專利名稱：：沙眼衣原體特異性寡核苷酸序列的制作方法沙眼衣原體特異性寡核普酸序列相關(guān)的申請(qǐng)[1]本申請(qǐng)要求2005年11月7日提交的標(biāo)題為"沙眼衣原體特異性寡核苷酸序列，，的臨時(shí)申請(qǐng)NO.60/734,155的優(yōu)先權(quán)。該臨時(shí)申請(qǐng)通過完全引用合并在此。發(fā)明背景[2]衣原體是對(duì)各種各樣的重要的人類和動(dòng)物感染負(fù)責(zé)的分布廣泛的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌性病原體。衣原體是專性的、非運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性細(xì)菌，特征是獨(dú)特的雙相性生命周期，具有功能上和形態(tài)上不同的二態(tài)的形式。衣原體科的四個(gè)主要物種之一的沙眼衣原體(C/z/am>^&frac/wmato)幾乎是專有的人類病原體，它是世界上性傳播的疾病和可預(yù)防的失明的最常見原因。沙眼衣原體存在15種不同的血清型，包括引起沙眼(一種雙側(cè)性角膜炎，其主要在非洲、中東和亞洲影響超過4億人)的血清型A、B、Ba和C;血清型D到K,其導(dǎo)致包涵體結(jié)膜炎和生殖道感染；以及血清型Ll到L3,其與性病性淋巴肉芽腫(在美國和歐洲少有的、但在熱帶國家占患有生殖器潰瘍疾病的患者的2-10%的性傳播的疾病)相關(guān)。3生殖器衣原體感染是在西方世界最常見的性傳播疾病(STD),是在美國最流行的細(xì)菌性STD。在2002年，超過800,000例新的生殖器衣原體病例被報(bào)告給CDC,超過了美國所有其他的應(yīng)報(bào)告的疾病(疾病控制和預(yù)防中心，"性傳播的疾病監(jiān)督，2002",美國衛(wèi)生與人類服務(wù)署，亞特蘭大，喬治亞州，2003年9月)。漏報(bào)是相當(dāng)數(shù)量的，因?yàn)榕灾卸噙_(dá)70-80%的感染和男性中大約50%的感染是臨床上沉默的(H.D.Davies等人,CMAJ，1996,153:1631-1644;S.D.Hillis等人,Sex.Transm.Dis.，1995，22:197-202;A.C.Gerbase等人,Sex.Transm,Infect.,1998,74:S12-S14;A.C.Gerbase等人，Lancet,1998，351:2-4)。未^t識(shí)別和未:f皮治療，細(xì)菌可以在宿主中保持傳染性達(dá)數(shù)月。沙眼衣原體感染的無癥狀特征可能促進(jìn)它在風(fēng)險(xiǎn)群體中的傳播并促進(jìn)感染的小者藏(reservoir)(S.E.ThompsonandA.E.^Vashington,Epidemiol.Rev.，1983,5:96-123;T.Ripa,Scand.J.Infect.Dis.Suppl.,1990,69:157-167)。41當(dāng)它們存在時(shí)，女性中的衣原體感染的癥狀包括增多的陰道排出物、性交后和/或經(jīng)期出血、下腹疼痛和排尿困難(B.A.CromerandF.P.Head,Sex.Transm.Dis.,1987,14:125-129;S.M.GarlandandB.Johnson,Med.J.Austral.,1989，150:174-177;G.R.Scott等人，Br.J.ObstetGynaecol.,1989,96:473-477;C.K.Malotte等人,Am.PublicHealth,1990，80:469-471;P.Oakeshott等人，F(xiàn)am.Pract.,1992,9:421-424;J.T.Humphreys等人，Sex.Transm.Dis.,1992,19:47-53)。由感染的母親生產(chǎn)的嬰兒存在著結(jié)膜炎和肺炎的風(fēng)險(xiǎn)。在男性中，癥狀包括尿道分必物和排尿困難(J.Schachter，N.Engl.J.Med.,1978,298:428-435)。如果不治療，衣原體感染可能發(fā)展到嚴(yán)重的生殖問題和其他健康問題，具有短期和長(zhǎng)期的后果。與疾病本身一樣，衣原體導(dǎo)致的損壞通常是"沉默的"。在女性中，未治療的感染可以轉(zhuǎn)播到子宮和/或輸卵管，并引起骨盆炎癥性疾病(N.S.PadianandA.E.Washington,Ann.Epidemiol.,1994,4:128-132)。這發(fā)生于具有未治療的衣原體的40%的女性中。骨盆炎癥性疾病(PID)可以引起對(duì)輸卵管、子宮和周圍組織的永久性損傷，其可以引起慢性的骨盆疼痛、不育和潛在致死的宮外孕(W.CatesJr.等人，Am.J.ObstetGynecol.，1991,164:1771-1781;J.Coste等人,Fertil.Steril.，1994,62:289-295;L.WestrdmandP.Wolner-Hansen,Genitourin.Med.,1993,69:9-17)。在男性中，未治療的衣原體可以引起前列腺炎、尿道的傷疤、不育和附睪炎。雖然患有任何性傳播疾病的患者處于另一種STD的共感染的提高風(fēng)險(xiǎn)之中，衣原體和淋病的共感染是最常見的。具有衣原體感染的百分之四十(40%)和女性和20%的男性祐淋病共感染。衣原體感染還被報(bào)告與發(fā)生子宮頸癌癥的提高的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(S.Hillis等人，Sex.Transm.Dis.,1995,22:197-202;T.Anttila等人,JAMA,2001，286:47-51)。由于衣原體感染的洽愈性抗生素治療是易于獲得和便宜的，早期診斷是控制這些感染的公共衛(wèi)生程序的重要部分。早期檢測(cè)的目標(biāo)包括中斷傳播鏈和預(yù)防長(zhǎng)期的后遺癥(J.Paavonen等人，Obstet.Gynecol.,1998,92:292-298)。如果暴露，具有生殖器衣原體感染的患者也處于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的提高的風(fēng)險(xiǎn)中。通過早期診斷和治療來縮短傳染性的持續(xù)時(shí)間對(duì)于降低HIV感染的風(fēng)險(xiǎn)具有主要影響。61細(xì)胞培養(yǎng)物中沙眼衣原體的分離已經(jīng)是實(shí)驗(yàn)室診斷的傳統(tǒng)方法，由于它的特異性而仍然是法醫(yī)學(xué)樣本的所選方法。然而，這種方法需要昂貴的設(shè)備、技術(shù)專家和嚴(yán)格的運(yùn)輸條件以保持樣本生存力；它還具有2到3天的周轉(zhuǎn)時(shí)間。在許多情況中，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)被基于抗原檢測(cè)的更快速的測(cè)試替代，通過直接的焚光抗體染色、酶免疫測(cè)定和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，其較少需要轉(zhuǎn)運(yùn)要求并可以在同一天內(nèi)提供結(jié)果。然而，這些方法仍然是費(fèi)力和耗時(shí)的，并其更重要地，缺乏篩選分析的敏感性，特別是對(duì)于無癥狀的患者。7近年來，基于核酸的雜交探針測(cè)試已經(jīng)被開發(fā)用于沙眼衣原體的直接檢測(cè)(R.Warren等人，J.Clin.Microbiol.,1993,31:1663-1666)。這些測(cè)試提供了更高的特異性，但對(duì)敏感性沒有實(shí)質(zhì)上的改善。此外，大多數(shù)這些測(cè)試是對(duì)子宮頸內(nèi)或尿道的樣本進(jìn)行的，其是使用侵入性采樣方法獲得的?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、分支DNA或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)技術(shù)的核酸擴(kuò)增分析是現(xiàn)在可獲得的(M.Buimer等人，J.Clin.Microbiol.，1996,34:2395-2400;M.A.Chernesky等人，Mol.andCellProbes,1996,11:243-249;T.C.Quinn等人，J.Clin.Microbiol.,1996,34:1401-1406;G丄.Ridgway等人,J.Clin.Pathol.,1996,49:116-119;C.M.Black,Clin.Microbiol.Rev.,1997,10:160-184;K.A.Crotchfelt等人,J.Clin.Microbiol.,1997,35:1536-1540;P.O.DaviesandG.L.Ridgway，Int.J.STDAIDS,1997,8:731-738;L.Gmn等人，NMJ,1997,315:226-230;K.A.Crotchfelt等人，J.Clin.Microbiol.，1998,36:391-394;C.A.Gaydos等人，J.Infect.Dis.,1998,177:417-424;R.Pasternack等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，1999，18:142-144)。除了就周圍樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、批次自動(dòng)化和快速處理時(shí)間而言提供非培養(yǎng)測(cè)試的所有益處之外，這些分析提供了更高的特異性和接近100%的敏感性。此外，它們可以對(duì)較低侵入性的臨床樣本例如尿液來進(jìn)行(J.E.Bauwens等人，J.Clin.Microbiol.,1993,31:3013-3116;M.Domeika等人，J.Clin.Microbiol.,1994,32:2350-2352;M.A.Chernesky等人，J.Clin.Microbiol.,1994,32:2682-2685;H.H.Lee等人，Lancet,1995,345:213-216;M.Bassiri等人，J.Clin.Microbiol.,1995,33:898-900;T.C.Quinn等人,J.Clin.Microbiol.，1996,34:1401-1406;R.Pasternack等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，1999，18:142-144;K.Tempieton等人，Int.J.STDAIDS,2001，12:793-796;R.A.McCartney等人，Br.J.Biomed.Sci.,2001,58:235-238;L.A.Cosentino等人，J.Clin.Microbiol.，2003,41:3592-3596)。所有這些益處使得核酸擴(kuò)增分析特別適合于無癥狀衣原體感染的沖企測(cè)以及作為篩選工具。然而，用于衣原體檢測(cè)的現(xiàn)有的核酸擴(kuò)增分析仍然展現(xiàn)了某些缺點(diǎn)和局限。雖然這些分析已經(jīng)被設(shè)計(jì)以最小化污染，仍然存在這阻礙來以這種相對(duì)新的技術(shù)替換較低敏感性的測(cè)試。主要的考慮包括由于某些樣本中存在擴(kuò)增抑制物引起的假陰性結(jié)果，以及由于如果沒有應(yīng)用嚴(yán)格的質(zhì)量控制操作的交叉污染的假陽性結(jié)果。其他考慮包括不能以相等的效力、成本和樣品通量檢測(cè)所有血清型的沙眼衣原體。明顯地，用于檢測(cè)衣原體感染的改進(jìn)的核酸擴(kuò)增分析的開發(fā)仍然是高度希望的。發(fā)明概述9本發(fā)明涉及用于生物樣品中沙眼衣原體的快速、選擇性和特異性檢測(cè)的系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明涵蓋可用于開發(fā)檢測(cè)和診斷衣原體感染的核酸擴(kuò)增測(cè)試的試劑。