼蟲導致幼蟲死亡率顯著增加(即在第7天所有昆蟲死亡；100%死亡率)，而對照gfpdsRNA對CPB存活無影響。耙標LD002dsRNA在2至3天后嚴重的影響幼蟲生長，而用相同濃度gfpdsRNA喂食的幼蟲發(fā)育正常(圖3-LD)。F.針對抗馬鈴薯葉甲活性使用人工飼料篩選較短版本的dsRNA此實施例舉例說明以下發(fā)現(xiàn)，較短(60或100bp)的dsRNA片段其自身或者作為串聯(lián)體構建物足以造成對馬鈴薯葉曱的毒性。LD014，已知在馬鈴薯葉甲中誘導致死性的靶標，被選擇用于此實施例。此基因編碼V-ATPase亞基E(SEQIDNO15)。另外選擇100個^^JJt的片段LD014—Fl(在SEQIDNO15的195-294位，SEQIDNO159)和60個^^Xt的片段LD014—F2(在SEQIDNO15的235-294位,SEQIDNO160)。也參見表7-LD。設計了兩個300^JJt的串聯(lián)體，LD014_C1和LD014_C2(SEQIDNO161和SEQIDNO162)。LD014—CI含有3個重復的上文所述100堿^Xt片段(SEQIDNO159)，LD014—C2含有5個重復的上文所述60堿^SJ^片段(SEQIDNO160)。也參見i7-LD。合成片段LD014_F1和LD014一F2作為有義和反義引物。在克隆之前，退火這些引物形成雙鏈DNA分;。在所述引物的5，和3，端分別包含Xbal和Xmal限制性位點，以利于克隆。所述串聯(lián)體制成作為300g對的合成基因。在所述合成DNA片段的5，和3，端分別包含XbaI和Xmal限制性位點，以利于克隆。用Xbal和Xmal消化4個DNA分子，即2個單個單元(LD014—Fl和LD014_F2)和2個串聯(lián)體(LD014_C1和LD014—C2)，并亞克隆至U通過Xbal和Xmal消化而線性化的pBluescriptllSK+中，分別得到重組質(zhì)粒pl、p2、p3和p4。產(chǎn)生雙鏈RNA:使用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成dsRNA。在兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的靶序列。對于LD014_F1，使用特異性T7正向引物oGBM159和特異性反向引物oGBM164(此處分別用SEQIDNO204和SEQIDNO205表示)在PCR反應中使用下述條件產(chǎn)生有義T7模板95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95。C30秒、55。C30秒和72'Cl分鐘，然后是72'C10分鐘。使用特異性正向引物oGBM163和特異性T7反向引物oGBM160(此處分別用SEQIDNO206和SEQIDNO207表示)在使用與上^目同IHf的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑敘QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商i兌明進行。所得dsRNA的有義鏈在本文中由SEQIDNO203表示。對于LD014—F2,使用特異性T7正向引物oGBM161和特異性反向引物oGBM166(此處分別用SEQIDNO209和SEQIDNO210表示)在PCR反應中使用下述條件產(chǎn)生有義T7模板95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95。C30秒、55。C30秒和72。C1分鐘，然后是72。C10分鐘。使用特異性正向引物oGBM165和特異性T7反向引物oGBM162(此處分別用SEQIDNO211和SEQIDNO212表示)在使用與上勤目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得dsRNA的有義鏈在本文中由SEQIDNO208表示。同樣，對于所述串聯(lián)體，在兩個獨立的PCR哀JI中產(chǎn)生獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子^^板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的耙序列。含有LD014—CI和LD014—C2的所述重組質(zhì)津立p3和p4用Xbal或Xmal線性化，純化^個構建物的^種線性片段并用作體外轉錄測定的模板，其中使用位于克隆位點側翼的T7啟動子。通過體外轉錄使用T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)制備雙鏈RNA。對于LD014_C1和LD014—C2所得dsRNA的有義鏈在本文中分別由SEQIDNO213和214表示。靶標LD014和串聯(lián)體的較短序列能夠誘導馬鈴薯葉甲致死性，如圖4-LD所示。Ci使用人工飼料針對抗馬鈴薯葉甲活性在不同濃度下篩選dsRNA將從1微克/微升(對于耙標LD027從0.1微克/微升)降至0.01納克/微升的一系列十倍稀釋的50微升dsRNA溶液表面施加到24孔板(Nunc)孔內(nèi)的固體人工飼料上。所述飼料在層流根中干燥。每個處理，測試24只馬鈴薯葉甲幼蟲(2期)，每孔兩只昆蟲。在昆蟲飼養(yǎng)室中*所逸板，條件為25士2'C，60%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。以固定間隔直至第14天評估所述甲蟲是活還是死。在7天后，用表面施加了相同濃度dsRNA的新鮮飼料替換所述飼料。將dsRNA靶標和僅使用飼料進行比較。在低至0.1至10納克dsRNA/微升的濃度下將含有不同耙標完好棵dsRNA的人工飼料喂食給馬鈴薯葉甲幼蟲導致高幼蟲死亡率，如圖5-LD所示。H.成蟲特別易感于經(jīng)口攝取的對應耙基因的dsRNA下文所提供的實施例強調(diào)了以下發(fā)現(xiàn)，昆蟲成蟲(不只是幼蟲期昆蟲)特別易感于經(jīng)口攝取的對應耙基因的dsRNA。選擇4個耙標用于此實驗乾標2、10、14和16(分別為SEQIDNO168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQIDNO235)用作對照。從我們實驗室飼養(yǎng)的培養(yǎng)物中隨機挑選幼齡成蟲(2-3天齡)，對昆蟲性別沒有偏好。每個處理選擇10只成蟲。在處理開始前，所述成蟲預先幼/敞至少6小時。在處理第一天，向每只成蟲喂食4個馬鈴薯葉圓片(直徑1.5平方厘米)，其通過在表面施加每圓片25微升0.1微克/微升靶標dsRNA(如實施例3A中所述進行合成；表面施加如實施例3E所述)進行了預處理。將每只成蟲限制在小的培養(yǎng)亞(直徑3厘米)中以確保所有昆蟲攝取相同量的食物，因此接受相同劑量的dsRNA。第二天，再次向每只成蟲喂食4片如上所述經(jīng)處理的葉圓片。第三天，收集每個處理的所有10只成蟲，一起放置于由塑料盒(尺寸30厘米x20厘米xl5厘米)構成的籠中，所述盒的蓋子中帶有細密的尼龍網(wǎng)以提供良好通風。在盒子中，底部放置了一些潮濕濾紙。所述紙的上面放置了一些(未處理的)馬鈴薯葉，以在實驗過程中維持成蟲。從第5天起，進行定期評估對死亡、存活(活動的)和瀕死昆蟲數(shù)量進行計數(shù)。對于瀕死昆蟲，將其背朝下放置以檢查它們是否能夠在數(shù)分鐘內(nèi)自己翻轉過來；只有不能翻過來的昆蟲被認為是瀕死的。在此實驗中證明了對應于不同靶標的雙鏈RNA對馬鈴薯葉甲成蟲明確的特異性毒性作用(圖6-LD)。對應于gfp片段的雙鏈RNA在最終評估日(第19天)顯示對CPB成蟲沒有毒性。此實驗清楚的顯示出只有當接觸到經(jīng)口遞送的dsRNA幾天后CPB成蟲的存活率才顯著降低。例如，對于乾標10,在第5天，10只成蟲中的5只瀕死(病態(tài)并緩'匱運動)；在第6天，10只成蟲中的4只死亡，3只瀕死；在第9天，觀察到所有成蟲死亡。作為此實驗的結論，可將施用靶標雙鏈RNA抗昆蟲侵害擴展到包括昆蟲侵害的兩個生活期(即幼蟲和成蟲)，所述昆蟲侵害可造成嚴重的作物破壞，如馬鈴薯葉甲的情況。I.測試轉基因馬鈴薯植物抗馬鈴薯葉曱幼蟲的實驗室試驗下文提供的實施例舉例說明了以下發(fā)現(xiàn)，表達CPB基因特異性發(fā)夾RNA的轉基因植物對馬鈴薯葉甲具有有害作用。馬鈴薯轉化使用來自JulieGilbert在NSF馬鈴薯基因組計劃(htt]3:〃www.potatogenome.org/nsf5)中的改進方案獲得穩(wěn)定轉化的馬鈴薯植物。使用來源于馬鈴薯(5Wflmi附似6mw"附)6487-9的'V系，馬鈴薯的莖節(jié)間外植體(獲得自PRIWageningen的LaboratoryofPlantBreeding,theNetherlands)作為轉化起始材料。用含f斤述發(fā)夾構建物的才艮癌農(nóng)桿菌(J^76""er/w附似附e/flc/e/w)C58dRi產(chǎn)接種體外來源的外植體。三天的共培R后，將所述外植體放在含100亳克/升卡那霉素和300毫克/升特泯菌的選擇培養(yǎng)基上。轉化后經(jīng)過6周以后，摘下最初推定的芽然后使其在選擇培養(yǎng)基上生根。來源于不同外植體的芽作為獨立事件處理，來源于相同愈傷組織的芽被稱為'同胞(sibling)，，直至它們的克隆狀況可被Southern確定，芽的節(jié)切斷物(nodalcutting)被稱為"克隆"?？赏ǖ野倚蛄械腉FP熒光或陰陽性鑒定(plus/minus)PCR來檢查生根的芽的轉基因狀況。然后在組織培養(yǎng)中克隆性增殖陽性芽以確保有足夠的副本在轉化后14周可以與可用于測試的最初植物一起用于馬鈴薯葉甲測定。生物測定在植物培養(yǎng)室中下述M下轉基因馬鈴薯植物生長至8-12片展開葉階段23±2'C，60%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。通過將500毫升自倒放置于植物上來罩住所述植物，瓶頸牢固的置于盆內(nèi)泥土中，在M部切個開口，覆蓋上一細尼龍網(wǎng)用以通風，減少內(nèi)部凝結水并防止幼蟲逃走。在此生物測定中，將7只新生CPB幼蟲放置于每個轉基因植物的葉上。測試發(fā)夾構建物LD002(包含SEQIDNO240X標記為pGBNB001/28A至F)和空栽體(標記為pK7GWIWG2D(II)/llA至F)的每個轉化事件之6個轉基因馬鈴薯同胞(即來源于同一個愈傷組織)，以及兩個野生型植物。溫度、濕度和光照條件如上所述。在第7天(生物測定開始后7天)，對存活者數(shù)目計數(shù)，記錄每個植物的存活幼蟲平均重量。使用Spotfirelnc.的SpotfireDecisionSite9.0軟件(版本17.1.779)進行數(shù)據(jù)分析。在此實驗中，兩個同胞植物(標記為pGBNB001/28A和pGBNB001/28F)上所有馬鈴薯葉甲幼蟲在第7天死亡(圖7-LD),所述植物帶有發(fā)夾構建物LD002，來自于單個轉化事件。相比于空載體轉基因植物或野生型V系植物，這兩,物上的CPB幼蟲造成的攝食損傷非常低。實施例4:辣才艮猿葉曱(尸/^g^fowMustardleafbeetle,MLB)A.通過家族PCR克隆辣根猿葉甲PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016和PC027基因的部分序列。4吏用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)按照制造商的說明從第三幼蟲期辣根猿葉曱(辣才艮猿葉甲；來源Dr.CarolineMuller，Julius畫von-Sachs-InstituteforBiosciences,ChemicalEcologyGroup，UniversityofWuerzburg，Julius-von-Sachs國Platz3，D-97082Wuerzburg,Germany)中分離高質(zhì)量的總RNA。通過DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)處理按照制造商的說明除去RNA制備物中存在的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptTMIIIReverseTranscriptase,Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照制造商的說明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含PCOOl、PC003、PC005、PCOIO、PC014、PC016和PC027基因一部分的cDNA序列，按照制造商的說明進行一系列使用簡并引物和AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)的PCR反應。在表2-PC中給出了用于擴增每個基因的簡并引物序列。這些引物分別用于使用下述條件的各個PCR反應95'C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、55。C1分鐘和72。C1分鐘，然后是72。C10分鐘。在瓊脂糖皿上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并將女克隆入pCR4/TOPO載體(Cat.Nr.K4530-20,Invitrogen),并測序。分別通過如表2-PC中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。對應的部分^^列由表3-PC中給出的各個SEQIDNO分別表示。表3-PC提供了cDNA克隆的M酸序列，讀碼框的起始由方括號表示。B.產(chǎn)生辣根猿葉曱基因的dsRNA4吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。未兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子;^板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的乾序列。對于每個耙基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個乾序列有義模板的各個引物的序列在表8-PC中給出。表8-PC提供制M根猿葉甲靼序列的dsRNA片段之細節(jié)，其包括引物序列。PCR反應的條件如下95。Cl分鐘，然后是20個循環(huán)的95。C30秒、60°C30秒和72'C1分鐘，然后是15個循環(huán)的95'C30秒、50。C30秒和72'Cl分鐘，然后是72。C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上勤目同M的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個乾基因反義模板的各個引物序列在表8-PC中給出。在瓊脂糖皿上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化。混合所產(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商i兌明進行。所得每個耙基因的dsRNA有義鏈在表8-PC中給出。C.將辣根猿葉甲基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片殺^作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的靼基因的靶核苷^列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記物。使用含attL入門克隆(見實施例4A)和含attR終點載體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物載體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)議獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的說明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到了PCOOl、PCOIO、PC014、PC016和PC027基因各自的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)舍子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進才艮癌農(nóng)桿菌。對含有不同耙標的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒進行限制性酶消化(見實施例4B)。對于PC001,使用BsoBI和Pvul雙消化；對于PC010使用Pvul和PvuII雙消化；對于PC014,j吏用HincII、Pvul和Xhol三消4t;對于PC016,使用ApaLI單消化；對于PC027,使用Aval和Drdl雙消化。使用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少1個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進ToplO化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。發(fā)夾構建物的完整序列是-PCOOl(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO508中表示；-PC010(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO509中表示；-PC014(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO510中表示；-PC016(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDN0511中表示；-PC027(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO512中表示；表9-PC提供了每個發(fā)夾構建物的完整序列。D.使用油菜葉圓片測試dsRNA靶標抗辣根猿葉甲活性的實驗室試驗下文提供的實施例舉例說明了以下發(fā)現(xiàn)，辣才艮猿葉甲(mustardleafbeetle,MLB)幼蟲易感于經(jīng)口才ILV的對應于自身靶標基因的dsRNA。為了測試抗MLB幼蟲的不同雙鏈RNA樣本，采用了使用油菜(inm/mm"/7ws品種SWOban,來源NickBalaam,SwSeedLtd，49NorthRoad,Abington，Cambridge,CB16AS，UK)葉材料作為食物來源的葉圓片測定。在昆蟲室中相同品種的油菜上保持所述昆蟲培養(yǎng)物，條件為25士2'C,60±5%相對濕度，16小時光照/8小時黑暗的光周期。使用合適尺寸的穿孔器從4至6周齡的油菜植物上切下約1.1厘米直徑(或約0.95平方厘米)的圓片。在含有0.05%TritonX-100的Milli-Q水中將雙鏈RNA樣品稀釋到0.1微克/微升。通過施加25微升耙標PC001、PC003、PC005、PCOIO、PC014、PC016、PC027dsRNA和對照gfpdsRNA的稀釋溶液或者0.05%TritonX-100到近軸葉表面制備經(jīng)處理的葉圓片。將葉圓片干燥并單獨放置到24孔多孔板的每一個孔中，所述孔含有1亳升凝膠化的2%瓊脂，其有助于防止葉圓片干枯。將兩只新生MLB幼蟲放置于所逸板的每個孔中，然后用多孔塑料蓋將其蓋上。將所a(含有48只昆蟲的一個處理)分為4個重復，每個重復12只昆蟲(每行)。將含有所述昆蟲和葉圓片的平板保存在昆蟲室中，條件為25士2。C，60±5%相對濕度，16小時光照/8小時黑暗的光周期。用葉圓片喂食昆蟲2天，之后將它們轉移到含有新鮮處理的葉圓片的新平板。然后，在生物測定開始后4天，收集來自每個重復的昆蟲并轉移到含未處理新鮮油菜葉的培^。在第2、4、7、9和11天記錄幼蟲死亡率和平均重量。對于所有測試的靶標，在完好棵靶標dsRNA處理的油菜葉上飼養(yǎng)辣根猿葉甲幼蟲都導致幼蟲死亡率顯著增加，如圖1(a)所示。對于靶標PC010所測試的雙鏈RNA第9天導致100。/。幼蟲死亡率，對于PC027是在第11天。對于所有其它的靼標，相比于對照gfpdsRNA、僅僅0.05%TritionX-100或僅僅未處理的葉在第11天達到高死亡率值(平均值百分數(shù)士a0.05的置信區(qū)間)PC001(94.4±8.2),PC003(86.1±4.1),PC005(83.3±7.8)，PC014(63.9±20.6)，PC016(75.0±16.8)，gfpdsRNA(11.1±8.2),0.05%TritonX畫100(19.4±10.5)，僅僅葉(8.3±10.5)?；谒鼈兊钠骄亓吭u估存活幼蟲。對于所有所測試靶標，在所述生物測定4天后，辣根猿葉甲幼蟲具有顯著降低的平均重量；同僅僅喂食葉的幼蟲一樣，喂食對照gfpdsRNA或僅僅0.05%TritionX-100的昆蟲正常發(fā)育(圖1(b)-PC)。E.