一種利用基因操作提高球孢白僵菌分生孢子產(chǎn)量和毒力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及利用基因工程方法改良真菌性狀。
【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲病原真菌是一類重要的昆蟲病原微生物，是自然界控制昆蟲種群的一類 重要自然控制因子（Clarksonetal.，1996,TrendsMicrobiol.，4:197 - 203;Feng etal. , 1994,BiocontrolSci.Technol. , 4:3 - 34；Robertsetal. , 2004,Adv.Appl. Microbiol. , 54:1 - 70)。其中白僵菌（Beauveria)、綠僵菌（Metarhizium)、棒束抱 (Isaria)、輪枝孢（Verticillium)等絲孢類真菌由于其顯著的流行潛力和生產(chǎn)的便利性， 被廣泛用于農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲的生物防治。而且，與細(xì)菌和病毒類昆蟲病原微生物通過 消化道侵染方式不同，昆蟲病原真菌是唯一直接穿透體壁侵染昆蟲的微生物，對(duì)于控制將 口針直接插入植物韌皮部吸食汁液的刺吸式口器害蟲如蚜蟲、葉蟬、飛虱等具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì) (Hajeketal. , 1994,Annu.Rev.Entomol. , 39:293 - 322 ；St.Legeretal. , 1996,Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 93:6349 - 6354)。因此，開發(fā)和應(yīng)用真菌殺蟲劑受到國內(nèi)外的廣泛關(guān) 注，目前全球注冊(cè)登記的真菌制劑多達(dá)170余種，用于防治農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲（deFaria etal·，2007,BiolControl, 43:237-256)〇
[0003] 分生孢子是球孢白僵菌等昆蟲病原真菌侵染昆蟲的主要單元，產(chǎn)孢量是生產(chǎn)真菌 殺蟲劑重要參數(shù)。目前，生產(chǎn)上提高產(chǎn)孢量的方法主要是通過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，尚無 利用基因操作提高菌株分生孢子產(chǎn)量的報(bào)道。毒力或侵染速度是真菌制劑應(yīng)用效果的重要 指標(biāo)，增強(qiáng)病原真菌毒力是提升其應(yīng)用效果的重要環(huán)節(jié)。
[0004] 細(xì)胞壁糖蛋白與真菌發(fā)育分化、侵染致病、細(xì)胞粘著和在宿主細(xì)胞附著、以及逆 境脅迫反應(yīng)密切相關(guān)（GaurandKlotz，1997,Infect.Immun. ,65:5289 - 529;Buckand Andrewa, 1999,Appl.Environ.Microbiol.,65:465 - 471；Friemanetal.,2002,Mol. Microbiol. , 46:479 - 492 ；Fernandez-Alvarezetal., 2009,PlantCell, 21:3397 -3412;WangandSt.Leger, 2007,Eukaryot.Cell, 6:808 - 816)。其中，0-甘露糖基化 蛋白修飾是〇-糖基化蛋白修飾的一種重要類型，該類修飾從酵母到人類具有進(jìn)化上的 保守性，主要是將甘露糖基添加到修飾的革E標(biāo)蛋白（GentzscandTanner, 1996,ΕΜΒ0 J. , 15:5752 - 5759 ；Strahl-Bolsingeretal. , 1999,J.Biol.Chem. , 274:9068 - 9075 ； Wilieretal· ,2003,Curr.Opin.Struct.Biol. ,13:621 - 630)。在真菌中，蛋白質(zhì) 的〇-甘露糖化由蛋白質(zhì)〇-甘露糖化轉(zhuǎn)移酶（protein-〇-mannosyltransferases(PM Ts))起始。PMTs是一類定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜蛋白，將第一個(gè)甘露糖基加到修飾蛋白的絲 氨酸（Ser)或蘇氨酸（Thr)殘基上。