更具體地，本發(fā)明提供了擴(kuò)增引物的寡核苷酸序列以及用于沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒(crypticplasmid)中任一目標(biāo)核酸序列鏈的檢測(cè)的檢測(cè)探針。某些本發(fā)明的寡核苷酸序列具有識(shí)別沙眼衣原體的所有十五種血清型的優(yōu)點(diǎn)。10在某些實(shí)施方式中，作為引物集和引物/探針集來提供寡核苷酸序列，其可被用于包括涉及實(shí)時(shí)和多路(multiplex)檢測(cè)的各種核酸擴(kuò)增分析的任一種中。本發(fā)明的其他方法包括用在此描述的至少一種引物集或引物/探針集和擴(kuò)增反應(yīng)試劑接觸懷疑含有沙眼衣原體核酸的測(cè)試樣品以形成反應(yīng)混合物。所述反應(yīng)混合物然后置于擴(kuò)增條件之下以擴(kuò)增沙眼衣原體核酸，如果測(cè)試樣品中存在沙眼衣原體核酸，并產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物可以使用各種檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，利用本發(fā)明的檢測(cè)探針形成擴(kuò)增產(chǎn)物/探針雜交物，這種雜交物的檢出表明領(lǐng)'j試樣品中存在沙眼衣原體。在整個(gè)說明書中，采用了以下段落中定義的一些術(shù)語。[21術(shù)語"個(gè)體"、"受試者，，和"患者，，在此可互換地使用。它們是指可以作為沙眼衣原體的宿主、但可能纟皮或可能未^:所述細(xì)菌感染的人類。該術(shù)語不指示特定的年齡，因而涵蓋了成年人、兒童、新生兒以及胎兒。[22如在此使用的，術(shù)語"測(cè)試樣品"是指懷疑含有沙眼衣原體核酸的任何液體或固體材料。測(cè)試樣品可以是、或可以來自任何可以含有沙眼衣原體核酸的生物組織或液體。通常，樣品將是"臨床樣品"，即，從要測(cè)試衣原體感染的患者獲得或分離的樣品。這種樣品包括但不限于含有細(xì)胞材料并且可以或可以不含有細(xì)胞的體液，例如，血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、眼睛晶狀體液、淋巴液、羊水，等等；子宮頸內(nèi)的、尿道的、直腸的、陰道的、外陰-陰道的、鼻咽的和肺部的樣品；以及具有已知的診斷結(jié)論的存檔樣品。測(cè)試樣品還可以包括組織的切片，例如冷凍的切片。術(shù)語"測(cè)試樣品"還涵蓋通過加工生物樣品衍生的任何材料。衍生的材料包括但不限于從樣品分離的細(xì)胞(或它們的子代)、細(xì)胞成分、以及從樣品提取的核酸分子。獲得測(cè)試樣品的生物樣品的加工可以包括一種或多種的過濾、蒸餾、離心、提取、濃縮、稀釋、純化、鈍化干擾成分、添加試劑，等等。[23術(shù)語"核酸"、"核酸分子"和"多核苷酸，，在此可互換地使用。它們是指處于單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有說明，包括可以與天然發(fā)生的核苷酸按類似方式起作用的天然核苷酸的已知類似物。該術(shù)語涵蓋具有合成的主干的核酸樣結(jié)構(gòu)，以及擴(kuò)增產(chǎn)物。[24如在此使用的，術(shù)語"寡核苷酸，，是指可以用作擴(kuò)增引物或檢測(cè)探針的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的短的串列。這種短的核酸序列延伸通常是化學(xué)合成的，然而，它們可以通過任何其他適合的方法來制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，寡核苷酸的長(zhǎng)度(即，核香酸的數(shù)目)可以廣泛地變化，常常取決于它預(yù)期的功能或用途。一般地，寡核苷酸包含5到300個(gè)之間的核苷酸，例如約15到約100個(gè)核普酸之間，或約15到約50個(gè)核苦酸之間。25]術(shù)語"分離的"當(dāng)涉及寡核苷酸時(shí)是指寡核苷酸，根據(jù)它的來源或操作，分離自與之天然相關(guān)的至少某些成分。"分離的"，可選擇地或另外地，是指感興趣的寡核苷酸是通過人的手產(chǎn)生或合成的。[26在此關(guān)于寡核普酸(例如，在此提供的寡核苷酸)所使用的術(shù)語"活性片段"是指任何核酸分子，其包含足夠同源于或來自于所述寡核苦酸的核普酸序列的核苷酸序列，其包括比所述全長(zhǎng)寡核苷酸更少的核苷酸并且保持了完整序列的至少一種生物學(xué)性質(zhì)。一般地，活性片段包括具有全長(zhǎng)寡核苷酸的至少一種活性的序列。本發(fā)明的寡核苷酸序列的活性片段或部分可以是核酸分子，其長(zhǎng)度是例如10、15、20、25、30或更多核苷酸，并且可以用作擴(kuò)增引物和/或檢測(cè)探針用于生物樣品中沙眼衣原體的片全測(cè)。27當(dāng)關(guān)于寡核苷酸的活性片段在此使用時(shí)，術(shù)語"足夠同源"是指核酸分子，其具有與所述寡核苷酸相比至少35%的序列同源性。在某些實(shí)施方式中，所述序列同源性是至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法來完成兩個(gè)序列之間的序列比較和同一性百分比的確定。例如，兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性百分比可以4吏用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)來測(cè)定,其已經(jīng)^皮合并到ALIGN程序(版本2.0)中，使用PAM120加權(quán)殘基表，12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分。做為選擇，兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性百分比可以使用GCG軟件包(可在http:〃www.gcg.com獲得)中的GAP程序來測(cè)定，使用NWSgapdna.CMP矩陣。[30]術(shù)語"雜交"是指核苷酸序列之間復(fù)合物的形成，所述核苷酸序列是足夠互補(bǔ)的，以經(jīng)由Watson-Crick堿基配對(duì)或非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)形成復(fù)合物。當(dāng)引物與目標(biāo)序列(模板)雜交時(shí)，這種復(fù)合物(或雜交物)是足夠穩(wěn)定的，以提供例如DNA聚合酶所需的啟動(dòng)(priming)功能來啟動(dòng)DNA合成。要理解的是，雜交序列不必具有完美的互補(bǔ)性來提供穩(wěn)定的雜交物。在許多情況下，穩(wěn)定的雜交物將在少于10%的堿基錯(cuò)配的情況下形成。因而，如在此使用的，術(shù)語"互補(bǔ)的"是指在分析條件下與其互補(bǔ)物形成穩(wěn)定雙鏈體的寡核苷酸，一般其中有約90%或更高的同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何估計(jì)和調(diào)節(jié)雜交條件的嚴(yán)格度，從而具有至少期望水平的互補(bǔ)性的序列將穩(wěn)定地雜交，而具有更低互補(bǔ)性的那些序列不會(huì)雜交。對(duì)于雜交條件和參數(shù)的實(shí)例，參見,例^口,J.Sambrook等人,"A/o/ecw/arC/om力g;爿Z^6orafo^yA/a"w"/",1989,SecondEdition,ColdSpringHarborPress:Plainview,NY;F.M.Ausubel,"CMTewf尸rofoco/sz'wMo/ecw/arS/o/ogy",1994,JohnWiley&Sons:Secaucus,NJ。如在此使用的，術(shù)語"擴(kuò)增"是指提高樣品中特定核酸序列群體的存在的方法。擴(kuò)增方法(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR)是本領(lǐng)域已4口的，以下更i羊細(xì):l也討論。如在此使用的，術(shù)語"目標(biāo)序列，，是指要檢測(cè)的特定核酸序列。優(yōu)選的，目標(biāo)序列包括寡核苷酸引物將與之復(fù)合的核酸序列。目標(biāo)序列也可以包括探針雜交區(qū)域，探針將與所述探針雜交區(qū)域在期望的條件下形成穩(wěn)定的雜交物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的是，目標(biāo)序列可以是單鏈或雙鏈的。在本發(fā)明的上下文中，感興趣的目標(biāo)序列處在沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒中。331術(shù)語"引物"和"擴(kuò)增引物"在此可互換地使用。它們是指一種寡核苷酸，當(dāng)處于適合的條件(例如，緩沖液、鹽、溫度和pH值)下，在存在核苷酸和用于核酸聚合化的試劑(例如，DNA依賴性或RNA依賴性聚合酶)的情況下，其可以作為引物延伸產(chǎn)物的合成的起始點(diǎn)。為了擴(kuò)增中的最大效力，引物優(yōu)選的是單鏈的，但作為選擇可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，在用于制備延伸產(chǎn)物之前，引物可以首先被處理(例如，變性)以容許它的鏈的分離。這種變性步驟一般使用熱量來進(jìn)行，但做為選擇可以使用堿來進(jìn)行，隨后中和。典型的引物在序列的長(zhǎng)度上含有與目標(biāo)序列基本上互補(bǔ)的約10到約35個(gè)核苷酸。然而，引物也可以含有其他序列。例如，用于鏈置換擴(kuò)增(SDA)的擴(kuò)增引物優(yōu)選的在目標(biāo)結(jié)合序列的5'的位置包括限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(參見,例如，美國專利NO.5,270,184和5,455,166)?；诤怂嵝蛄械臄U(kuò)增(NASBA)、自持的序列復(fù)制(3SR)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)引物優(yōu)選的包括與引物的目標(biāo)結(jié)合序列連接的RNA聚合酶啟動(dòng)子。將這些專門化的序列連接到用于所選擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)合目標(biāo)序列的方法是本4貞i或7厶^p的。[34]術(shù)語"正向引物"和"正向擴(kuò)增引物"在此可互換地使用，是指相對(duì)于反向引物與目標(biāo)序列5'雜交(或退火)的引物。術(shù)語"反向引物"和"反向擴(kuò)增引物"在此可互換地使用，是指相對(duì)于正向引物與目標(biāo)序列3'雜交(或退火)的引物。[35如在此使用的，術(shù)語"擴(kuò)增條件"是指促進(jìn)引物序列的退火和/或延伸的條件。這種條件是本領(lǐng)域公知的，取決于所選的擴(kuò)增方法。因而，例如，在PCR反應(yīng)中，擴(kuò)增條件一般包括熱循環(huán)，即，反應(yīng)混合物在兩種或多種溫度之間的循環(huán)。在等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中，沒有熱循環(huán)地發(fā)生擴(kuò)增，雖然可能需要初始的溫度提高來啟動(dòng)反應(yīng)。擴(kuò)增條件涵蓋所有反應(yīng)條件，包括但不限于溫度和溫度循環(huán)、緩沖液、鹽、離子強(qiáng)度、以及pH值，等等。