使用油菜葉圓片在不同濃度篩選dsRNA抗辣根猿葉曱幼蟲活性的實驗室試驗將25微升一系列10倍稀釋(從0.1微克/微升降至0.1納克/微升)的來自靼標PC010或PC027的dsRNA溶液表面施加到油菜葉圓片，如上文實施例4D所述。作為陰性對照，將僅僅0.05%TritonX-100施加到葉圓片。每個處理，測試24只辣根猿葉甲新生幼蟲，每孔兩只。在昆蟲飼養(yǎng)室中保存所述平板，條件是25士2。C，60±5%相對濕度，16:8小時的光照黑暗光周期。在第2天，將所述幼蟲轉移到含有新鮮dsRNA處理的葉圓片的新平板。在第4天對于靶標PC010，第5天對于靶標PC027,將來自每個重復的昆蟲轉移到含充足的未處理葉材料的培一。在第2、4、7、8、9和11天對耙標PC010，以及在第2、5、8、9和12天對靶標PC027評估所述甲蟲的存活與否。以低至1納克dsRNA/微升溶液的濃度^^根猿葉曱喂食含有所述兩個不同耙標(PC010和PC027)的完好棵dsRNA的油菜葉圓片導致高死亡率，如圖2(a)和(b)中所示。不同濃度dsRNA平均死亡率百分數(shù)±a0.05的置信區(qū)間對于耙標PC010在第11天，0ng/^il:8.3±9.4，0.1jig/^il:100，0.01ng/pl:79.2±20.6，0.001ng/jil:58.3±9.4，0.0001ng/^il:12.5±15.6，對于乾標PC027在第12天，0ng/^il:8.3±9.4，0,1ng/^il:95.8±8.2，0.01Hg/pl:95.8±8.2，0.001ng/^il:83.3±13.3，0.0001ng/jil:12.5±8.2。F.轉基因擬南芥(Arabidopsis仇aliana)植物上#>坊(Myzusperiscae)蟲害的實驗室試驗產(chǎn)生轉基因植物用浸花法(floraldip)(CloughandBent(1998)PlantJournal16735-743)轉化擬南芥。將植物的空氣中部分在含下列物質(zhì)的溶液中孵育數(shù)秒，所述溶液含有5%蔗糖、來自過夜培養(yǎng)物的重懸根癌農(nóng)桿菌(Jgra^"er/w/M似w^/""'ews)C58C1Rif菌林細胞以及0.03%的表面活性劑SilwetL-77。接種后，用透明塑料覆蓋植物16個小時以保持濕潤。為了增加轉化效率，一周后重復所述步驟。隨種子成熟停止?jié)菜?，收獲干燥種子，冷處理兩天。滅菌后，將種子置于含卡那霉素的培養(yǎng)基中以選擇轉化植物。轉移所選擇的植物到泥土用以最優(yōu)化的產(chǎn)生T2種子。生物測定通過使得分離的T2種子在合適選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)來選擇轉基因擬南芥植物。當這些轉基因植物的根完全形成時，將它們轉移到新鮮人工培養(yǎng)基或泥土，使得它們在最優(yōu)條件下生長。測試整個轉基因植物對桃蜂若蟲的抗性，顯示(l)顯著抵抗攝食若蟲對植物的損害，(2)增加若蟲的死亡率，和/或(3)降低若蟲存活者的重量(或者任何其它異常的昆蟲發(fā)育)。實施例5:墨西哥豆胍蟲vanv幼s,Mexicanbeanbeetle,MBB)A.克隆墨西哥豆瓢蟲部分基因序列從4個不同幼蟲期墨西哥豆瓢蟲(墨西哥豆瓢蟲；來源ThomasDorsey,SupervisingEntomologist,NewJerseyDepartmentofAgriculture,DivisionofPlantIndustry,BureauofBiologicalPestControl,PhillipAlampiBeneficialInsectLaboratory,POBox330，Trenton,NewJersey08625-0330，USA)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville,Maryland,USA)按照使用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照使用說明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含EV005、EV009、EVOIO、EV015和EV016基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照4吏用i兌明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-EV中給出，其顯示了包含引物序列和所得cDNA序列的墨西哥豆瓢蟲乾基因。這些引物分別用于各個PCR反應，其4吏用以下條件對于EV005和EV009，95。Cl0分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、50。C1分鐘和72'Cl分30秒，然后是72°C7分鐘；對于EV014，95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、53。C1分鐘和72'C1分鐘，然后是72'C7分鐘；對于EV010和EV016,95eClO分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、54'C1分鐘和72'C1分40秒，然后是72。C7分鐘。在瓊脂糖^MJi分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR4/TOPO栽體(Cat.Nr.K453020，Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-EV中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。分別通過如表3-EV中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分M酸序列，其中讀碼框的起點以方括號表示。B.產(chǎn)生墨西哥豆瓢蟲基因的dsRNA1吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。i兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的乾序列。對于每個耙基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個靼序列有義模板的各個引物的序列在表8-EV中給出。PCR反應的條件如下95。Cl分鐘，然后是20個循環(huán)的95'C30秒、60°C30秒和72°C1分鐘，然后是15個循環(huán)的95'C30秒、5(TC30秒和72'Cl分鐘，然后是72。C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上勤目同*的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個耙基因反義模板的各個引物序列在表8-EV中給出。在瓊脂糖皿上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化。混合所產(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個耙基因的dsRNA有義鏈在表8-EV中給出。C.將墨西哥豆鬆蟲基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片^作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的靼基因的耙核苷^f列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記。使用含attL入門克隆(見實施例5A)和含attR終點載體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物載體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)議獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的說明，使用LRClonaseTMII酶混合物(Cat.Nr.11791-020,Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到了每個耙基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進根癌農(nóng)桿菌。對>^有不同把標的pCR8/GW/TOPO質(zhì)粒進行限制性酶消化(見實施例B)。使用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25°C孵育至少l個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37'C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進ToplO化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。D.使用豆葉圓片測試dsRNA靶標抗墨西哥豆胍蟲幼蟲活性的實驗室試驗下文提供的實施例舉例說明了以下發(fā)現(xiàn)，墨西哥豆鉱蟲(Mexicanbeanbeetle,MBB)幼蟲易感于經(jīng)口攝入的對應于自身把基因的dsRNA。為了測試抗MBB幼蟲的不同雙鏈RNA樣品，采用了4吏用油豆角(/Vifl^/"svw/g肌、品種Montano，來源AveveNV,Belgium)葉材料作為食物來源的葉圓片測定。在昆蟲室中相同品種的豆上保持所述昆蟲培養(yǎng)物，條件為25士2'C，60±5%相對濕度，16小時光照/8小時黑暗的光周期。使用合適尺寸的穿孔器從1至2周齡的豆植物上切下約1.1厘米直徑(或約0.95平方厘米)的圓片。在含有0.05%TritonX-100的Milli-Q水中將雙鏈RNA樣品稀釋到l微克/微升。通過施加25孩￡升耙標Ev005,Ev010,Ev015,Ev016dsRNA和對照gfpdsRNA的稀釋溶液或者0.05%TritonX-100到近軸葉表面制備經(jīng)處理的葉圓片。將葉圓片千燥并單獨放置到24孔多孔板的每一個孔中，所述孔含有1亳升皿化的2%瓊脂，其有助于防止葉圓片干枯。將一只新生MBB幼蟲放置于所ii^L的每個孔中，然后用多孔塑料蓋將其蓋上。將所述板分為3個重復，每個重復8只昆蟲(行)。將^、有所述昆蟲和葉圓片的平柘J^在昆蟲室中，條件為25土2'C，60±5%相對濕度，16小時光照/8小時黑暗的光周期。用葉圓片喂食昆蟲2天，之后將它們轉移到^^有新鮮處理的葉圓片的新平板。然后，在生物測定開始后4天，每天都將所述昆蟲轉移到含未處理新鮮豆葉的培一直至第10天。在笫2天以及之后每隔一天記錄幼蟲死亡率。用含表面施加的完好棵耙標dsRNA的油豆角葉飼養(yǎng)墨西哥豆狐蟲幼蟲導致幼蟲死亡率顯著增加，如圖1所示。8天后，所測試的靶標EV010、Ev015和Ev016雙鏈RNA導致100%死亡率，而耙標Ev005dsRNA花費10天殺死所有幼蟲。在含對照gfpdsRNA或僅^M^面活性劑TritonX-100的葉圓片飼養(yǎng)的大部分昆蟲在整個生物測定中保持存活(圖l-EV)。E.使用豆葉圓片測試dsRNA耙標抗墨西哥豆瓢蟲成蟲活性的實驗室試驗下文提供的實施例舉例說明了以下發(fā)現(xiàn)，墨西哥豆瓢蟲成蟲易感于經(jīng)口攝入的對應于自身乾基因的dsRNA。在與墨西哥豆胍蟲幼蟲相似的生物測定"^殳置中，測試MBB成蟲抗表面施加到豆葉圓片的雙鏈RNA。每個耙標Ev010、Ev015和Ev016的測試dsRNA在0.05。/。TritonX-100中稀釋至終濃度為0.1微克/微升。通過將30微升測試溶a面施加到每個圓片上對豆葉圓片進行處理。使所述圓片完全干燥，然后將其放置24孔板每個孔中2%凝膠化瓊脂薄片上。從培養(yǎng)籠中收集三日齡成蟲，禁食7-8小時，然后在生物測定板的每個孔中放置一只成蟲(因此每個處理24只成蟲)。所*^在昆蟲飼養(yǎng)室中(以與MBB幼蟲相同的條件保存24小時)，之后將所述成蟲轉移到含新鮮dsRNA處理葉圓片的新板。再過24小時，收集來自每個處理的成蟲，將其放置于30厘米xl5厘米xl0厘米的塑料盒中，所述盒包含兩盆未處理的3周齡豆植物。從第4天到第11天評估昆蟲死亡率。所有三個被墨西哥豆胍蟲成蟲攝入的耙標dsRNA(Ev010、Ev015和Ev016)導致死亡率從第4天(生物測定開始后4天)開始增加，如圖2-EV(a)所示。從第5天開始，觀察到最初用靶標dsRNA處理的豆葉圓片喂食的昆蟲與用含對照gfpdsRNA或表面活性劑TritonX-100圓片喂食的昆蟲之間進食模式的明顯改變。對所有三個靶標，相比于gfpdsRNA和僅^面活性劑對照，明顯可見MBB成蟲對未處理豆植物葉損傷的減少，雖然水平各有不同；對昆蟲喂食乾標15造成對豆葉最小的損傷(圖2-EV(b))。實施例6:棉鈴象甲(Jw幼owo附wsgnmfife,Cottonbollweevil,CBW)A.克隆棉鈴象甲部分基因序列從3齡棉鈴象曱(棉鈴象甲；來源DrGaryBenzon，BenzonResearchlnc，7KuhnDrive,Carlisle,Pennsylvania17013,USA)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)按照使用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照使用說明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含AG001、AG005、AGOIO、AG014和AG016基因一部分的cDNA序列，進行了使用筒并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照4吏用i兌明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-AG中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下^4h對于AG001、AG005和AG016,95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、50'Cl分鐘和72'Cl分30秒，然后是72'C7分鐘；對于AG010，95'C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、54°C1分鐘和72°C2分30秒，然后是72°C7分鐘；對于AG014,95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、55°C1分鐘和72°C1分，然后是72°C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR8/GW/TOPO栽體(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-AG中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指部分序列。分別通過如表3-AG中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分^J^酸序列。B.產(chǎn)生棉鈴象甲基因的dsRNA寸吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。;兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子^^板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的靼序列。對于每個乾基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個耙序列有義模板的各個引物的序列在表8-AG中給出。按如下進行梯度降溫(touch-down)PCR反應95°C1分鐘，然后是20個循環(huán)的95。C30秒、60。C30秒(每個循環(huán)降低0.5°C)和72。C1分鐘，然后是15個循環(huán)的95°C30秒、50。C30秒和72°Cl分鐘，然后是72°C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上述相同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個耙基因反義模板的各個引物序列在表8-AG中給出。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaCK)4沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個耙基因的dsRNA有義M表8-AG中給出。C.將棉鈴象甲基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA千擾機制通過dsRNA片段起作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的靼基因的耙核苷,列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記物。使用含attL入門克隆(見實施例6A)和含attR終點載體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組^^應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物載體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)i義獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的^兌明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到每個靶基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元栽體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進才艮癌農(nóng)桿菌。對含有不同乾標的pCR8/GW/TOPO進行限制性酶消化(見實施例6B)。4吏用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少1個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進Topl0化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。D.測試表達dsRNA乾標之大腸桿菌抗棉鈴象甲的實驗室試驗基于植物的生物測定用化學誘導表達dsRNA的細菌懸液噴灑整個植物，然后用所述植物喂食CBW。它們在植物培養(yǎng)室中生長。通過將500亳升塑料瓶倒置于植物上來革住所述植物，瓶頸牢固的置于盆內(nèi)泥土中，在瓶底部切個開口，覆蓋上一密尼龍網(wǎng)用以通風，減少內(nèi)部凝結水并防止幼蟲逃走。將CBW置于籠中每個處理過的植物上。用含pGXXX0XX或pGN29質(zhì)粒的;^桿菌菌林AB301-105(DE3)懸液處理植物。將不同量的細菌施加給植物例如66、22和7單位，其中一個單位定義為600納米波長光密度值是1的1亳升細菌懸液中109個細菌細胞。在每種情況下，用噴霧器將總體積1至10毫升噴灑給植物。在此試驗中每個處理使用一棵植物。對存活者數(shù)量進行計數(shù)，記錄每個存活者的重量。用表達來自pGXXX0XX的靶標dsRNA的大腸桿菌菌林AB301-105(DE3)懸液i灑植物導致相比于pGN29對照昆蟲死亡率顯著增加。這些實驗顯示在野生型或RNA酶III缺乏細菌表達系統(tǒng)中對應于昆蟲基因耙序列的雙鏈RNA對昆蟲有毒性，其形式為顯著增加昆蟲死亡率和存活幼蟲生長/發(fā)育遲緩。從這些實驗中還明顯提供了通過應用噴霧制劑有效保護植物/作物免受昆蟲破壞的實例，所述制劑由表i^t應于昆蟲基因靶標的雙鏈RNA的細菌組成。實施例7:赤擬谷盜(7>/辦<//"附cflstowew附，Redflourbeetle,RFB)A.克隆赤擬谷盜部分基因序列從所有不同階段的赤擬谷盜(赤擬谷盜；來源DrLaraSenior,InsectInvestigationsLtd,CapitalBusinessPark,Wentloog,Cardiff,CF32PX,Wales,UK)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照使用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照使用說明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含TC001，TC002,TCOIO，TC014和TC015基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照4吏用i兌明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-TC中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、50。