模式真菌釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae) 含有七個(gè)PMT蛋白（ScPmtl-7)，分屬于三個(gè)不同的亞家族，S卩PMT1亞家族（包括Pmtl、 Pmt5和Pmt7)、PMT2亞家族（包括Pmt2、Pmt3和Pmt6)和PMT4亞家族（包括Pmt4) (GentzschandTanner, 1996,ΕΜΒ0J. , 15:5752 - 5759 ； 1997,Glycobiology, 4:481-486)〇 白色念珠菌（Candidaalbicans)和漢遜酵母菌（Hansenulapolymorpha)均含有五 個(gè)PMT蛋白，包括兩個(gè)PMT1亞家族蛋白、兩個(gè)PMT2亞家族蛋白和一個(gè)PMT4亞家族蛋 白(Rouabhiaetal. , 2005,Infect.Tmmun. , 73:4571 - 4580；Kimetal. , 2013,Fungal Genet.Biol.，58-59:10 _24)。但是，裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、隱球酵 母（Cryptococcusneoformans)和絲狀真菌如構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans)、煙曲 霉（A.fumigatus)、灰葡萄抱（Botrytiscinerea)、玉米黑粉菌（Ustilagomaydis)、球 抱白僵菌（Β·bassiana)等，每個(gè)PMT亞家族僅有一個(gè)成員（町11616七&1.，2005，]\1〇1· Microbiol. , 57:156 - 170；ffillgeretal.,2009,PLoSOne,4:e6321；Kriangkripipat andMomany, 2009,Eukaryot.Cell,8:1475 - 1485；Zhouetal.,2007,Eukaryot. Cell, 6:2260 _ 2268；Gonzalezetal. , 2013,PLoSOne, 8:e65924 ；Ferna.ndcz~Alva.rez etal. ,2009,PlantCe11,21:3397 - 3412；ffangetal.,2014,G1ycobiolo gy, 24:638-648)。在釀酒酵母（S.cerevisiae)和白色念珠菌（C.albicans)中，PMT1 和 PMT2亞家族成員形成具有酶活形式的異源二聚體，PMT4則形成具有酶活形式的同源二聚 體（Gentzschetal·，1995,FEBSLett.，377:128 - 130;Girrbachetal·，2003,J.Biol. Chem. ,278:12554 - 12562)。在裂殖酵母中也發(fā)現(xiàn)相似的二聚體活性形式（Wilieret al·，2005,Mol.Microbiol.，57:156 - 170)。
[0005] 0-甘露糖化的生理學(xué)功能主要是通過基因敲除等手段進(jìn)行研究的。在模式 真菌釀酒酵母（S.cerevisiae)中，單個(gè)Pmt基因?qū)瓴⒉皇潜匦璧模械腜mt參與細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞完整性、細(xì)胞極化和形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程（Girrbachet al·，2000,J.Biol.Chem.，275:19288 - 19296)。在白色念珠菌（C.albicans)中，Pmt 亞基對(duì)菌株生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生、殺真菌劑抗性和毒力具有重要影響，但不同的Pmt亞基的 作用存在差異或作用專化性（Timpeletal·，1998,J.Biol.Chem.，273:20837-20846 ; Prilletal. , 2005,Mol.Microbiol. , 55 : 546 - 560；Timpeletal. , 2000,J. Bacteriol. ,182:3063 - 3071；Rouabhiaetal. , 2005,Infect.Tmmun. , 73:4571 - 4580)〇 單個(gè)敲除裂殖酵母（S.p〇mbe)Pmtl或Pmt4基因均降低了菌株0-甘露糖基化水平，導(dǎo)致菌 株細(xì)胞壁和分隔形成異常，嚴(yán)重影響了細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞的分裂（Wilieretal.，2005,Mol. Microbiol.，57:156 - 170)。隱球酵母（C.neoformans)Pmt1 和Pmt4 對(duì)菌株形態(tài)發(fā) 生和毒力具有關(guān)鍵作用，雙敲除Pmtl和Pmt4對(duì)菌株是致死的（Olsonetal.，2006; Eukaryot.Cell，6:222 - 234;Willgeretal.，2009;PLoS0ne，4:e6321)。構(gòu)巢曲霉 (A.nidulans)所有單個(gè)Pmt亞基對(duì)菌株存活并不是必需的，但單個(gè)Pmt亞基突變株在高 溫下的生長(zhǎng)明顯受抑制，菌體形態(tài)異常（KriangkripipatandMomany, 2009,Eukaryot. Cell, 8:1475 - 1485)。