[36]如在此使用的，術(shù)語"擴(kuò)增反應(yīng)試劑"是指核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用的試劑，可以包括但不限于，緩沖液、具有逆轉(zhuǎn)錄酶和/或聚合酶活性或核酸外切酶活性的酶；酶輔助因子，例如鎂或錳；鹽；煙酰胺腺。票呤二核酸(NAD);和三磷酸脫氧核普(dNTP),例如三磷酸脫氧腺苷，三磷酸脫氧鳥苷、三磷酸脫氧胞普和三磷酸胸苷。擴(kuò)增反應(yīng)試劑可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員取決于使用的擴(kuò)增方法容易地選擇。[37]術(shù)語"探針"和"檢測(cè)探針"在此可互換地使用，是指在合適的條件能夠選擇性地與目標(biāo)序列的至少一部分雜交的寡核苷酸。一般地，探針序列被鑒定為"互補(bǔ)"于編碼鏈或有義鏈，或"反向互補(bǔ)，，于編碼鏈或有義鏈。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，檢測(cè)探針用可檢測(cè)部分來標(biāo)記。[38術(shù)語"標(biāo)記的"或"用可檢測(cè)試劑(或部分)標(biāo)記的"在此可互換地使用，來指出，例如在與另一個(gè)實(shí)體(例如，擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物或擴(kuò)增子)結(jié)合之后，實(shí)體(例如，寡核苷酸檢測(cè)探針)可以被顯現(xiàn)。優(yōu)選的，選擇可檢測(cè)試劑或部分，從而它產(chǎn)生可以被測(cè)量的信號(hào)，信號(hào)的強(qiáng)度與結(jié)合的實(shí)體的數(shù)量相關(guān)(例如，成比例)。用于標(biāo)記和/或檢測(cè)核酸分子的各種各樣的系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。標(biāo)記的核酸可以通過摻入、或結(jié)合于標(biāo)記來制備，所述標(biāo)記是可通過分光鏡的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電學(xué)的、光學(xué)的或化學(xué)的方法直接或間接檢測(cè)的。適合的可檢測(cè)試劑包括但不限于，放射性核素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光試劑、微粒、酶、比色標(biāo)記、磁性標(biāo)記、半抗原、分子信標(biāo)、和適體信標(biāo)。術(shù)語"熒光團(tuán)"、"熒光部分"和"熒光染料，，在此可互換地使用。它們是指在一個(gè)波長(zhǎng)吸收電磁輻射的量子、在不同的、一般更長(zhǎng)的波長(zhǎng)下響應(yīng)發(fā)射一種或多種光子的分子。各種各樣結(jié)構(gòu)和特征的大量熒光染料適合用于本發(fā)明的實(shí)踐。用于熒光標(biāo)記核酸分子的方法和材料是已知的(參見，例如R.P.Haugland,"Mo/ecw/"r尸raZ)^.'//a"必ooA0/f7縦"園/尸rahWb，c/2C/z謹(jǐn)'c^，2-7W,5thEd.，1994,MolecularProbes,Inc.)。優(yōu)選的，熒光部分以高效率吸收并發(fā)射光(即，它在使用的激發(fā)波長(zhǎng)下具有高摩爾吸光系數(shù)，和高熒光量子產(chǎn)量)，并且是不感光的(即，在進(jìn)行分析所需的時(shí)間內(nèi)在光激發(fā)時(shí)它不經(jīng)歷顯著的降解)。不是自身可直接被檢測(cè)的，某些熒光染料在熒光共振能量傳遞(FRET)的過程中將能量轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光染料，該第二染料產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。這種FRET焚光染料對(duì)也被術(shù)語"熒光部分"涵蓋。物理上連接的焚光報(bào)告物/淬滅劑部分的使用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這些實(shí)施方式中，當(dāng)熒光報(bào)告物或淬滅劑部分保持緊密接近時(shí)，例如處在核酸探針的末端，淬滅劑部分阻止了來自報(bào)告物部分的熒光信號(hào)的才全測(cè)。當(dāng)兩個(gè)部分物理上分離時(shí)，例如，在^皮TaqDNA聚合酶裂解之后，來自報(bào)告物部分的熒光信號(hào)變得可檢測(cè)。140術(shù)語"可直接;險(xiǎn)測(cè)的"，當(dāng)在此涉及標(biāo)記或可4企測(cè)部分使用時(shí)，是指標(biāo)記或可檢測(cè)部分不需要進(jìn)一步的反應(yīng)或操作來成為可檢測(cè)的。例如，熒光部分是通過熒光光譜方法可直接檢測(cè)的。術(shù)語"可間接檢測(cè)的"，當(dāng)在此涉及標(biāo)記或可檢測(cè)部分使用時(shí)，是指標(biāo)記或可片企測(cè)部分在進(jìn)一步的反應(yīng)或操作之后變成為可檢測(cè)的。例如，在與附著于報(bào)告物如熒光染料的合適的抗體反應(yīng)之后，半抗原變成為可檢測(cè)的。優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)i兌明[41]如上所述，本發(fā)明涉及用于特異性和選擇性地檢測(cè)生物樣品中的沙眼衣原體的方法和試劑。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用沙眼衣原體特異性寡核苷酸序列和敏感的基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)，其容許檢測(cè)含有甚至少量細(xì)菌的樣品中的沙眼衣原體。I-擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針的寡核苷酸序列^:'窮^,裙茅凌^^|42]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸序列，其可以用于沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒中目標(biāo)序列的任一鏈的特異性檢測(cè)的核酸擴(kuò)增測(cè)試。43]沙眼衣原體的7,493堿基對(duì)隱性質(zhì)粒是衣原體感染的基于DNA的診斷的良好目標(biāo)，因?yàn)樗鼘?duì)該有機(jī)體是特異性的，并且以每個(gè)基因組約7-10個(gè)拷貝在基本上所有的臨床菌林中存在(J.E.Tam等人，Plasmid,1992,27:231-236)。所有來自人類沙眼衣原體分離物的質(zhì)粒是極其相似的，具有低于1%的核苷酸序列變異。沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒的完整DNA內(nèi)容已經(jīng)^皮測(cè)序(K.S.SripmkashandE.S.Macavoy，Plasmid，1987,18:205-214;C.Hatt等人，NucleicAcidsRes.,1988，16:4053-4067;M.Comanducci等人，Mol.Microbiol.,1988,2:531-538;M.Comanducci等人，Plasmid,1990,23:149-154;N.S.ThomasandI.N.Clarke,Proc.2ndMeetingEur.Soc.ChlamydiaRes.1992,p.42,SocietaEditriceEsculapio:Bologna,Italy)并凈皮寸呆存在GenBank(Accession#X06707)中。441本發(fā)明的寡核苷酸序列特異于沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒中的目標(biāo)序列。更具體地，本發(fā)明提供了擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針的寡核苷酸序列，其識(shí)別沙眼衣原體的一種或多種血清型。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸序列識(shí)別沙眼衣原體的所有十五種血清型。本發(fā)明的示范性的寡核苷酸序列在表1和表2中示出(SEQIDNO:1到41)，連同它們相應(yīng)的作圖位置。這些序列是本申請(qǐng)人利用載體NTI、ABI引物表達(dá)和OHgo6軟件程序通過與沙眼衣原體隱性質(zhì)粒pLGV440序列的序列比對(duì)筌定的。45]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，用于沙眼衣原體的擴(kuò)增、檢測(cè)或定量的在此公開的任何寡核苷酸序列(或其活性片段)可以被采用作為檢測(cè)探針或擴(kuò)增引物，取決于預(yù)期的用途或分析形式。例如，在一個(gè)分析中用作擴(kuò)增引物的發(fā)明的寡核苷酸序列可以在另一個(gè)分析中用作檢測(cè)探針。給出的序列可以被修飾，例如，通過在發(fā)明的寡核苷酸序列上附著所選擴(kuò)增方法所需的專門化序列(例如，啟動(dòng)子序列)，或通過連接熒光染料以便于檢測(cè)。還要理解的是，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以包括一種或多種序列，所述序列可以充當(dāng)間隔區(qū)、接頭、用于標(biāo)記或結(jié)合到酶的序列、可以為所述寡核苷酸賦予對(duì)降解過程增加的穩(wěn)定性或敏感性或其他期望性質(zhì)的序列。46]根據(jù)本發(fā)明所提供的寡核苷酸序列，可以制備一種或多種寡核苷酸類似物(參見下文)。這種類似物可以含有可選擇的結(jié)構(gòu)，例如肽核酸或"PNA"(即，具有肽樣主干代替天然發(fā)生核酸的磷酸鹽糖類主干的分子)等等。這些表現(xiàn)了本發(fā)明的序列的可選擇的結(jié)構(gòu)也是本發(fā)明的部分。類似地，理解的是，由本發(fā)明的序列構(gòu)成的寡核苷酸可以含有核酸堿基的刪除、添加和/或替換，達(dá)到這樣的改變不消極地影響核酸分子的性質(zhì)的程度。特別地，所述改變應(yīng)當(dāng)不引起寡核普酸的雜交性質(zhì)的顯著降低。//參桌和《參/探奸菜[47]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在此公開的寡核普酸序列的組合，用于檢測(cè)生物樣品中的沙眼衣原體。更具體地，本發(fā)明提供了引物集和引物/探針集。48如在此使用的，術(shù)語"引物集"是指兩種或多種引物，其在一起能夠啟動(dòng)感興趣核普酸序列(例如，沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒內(nèi)的目標(biāo)序列)的擴(kuò)增。在某些實(shí)施方式中，術(shù)語"引物集"是指包括正向引物和反向引物的一對(duì)引物。這種引物集或引物對(duì)在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中是特別有用的。