C1分鐘和72。C1分30秒，然后是72'C7分鐘(TCOOl、TC014、TC015);95'Cl0分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、54。Cl分鐘和72。C2分30秒，然后是72。C7分鐘(TC010);95。Cl0分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、53°C1分鐘和72。C1分，然后是72°C7分鐘(TC002)。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR8/GW/t叩o載體(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-TC中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。分別通過如表3-TC中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分#^*列。B.產(chǎn)生赤擬谷盜基因的dsRNA葉吏用市售試劑盒T7RibomaxExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。為兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的乾序列。對于每個耙基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個靼序列有義模板的各個引物的序列在表8-TC中給出。PCR反應條件如下95℃1分鐘，然后是20個循環(huán)的95℃30秒、60℃30秒(-0.5℃/循環(huán))和72℃1分鐘，然后是15個循環(huán)的95℃30秒、50℃30秒和72℃1分鐘，然后是72℃10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上勤目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個靼基因反義模板的各個引物序列在表8-TC中給出。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑敘QiaquickPCRPurificationKit.Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向才莫板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個乾基因的dsRNA有義鏈在表8-TC中給出。C.將赤擬谷盜基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片a作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的靼基因的靶核苷^列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記物。使用含attL入門克隆(見實施例7A)和含attR終點栽體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物載體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)i義獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的i兌明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到每個靶基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進才艮癌農(nóng)桿菌。對含有不同把標的pCR8/GW/TOPO進行P艮制性酶消化(見實施例7B)。<吏用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少1個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進ToplO化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。D.使用人工飼料測試dsRNA靶標抗赤擬谷盜幼蟲活性的實驗室試驗下文提供的實施例舉例說明了以下發(fā)現(xiàn)，赤擬谷盜(RFB)幼蟲易感于經(jīng)口攝入的對應于自身靼基因的dsRNA。赤擬谷盜培養(yǎng)于InsectInvestigationsLtd.(來源ImperialCollegeofScience,TechnologyandMedicine,SilwoodPark,Berkshire,UK)。根據(jù)公司SOP/251/01培養(yǎng)昆蟲。簡言之，所述甲蟲居住于塑,或箱中。其具有頂部開口用以通風。頂部裝有網(wǎng)并用彈性帶固定以防止逃脫。將幼蟲飼養(yǎng)培養(yǎng)基(面粉)放置于可飼養(yǎng)甲蟲的容器中。在控溫室中培養(yǎng)保藏的產(chǎn)品曱蟲群，條件為25士3'C，16:8小時的明亮黑暗循環(huán)。將乾標TC014的雙鏈RNA(具有對應于SEQIDNO799的序列)加入到面粉和乳粉(全麥粉乳粉比為4:l)的混合物中，使之過夜干燥。分別制備每個重復:將100微升10微克/微升dsRNA溶液(1亳克dsRNA)加入到0.1克面粉/乳混合物。將千燥的混合物研磨成細粉。在培一(55毫米直徑)中維持昆蟲，將雙層濾紙呈線型放置。將經(jīng)處理的飼料放置于兩個濾紙層之間。將10只1齡混合性別的幼蟲放置于每個亞(重復)中。每個處理進行4次重復。對照是Milli-Q水。定期進行評估(存活數(shù))。在試驗過程中，測試條件是25-33'C和20-25。/o相對濕度，12:12小時的光照黑暗光周期。相比于僅僅飼料對照，赤擬谷盜幼蟲在經(jīng)耙標TC014dsRNA處理人工飼料上隨時間存活率顯著降低，如圖1-TC所示。實施例8:杉匕螃(Myzwsff^yfcflg,Greenpeachaphid，GPA)A.克隆桃蜂部分基因序列從桃奸若蟲(桃奸；來源DrRachelDown,Insect&PathogenInteractions,CentralScienceLaboratory,SandHutton，York,Y0411LZ,UK)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照使用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)按照4吏用i兌明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含MPOOl、MP002、MPOIO、MP016和MP027基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照4吏用說明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-MP中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件對于MPOOl、MP002和MP016,95'C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、50°C1分鐘和72°Cl分30秒，然后是72。C7分鐘；對于MP027,使用梯度降溫程序95。Cl0分鐘，然后是10個循環(huán)的95°C30秒、60°C40秒(每循環(huán)降低1°C)和72°C1分10秒，然后是30個循環(huán)的95。C30秒、50'C40秒和72-C1分10秒，然后是72。C7分鐘；對于MPOIO，95°C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、54。C1分鐘和72'C3分，然后是72。C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit，Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并將其i隆入pCR8/GW/topo載體(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-MP中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。分別通過如表3-MP中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分M酸序列。B.產(chǎn)生書fc奸基因的dsRNA4吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。^兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的耙序列。對于每個粑基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個靼序列有義模板的各個引物的序列在表8-MP中給出。按照如下M進行梯度降溫PCR反應95。C1分鐘，然后是20個循環(huán)的95°C30秒、55。C30秒(對于MPOOl、MP002、MP016、MP027和gfp)或者50'C30秒(對于MP010)并且每循環(huán)降低0.5。C和72。C1分鐘，然后是15個循環(huán)的95'C30秒、45°C30秒和72。C1分鐘，然后是72'C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上述相同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個靼基因反義模板的各個引物序列在表8-MP中給出。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個靼基因的dsRNA有義^表8-MP中給出。C.將桃奸基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片^^作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的耙基因的靶核苷^列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記。使用含attL入門克隆(見實施例8A)和含attR終點載體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物載體pK7GWIWG2D(II)才艮據(jù)材料轉移協(xié)i義獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的說明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到MP001,MP002,MPOIO，MP016和MP026每個基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進根癌農(nóng)桿菌。對所有克隆進pCR8/GW/topo的靼標進行Alw"I限制性酶消化(見實施例8B)。4吏用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少l個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進Topl0化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分沖斤選擇陽性克隆。發(fā)夾構建物的完整序列如下-MP001(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO1066中表示；-MP002(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO1067中表示；-MP010(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO1068中表示；-MP016(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO1069中表示；-MP027(有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義)在SEQIDNO1070中表示。表9-MP提供了每個發(fā)夾構建物的完整序列。D.使用液體人工飼料測試dsRNA耙標抗桃辨活性的實驗室試驗基于適于豌豆辨(爿o;"/^s/p/^w/7&W附)的飼料制備用于桃辨的液體人工飼料，如Febvayetal(1988)[Influenceoftheaminoacidbalanceoiltheimprovementofanartificialdietforabiotypeofy4cj^A柳》/row/usMfft(HomopteraAphididae)/Z^/662449-2453所述，但是進行了一些修改。按如下制備所述飼料的氨基酸成分以毫克/100毫升計，丙氨酸178.71，p-丙氨酸6.22，精氨酸244.9，天冬酰胺298.55,天冬氨酸88.25,半胱氨酸29.59,谷氨酸149.36，谷氨酰胺445.61，甘氨酸166.56，組氨酸136.02,異亮氨酸164.75,亮氨酸231.56，鹽酸賴氨酸351.09，蛋氨酸72.35，鳥氨酸(HC1)9.41，苯丙氨酸293，脯氨酸129.33，絲氨酸124.28，蘇氨酸127.16,色氨酸42.75,酪氨酸38.63,L-纈氨酸1卯.85。除了酪氨酸之外所述氨基酸溶解于30毫升Milli-Q水，酪氨酸在加入到氨基酸混合物之前首先溶解于數(shù)滴1M鹽酸中。以如下5x濃縮儲液的形式制備飼料的維生素混合物成分以亳克/升計，氨基苯甲酸100、抗壞血酸1000、生物素l、泛酸釣50、氯化膽堿500、葉酸10、肌醇420、煙酸IOO、鹽酸吡,醇25、核黃素5、鹽酸硫胺25。將核黃素在50。C溶解于l毫升水中，然后加入到維生素混合物儲液。所述維生素混合物被等分為每等份20毫升，保存于-20。C。將一等份維生素混合物加入到氨基酸溶液。分別以下述量將蔗糖和MgS04*7H20加入混合物20克和242毫克。按如下制備痕量金屬溶液以毫克/100亳升計，CuS045H204.7,FeCl36H2044.5,MnCl24H206.5,NaCl25.4，ZnCl28.3。將10毫升的痕量金屬溶液和250毫克KH2P04加入到飼料，加入Milli-Q水至液體飼料務沐積為100毫升。用1MKOH溶液將飼料pH調(diào)節(jié)到7。通過0,22微米濾片(Millipore)將液體飼料過濾滅菌。書fc辨(#>辨；來源DrRachelDown,Insect&PathogenInteractions,CentralScienceLaboratory,SandHutton，York,Y0411LZ，UK)飼養(yǎng)于受控環(huán)境室中帶70微米網(wǎng)的鋁框架籠中的4至6周齡油茱上(丑nww'oim"/7"s品種SWOban，來源NickBalaam,SwSeedLtd，49NorthRoad,Abington,Cambridge,CB16AS，UK),飼養(yǎng)條件如下23±2°C，60±5%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。生物測定開始之前的一天，從飼養(yǎng)籠中收集成蟲并放置于培P中新鮮摘下的油菜葉上，將其在昆蟲室中放置過夜。第二天，選取l齡若蟲轉移到銅養(yǎng)室。飼養(yǎng)室包括10只放置于小培#^(直徑3厘米)中的1齡若蟲，所述培一蓋有單層薄的拉伸封口膜(parafilmM)，其上加有50微升飼料。用第二層封口膜密封所述室，在與成蟲培養(yǎng)相同的條件下孵育。每隔一天更新帶有dsRNA的飼料，在第8天(即生物測定開始后第8天)評估昆蟲的存活率。每個處理，同時建立5個生物測定飼養(yǎng)室(重復)。將測試和對照(gfp)dsRNA溶液加入到飼料中至終濃度為2微克/微升。所述飼養(yǎng)室保持在23士2。C，60±5%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。通過GraphPadPrism版本4進行Mann-Whitney檢驗，以確定耙標27(MP027)和gfpdsRNA的中值之間是否有顯著差異。在所述生物測定中，使用飼養(yǎng)室將添加有耙標27(SEQIDNO1061)完好棵dsRNA的液體人工飼料喂食給桃辨若蟲，導致死亡率顯著增加，如圖1所示。對于乾標27、gfpdsRNA和僅僅飼料本身的處理，存活者平均百分數(shù)分別是2、34和82。使用Mann-Whitney檢驗比較靶標027和gfpdsRNA組，得到0.004的單尾P值，其顯示耙標027的中值與gfpdsRNA的預期較大中值有顯著差異(P<0.05)。加有靶標27dsRNA的液體飼料上的桃蜂明顯小于僅僅飼料或加有gfpdsRNA對照的飼料上飼養(yǎng)的桃辨(數(shù)據(jù)未顯示)。E.轉基因4以南芥(y4rfl6zV/o/7sis植物上杉匕辨(AfysMS/;en'srfle)寸曼害的實驗室試驗產(chǎn)生轉基因植物用浸花法(CloughandBent(1998)PlantJournal16:735-743)轉化擬南芥。將植物的空氣中部分在含下列物質(zhì)的溶液中孵育數(shù)秒，所述溶液含有5%蔗糖、來自過夜培養(yǎng)物的重懸根癌農(nóng)桿菌(jgra辦fl"en'w附似/Me/"c^/w)菌林C58C1Rif細胞以及0.03%的表面活性劑SilwetL-77。接種后，用透明塑料覆蓋植物16個小時以保持濕潤。為了增加轉化效率，一周后重復所述步驟。隨種子成熟停止?jié)菜?，收獲千燥種子，冷處理兩天。滅菌后，將種子置于含卡那霉素的培養(yǎng)基中以選擇轉化植物。轉移所選擇的植物到泥土用以最優(yōu)化的產(chǎn)生T2種子。生物測定通過使分離的T2種子在合適選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)來選擇轉基因擬南芥植物。當這些轉基因植物的根完全形成時，將它們轉移到新鮮人工培養(yǎng)基或泥土，使得它們在最優(yōu)條件下生長。測試整個轉基因植物對桃蚜若蟲的抗性，顯示(1)顯著抵抗攝食若蟲對植物的損害，(2)增加若蟲的死亡率，和/或(3)降低存活若蟲的重量(或者任何其它異常的昆蟲發(fā)育)。實施例9.褐飛虱(7V//^mrvgtofaggws，Brownplanthopper,BPH)A.克隆褐飛鼠部分基因使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.I8O8OO44,Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照使用i兌明從褐飛虱(來源Dr.J.A.Gatehouse,Dept.BiologicalSciences,DurhamUniversity,UK)高質(zhì)量的總RNA中產(chǎn)生cDNA。為了分離包含NLOOl、NL002、NL003、NL004、NL005、NL006、NL007、NL008、NL009、NLOIO、NLOll、NL012、NL013、NL014、NL015、NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照使用說明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-NL中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件對于NL001,95'C5分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、55。C1分鐘和72°C1分鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL002，95。C3分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、55'Cl分鐘和72°C1分鐘，然后是72°C10分鐘；對于NL003,95。C3分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、61。C1分鐘和72'C1分鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL004,95'C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、51。Cl分鐘和72°Cl分鐘；對于NL005,95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、54°Cl分鐘和72。C1分鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL006,95°C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、55。