煙曲霉（A.fumigates)中，敲除Pmtl亞基導(dǎo)致菌株產(chǎn)生溫度敏 感表型（Zhouetal·，2007,Eukaryot.Cell, 6:2260 - 2268)，然而敲除Pmt4 導(dǎo)致菌絲 形態(tài)異常，分生孢子產(chǎn)生極少以及出現(xiàn)不正常及極性生長(zhǎng)（Mouynaetal.，2010，Mol. Microbiol.，76:1205 - 1221)，而降低Pmt2表達(dá)水平則導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)延滯、細(xì)胞壁缺陷、極 性生長(zhǎng)異常以及降低分生孢子產(chǎn)生等（Fangetal·，2010,Glycobiology，20:542 - 552)。 植物病原真菌玉米黑粉菌（U.maydis)中，缺失Pmtl或Pmt2對(duì)菌株生長(zhǎng)和配接無明顯 影響，但Pmt4參與保持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性，而且對(duì)侵染結(jié)構(gòu)附著胞形成和穿透宿主植物 體壁是必需的（Fern&ndez-人丨vai.ezal.，2009,PlantCell, 21:3397 - 3412)?；移?萄孢（B.cinerea)Pmt亞基（特別是Pmt2亞基）對(duì)維持細(xì)胞壁穩(wěn)定性、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢 以及胞外基質(zhì)的產(chǎn)生等起了關(guān)鍵作用。而且，每個(gè)Pmt亞基均介導(dǎo)毒力和對(duì)寄主植物的 穿透（Gonzcilezetal.，2013，PLoSONE，8:e65924)。生防真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)中，敲除一個(gè)與Pmt2功能相似的Pmt亞基基因Pmtl，引起菌株對(duì)高滲脅迫和 細(xì)胞壁合成抑制劑焚光增白劑（calcofluorwhite)敏感性增強(qiáng)，細(xì)胞隔膜形成缺陷 (G0rka-Nie0etal·，2008,ActaBiochim.Pol. 55:251 - 259)。另外，在白色念珠菌 (C.albicans)、裂殖酵母（S.pombe)、隱球酵母（C.neoformans)、煙曲霉（A.fumigates)和 玉米黑粉菌（U.maydis)中，敲除Pmt2同源基因?qū)е戮曛滤?，表明Pmt2是這些真菌存活 所必需的（卩1116七31.，2005，]?〇1.]\^(^〇1^〇1.55:546 - 560;町11616七31.，2005，]\1〇1· Microbiol. 57:156 - 170；ffillgeretal. , 2009,PLoSOne, 4:e6321；Fangetal. , 2010, Glycobiology, 20:542 - 552 ；Fernandez-Aivarezetal. , 2009,PlantCell, 21:3397 -3412)。然而，在其它一些真菌包括A.nidulans、B.cinerea和T.reesei中，Pmt2并不 是存活所必需的（KriangkripipatandMomany, 2009,Eukaryot.Cell, 8:1475 - 1485 ; Gonzalezetal. , 2013,PLoSOne8:e65924 ；G0rka-Niecetal. , 2008,ActaBiochim. Pol.，55:251 - 259)。由此表明，蛋白質(zhì)0-甘露糖基化活性在真菌發(fā)育和生長(zhǎng)過程中扮演 了重要角色，但在不同的真菌中明顯存在功能上的分化。
[0006]所有真核細(xì)胞Pmtl均含有一個(gè)PMT(dolichyl-phosphate-mannose-prot einmannosyltransferase)結(jié)構(gòu)域和三個(gè)MIR(mannosyltransferase,inositol triphosphate-andryanodinereceptor)結(jié)構(gòu)域（Ponting, 2000)。在釀酒酵母中， MIR結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)或體外對(duì)Pmtl酶活（甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活）均是必需的（Girrbachet al·，2000,J.Biol.Chem.，275:19288 - 19296)，但刪除MIR結(jié)構(gòu)域不影響Pmtl對(duì)一個(gè)光敏 肽底物的結(jié)合（Lommeletal·，2011，J.Biol.Chem·，286:39768 - 39775)。然而，在絲狀真 菌中，MIR結(jié)構(gòu)域?qū)mtl酶活的貢獻(xiàn)以及功能，尚不明確。昆蟲病原真菌球孢白僵菌中存 在三個(gè)Pmt亞基Pmtl、Pmt2和Pmt4。利用基因敲除（Pmtl和Pmt4)和反義抑