[49包含正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物的引物集的實(shí)例包括引物集1，其包括包含SEQIDNO:1(5'-GGATACTCATCAGGCGTTCCTAAT-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:2(5'-CCCATACCACACCGCTTTCT隱3')或其任何活性片段的反向引物；引物集2,其包括包含SEQIDNO:5(5'-TGTGACCTTCATTATGTCGGAGTCT-3')或其任何活性片,爻的正向引物，和包含SEQIDNO:6(5'-GTTCTCTCAAGCAGGACTACAAGCT-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集3,其包括包含SEQIDNO:9(5'-GCTCCGGATAGTGAATTATAGAGACTAT-3')或其任何活性片l殳的正向引物，和包含SEQIDNO:10(5'-AGATCGTCTGTGCGCAAAG-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集4,其包括包含SEQIDNO:13(5'-TTTGCGCACAGACGATCTA-3')或其任何活性片,殳的正向引物，和包含SEQIDNO:14(5'-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA國3')或其任何活性片段的反向引物；引物集5,其包括包含SEQIDNO:16(5'-GAGCACCCTAGGCGTTTGT-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:17(5'-CGTTCTCTCAAGCAGGACTACA-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集6,其包括包含SEQIDNO:20(5'-GGATGCAACTTGGCCCAAT-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:21(5'-GACACTAGCCCCCAATCCA-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集7,其包括包含SEQIDNO:23(5'-AATTTTGTCTTTGCGCACAG-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:24(5'-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集8，其包括包含SEQIDNO:26(5'-TGTCTTTGCGCACAGACGA-3')或其任何活性片^殳的正向引物，和包含SEQIDNO:27(5'國ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集9,其包括包含SEQIDNO:29(5'-TGCGCACAGACGATCTATTT-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:30(5'-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集10,其包括包含SEQIDNO:32(5'-TCTTTGCGCACAGACGATC-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:33(5'畫TGCAACTCCTCCATTAAGCTG-3')或其任何活性片段的反向引物；引物集11,其包括包含SEQIDNO:35(5'-TGCGCACAGACGATCTATTT-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQIDNO:36(5'-TGCAACTCCTCCATTAAGCTG-3')或其任何活性片段的反向引物。[50]本發(fā)明還提供了可以用于多路形式分析的引物集。這種引物集的實(shí)例是引物集CT(mpx),其包括包含SEQIDNO:38(5'-AGCCCTACGCCATTAGTTATGG-3')或其任何活性片段的第一正向引物，包含SEQIDNO:39(5'-GCCCTACGCGATTAGTTATGG-3')或其任何活性片段的第二正向引物，以及包含SEQIDNO:40(5'-CCCATACCACACCGCTTTCT-3')或其任何活性片段的反向引物。[51這些引物集可以根據(jù)任何核酸擴(kuò)增技術(shù)來使用，所述核酸擴(kuò)增技術(shù)采用兩種或多種寡核苷酸來擴(kuò)增目標(biāo)序列(如以下討論的)。使用發(fā)明的引物集產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物可以使用本領(lǐng)域公知的各種檢測(cè)方法來檢測(cè)。例如，擴(kuò)增產(chǎn)物可以使用瓊脂糖凝膠電泳、通過溴化乙錠染色來可視化、并暴露于紫外(UV)線來檢測(cè)，或通過擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析來確認(rèn)沙眼衣原體身份。[52]做為選擇，可以使用多種的同質(zhì)的或異質(zhì)的方法采用探針序列來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。一般地，在所有這些方法中，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈(或擴(kuò)增子)雜交來形成擴(kuò)增產(chǎn)物/探針雜交物。因而可以直接或間接地檢測(cè)雜交物，例如利用在引物、探針、或引物和探針兩者上的標(biāo)記。[531如在此使用的，術(shù)語"引物/探針"是指包含兩種或多種引物、以及可以檢測(cè)目標(biāo)序列的至少一種探針的組合，所述兩種或多種引物在一起能夠啟動(dòng)感興趣的核苷酸序列(例如，沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒內(nèi)的目標(biāo)序列)的擴(kuò)增。探針可以與擴(kuò)增產(chǎn)物(或擴(kuò)增子)的鏈雜交來形成擴(kuò)增產(chǎn)物/探針雜交物以容許擴(kuò)增子的檢測(cè)。本發(fā)明還提供了可以用于多路檢測(cè)形式的引物/探針集。這種引物/探針集的實(shí)例是引物/探針集CT(mpx),其包括包含SEQIDNO:38(5'-AGCCCTACGCCATTAGTTATGG-3')或其活性片段的第一正向擴(kuò)增引物，包含SEQIDNO:39(5'誦GCCCTACGCGATTAGTTATGG-3')或其活性片段的笫二正向擴(kuò)增引物，包含SEQIDNO:40(5'-CCCATACCACACCGCTTTCT-3')或其活性片段的反向擴(kuò)增引物，以及包含SEQIDNO:41(5'—CGACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTT-3')或其活性片段的檢測(cè)探針。57]本發(fā)明的寡核苷酸可以通過多種方法的任一種來制備(參見，例如J.Sambrook等人,"M/ecw/arC7cw'wg.'^Mfl/w"/",1989，2ndEd.，ColdSpringHarbourLaboratoryPress:NewYork,NY;"尸CA尸rafocoAy.'XGw/t/eMef/zoA"""/^//cadows",1990,MA.Innis(Ed.),AcademicPress:NewYork,NY;P.Tijssen"外6n'cfeWowvW/ZzA^o/ecw/arSz'o/ogy卩尸aWi1/awd//^，，,1993,ElsevierScience;"尸CT5Vn2啤W,1995,M.A.Innis(Ed.),AcademicPress:NewYork,NY;and"57zoW尸rc^oco/了Mo/ecw/ar5z.o/ogy",2002，F(xiàn).M.Ausubel(Ed.),5thEd.，JohnWiley&Sons:Secaucus,NJ)。例如，寡核苦酸可以使用本領(lǐng)域公知的多種化學(xué)技術(shù)的任一種來制備，包括，例如化學(xué)合成和基于模板的聚合化，例如在S.A.Narang等人，Meth.Enzymol.1979,68:90-98;E丄.Brown等人，Meth.Enzymol.1979,68:109-151;E.S.Belousov等人，NucleicAcidsRes.1997,25:3440-3444;D.Guschin等人，Anal.Biochem.1997，250:203-211;M丄Blommers等人，Biochemistry,1994，33:7886-7896;andK.Frenkel等人，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.1995,19:373-380;andU.S.PatNo.4,458,066)中描述的。58例如，寡核苷酸可以使用根據(jù)亞磷酰胺方法的自動(dòng)化的、固相過程來制備。在這樣的方法中，每種核苷酸被分別地添加到生長(zhǎng)中的寡核香酸鏈的5'末端，所述寡核苷酸鏈在3'末端附著到固相支持物上。添加的核苷酸是三價(jià)的3'-亞磷酰胺的形式，其通過5'位置的二曱氧基三基(或DMT)基團(tuán)被保護(hù)免于聚合化。在堿基誘導(dǎo)的亞磷酰胺聯(lián)結(jié)之后，輕度氧化給出了五價(jià)的磷酸三酯中間物，DMT消除提供了寡核苷酸延伸的新位點(diǎn)。然后寡核苷酸從固相支持物上裂解下來，用氫氧化銨對(duì)磷酸二酯和環(huán)外的氨基解保護(hù)。這些合成可以在寡聚物合成儀上進(jìn)4亍,l列長(zhǎng)口可以/人PerkinElmer/AppliedBiosystems,Inc.(FosterCity,CA)、DuPont(Wilmington,DE)或Milligen(Bedford,MA)商業(yè)上可獲得的那些。做為選擇，寡核苷酸可以被定制和從本領(lǐng)域公知的多種的商業(yè)來源獲得，例如，MidlandCertifiedReagentCompany(Midland,TX)、ExpressGen,Inc.(Chicago,IL)、OperonTechnologies,Inc.(Huntsville,AL)和許多其他公司。[59]本發(fā)明的寡核苷酸的純化，當(dāng)必要或期望時(shí)，可以通過本領(lǐng)域公知的的多種方法的任一種來進(jìn)行。寡核苦酸的純化一般通過天然丙烯酰胺凝膠電泳、通過例如J.D.Pearson和F.E.Regnier(J.Chrom.,1983,255:137-149)所描述的陰離子交換HPLC、或通過反相HPLC(G.D.McFarlandandP.N.Borer,NucleicAcidsRes.,1979,7:1067-1080)來進(jìn)行。60]寡核苷酸的序列可以使用任何適合的測(cè)序方法來證實(shí)，包括但不限于，化學(xué)降解(A.M.MaxamandW.Gilbert,MethodsofEnzymology，1980,65:499-560)、基質(zhì)輔助的激光脫附電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法(U.Pieles等人，NucleicAddsRes.,1993,21:3191-3196)、在堿性磷酸酶和核酸外切酶消化的組合之后的質(zhì)譜法(H.WuandH.Aboleneen,Anal.Biochem.，2001,290:347-352)等等。61如之前已經(jīng)提及的，修飾的寡核苷酸可以使用本領(lǐng)域已知的幾種方法的任一種來制備。這種修飾的非限制性實(shí)例包括曱基化、"帽"、一個(gè)或多個(gè)天然發(fā)生核苷酸用類似物替換、和核苷酸內(nèi)修飾，例如，具有不帶電的連鍵(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基曱酸，等等)或帶電的連鍵(例如，硫代磷酯、二硫代磷酸酯，等等)。寡核苷酸可以含有一種或多種其他的共價(jià)連接的部分，例如，蛋白質(zhì)(例如，核酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴氨酸，等等)、嵌入劑(intercalator)(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素，等等)、螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、鐵、氧化的金屬，等等)和烷化劑。