C1分鐘和72'C3分30秒，然后是72'C10分鐘；對于NL007，95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、54°C1分鐘和72°C1分15秒鐘，然后是72°C10分鐘；對于NL008和NL014,95'C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、53-Cl分鐘和72-Cl分鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL009、NLOll、NL012和NL019,95°C10分4中，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、55。C1分鐘和72。C1分鐘，然后是72'ClO分鐘；對于NLOIO,95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、54°C1分鐘和72。C2分30秒鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL013,95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、54°C1分鐘和72'Cl分10秒鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL015和NL016,95°C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、54。C1分鐘和72。C1分40秒，然后是72。C10分鐘;對于NL018,95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95'C30秒、54°C1分鐘和72'Cl分35秒鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL021、NL022和NL027，95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、54。C1分鐘和72'Cl分45秒，然后是72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR8/GW/topo載體(Cat.Nr.K250020，Invitrogen),并測序。分別通過如i2-NL中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所迷部分序列。分別通過如表3-NL中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分M^列。B.通過EST序列克隆褐飛虱NL023基因的部分序列使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照使用說明從褐飛虱(來源Dr.J.A.Gatehouse,Dept.BiologicalSciences,DurhamUniversity,UK)高質(zhì)量的總RNA中產(chǎn)生cDNA。從褐飛虱cDNA中擴增部分cDNA序列NL023,其對應于公共數(shù)據(jù)庫GenBank中的褐飛虱EST序列，登錄號CAH65679.2。為了分離包含NL023基因部分的cDNA序列，按照制造商的說明進行使用基于EST的特異性引物的一系列PCR反應，其使用了PerfectShotTMExTaq(CatN。，RR005A,TakaraBioInc.)。對于NL023,在兩個獨立的PCR反應中使用特異性引物oGBKW002和oGBKW003(在本文分別由SEQIDNO1157和SEQIDNO1158表示)，其條件如下95。C3分鐘，然后是30個循環(huán)的95°C30秒、56。C30秒和72。C2分鐘，然后是72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)所得PCR片段，并將其i隆入pCR4-topo載體(CatN°K4575-40,Invitrogen)，并測序。本文中由SEQIDNO1111表示對兩個PCR產(chǎn)物測序所得的一致序列，其指NL023基因的部分序列。本文中由SEQIDNO1112表示相應的部分絲紗列。C.產(chǎn)生褐飛H基因的dsRNAl吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。^兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的靼序列。對于每個耙基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個乾序列有義模板的各個引物的序列在表8-NL中給出。PCR反應frff如下對于NL001和NL002，94。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的94'C30秒、60'C30秒和72'Cl分鐘，然后是72'C10分鐘；對于NL003,94°C4分鐘，然后是35個循環(huán)的94°C30秒、66'C30秒和72°Cl分鐘，然后是72'C10分鐘；對于NL004、NL006、NL008、NL009、NL010和NL019,95°C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95。C30秒、54'C30秒和72'Cl分鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL005和NL016,95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95'C30秒、57'C30秒和72'Cl分鐘，然后是72'C10分鐘；對于NL007和NL014，95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95。C30秒、51。C30秒和72。C1分鐘，然后是72'C10分鐘；對于NLOll、NL012和NL022,95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95。C30秒、53'C30秒和72'Cl分鐘，然后是72'C10分鐘；對于NL013、NL015、NL018和NL021，95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95'C30秒、55。C30秒和72'Cl分鐘，然后是72。C10分鐘；對于NL023和NL027,95°C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95'C30秒、52。C30秒和72。C1分鐘，然后是72。C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上勤目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個耙基因反義模板的各個引物序列在表8-NL中給出。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)進行純化。混合所產(chǎn)生的T7正向和反向^^板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行，但進行如下修改RNA沉淀在70。/。乙醇中洗兩次。所得每個耙基因的dsRNA有義鏈在表8-NL中給出。用于針對綠色熒光蛋白(gfp)對照的使用T7引物的PCR反應的才莫板DNA是質(zhì)粒pPD96.12(theFireLab，http:〃genome-www.stanford.edu/group/fire/)，其含有,皮3個合成內(nèi)含子隔開的野生型gfp編碼序列。使用市售試劑盒T7RibomaxExpressRNAiSystem(CatN°P1700,Promega)合成雙鏈RNA。在兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的耙序列。對于gfp，使用特異性T7正向引物oGAU183和特異性反向引物oGAU182(本文中分別由SEQIDN0236和SEQIDNO237表示)在PCR反應中產(chǎn)生有義T7模板，其i件如下95。C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95'C30秒、55'C30秒和72'C1分鐘，然后是72-C10分鐘。使用特異性正向引物oGAU181和特異性T7反向引物oGAU184(本PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。在瓊脂糖皿上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行，但進行如下修改RNA沉淀在70%乙醇中洗兩次。本文中，所得dsRNA的有義鏈由SEQIDN0235表示。D.使用液體人工飼料篩選dsRNA靶標抗褐飛虱活性的實驗室試驗如Koyama(1988)[Artificialrearingandnutritionalphysiologyoftheplanthoppersandleafhoppers(HomopteraDelphacidaeandDeltocephalidae)onaholidicdietJARQ2220-2刀所述制備用于褐飛虱的液體人工飼料(MMD-1)，但改變了飼料蔗糖成分的終濃度使用14.4%(重量/體積)。將飼料成分制成為獨立的濃縮物10x礦物質(zhì)儲液(保存于4°C),2x氨基酸儲液(保存于-20'C)和10x維生素儲液(保存于-20'C)。生物測定臨開始時混合所述儲液成分至4/3x濃度，以允許用測試dsRNA溶液(4x濃度)進行稀釋，調(diào)節(jié)pH至6.5,過濾滅菌并分裝為約500微升等分。褐飛虱飼養(yǎng)于受控環(huán)境室中2-3月齡7jc稻(s她'vflcvTaichungNativel)植物上27±2°C，80%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。飼養(yǎng)室包含10只1齡或2齡若蟲，其置于蓋有單層薄拉伸封口膜(parafilmM)的小培#(直徑3厘米)中，所述封口膜上加有50微升飼料。用第二層封口膜密封所述室，在與成蟲培養(yǎng)相同的條件下孵育。每隔一天更新帶有dsRNA的伺料，每天評估昆蟲的存活率。每個處理，同時建立5個生物測定飼養(yǎng)室(重復)。將測試和對照(gfp)dsRNA溶#入到飼料中至終濃度為2毫克/毫升。所述飼養(yǎng)室保存在27士2'C，80%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲線模型對昆蟲存活數(shù)據(jù)進行分析，使用時序檢驗(Prism版本4.0)比較組之間的存活率。如四個獨立的生物測定中所示，使用飼養(yǎng)室用含完好棵dsRNA的液體人工飼料喂食褐飛虱導致若蟲死亡率顯著增加(圖1(a)-(d)-NL;表10-NL(a)-(d))(DurhamUniversity),這些結果證明，對應于不同必需BPH基因的dsRNA顯示出對褐飛虱的顯著毒性。在這些生物測定中，gfpdsRNA對BPH存活的影響與僅僅喂食飼料的存活率沒有顯著差異。表10-NL(a)-(d)顯示褐飛虱在含有2亳克/亳升(終濃度)下述靼標的人工飼料上的存活之總結；在表10-NL(a)中NL002、NL003、NL005、NL010;在表IO畫NL(b)中NL009、NL016;在表IO畫NL(c)中NL014、NL018;和表10-NL(d)中NL013、NL015、NL021.在存活分析欄中，RNAi的作用如下表示+=相比于gfpdsRNA對照存活率顯著下降U<0.05);-=相比于gfpdsRNA對照存活率沒有顯著差異。使用時序檢驗比較存活曲線(在僅僅飼料和添加了測試dsRNA的飼料、gfpdsRNA和測試dsRNA、以及僅僅飼料和gfpdsRNA之間)。E.使用人工飼料針對抗褐飛虱活性在不同濃度下篩選dsRNA的實驗室試驗將50微升添加了不同濃度靶標NL002dsRNA(即l、0.2、0.08和0.04亳克/毫升，終濃度)的液體人工飼料施加到褐飛氛飼養(yǎng)室。帶有dsRNA的飼料每隔一天更新一次，每天評估昆蟲存活。每個處理，同時建立5個生物測定飼養(yǎng)室(重復)。所述飼養(yǎng)室保存在27士2。C，80%相對濕度，16:8小時的明亮黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲線模型對昆蟲存活數(shù)據(jù)進行分析，使用時序檢驗(Prism版本4.0)比較組之間的存活。喂食添加有不同濃度完好棵耙標NL002dsRNA的液體人工飼料導致在低至0.04毫克dsRNA/毫升飼料的終濃度下BPH死亡率顯著高于僅僅喂食飼料的存活，如圖2-NL和表ll-NL所示。表11-NL總結了添加了1、0.2、0.08和0.04毫克/亳升(終濃度)靶標NL002的人工飼料喂食試驗中褐飛虱的存活。在存活分析欄中，RNAi的作用顯示如下+=相比于僅僅祠料對照存活率顯著下降(a<0.05);-=相比于僅僅飼料對照沒有顯著差異。使用時序檢驗比較存活曲線。實施例10:二化螺(C77<w卯/T5^fe，Ricestripedstemborer)A.通過家族PCR克隆二化螟基因部分序列從4個不同幼蟲階段的二化螟中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)按照4吏用i兌明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。4吏用市售試劑盒(SuperScriptTMIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照4吏用i兌明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含CS001、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、CSOll、CS013、CS014,、CS015、CS016和CS018基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照使用說明進行。用于擴增每個基因的筒并引物序列在表2-CS中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件95'C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、55。C1分鐘和72°C1分鐘，然后是72。C10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR4/topo載體(Cat.Nr.K250020,Invitrogen),并測序。分別通過如i2-CS中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。分別通過如表3-CS中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分"tj^酸序列。B.產(chǎn)生二化螟基因的dsRNA4吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700，Promega)合成毫克量的dsRNA。為兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的乾序列。對于每個乾基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個靼序列有義模板的各個引物的序列在表8-CS中給出。PCR反應條件如下95'C4分鐘，然后是35個循環(huán)的95。C30秒、55。C30秒和72。C1分鐘，然后是72。C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用與上i^目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個靼基因反義模板的各個引物序列在表8-CS中給出。在瓊脂糖^上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑封QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商i兌明進行。所得每個耙基因的dsRNA有義鏈在表8-CS中給出。C.將二化螟基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片^^作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的耙基因的耙核苷^f列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記物。使用含attL入門克斷見實施例10A)和含attR終點栽體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物栽體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)i義獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的i兌明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020，Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到每個靶基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進根癌農(nóng)桿菌。對含有不同耙標的pCR8/GW/topo進行限制性酶消化(見實施例10B)。4吏用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少l個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進ToplO化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。D.使用人工飼料測試dsRNA靶標抗二化螟幼蟲活性的實驗室試驗二化螟(來源Syngenta,Stein，Switzerland)維持在基于Kamano和Sato,1985(HandbookofInsectRearingVolumesI&IIPSinghandRFMoore,eds,ElsevierSciencePublishers,AmsterdamandNewYork,1985，pp448)所述經(jīng)修改的人工飼料上。簡言之，一升飼料的制備如下將20克瓊脂加入到980毫升Milli-Q水中并高壓滅菌；使瓊脂溶液冷卻至約55。C,加入剩余成分并完全混合40克玉米粉(Polenta)、20克纖維素、30克蔗糖、30克酪蛋白、20克麥芽(烘烤)、8克Wesson鹽混合物、12克Vanderzant維生素混合物、1.8克抗壞血酸、1.6克尼泊金(對羥基苯甲酸甲酯)、0.3克金霉素、0.4克膽固醇和0.6克L-半胱氨酸。將飼料冷卻至約45'C然后倒入飼養(yǎng)盤或杯。使飼料進入水平層流拒。從飼養(yǎng)有成蟲的籠中移出帶有昆蟲所產(chǎn)卵的稻葉片，將其固定在飼養(yǎng)杯或盤的固體祠料上。使卵孵化，新生幼蟲用于生物測定和昆蟲培養(yǎng)物的維持。在試驗和飼養(yǎng)中，條件是28士2。C，80±5%相對濕度，16:8小時的光照黑暗光周期。相同的人工飼料用于生物測定，但是在這種情況下，將所述飼料平均的倒入24孔板中，每個孔含有l(wèi)毫升飼料。一旦飼料設置好了，就將測試制劑施加到飼料表面(2平方厘米)，比率為50微升的1微克/微升靶標dsRNA。使所述dsRNA溶液干燥，將2只1齡幼蟲放置于每個孔中。7天后，將幼蟲轉移到多孑L板中新鮮處理的飼料上。在第14天(即生物測定開始后14天)，記錄存活和死亡昆蟲的數(shù)目，并檢查是否異常。每個處理共測試24只幼蟲。進行一個替代性生物測定，其中用處理過的稻葉喂食二化螟新生幼蟲。將釉稻品種臺中在來一號(Indicarice，Taichungnative1)的小葉片浸于含1微克/微升乾標dsRNA的0.05%TritonX-100溶液中，使之干燥，將每片置于含凝膠化2%瓊脂的24孑L板的一個孔中。將兩只新生幼蟲從飼養(yǎng)盤轉移到每個dsRNA處理的葉片(每個處理24只幼蟲)。在4和8天后，將所述幼蟲轉移到新鮮處理的稻葉片。在第4、8和12天評估存活和死亡昆蟲的數(shù)目，還對任何異常進行記錄。實施例11:小菜蛾(7Vf/fe〃flxv/^yfe〃a，Diamondbackmoth)A.克隆小菜蛾的部分序列從所有不同幼蟲階段的小菜蛾(小菜蛾；來源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd.,CapitalBusinessPark,Wentloog，Cardiff,CF32PX，Wales,UK)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照使用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(SuperscriptIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照4吏用i兌明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含PXOOl、PX009、PXOIO、PX015、PX016基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其中使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照使用說明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-PX中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、50。C1分鐘和72'C1分30秒，然后是72'C7分鐘(對于PXOOl，PX009,PX015,PX016);:95°C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、54。C1分鐘和72°C2分30秒，然后是72。C7分鐘(對于PX010)。在瓊脂糖^Ji分析、純化(QlAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR8/GW/topo載體(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-PX中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。分別通過如表3-PX中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分^J^酸序列。B.產(chǎn)生小菜蛾基因的dsRNA4吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。^兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的耙序列。對于每個把基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個耙序列有義模板的各個引物的序列在表8-PX中給出。PCR反應^Hf如下95。Cl分鐘，然后是20個循環(huán)的95。C30秒、6(TC30秒(-0.5。C/循環(huán))和72。C1分鐘，然后是15個循環(huán)的95'C30秒、50°C30秒和72。C1分鐘，然后是72。C10分鐘。^JI特異性正向和特異性T7反向引物在使用與上勤目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個粑基因反義模板的各個引物序列在表8-PX中給出。在瓊脂糖凝膠上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑對QiaquickPCRPurificationKitCat.Nr.28106,Qiagen)以及NaCK)4沉淀進行純化。混合所產(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個靼基因的dsRNA有義鏈在表8-PX中給出。C.將小菜蛾基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片^^作用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的耙基因的靼核苷^列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記。使用含attL入門克斷見實施例11A)和含attR終點栽體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物載體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)議獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的說明，使用LRClonaseII酶混合物(CatNr.11791-020，Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到每個靶基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進才艮癌農(nóng)桿菌。對含有不同耙標的pCR8/GW/topo進行限制性酶消化(見實施例11B)。使用QiaquickGelExtractionKit(Cat.Nr.28706,Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少l個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37。C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進ToplO化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。D.使用人工飼料測試dsRNA靶標抗小菜蛾幼蟲活性的實驗室試驗小菜蛾維持在InsectInvestigationsLtd.(來源NewcastleUniversity,Newcastle-upon-Tyne,UK)。/斤述昆蟲飼養(yǎng)于巻心菜葉上。選擇1齡混合性別的幼蟲(約1日齡)用于此試驗。昆蟲維持在E卯endorf管中(1.5毫升容積)。將按照制造商說明制備的市售小菜蛾飼料(Bio-Serv,NJ,USA)放置于每個管的蓋上(0.25毫升容積，8亳米直徑)。在仍是液體時，所述飼料較為平滑以移去多余的部分，并產(chǎn)生平的表面。一旦所述飼料固化，就將測試制劑施加到飼料表面，比率為每個重復25孩i升未稀釋制劑(1微克/微升dsRNA靼標)。使得測試制劑干燥，每個管中放置一只l齡幼蟲。將所述幼蟲放置于蓋中飼料的表面，然后將管小心的閉合。將所述管倒置M，使得每只幼蟲保持在管蓋上飼料的表面。一周兩次將所述幼蟲轉移到帶有新鮮飼料的新Eppendorf管。在試驗的頭兩周提供給幼蟲經(jīng)處理的飼料，之后提供未處理的飼料。在總共38天中，一周兩次進行評估，在38天時所有幼蟲都死亡了。在每次評估中，對死亡或存活進行評估并且檢查其異常。對于每個處理，進行40個單幼蟲重復。在試驗中，測試條件是23至26。C，50至65%相對濕度，16:8小時的光照黑暗光周期。實施例12:美洲蜷蟀(爿c/g似rfowes"cMs，Housecricket)A.克隆美洲蟋蟀基因部分序列從所有不同幼蟲階段的美洲蟋蟀(美洲蟋蟀；來源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd,,CapitalBusinessPark,Wentloog，Cardiff,CF32PX，Wales,UK)中使用TRIzol試劑(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville,Maryland,USA)按照4吏用說明分離高質(zhì)量的總RNA。按照使用說明通過DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)處理除去RNA制備物中的基因組DNA。使用市售試劑盒(S叩erScriptTMIII逆轉錄酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)按照l吏用說明產(chǎn)生cDNA。為了分離包含ADOOl、AD002、AD009、AD015和AD016基因一部分的cDNA序列，進行了使用簡并引物的一系列PCR反應，其使用了AmplitaqGold(Cat.NrN8080240,AppliedBiosystems)并按照4吏用+兌明進行。用于擴增每個基因的簡并引物序列在表2-AD中給出。這些引物分別用于各個PCR反應，其使用以下條件95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95。C30秒、50。C1分鐘和72。C1分30秒，然后是72。C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析、純化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)所得PCR片段，并將其克隆入pCR8/GW/topo載體(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)，并測序。分別通過如表2-AD中給出的各個SEQIDNO表示所得PCR產(chǎn)物的序列，其指所述部分序列。分別通過如表3-AD中給出的各個SEQIDNO表示相應的部分^J^^列。B.產(chǎn)生美洲蟋蟀基因的dsRNA葉吏用市售試劑盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成亳克量的dsRNA。^兩個獨立的PCR反應中產(chǎn)生最初兩個獨立的單5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有與T7啟動子方向不同的鞋>序列。對于每個耙基因，使用特異性T7正向和特異性反向引物產(chǎn)生有義T7模板。用于擴增每個靼序列有義模板的各個引物的序列在表8-AD中給出。PCR反應M如下95。C1分鐘，然后是20個循環(huán)的95。C30秒、60。C30秒(-0.5°。/循環(huán))和72'C1分鐘，然后是15個循環(huán)的95。C30秒、50。C30秒和72'C1分鐘，然后是72。C10分鐘。使用特異性正向和特異性T7反向引物在使用如上勤目同條件的PCR反應中產(chǎn)生反義T7模板。用于擴增每個靼基因反義模板的各個引物序列在表8-AD中給出。在瓊脂糖皿上分析所得PCR產(chǎn)物，并通過PCR純化試劑敘QiaquickPCRPurificationKit;Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀進行純化?；旌纤a(chǎn)生的T7正向和反向模板，以進行轉錄，退火所得RNA鏈，進行DNA酶和RNA酶處理，通過醋酸鈉純化，其按照制造商說明進行。所得每個乾基因的dsRNA有義鏈在表8-AD中給出。C.將美洲蟋蟀基因重組進植物載體pK7GWIWG2D(II)由于RNA干擾機制通過dsRNA片賴^^ft用，以反義和有義方向克隆如上文所選擇的靼基因的靼核苷^列(其被內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子分隔開)以形成dsRNA發(fā)夾構建物，其中CmR是氯霉素抗性標記物。使用含attL入門克斷見實施例12A)和含attR終點載體(=pK7GWIWG2D(II))之間的LR重組反應產(chǎn)生這些發(fā)夾構建物。植物栽體pK7GWIWG2D(II)根據(jù)材料轉移協(xié)議獲得自VIB/PlantSystemsBiology。按照制造商的說明，使用LRClonaseII酶混合物(Cat.Nr.11791-020,Invitrogen)進行LR重組反應。這些克隆實驗得到每個靶基因的發(fā)夾構建物，其具有啟動子-有義-內(nèi)含子-CmR-內(nèi)含子-反義方向，其中啟動子是植物有效的35S啟動子。帶有35S啟動子的二元載體pK7GWIWG2D(II)適于轉化進根癌農(nóng)桿菌。對含有不同靶標的pCR8/GW/t叩o進行限制性酶消化(見實施例12B)。^f吏用QiaqukkGelExtractionKit(Cat.Nr.28706，Qiagen)對含有側翼是attL位點的目的基因之條帶進行純化。將150納克量的純化片段和150納克pK7GWIWG2D(II)與LRclonaseII酶放在一起，在25。C孵育至少l個小時。在蛋白酶K溶液處理之后(37'C10分鐘)，將全部重組混合物轉化進ToplO化學感受態(tài)細胞。通過限制性消化分析選擇陽性克隆。D.使用人工飼料測試dsRNA耙標抗美洲蟋蟀幼蟲活性的實驗室試驗美洲雄蟀維持在InsectInvestigationsLtd.(來源BladesBiologicalLtd"Kent,UK)。所述昆蟲飼養(yǎng)于l夫顆粒和巻心菜葉上。選擇相同大小不大于5天的混合性別若蟲用于此試驗。將雙鏈RNA和基于小麥的顆粒狀嚙齒類動物飼料(大鼠和小鼠標準飼料，B&KUniversalLtd.，Grimston，Aldbrough,Hull,UK)混合。所述飼料BKOOIP含有下述成分，以重量降序排列小麥、大豆、麩皮、大麥、顆粒狀粘合劑、嚙齒動物5種維生素、混合脂、磷酸二釣、mouldcarb。細細研磨顆粒狀嚙齒動物飼料，在微波爐進行熱處理以使得任何酶成分失活，然后混合。所有嚙齒動物飼料取自同一批次以保持一致性。將研磨過的飼料和dsRNA完全混合，形成相同重量的小顆粒，將其在室溫過夜干燥。將靶標和gfp對照的雙鏈RNA樣品以10艱史克/孩吏升的濃度施加，比例為1克研磨過的飼料加1毫升dsRNA溶液，由此得到施加率為10毫克dsRNA/克顆粒。每周更換顆粒。在試驗的前三周給昆蟲提供處理過的顆粒。之后提供未處理的顆粒。昆蟲維持在有蓋的塑料容器中(9厘米直徑，4.5厘米深)，每個容器十只。每個容器中含有一個處理過的誘辨顆粒和一個水源(潮濕棉球)，上述兩者各自置于獨立的小型稱重船型皿(weighboat)中。水在本實驗中無限制地更新。以一周兩次的間隔進行評估，兩次評估之間不超過4天，直至所有對照昆蟲或者死亡或者蛻皮至成蟲期(84天)。在每次評估中，對死亡或存活進行評估并且檢查其異常。從第46天開始，一旦開始蛻皮至成蟲，評估所有昆蟲(存活和死亡的)是若蟲還是成蟲。在試驗第55天對存活的昆蟲稱重。每個處理進行4個重復。在試驗中，測試條件是25至33。C，20至25%相對濕度，12:12小時的光照黑暗光周期。表1A<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>表1-LD<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>表1-PX<table>complextableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>表1-AD<table>complextableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>表2-LD<table>complextableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表2-PC<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>表2-NL<table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>表2.PX把標ID正向引物5'—3'反向引物cDNA序列(有義鏈)5'—3'PX001SEQIDNO:2110GGCCCCAAGAAGCATTTGAAGCGSEQIDNO:21"CTTCGTGCCCTTGCCRATKATRAABACGSEQIDNO:2100GGCCCCAAGAAGCATTTGMGCGCCTGMCGCGCCGCGCGCATGGATGCTGGACAAGCTCGGCGGCGTGTACGCGCCGCGGCCCAGCACGGGCCCGCACAAGCTGCGGCAACGAGGTGCTGAAGATCGTGAAGCAGCGCCTCATCAAGGTGGACGGCACCACCGCATCACTCCCGAGGAGGCCAAGTACAAGCTGTGCAAGGTGAAGCGCGTGGCGACGGGCCCCAAGAACGTGCCGTACATCGTGACGCACAACGGCCGCACGGCCACCTGCAAGATCATGGACATCATCAAGTTCGACTCAGGTMCCTGTGCATGATCACGGGAGGGCGTAACTTGGGGCGAGTGGGCACCATCGTGTCCCGCGAGAGGCACCCCGGGAGCTTCGACATCGTCCACATCAAGGACACCACCGGACACACCTTCGCCACCAGGTTGAACAACGTGTTCATCATCGGCMGGGCACGAAGPX009SEQIDNO:2112GCACGTTGATCTGGTACARRGGMACCSEQIDNO:2113GCAGCCCACGCYYTGCACTCSEQIDNO:2102GCACGTTGATCTGGTACAAAGGAACCGGTTACGACAGCTACAAGTATTGGGAGAACCAGCTCATTGACTTTTTGTCAGTATACAAGAAGAAGGGTCAGACAGCGGGTGCTGGTCAGMCATCTTCAACTGTGACTTCCGCAACCCGCCCCCACACGGCAAGGTCGTCCAGAGTTCTACAACGACACGGCTAACCTGCCTGMGCCATGCCCGTGGACTGTGGGTGTCGTGCCACGGCGAGACGCCGGCGGACAAGGAGAACATCGGGCCCGCCGAGGGGTATCTGAGCCCGCTGGTCGCCGTGCATTTGGAGAGGCCGAGGACCGGCATAGTGATCAACATCGAGTGCAAAGCGTGGGCTGCPX010SEQIDNO:2114GTGGCTGCATACASEQIDNO:2115CGCGGCTGCTCCATSEQIDNO:2104GTGGCTGCATACAGTTCATTACGCAGTACCAGCACTCTAGTGGACMCGTCGCG200780002295.4勢溫也雜134/281^GcGGcGcTt;G5GMGMcMGGAcGAGTcGGAcGGAG^AcccAAGAG丁ccG叮TGGTccGGGccAAGGc蕓AGGcGTGGAGTGT<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>表2-AD<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table>表3-TC<table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table>表3-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>表3-NL<table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table>表4-LD<image>imageseeoriginaldocumentpage173</image><table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage183</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage184</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage187</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage188</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage189</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage190</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage191</image><table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage193</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage196</column></row><table>NL001"66TTCGACATCGTGCACATCAAGGAC22474232棉鈴蟲NL001"67ATCACAGCTGAAGAAGCTAAGTACMG25956820(Biphylluslunatus)NL0011168TGTGTATGATCACTGGAGGTCGTAA25957367粒步甲NL0011169AACGTTTTCATCATCGGCAAG27613698甘比亞瘧蚊NL0011170CCAAAATCATGGACTTCATCA3738704煙草天蛾NL001"71TGATCTATGATGTTAAGGGACG3738704煙草天蛾NL001"72CATGGATGTTGGACAAATTGGG37951951美松齒小蠹，56772312黑果蠅，60305420(Mycetophagusquadripustulatus),67885868擬暗果蠅，77321575搖蚊，25956479(Biphylluskinatus),22474232棉鈴蟲NL0011173TTTTGCCACTAGGTTGAACAACGT37953169美松齒小ftNL0011174GCAGCGTCTCATCAAGGTTGACGGCAA48927129紋石蛾NL001"75AAGGGACGTTTCACCATCCAC50818668詩神袖蝶NL0011176AACCTGTGTATGATCACTGGAGG60293875琉璃葉蟬NL001"77ACTAACTGTGAAGTGAAGAAAATTGT60293875琉璃葉蟬NL0011178TTCTTCCGTTTGATCTATGATGT60293875琉璃葉蟬，71047771(Oncometopianigricans)NL001"79TGTATGATCACTGGAGGTCGTAACTTGGG60297219根象鼻蟲NL0011180CATGGATGTTGGACAAATTGGGTGG60311985非洲鳳蝶NL0011181GCTGAAGAAGCTAAGTACAAG68758383(Acanthoscurriagomesiana)NL001"82GGAGGTCGTAACTTGGGTCGTGT77327303搖蚊NL001"83TATGATGTTAAGGGACGTTTCACCAT77327303搖蚊NL0011184CATGGATGTTGGACAMTTGGG93002561(Drosophilagrimshawi)93001617(Drosophilamojavensis)92939328黑果械，112433559桃蟲牙<table>tableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage200</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage201</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage202</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage203</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage204</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage206</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage207</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage208</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage209</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage210</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage211</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage212</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage213</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage214</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage215</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage216</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage217</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage218</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage219</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage220</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage221</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage222</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage223</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage224</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage225</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage226</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage227</column></row><table>表4-AD<table>tableseeoriginaldocumentpage228</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage229</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage230</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage231</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table>表5-TC<table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table>表5-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table>表5-NL<table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table>表6-PC<table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage237</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage238</column></row><table>表6-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage239</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage240</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage241</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage242</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage243</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage244</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage245</column></row><table>表6-PX<table>tableseeoriginaldocumentpage246</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage247</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage248</column></row><table>表8-LD<table>tableseeoriginaldocumentpage249</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage250</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage251</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage252</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage253</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage254</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage255</column></row><table>表8-PC<table>tableseeoriginaldocumentpage255</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage256</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage257</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage258</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage259</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage260</column></row><table>表8-AG<table>tableseeoriginaldocumentpage260</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage261</column></row><table>表8-TC<table>tableseeoriginaldocumentpage262</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage263</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage264</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage265</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage266</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage267</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage268</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage269</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage270</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage271</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage272</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage273</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage275</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage276</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage277</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage278</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage279</column></row><table>表8-AD<table>tableseeoriginaldocumentpage280</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage281</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage282</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage283</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage284</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage285</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage286</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage287</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage288</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage289</column></row><table>表9-PC<table>tableseeoriginaldocumentpage290</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage291</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage292</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage293</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage294</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage295</column></row><table>表9-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage295</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage296</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage297</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage298</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage299</column></row><table>表10陽NL(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage300</column></row><table>表10誦NL(c)RNAi<table>tableseeoriginaldocumentpage301</column></row><table>表11-NL<table>tableseeoriginaldocumentpage302</column></row><table>權利要求1.包含選自含以下核酸序列之組中核酸序列的分離核苷酸序列(i)任意以下序列SEQIDNO1，3，5，7，9，11·13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908to1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70％，優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％，更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列中的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含以下任意序列中至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互補序列。2.由權利要求1的多核苷酸序列表達產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中植物害蟲攝取所述核糖核苷酸序列抑制所述害蟲的生長。3.權利要求2的核糖核苷酸序列，其中攝取所述序列抑制與所述序列基本上互補的核苷酸序列的表達。4.用包含權利要求l所定義核酸序列的多核苷酸轉化的細胞，所述核酸序列任選地與調(diào)控序列有效連接。5.權利要求4的細胞，其中所述細胞是植物細胞。6.用包含權利要求l定義之核酸序列的多核苷酸轉化的植物，所述核酸序列任選地與調(diào)控序列有效連接。7.權利要求6的植物，其中所述序列抑制害蟲的生物活性。8.權利要求6的植物，其中所述序列抑制靼序列的表達。9.權利要求8的植物，其中所述耙序列是昆蟲、線蟲或真菌的序列。10.權利要求6至9中任一項的植物，其中所述植物是細胞質(zhì)雄性不育的。11.權利要求6至10中任一項的植物，其中所述植物還包含或表達選自以下的殺蟲劑馬鈴薯塊莖貯藏蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側孢芽孢桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白。12.權利要求ll的植物，其中所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白選自Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元殺蟲蛋白CryET33和CryET34、二元殺蟲蛋白CryET80和CryET76、二元殺蟲蛋白TIC100和TIC101以及二元殺蟲蛋白PS149B1。13.權利要求6至12中任一項的植物，其中所述植物選自包含以下的組苜蓿、蘋果、杏、朝鮮薊、蘆筍、油梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、青花菜、抱子甘藍、巻心菜、卡諾拉油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、谷類、芽菜、櫻桃、柑桔、克萊蒙汀小柑橘、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、茄子、菊苣、桉樹、無花果、葡萄、葡萄柚、花生、醋栗、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、萊姆酸橙、松樹、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麥、菜秋葵、洋蔥、橙、觀賞性植物或花或樹、番木瓜、歐芽、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠蘿、車前草、李子、石榴、馬鈴薯、南瓜、菊苣、蘿卜、油菜、懸鉤子、稻、黑麥、高粱、大豆(soy)、大豆(soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、橘子、茶樹、煙草、番茄、藤^t物、西瓜、小麥、山藥以及密生西葫蘆。14.權利要求6至13中任一項的植物，其中所述植物對選自包含以下組中的昆蟲的侵害具有抗性馬鈴薯葉甲屬(Z^7ftVi^fl^flspp.)(例如，馬鈴薯葉甲(丄.flfec^w//wMto)、偽馬鈴薯葉曱(丄.ywrt"")或丄.tocawfl)、合爪負泥蟲屬(Z^mispp.)(例如，三條負泥蟲(丄.^7/"e"似))、茄跳甲屬(勾，^^:spp.)(例如，美國馬鈴薯跳甲(Ecwcm附w/s)、煙草跳曱()或塊莖跳曱似6肌'S"))、豆芫著屬(五/7/Cfl她Spp.)(例如，北美豆芫普v故W"))、食植胍蟲屬(五/7//^/^"spp.)(例如，墨西哥豆胍蟲(E.v"Wve幼's))、猿葉甲屬(iVi"^/owspp.)(例:i口，^^才艮猿葉甲(i>."c似eflnV^))、褐飛虱屬(7W/fl/7fln^tospp.))(例如，褐飛虱(TV./wge"s))、灰飛氦屬(Z^^fe//7/ixspp.)(例如，灰飛虱(丄.WnVite//Ms))、黑尾葉蟬屬(A^/7/iote^vspp.)(例如，二點黑尾葉蟬(Lv/^fc^is),或黑尾葉蟬(TV.c/w"/ce/w)，或二條黑尾葉蟬(iV."/gro/wV似s))、白背飛虱屬(5V^"te〃"spp.)(例如，白背飛虱(5"./^*";/^"))、爿c/i""spp.(例如，美洲蟠蟀(A.domesticus))、桿長棒屬(她，spp.)(例如，美洲谷桿長蝽(及/ewcc^m^/eMC一m^))、黑棒屬(/ScW朋/7力omSpp.)(舍!j如,稻,繁、棒(51VefTzV/w/&))、綠棒屬(JCTOS/CfTIWWSpp.)