寡核香酸也可以通過形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯連鍵來衍生。此外，本發(fā)明的寡核苷酸序列也可以用標(biāo)記來修飾。,#芬^^/{/的標(biāo)記寡核香酸和可檢測(cè)試劑之間的締合可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。標(biāo)記的沖企測(cè)探針可以通過摻入或結(jié)合于可片全測(cè)部分來制備。標(biāo)記可以直接附著到核酸序列，或間接地附著(例如，通過接頭)。各種長(zhǎng)度的接頭或間隔區(qū)臂是本領(lǐng)域已知的并且是商業(yè)上可獲得的，可以選擇來降低位阻，或給產(chǎn)生的標(biāo)記的分子賦予其他有用的或期望的性質(zhì)(參見，例如E.S.Mansfield爭(zhēng)人，Mol.CellProbes,1995,9:145-156)。任何各種可檢測(cè)試劑可以用于本發(fā)明的實(shí)踐。適合的可檢測(cè)的試劑包括但不限于，各種配體、放射性核素(例如，32P、35S、3H、"C、125I、131I,等等)；熒光染料(對(duì)于特定的示范性熒光染料，參見下文)；化學(xué)發(fā)光試劑(例如，吖啶酯、穩(wěn)定的dioxetanes，等等)；光譜地可分解的無機(jī)熒光半導(dǎo)體納米晶體(即，量子點(diǎn))、金屬納粒(例如，金、銀、銅和鉑)或納簇；酶(例如，在ELISA中使用的那些，即，辣根過氧化酶、P-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)；比色標(biāo)記(例如，染料、膠體金，等等)；磁性標(biāo)記(例如，DynabeadsTM);和生物素、dioxigenin或其他半抗原和蛋白質(zhì)，針對(duì)它們的抗血清或單克隆抗體是可獲得的。66]在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)明的檢測(cè)探針是熒光標(biāo)記的。各種各樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的大量已知的熒光標(biāo)記部分適合于在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。適合的熒光染料包括但不限于，熒光素和熒光素染料(例如，熒光素異硫基花青素或FITC、naphthofluorescein、4',5'-二氯-2'，7'-二曱氧基熒光素、6-羧基熒光素或FAM)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、oxonol染料、藻紅素、藻紅、曙紅、玫瑰紅染料(例如，羧基四甲基羅丹明或TAMRA、羧基羅丹明6G、羧基-X-羅丹明(ROX)、麗絲胺羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明綠、羅丹明紅、四曱基羅丹明或TMR)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基-香豆素、二烴基氨基香豆素、傘花內(nèi)酯和氨基曱基香豆素或AMCA)、OregonGreen染料(例如，OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514)、得克薩斯紅、得克薩斯紅-X、SpectrumRed、SpectrumGreen、花青染料(例如，Cy-3TM、Cy-5TM、Cy-3.5TM、Cy-5.5TM)、AlexaFluor染料(例如，AlexaFluor350、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor660和AlexaFluor680)、BODIPY染料(例如，BODIPYFL、BODIPYR6G、BODIPYTMR、BODIPYTR、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665)、IRDyes(例如，IRD40、IRD700、IRD800)等等。對(duì)于適合的熒光染料以及連接或摻入熒光染料到核酸分子中的方法的更多實(shí)例，參見，例如，"r/ze//(3"必ooA:F/"or"ce"/尸rakaw<ii^e(arc/z/Vot/wC，,9thEd.,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR。熒光染料以及標(biāo)記試劑盒是商業(yè)上可獲得的，來自，例如AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway,NJ)、MolecularProbesInc.(Eugene,OR)和NewEnglandBiolabsInc.(Berverly，MA)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，PCR檢測(cè)探針是TaqManTM樣探針，它在5'末端用熒光部分標(biāo)記，在3'末端用淬滅劑部分標(biāo)記。例如，在美國專利NO.5,210,015、5,804,375、5,487,792和6,214,979以及WO01/86001中公開了用于TaqManTM樣探針的適合的熒光基團(tuán)和淬滅劑。淬滅劑的實(shí)例包括但不限于DABCYL(即，4-(4'-二曱基氨基偶氮苯)-苯曱酸)琥珀酰亞胺基酯、二芳基羅丹明羧酸、琥珀酰亞胺基酯(或QSY-7)和4',5'-二硝基熒光素羧酸、琥珀酰亞胺基酉旨(或QSY-33)(全部可,人侈寸j!口MolecularProbes獲4尋)、quenched((Q1;可從EpochBiosciences,Bothell,WA獲得)、或"BlackHoleQuencher"BHQ陽1、BHQ畫2和BHQ-3(可從BioSearchTechnologies,Inc.,Novato,CA獲得)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，PCR檢測(cè)探針是TaqManTM樣探針，它在5'末端用FAM標(biāo)記，在3'末端用BlackHoleQuencher才示t己。正常的或修飾的核苷酸的"尾部，，也可以纟皮添加到寡核苷酸探針用于可檢測(cè)目的。與互補(bǔ)于尾部并含有一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記(例如，熒光基團(tuán)、酶或被放射性標(biāo)記的堿基)的核酸的第二次雜交容許擴(kuò)增子/探針雜交物的可視化(參見，例如，從EnzoBiochem.Inc.,NewYork:NY商業(yè)上可獲得的系統(tǒng))。使用發(fā)明的寡核苷酸有用的分析的另一個(gè)實(shí)例是信號(hào)放大方法，例如在美國專利NO.5,124,246中描述的(通過完全引用將其合并在此)。在該方法中，信號(hào)通過使用擴(kuò)增多聚體來放大，擴(kuò)增多聚體是被構(gòu)建以含有第一片段和多個(gè)相同的第二片段的多核苷酸，所述第一片段與添加到寡核苦酸探針的"尾部，，特異性雜交，所述第二片段與標(biāo)記的探針特異性地雜交。擴(kuò)增的程度與第二片段的重復(fù)數(shù)是理論上成比例的。多聚體可以是線性的或者分支的。分支的多聚體可以是分岔或雞冠的形狀。71特定核酸標(biāo)記技術(shù)的選擇將取決于形勢(shì)并將取決于幾個(gè)因素，例如標(biāo)記方法的簡(jiǎn)易性和成本、期望的樣品標(biāo)記的質(zhì)量、可4全測(cè)部分對(duì)雜交反應(yīng)的影響(例如，對(duì)雜交過程的速度和/或效力的影響)、使用的擴(kuò)增方法的性質(zhì)、檢測(cè)系統(tǒng)的性質(zhì)、可檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)的性質(zhì)和強(qiáng)度，等等。炎^7發(fā)銀的,/參的,嫉衣##《標(biāo)#/(/的^增72]本發(fā)明的寡核苷酸序列擴(kuò)增測(cè)試樣品中沙眼衣原體目標(biāo)序列的使用不局限于任何特定的核酸擴(kuò)增技術(shù)或其任何特定的修改體。實(shí)際上，發(fā)明的寡核苷酸序列可以應(yīng)用于本領(lǐng)域公知的的多種核酸擴(kuò)增方法的任一種(參見，例如，A.R.KimmelandS丄.Berger,MethodsEnzymol.1987,152:307-316;J.Sambrook等人,"楊/ecw/arC7om'"g.'爿丄aZ)0ra/10/7Mmw"/",1989,2ndEd.,ColdSpringHarbourLaboratoryPress:NewYork,NY;"572or//Votoco/sz力M/ecw/or5z'o/ogy",F.M.Ausubel(Ed.),2002,5thEd.,JohnWiley&Sons:Secaucus,NJ)。731這些公知的核酸擴(kuò)增方法包括但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(或PCR,在例^口"尸CA尸rafoco/s.'爿Gm'fifef<9Mef/zo(iy""<iJ///z'ca〃'cw51，，,MA.Innis(Ed.),1990,AcademicPress:NewYork;"尸C臘rafegW，M.A.Innis(Ed.),1995，AcademicPress:NewYork;"尸o/戸era化c/za//McPherson等人(Eds.),1991,IRLPress:Oxford;Saiki等人，Nature,1986,324:163;和美國專利No.4,683,195,4,683,202和4,889,818中描述的，它們每一個(gè)通過完全引用合并在此)；以及其各種變體，包括基于TaqManTM的分析(Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1991,88:7276-7280)，和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(或RT-PCR，例如在美國專利Nos.5,322,770和5,310,652中描述的)。在PCR中，采用一對(duì)過量的引物來與目標(biāo)核酸的互補(bǔ)鏈雜交。使用目標(biāo)序列作為模板通過DNA聚合酶延伸每個(gè)引物。延伸產(chǎn)物在從原始的目標(biāo)鏈解離(變性)之后變得靶向自身。新的引物然后雜交并通過聚合酶延伸，該循環(huán)被重復(fù)以指數(shù)性地提高目標(biāo)序列分子的拷貝數(shù)。能夠在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的DNA聚合酶的實(shí)例包括但不限于^cc/z'DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、分離自7T^r/m^"^""cw的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq)、可,人各種來源(例4口,PerkinElmer)、77zermz^f/^rmo//n'/z^(UnitedStatesBiochemicals)、Bacillusstereothermophilus(Bio-Rad)或77zer膨coccws/"畫fe("Vent"聚合酶，NewEnglandBiolabs)獲得的。RNA目標(biāo)序列可以通過將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA、然后進(jìn)行PCR(RT-PCR)來擴(kuò)增，如上所述的。做為選擇，如在美國專利NO.5,322,770中描述的，可以對(duì)兩個(gè)步驟使用單個(gè)的酶。鏈置換擴(kuò)增(SDA)在固定的溫度下組合了限制性內(nèi)切酶切開它的目標(biāo)DNA的未修飾鏈的能力和核酸外切酶缺陷性DNA聚合酶在切口處延伸3'末端并替換下游DNA鏈的作用(G.T.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:392-396)。SDA中使用的引物包括目標(biāo)結(jié)合序列5'的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(美國專利5,270,184和5,344,166,它們每一個(gè)通過完全引用合并在此)。77]基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)利用三種酶——例如，RNaseH、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶——在低的等溫溫度、一般41。C下共同工作(J.Compton,Nature,1991，350:91-92;A.B.ChanandJ.D.Fox,Rev.Med.Microbiol.,1999,10:185-196)。NASBA反應(yīng)的產(chǎn)物主要是單鏈RNA。自持的序列復(fù)制(3SR)反應(yīng)是目標(biāo)DNA或RNA序列的等溫?cái)U(kuò)增的非常有效的方法。3SR系統(tǒng)涉及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、E.ColiRNaseH和DNA依賴性RNA聚合酶(例如，T7RNA聚合酶)的集體活性。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)利用RNA聚合酶來從工程化到引物區(qū)域中的啟動(dòng)子產(chǎn)生RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄酶來從DNA模板產(chǎn)生互補(bǔ)DNA,利用RNaseH來從cDNA除去RNA(J.C.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:1874-1878)。[781NASBA、3SR和TMA引物需要與引物的目標(biāo)結(jié)合序列連接的聚合^特異::識(shí)別的:酸序;:j(是天然發(fā)生的、、合成地產(chǎn)生的或是限制性消化的產(chǎn)物)，所述RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合該序列并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，從而產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。有用的啟動(dòng)子的實(shí)例包括被某些噬菌體聚合酶例如來自噬菌體T3、T7或SP6的聚合酶識(shí)別的那些，或來自￡.co//的啟動(dòng)子。f乂f^，狹衣^傳《浙yf^W趁^79]在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，寡核苷酸探針序列被用于檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物(即，擴(kuò)增的沙眼衣原體目標(biāo)序列)。本發(fā)明的探針序列可以使用多種公知的同質(zhì)的或異質(zhì)的方法來應(yīng)用。[801同質(zhì)的檢測(cè)方法包括但不限于，在存在目標(biāo)序列的情況下發(fā)射信號(hào)的、附著于所述探針的FRET標(biāo)記的使用，分子信標(biāo)(S.TyagiandF.R.Kramer，NatureBiotechnol.1996,14:303-308;S.Tyagi等人，NatureBiotechnol.1998,16:49-53;L.G.Kostrikis等人，Science,1998,279:1228-1229;D丄.Sokol等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95:11538-11543;S.A.Marras等人，GenetAnal.1999，14:151-156;andU.S.Pat.Nos.5,846,726,5,925,517,6,277,581和6,235,504)，和所謂的TaqManTM分析(美國專利Nos.5,210,015;5,804,375;5487,792和6214,979以及WO01/86001)。利用這些片全測(cè)技術(shù)，當(dāng)形成之時(shí)或以所謂實(shí)時(shí)的方式，擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物可以被檢測(cè)，結(jié)果，當(dāng)反應(yīng)混合物處于擴(kuò)增條件之下時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物/探針雜交物形成并被檢測(cè)。81在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的檢測(cè)探針用于TaqMan分析中。TaqManTM分析也稱為發(fā)熒光5'核酸酶分析，是用于核酸目標(biāo)的強(qiáng)大和通用的基于PCR的檢測(cè)系統(tǒng)。通過監(jiān)視熒光信號(hào)的產(chǎn)生，與熱循環(huán)一同進(jìn)行分析。該分析系統(tǒng)具有產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的能力，容許確定目標(biāo)拷貝數(shù)目。例如，可以使用預(yù)先定量的沙眼衣原體的懸浮液的連續(xù)稀釋物來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知的樣品可以針對(duì)它來比較。利用例如具有內(nèi)源5'核酸酶活性的AmpliTaqGoldDNA聚合酶來消化如上所述的用熒光報(bào)告物染料和淬滅劑部分標(biāo)記的寡核苷酸探針，方便地進(jìn)行TaqManTM分析。隨著探針被消化，分開熒光和淬滅劑部分并引起與目標(biāo)序列的擴(kuò)增成比例的熒光信號(hào)的增強(qiáng)，通過測(cè)量在擴(kuò)增循環(huán)期間發(fā)生的熒光方面的改變來獲得分析結(jié)果。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)的步驟包括擴(kuò)增所有的或部分沙眼衣原體核酸來獲得沙眼衣原體擴(kuò)增子，并檢測(cè)任何沙眼衣原體擴(kuò)增子。188根據(jù)本發(fā)明的方法，測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在可以通過抬，測(cè)任何沙眼衣原體核酸來確定，所述沙眼衣原體核酸包含沙眼衣原體的隱性質(zhì)粒內(nèi)的序列。因而，懷疑包含這種沙眼衣原體目標(biāo)序列的任何液體或固體生物材料可以是適合的測(cè)試樣品。優(yōu)選的測(cè)試樣品包括尿液(例如，首次排空尿)、精液、唾液、眼睛晶狀體液、'淋巴液、子宮頸內(nèi)的、尿道的、直腸的、陰道的、外陰-陰道的、和鼻咽的樣品。89測(cè)試樣品可以獲自或分離自懷疑感染沙眼衣原體的患者。如已經(jīng)提及的，可以在分離后沒有進(jìn)一步的處理/加工地使用測(cè)試樣品，或做為選擇，可以在分析之前加工。例如，測(cè)試樣品可以;故處理以從它可能含有的任何沙眼衣原體細(xì)胞中釋放核酸。核酸提取的方法是本領(lǐng)域公知的，包括化學(xué)方法、溫度方法和機(jī)械方法(參見，例如J.Sambrook等人，"Mo/ecM/orC7om力g,j丄a6on^o^yA^wwa/",1989,2ndEd,ColdSpringHarbourLaboratoryPress:NewYork,NY)。存在著大量不同的和通用的試劑盒，可以用于從生物樣品提取核酸，其可以商業(yè)上獲自，例如,AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)、BDBiosciencesClontech(PaloAlto,CA)、EpicentreTechnologies(Madison，WI)、GentraSystems,Inc.(Minneapolis,MN)、MicroProbeCorp.(Bothell,WA)、OrganonTeknika(Durham,NC)和QiagenInc.(Valencia,CA)。詳細(xì)描述要遵循的方案的用戶指南通常包括在這些試劑盒中。敏感性、處理時(shí)間和成本可能是試劑盒與試劑盒之間不同的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地選擇最適合于特定情況的試劑盒。[90在^是取之前，沙眼衣原體細(xì)胞可以;故純化、濃縮或從原始生物樣品的其他成分中分離，例如，通過過濾或離心。AVf[9ij本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，根據(jù)本發(fā)明的方法的沙眼衣原體目標(biāo)序列的擴(kuò)增和擴(kuò)增的沙眼衣原體核酸的檢測(cè)可以使用在此描述的任何擴(kuò)增/檢測(cè)方法來進(jìn)行。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，測(cè)試樣品中沙眼衣原體的檢測(cè)使用TaqManTM分析來進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物的形成通過熒光以實(shí)時(shí)的方式監(jiān)^L。在這些實(shí)施方式中，使用如上所述的在5'末端用焚光報(bào)告物標(biāo)記和在3'末端用淬滅劑部分標(biāo)記的探針。適合于TaqManTM分析形式的擴(kuò)增條件的優(yōu)化和擴(kuò)增反應(yīng)試劑的選擇在技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。[92在某些實(shí)施方式中，內(nèi)部對(duì)照或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)^皮添加到生物樣品(或添加到從生物樣品提取的純化的核酸中)來充當(dāng)提取和/或目標(biāo)擴(kuò)增的對(duì)照。優(yōu)選的，內(nèi)部對(duì)照包括不同于目標(biāo)序列、并且能夠被用于擴(kuò)增目標(biāo)沙眼衣原體核酸的引物所擴(kuò)增的序列。內(nèi)部對(duì)照的使用容許監(jiān)視提取過程、擴(kuò)增反應(yīng)、和檢測(cè)、以及分析性能的控制。擴(kuò)增的對(duì)照和擴(kuò)增的目標(biāo)一般地通過使用用于檢測(cè)對(duì)照和目標(biāo)的不同探針(例如，用不同的可檢測(cè)試劑標(biāo)記的)來在檢測(cè)步驟中辨別。[93]測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在可以通過使用不同等分量的相同生物測(cè)試樣品、或使用不同的測(cè)試樣品(例如，如果分析的第一樣品是尿液樣品則為子宮頸內(nèi)棉拭，或在不同時(shí)間采集的尿液樣品)重復(fù)根據(jù)本發(fā)明的分析來確認(rèn)。做為選擇或另外地，測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在可以通過進(jìn)行不同的分析(即，根據(jù)不同的方法的分析)來確認(rèn)。例如，如果第一分析使用TaqManTM分析來進(jìn)行，第二分析可以使用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)反應(yīng)來進(jìn)行。94]做為選擇，測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在可以通過非本發(fā)明的分析來確認(rèn)。