(例如，擬綠棒(A/^7fl^))、稻弄蝶屬(尸"f""mspp.)(例如，i紋稻弄蝶(戶.))、禾草螟屬(C77ospp.X例如，二化螟(C.sw/7/r^s"http://s)、臺灣稻螟(C."wn'"7/"s)或黑頭螟(Cl/70/3;c/10w^))、禾草螟屬(C7n7"mmspp.)(例如，稻桿螟(C/w/j;c/io^fl))、fe莖夜蛾屬(Xm"w/"spp.)(例如，稻蛀莖在_蛾(5WM/eM"s))、蛀禾螟屬(T)j/^o^flspp.)(例如，白稻螟(r./rt"ototo)或三化螟(7Wm^W"/"s))、縱巻葉野螟屬(Oi—fl/ocrac/sspp.)(例如，稻縱巻葉野螟(C膨力Viflfc))、潛錄屬(々考zflspp.)(例如，日本稻潛繩)或j.戸n^Vww/s1)、D/afraeflspp.(例如，小蔗螟(2).sfl"/^m/Zs)或西南玉米桿草螟(/)gnmrf/ose//"))、7Varw"g"spp.(例如,Lfl^iescews)、黃夜域?qū)賒flw幼o^fes1spp.)(例如，犁紋黃夜蛾(X^yi"sv^wi))、灰翅夜蛾屬(S/w^/;紐mspp.)(例如，草地貪夜蛾(5!/ra^^n/fl)、甜菜夜蛾(5*.d/g"fl)、?；页嵋苟?5*./Z加m/Zs)或又/7m^/^)、秘夜蛾屬(Afy幼/扁flspp.)(例如,A^/r附w"(JPsd^/WflJ)、份"cov^pflspp.(例如，谷實夜域(及扉))、CV/os/7/sspp.(例如，C6f簡wefl)、稻7JC象屬(丄/swr力c(/7加sspp.)(例如,稻水象甲(￡.00^Y7A"MS))、稻象屬(五CA/"0C/IC附MSSpp.)(例如，稻象s"《冊附os))、Z)/c/orf/spflspp.(例如，Z).a簡/gem)、負泥蟲屬(Ow/ewflspp.X例如，水稻負泥蟲(aspp.)(例如，米象(51.oo^ae))、尸"c/^力》/^/sspp.(例如，稻癭蚊(戶.0O;zm))、水竭屬(/Tj^"http://z'flspp.)(例如，麥葉毛目艮水錄(Egf/s^/")或日稻毛眼7jc娓(丑s"s"A://))、C7i/on戸spp.(例如，稻桿潛錄(C."o^fle))、葉曱屬(D/Wn^/cflspp.)(例如，玉米才艮葉甲(D.v/f^y^YivzV^^m)、巴氏才艮葉甲(D.Aflf^en')、黃瓜十一星葉甲(D.wwrfec/附/;w/fc似to/^min//)、vzV^miMfle、^toto)、桿野螟屬(0欲/"/"spp.)(例如，玉米螟(a))、地虎屬(J^Y^/sspp.)(爭J如，小地老虎(j.))、五/"s附0pa/7wwspp.(例如，南美玉米苗斑螟())、梳爪叩頭蟲屬(Afe/"wo似sspp.)(掄轉血矛線蟲)、圓頭犀金龜屬(Q^/^^/7/ia/"spp.)(例如,C60m1fc或Cl/附艦cw/"to)、弧麗金龜屬(i*fl>p/〃/flspp.)(例如，日本弧麗金龜(尸.力/7om'cfl))、浪匕曱屬(CAfletocwe附flspp.)(例如，玉米銅色通匕甲(C./7m//cflr/fl))、龍頸象屬(5^/^Aio/7/ion/sspp.)(例如，玉米長味象(51.附flZ6fc))、縊管蜂屬(J/^/"/ow》/w/附spp.)(例如，玉米辨附fl/^s))、圓尾蜂屬(JwMm/^/sspp.)(例如，A)、黑蝗屬(Me/fl鼎/7/wsspp.)(例如，紅足黑蝗(M:/^mm7^m附))、特異黑埴(Md斷"w"""s)或遷飛黑埴(Msa"^>i—s))、種錄屬(母/e附戸spp.)(例如,種錄(雙/7/fl似ni))、呆薊馬屬(v4w"/7/io幼n》sspp.)(例如,黃呆薊馬(Ao6sxT"ras))、iSV/ewo/;sisspp.(例如，5*./fi//es/fl)、葉螨屬(spp.)(例如，二點葉螨(t:wW/,)、朱砂葉螨(r.c/wtf6tf">i"s)、fl^/Zcov^"/mspp.(例如，谷實夜蛾或才帛鈴蟲(^ffar附/gem))、i^"/朋/7/^flspp.(例如，紅鈴麥蛾())、金岡!]鉆屬(jEVw/"sspp.)(例如，承紋鉆夜蛾(￡.v/股〃"))、實夜蛾屬(^//W/i/"pp.)(例如，煙芽夜蛾(Ev/mCeWS))、花象屬(^f^OMO附f^Spp.)(例如,墨西哥棉鈴象棉鈴象甲(Agra"flf/s))、i^w^towfosre/Zsspp.(例如，棉偽斑腿盲砵(P.sw/"似s))、結翅粉鼠屬(7>/"&^/^spp.)(例如，結翅粉虱(r.fl6Mft7oweMs)、溫室粉虱(71.vfl"m/7Vra附))、小粉虱屬(fie附/s/flspp.)(例如，銀葉粉虱(及fl^rt爭///))、蜂屬(々A/sspp.)(例如，棉蜂(Awss",7))、草盲蝽屬(丄j《wsspp.)(例如，美國牧草盲蜂(丄.//weo/flf7、)或丄.AeS/7^"W51)、美'》川棒屬(iWSrAz'5/ws1Spp.)(眾'J如，斑點美洲蝽cwis/7eraws))、C7/ww^raaspp.(例如，賽氏棒(C.^W))、綠棒屬(7Vezflraspp.)(例如，稻綠棒(TV.v/"7/w/fl))、薊馬屬(77i咖spp.)(例如，煙薊馬(7:勵flc/))、花薊馬屬(F腦飾/e〃"spp.)(例如，煙褐薊馬(F./wscfl)或西方花薊馬(F.)、綠小葉蟬屬(E附/w"scflspp.)(例如，蠶豆小綠葉蟬(E/"6fle))、瘤奸屬(Af^wsspp.)(例如，書&蜂(Af./7era/c"e))、薯個木虱屬(ftim加Vzflspp.)(例如，馬鈴薯木虱(尸.cocA^m〃/))、CVmofiferasspp.(例如，C或C鄉(xiāng)/wri"ws)、麥蛾屬(iV^Aw/應eflspp.)(例如，馬鈴薯麥蛾(P.o/7efTw/e//fl))、長管蜂屬(Af"c7Yw》/m附spp.)(命J:ft口，大戟長管蜂(iVf.e"/7Aw*6^))、T7rjwitospp.(例如,r./7fl/,/^v/rms)、麥蛾屬(i^A0n>wfletfspp.)(例如，馬鈴薯麥蛾(尸.o>/^m//e〃fl))、//^//cov"flspp.(例如，谷實夜蛾)、Z^mVispp.(例如，L/j^o/7^sice〃")、Z/附0w/"sspp.(掄轉血矛線蟲)、7kf"http://wcflspp.(例如，煙草天蛾(AT.sex似)或番癡天蛾(7V/'《w/w《we附flcw/flto))、斑潛錄屬(丄/n》附y(tǒng)^tspp.)(侈'如，蔬菜斑潛蠅(丄.s""，)、三葉草斑潛蠅(丄.或南jl:斑潛蠅(￡toVto6mis/s))、果錄屬(2M)鄉(xiāng)M/flspp.)(例如，黑腹果錄附e/fl"^fls^)、2).戸Aw6fl、擬暗果錄(2X/75^Mrfootewm)或擬果錄(D.s/附w/"ws))、步曱屬(CVhyi6msspp.)(例如,粒步甲(C^wiw/fltos))、搖蚊屬(C7wV卵o附wsspp.)(例如，搖蚊(C.^w似wws))、櫛首蚤屬(Ctewoc印/m/zVifesspp.X例如，貓樣首^())、非耳味象屬(D/";7M/7Mspp.)(例如，根象^蟲(Z).fl6辦Mv/fl似s))、齒小蠹屬(/戸spp.)(例如，美+〉齒小橐(///"/))、擬谷盜屬(7>幼"http://"附spp.)(例如，赤擬谷盜(Zcfl^mw/M))、舌繩屬(G/o^/""spp.)(例如，刺舌錄(G".柳ors/to"s))、按蚊屬(Jwop/^/^fspp.)(伊J如，甘t匕亞按蚊(j.g"附辦/"e))、^ffe/Zcover/7"spp.(例如，棉鈴蟲(^Kflf7w/gera))、^fqvr幼^w》Aowspp.(侈'J如，豌豆蜂(A/7/raWf))、蜜蜂屬(J/7/sSpp.)(例如，意大利蜜^(A附e/zy^rfl))、1T(0附fl/o^/scttspp.(侈l]如，i乾璃葉蜂())、<尹蚊屬(j^fesspp.)(例如，埃及斑紋(A"^j/7ri))、蠶蛾屬(^ow6jo;spp.)(例如，家香(必.附or/))、飛蝗屬(丄ocw對flspp.)(例如，飛蝗(丄.附&nitoWfl))、牛蜱屬(5<0/;/7"spp.)(舍'J如，孩i小牛蜱(j5.w/cn/7/ws))、^4cflw幼osrwr/"'spp.(例如，Ago附w.fl冊))、Z)z》/o>/7fmispp.(例如，太平洋4斤翅蠊(2X/ww"flto))、袖蝶屬(丑e/zVwi/wsspp.)(例如，瓦氏袖蝶(Em^)或詩神袖蝶(E附e/z;o附^ie))、象蟲屬(Cwm///0spp.)(例如，歐洲櫟象(C.g/"m//ww))、iVwte〃"spp.(例如，小菜蛾(尸.A^/rWte//fl))、花蜂屬(v4附6/j^附附flSpp,X眾!j如，并j飾花蜂(J.Vfl/7'ggtt似W))、拃香屬(j威m^spp.)(例如,天要(A戸附fl附fl/))和阿蚊屬(J環(huán)^msspp.)(例如，騷擾阿蚊(h由腸to))。15.權利要求6至14中任一項之植物的種子或者繁殖或增殖材料，其中所述種子或者繁殖或增殖材料包含具有權利要求1所定義之核酸序列的多核苷酸，或者其中所述種子包含由所述多核苷^達產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷^f列。16.從權利要求6至14中任一項的植物或者權利要求15的種子或者繁殖或增殖材料得到的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品包含具有權利要求1所定義之核酸序列的多核苷酸，或者其中所述種子包含由所述多核苷^A達產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷i^f列。17.權利要求16的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自食品、伺料、纖維、紙、粗粉、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉、青貯飼料、咖啡、茶和油。18.包含權利要求6至14中任一項之植物、權利要求15之種子或者繁殖或增殖材料或者權利要求16或17之產(chǎn)品的殺蟲劑，所述植物、種子、繁殖或增殖材料或者產(chǎn)品表ii^利要求1所定義之核酸序列。19.一種用于控制或防止昆蟲生長的方法，其包括向害蟲提供植物材料，其中所述植物材料來源于權利要求6至14中任一項的植物、權利要求15的種子或者繁殖或增殖材料或者權利要求16或17的產(chǎn)品，其中所述植物、種子、繁殖或增殖材料或者產(chǎn)品包含抑制昆蟲生物活性的多核苷^列。20.權利要求19的方法，其中所述多核苷酸包含權利要求l所定義的核,列。21.用于產(chǎn)生對植物病原性生物具有抗性的植物的方法，其包括-用具有權利要求1所定義核酸序列的多核苷酸轉化植物細胞，所述核酸序列任選地與調(diào)節(jié)序列有效連接，-從經(jīng)轉化的植物細胞再生植物；以及-在適于從所述多核苷酸表達RNA分子的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉化植物，所述培養(yǎng)的經(jīng)轉化植物與未轉化植物相比對所述植物病原性生物具有抗性。22.用于提高產(chǎn)量的方法，其包括—用具有權利要求1所定義核酸序列的多核苷酸轉化植物細胞，所述核酸序列任選地與調(diào)節(jié)序列有效連接，-從經(jīng)轉化的植物細胞再生植物；以及—在適于從所述多核苷酸表達RNA分子的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉化植物，所i^達抑制植物病原性生物的進食以及由于害蟲侵害導致的產(chǎn)量損失。23.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中多核苷酸的表達產(chǎn)生抑制害蟲中耙基因的RNA分子，所述害蟲已才聶取所述作物植物的一部分，其中所述耙基因行使選自以下的至少一種基本功能害蟲攝食、害蟲的生存力、害蟲細胞凋亡、害蟲或任何害蟲細胞的分化和發(fā)育、害蟲有性繁殖、肌肉形成、肌肉顫搐、肌肉收縮、保幼激素形成和/或減少、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉運、維持細胞膜的電勢、M酸的生物合成、M酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感受、觸角形成、翅的形成、足的形成、卵的形成、幼蟲的成熟、消化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的維持、神經(jīng)傳遞、幼蟲階段過渡、蛹化、從蛹羽化、細胞分裂、能量代謝、呼吸、細胞骨架結構合成和維持、核苷酸代謝、氮代謝、水的利用、保水性和感官知覺。24.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(0以下任意序列SEOIDNO1,3,5,7>9,11,13,15,17,19,21,23,49至158,159，160至163'168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240至246，或2486，或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％,更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1，3,5,7,9,11，13,15.17,19,21,23,49至158,159,160至163圓168,173,178,183,188,193.198,203,208,215,220,225,230，240至246,或2486.或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核普酸的序列SEQIDNO1,3,5,7,9,11,13,15,17'19,21,23,49至158,159,160至163,168,173,178,183,188,193,198,203,208.215,220,225,230'240至246,或2486.或其互補序列'或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO49至158中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互4卜序列，和-所述昆蟲選自包含以下的組馬鈴薯葉甲屬(例如，馬鈴薯葉甲、偽馬鈴薯葉甲和胡頹子葉茄葉甲(丄."x朋"))。25.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下寸壬意序歹'J:SEQIDN0247'249'251'253,255'257'259'275至472,473,478,483,488,493,498,503,508至512,或其互^卜序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO247,249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483，488,493,498,503,508至512,或其互補序列，以及(m)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO247,249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,488，493,498,503,508至512，或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO275至472中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，和-所述昆蟲選自猿葉甲屬(例如，辣根猿葉甲)。26.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO513,515'517.519,521,533至575,576,581，586,591或596,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、％%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO513,515，517,519,521,533至575,576,581，586,591或596,或其互補序列，以及(iii)包含以下4壬意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO513,515,517,519,521,533至575,576，581，586,591或596,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO533至575中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，和-所述昆蟲選自食植瓢蟲屬(例如，墨西哥豆瓢蟲)。27.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO601,603,605,607,609，621至767'768，773,778,783或788,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO601,603,605,607,609，621至767'768,773,778,783或788,或其互補序列，以及(m)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO601,603,605,607，609,621至767，768,773,778,783或788,或其互補序列，28.或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO621至767中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，和-所述昆蟲選自花象屬(例如，棉鈴象曱)。28.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO793,795,797.7的，801,813至862,863,868，873,878或883,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO793,795,797.7的，801,813至862,863.868，873,878或883,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO793,795,797,7的，801,813至862,863,868，873,878或883,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO813至862中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，和-所述昆蟲選自擬谷盜屬(例如，赤擬谷盜)。29.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下寸壬意序列SE。,DN0888'890'&92'的4'896'908至1040'1041,1046、1051、1056,1061,或1066至1070，或其互4卜序歹'J，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%,更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99。/。一致性的序列SEQIDNO888,890,892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061，或1066至1070,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO888,890,892,894，896,908至1040,1041,1046,1051、1056、1061'或1066至1070，或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO卯8至1040中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，并且-所述昆蟲選自瘤蜂屬(例如，桃蜂)。30.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO1071，1073，1075,1077,1079，1081,1083，1085，1087，1089.1091,1093,1095,1097.1099,1101，1103,1105,"07,"09,"11，1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592，1597,1602，1607,1612,1617,1622，1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672或化77,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99。/。