III-沙眼衣原體和其他有機(jī)體的同時(shí)檢測(cè)95如已經(jīng)提及的，本發(fā)明的引物/探針集特異于沙眼衣原體。本申請(qǐng)人在具有表4所列74中近相關(guān)有機(jī)體的多路分析形式中挑戰(zhàn)了引物/探針集CT5，沒有發(fā)現(xiàn)交叉相關(guān)(參見實(shí)施例1)。[96因而，本發(fā)明還提供了使用至少兩種引物/探針集(即，一種選自在此公開的沙眼衣原體特異性引物/探針集，另一種選自對(duì)要測(cè)試的其他有機(jī)體特異的引物/探針集)的組合來同時(shí)檢測(cè)測(cè)試樣品中沙眼衣原體與另一種有機(jī)體的存在的方法。[971可以與沙眼衣原體同時(shí)檢測(cè)的其他有才幾體包括但不限于，在表4中列出的任何有機(jī)體。在某些實(shí)施方式中，其他有機(jī)體是淋病奈瑟菌[98]特別地，本發(fā)明提供了檢測(cè)測(cè)試樣品中沙眼衣原體和/或淋病奈瑟菌(^ewwnag，wr/^a)的方法，其包括步驟提供懷l^含有沙眼衣原體核酸和/或'淋病奈瑟菌(A^\^enag0"0〃/2eaf)核酸的測(cè)試樣品；4吏測(cè)試樣品與引物/探針集CT(mpx)接觸，從而如果沙眼衣原體核酸存在于測(cè)試樣品中，所述引物/探針集CT(mpx)的至少一個(gè)引物或探針可以與沙眼衣原體核酸雜交；使測(cè)試樣品與特異于淋病奈瑟菌(A^^enago"o/r/ze")的至少一種引物/探針集接觸，從而如果淋病奈瑟菌(iV&Menagoww77ze")核酸存在于測(cè)試樣品中，所述特異于淋病奈瑟菌(A%&gowo〃/^")的引物/探針集的至少一個(gè)引物或探針可以與淋病奈瑟菌(A^^en力go"o廳/zea)核酸雜交；檢測(cè)與沙眼衣原體核酸雜交的引物/探針集CT(mpx)的任何引物或探針，其中與沙眼衣原體核酸雜交的引物或探針的檢出表明測(cè)試樣品中存在沙眼衣原體；以及檢測(cè)與淋病奈瑟菌go"o/r/ze力核酸雜交的特異于淋病奈瑟菌go"orr/z^)的引物/探針集的任何引物或探針，其中與淋病奈瑟菌(A^'^enago"oAT/2ea)核酸雜交的引物或探針的檢出表明測(cè)試樣品中存在淋病奈瑟菌(A^/^en力go"o〃/zea)。在某些實(shí)施方式中，特異于淋病奈瑟菌(A^^e/7"go"orr/ze")的引物/探針集選自標(biāo)題為"淋病奈瑟菌(iVez^enago"orr/7e")特異性寡核苷酸序列"、2006年4月7日提交的臨時(shí)申請(qǐng)NO.60/7卯,197中描述的引物/探針集。IV-試劑盒99在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括對(duì)于根據(jù)在此描述的方法檢測(cè)衣原體有用的材料。本發(fā)明的試劑盒可以由診斷實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)師來使用。[100]根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)沙眼衣原體所需的基本材料和試劑可以一皮一起組合到試劑盒中。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒包括至少一種本發(fā)明的引物集或引物/探針集，以及任選地，包含擴(kuò)增反應(yīng)試劑。每個(gè)試劑盒優(yōu)選地包含使得操作變得特異性的試劑。因而，適用于NASBA的試劑盒優(yōu)選地含有具有與目標(biāo)結(jié)合序列連接的RNA聚合酶啟動(dòng)子的引物，而適用于SDA的試劑盒優(yōu)選地含有包括目標(biāo)結(jié)合序列5'的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物。類似地，當(dāng)所述試劑盒適用于5'核酸酶分析，例如TaqManTM分析時(shí)，所述檢測(cè)探針優(yōu)選地含有至少一種熒光報(bào)告物部分和至少一種淬滅劑部分。[1011適合的擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括，例如，一種或多種的緩沖液、試劑、具有逆轉(zhuǎn)錄酶和/或聚合酶活性或核酸外切酶活性的酶；酶輔助因子，例如鎂或錳；鹽；煙酰胺腺噪呤二核普酸(NAD);和適合于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的三磷酸脫氧核普(dNTP),例如三磷酸脫氧腺苷；三磷酸脫氧鳥苷、三磷酸脫氧胞苷和三磷酸胸苷。例如，適用于NASBA的試劑盒可以含有適合數(shù)量的逆轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和T7RNA聚合酶。在適合于轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)例如NASBA的試劑盒中，可以包括含有例如DMSO的緩沖液，已知DMSO增強(qiáng)擴(kuò)增反應(yīng)。102取決于操作，試劑盒可以進(jìn)一步包含一種或多種的洗滌緩沖液和/或試劑、雜交緩沖液和/或試劑、標(biāo)記緩沖液和/或試劑、以及4企測(cè)裝置。包括在試劑盒內(nèi)的緩沖液和/或試劑優(yōu)選的為了該試劑盒預(yù)期的特定擴(kuò)增/檢測(cè)技術(shù)而優(yōu)化。使用這些緩沖液和試劑進(jìn)行操作的不同步驟的方案也可以被包括在試劑盒中。以下實(shí)施例描述了進(jìn)行和實(shí)踐本發(fā)明的一些優(yōu)選的方式。然而，要理解的是，這個(gè)實(shí)施例僅是為說明性的目的，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。此外，除非實(shí)施例中的描述以過去時(shí)態(tài)存在，如同說明書的其余部分一樣，該文本不意味著表明實(shí)際進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)或?qū)嶋H獲得了數(shù)據(jù)。實(shí)施例1:沙眼衣原體/'淋病奈瑟菌(7Vez'^en'agowo^r/z^0多路分4斤的特異性使用Stratagene，sMx3000尸TM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(StratageneInc.,SanDiego,CA)在單獨(dú)的、密封的反應(yīng)孔中進(jìn)行擴(kuò)增和纟企測(cè)。這些實(shí)驗(yàn)中使用的分析主混合物含有TaqDNA聚合酶、緩沖液、參考染料(ROX)和MgCl2、AmpEraseTMUNG(1單位/iuL),來自AppliedBiosystems(Perkin-ElmerAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)或QIAGEN(Hilden,Germany);TaqMan⑧寡核香酸引物和探針自身合成或購自BioSearchInc.。kPCR反應(yīng)混合物由25juL的主混合物和25juL純4匕的DNA組成。110]獲得的結(jié)果在表3中報(bào)告。這些結(jié)果顯示，CT/GC多路分析可以才企測(cè)廣泛的CT血清型和GC分離物。[llll還用107個(gè)拷貝的來自74種近相關(guān)有機(jī)體(表4中列出)的基因組DNA挑戰(zhàn)了CT/GC多路PCR主混合物，沒有顯示交叉反應(yīng)性。其他實(shí)施方式[1121根據(jù)在此公開的本發(fā)明的說明書或?qū)嵺`的考慮，本發(fā)明的其他實(shí)施方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。意圖是，說明書和實(shí)施例被認(rèn)為僅是示范性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神由以下的權(quán)利要求表明。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>*"c"代表互補(bǔ)于編碼鏈或有義鏈(+),"r.c."代表反向互補(bǔ)于編碼鏈或有義鏈(-)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*"mpx"代表多路的。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>權(quán)利要求1.一種分離的寡核苷酸，其包含選自由SEQIDNO1-41、其活性片段及其組合構(gòu)成的組的核酸序列。2.權(quán)利要求1的寡核苷酸用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的用途。3.—種分離的寡核苷酸擴(kuò)增引物，其包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO17、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、其活性片段及其組合構(gòu)成的組的核酸序列。4.一種分離的寡核苷酸檢測(cè)探針，其包含選自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:28、SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:37、SEQIDNO:41、其活性片l殳及其組合構(gòu)成的組的核酸序列。5.權(quán)利要求4的寡核苷酸檢測(cè)探針6.權(quán)利要求5的寡核苷酸檢測(cè)探針附著于所述寡核苷酸上。7.權(quán)利要求5的寡核苷酸檢測(cè)探針附著于所述寡核苷酸上。8.權(quán)利要求5的寡核苷酸檢測(cè)探針i也可4全測(cè)的。9.權(quán)利要求5的寡核苷酸檢測(cè)探針i也可纟全測(cè)的。10.權(quán)利要求5的寡核苷酸檢測(cè)探針著在所述寡核苷酸的5'末端的熒光部分。11.權(quán)利要求10的寡核苷酸檢測(cè)探針，其中所述寡核苷酸進(jìn)一步包含附著在3'末端的淬滅劑部分。,其進(jìn)一步包含可4全測(cè)標(biāo)記。,其中所述可4全測(cè)標(biāo)記直接地，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記間接地,其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是直接,其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是間接,其中等等可檢測(cè)標(biāo)記包含附12.權(quán)利要求11的寡核苷酸檢測(cè)探針，其中所述熒光部分包含6-歡基熒光素，所述淬滅劑部分包含BlackHoleQuencher。13.