一致性的序列SEQIDNO1071,1073，1075,1077，1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101，1103'"05,1107,1109,1111,"13，1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617'1622，1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672或1677,或其互補序列，以及(iii)包含以下^壬意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO1071,1073,1075,1077,1079,1081.1083'1085,1087,1089.1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,"05,1107,"09,1111，"13,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592，1597,化02'1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667，1672或1677，或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO1161至1571中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，并且-所述昆蟲選自褐飛虱屬(例如，褐飛虱)。31.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下4壬意序列SEQIDN01682'1684'1686,1688'1690'1692，1694，1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090或2095，或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700.1702，1704'1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090或2095,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO1682，1684,1686,1688，1690,1692,1694,1696，1698,1700,1702,1704，1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085，2090或2095,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO1730至2039中任意序列的至少17個連續(xù)核普酸的基因的直系同源物，或其互補序列，并且-所述昆蟲選自禾草螟屬(例如，二化螟、臺灣稻螟或黑頭螟)。32.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下4壬意序列SEQIDNO2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338，2339，23"，2349,2354或2359,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO2100,2102,2104,2106，2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354或2359,或其互4卜序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO2諷2102,2104,2106,2108,2120至2338，2339,2344，2349,2354或2359,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO2120至2338中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，并且-所述昆蟲選自P/iite/Zaspp.(例如，小菜蛾)。33.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法，其中-所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下4壬意序列SEQIDN02364'2366'2368'2370'2372'2384至2460，2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％,更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99°/。一致性的序列S￡QIDNO2364,2366,2368,2370,2372,2幼4至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO2384至2460中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列，并且-所述昆蟲選自Jd^tospp.(例如，美洲蝶蟀)。34.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO1'3'5,7,9,11，13,15,17，19,21,23,49至158,159，160至163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230,240至246,或2486,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1，3,5,7,9,11，13,15,17，19'21，23,49至158,159,160至163,168,173,178,183,188,193,198,203，208,215,220,225,230,240至246,或2486.或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO1,3,5,7,9,11，13,15,17，19,21,23,49至158,159,160至163.168,173,178,183，188,193,198,203，208,215,220,225,230,240至246，或2486,或其互補序列，或者其中所述核^f列是包含SEQIDNO49至158中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。35.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO247,249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,488,493,498,503,508至512,或其互岸卜序歹'J，(H)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO247'249'251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,488,493,498,503,508至512,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO247'249,251,253,255,257，259,275至472,473,478,483,488,493,498,503,508至512,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO275至472中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。36.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO513,515,517,519,521,533至575,576,581,586,591或596,或其互補序列'(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％,更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO513,515,517.519,521,533至575，576,581,586，591或596,或其互補序列'以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO513,515，517,519,521,533至575'576'581,586,591或596,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO533至575中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。37.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO601,603,605,607,609,621至767，768,773,778,783或788,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%,更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99。/。一致性的序列SEQIDNO601,603,605,607,609,621至767,7幼，773,778,783或788，或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO601,603,605,607,609,621至767，768，773,778,783或788,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO621至767中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。38.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO793,795,797,7的，801,813至862,863,868，873,878或883,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95。/。、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO793,795,797.7的，801,813至862,863,868，873,878或883,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO793,795,797,7的，801,813至862,863,868,873,878或883,或其亙補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO813至862中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。39.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下4壬意序列S￡Q10NO8B8'890，&92'894'896>908至1040'1041,1046、1051、1056,1061'或1066至1071，或其互4卜序歹'j，(U)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％,更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO888,890,892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056，1061,或1066至1071,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQ,DNO888,890,892,894,896,908至1040,1041,1046、1051'1056>1061,或1066至1071'或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO卯8至1040中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。40.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下任意序列SEQIDNO1071,1073'1075,1077,1079,1081,1083'1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,"05,1107,"09,"11,"13,"61至1571,1572,1577,1582,1587，1592,1597,1602,1607，1612,1617,1622，1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657，1662,1667,1672或1677，或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75。/。、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1071,1073，1075,1077，1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101,1103，1105，"07,1109,1111,1113，1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592，1597,1602,1607,化12,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672或1677,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列'SEQIDNO1071,1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,"01,1103,"05,1107'"09,"11,1113."61至1571,1572,1577,1582,1587，1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622，1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672或1677，或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO1161至1571中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。41.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下4壬意序列SEQIDN01682,1684'1686'1688'1690'1692'1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080，2085,2090或2095,或其互補序列'(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696'1698,1700,1702，1704,1730至2039,2040，2045,2050,2055,2060,2065'2070,2075,2080、2085,2090或2095,或其互補序列，以及(m)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO1682,1684,化86,1688，1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704，1730至2039，2040,2045,2050，2055,2060.2065,2070,2075,2080,2085,2090或2095,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO1730至2039中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。42.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以"Pf壬意序列SEQIDNO2100,2102.2104,2106,2諷2120至2338，2339，23"，2349，2354或2359,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％，更優(yōu)選至少95。/。、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO2100，2102,2104,2106，2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354或2359,或其互^^卜序列，以及(m)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344，2349，2354或2359,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO2120至2338中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。43.對害蟲具有抗性的轉基因植物，其包含多核苷酸，所述多核苷酸含有核酸序列，所述核酸序列選自包含以下的組(i)以下4壬意序列SEQIDNO2364'2366'2368'2370'2372'2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，(ii)與以下任意序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、卯％,^>優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO2364，2366,236B,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，以及(iii)包含以下任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的序列SEQIDNO2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互補序列，或者其中所述核酸序列是包含SEQIDNO2384至2460中任意序列的至少17個連續(xù)核苷酸的基因的直系同源物，或其互補序列。44.根據(jù)權利要求34至43中任一項的轉基因植物，其還包含或表達選自以下的殺蟲劑馬鈴薯塊莖貯藏蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側孢芽孢桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白。45.權利要求44的轉基因植物，其中所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白選自Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元殺蟲蛋白CryET33和CryET34、二元殺蟲蛋白CryET80和CryET76、二元殺蟲蛋白TIC100和TIC101以及二元殺蟲蛋白PS149B1。46.根據(jù)權利要求1的分離的核酸、根據(jù)權利要求2或3的雙鏈核糖核苷酸序列、根據(jù)權利要求4或5的細胞、根據(jù)權利要求6至14中任一項的植物、權利要求15的種子或者繁殖或增殖材料、權利要求16或17的產(chǎn)品、權利要求34至45中任一項的轉基因植物用于防止昆蟲在植物上生長的用途。47.根據(jù)權利要求1的分離的核酸、根據(jù)權利要求2或3的雙鏈核糖核苷酸序列、根據(jù)權利要求4或5的細胞、根據(jù)權利要求6至14中任一項的植物、權利要求15的種子或者繁殖或增殖材料、權利要求16或17的產(chǎn)品、權利要求34至45中任一項的轉基因植物用于防止昆蟲對植物侵害的用途。48.根據(jù)權利要求1的分離的核酸、根據(jù)權利要求2或3的雙鏈核糖核苷酸序列、根據(jù)權利要求4或5的細胞、根據(jù)權利要求6至14中任一項的植物、權利要求15的種子或者繁殖或增殖材料、權利要求16或17的產(chǎn)品、權利要求34至45中任一項的轉基因植物用于提高產(chǎn)量的用途。全文摘要本發(fā)明涉及使用雙鏈RNA分子防治害蟲侵害的方法。本發(fā)明提供利用本發(fā)明的植物制備表達所述雙鏈RNA分子的轉基因植物的方法，以及殺蟲劑和商品。文檔編號C12N15/113GK101370941SQ200780002295公開日2009年2月18日申請日期2007年1月12日優(yōu)先權日2006年1月12日發(fā)明者勞倫特·庫布勒,埃爾絲·萬布勒,羅曼·雷馬克斯申請人:德福根有限公司