用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的寡核苷酸的集合，其包含選自由引物集l、引物集2、引物集3、引物集4、引物集5、引物集6、引物集7、引物集8、引物集9、引物集10、引物集11和引物集CT(mpx)構(gòu)成的組的引物集，其中引物集1包括包含SEQIDNO:1或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:2或其任何活性片段的反向引物；引物集2包括包含SEQIDNO:5或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:6或其任何活性片段的反向引物；引物集3包括包含SEQIDNO:9或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:10或其任何活性片段的反向引物；引物集4包括包含SEQIDNO:13或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:14或其任何活性片段的反向引物；引物集5包括包含SEQIDNO:16或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:17或其任何活性片段的反向引物；引物集6包括包含SEQIDNO:20或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:21或其任何活性片段的反向引物；引物集7包括包含SEQIDNO:23或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:24或其任何活性片段的反向引物；引物集8包括包含SEQIDNO:26或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:27或其任何活性片段的反向引物；引物集9包括包含SEQIDNO:29或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:30或其任何活性片段的反向引物；引物集10包括包含SEQIDNO:32或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:33或其任何活性片段的反向引物；引物集11包括包含SEQIDNO:35或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:36或其任何活性片段的反向引物；以及引物集CT(mpx)包括包含SEQIDNO:38或其任何活性片段的第一正向引物、包含SEQIDNO:39或其任何活性片段的第二正向引物以及包含SEQIDNO:40或其任何活性片段的反向引物。14.用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的寡核苷酸的集合，其包含選自由引物/探針集CT1、引物/探針集CT2-Pl、引物/探針集CT2-P2、引物/探針集CT3、引物/探針集CT4、引物/探針集CT5、引物/探針集CT6、引物/探針集CT7、引物/探針集CT8、引物/探針集CT9、引物/探針集CTIO、引物/探針集CT11和引物/探針集CT(mpx)構(gòu)成的組的引物/探針集，其中引物/探針集CTl包括包含SEQIDNO:l或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:2或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:3或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針以及包含SEQIDNO:4或其活性片段的反向互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT2-P1包括包含SEQIDNO:5或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:6或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:7或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT2-P2包括包含SEQIDNO:5或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:6或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:8或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT3包括包含SEQIDNO:9或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:10或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:11或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針以及包含SEQIDNO:12或其活性片段的反向互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT4包括包含SEQIDNO:13或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:14或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:15或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT5包括包含SEQIDNO:16或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:17或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO.18或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針以及包含SEQIDNO:19或其活性片段的反向互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT6包括包含SEQIDNO:20或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:21或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:22或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT7包括包含SEQIDNO:23或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:24或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:25或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT8包括包含SEQIDNO:26或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:27或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:28或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT9包括包含SEQIDNO:29或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:30或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:31或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT10包括包含SEQIDNO:32或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:33或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:34或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT11包括包含SEQIDNO:35或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:36或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:37或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；以及引物/探針集CT(mpx)包括包含SEQIDNO:38或其活性片段的第一正向擴(kuò)增引物、包含SEQIDNO:39或其活性片段的第二正向擴(kuò)增引物、包含SEQIDNO:40或其活性片段的反向擴(kuò)增引物以及包含SEQIDNO:41或其活性片段的檢測(cè)探針。15.權(quán)利要求14的寡核苷酸的集合，其中至少一種檢測(cè)探針包含可才企測(cè)一示i己。16.權(quán)利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記直接地附著于至少一個(gè)檢測(cè)探針。17.權(quán)利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記間接地附著于至少一個(gè)檢測(cè)探針。18.權(quán)利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是直接i也可纟企測(cè)的。19.權(quán)利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是間接i也可4全測(cè)的。20.權(quán)利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記包含附著在至少一個(gè)檢測(cè)探針的5'末端的熒光部分。21.權(quán)利要求20的寡核苷酸的集合，其中所述至少一個(gè)檢測(cè)探針進(jìn)一步包含附著在3'末端的淬滅劑部分。22.權(quán)利要求21的寡核苷酸的集合，其中所述熒光部分包含6-羧基熒光素，所述淬滅劑部分包含BlackHoleQuencher。23.用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的試劑盒，所述試劑盒包含擴(kuò)增反應(yīng)試劑；和選自由引物集l、引物集2、引物集3、引物集4、引物集5、引物集6、引物集7、引物集8、引物集9、引物集IO、引物集ll和引物集CT(mpx)構(gòu)成的組的至少一個(gè)引物集，其中引物集1包括包含SEQIDNO:1或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:2或其任何活性片段的反向引物；引物集2包括包含SEQIDNO:5或其任何活性片>^殳的正向引物以及包含SEQIDNO:6或其任何活性片段的反向引物；引物集3包括包含SEQIDNO:9或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:10或其任何活性片段的反向引物；引物集4包括包含SEQIDNO:13或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:14或其任何活性片段的反向引物；引物集5包括包含SEQIDNO:16或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:17或其任何活性片段的反向引物；引物集6包括包含SEQIDNO:20或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:21或其任何活性片段的反向引物；引物集7包括包含SEQIDNO:23或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:24或其任何活性片段的反向引物；引物集8包括包含SEQIDNO:26或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:27或其任何活性片段的反向引物；引物集9包括包含SEQIDNO:29或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:30或其任何活性片段的反向引物；引物集10包括包含SEQIDNO:32或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:33或其任何活性片段的反向引物；引物集11包括包含SEQIDNO:35或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQIDNO:36或其任何活性片段的反向引物；以及引物集12包括包含SEQIDNO:38或其任何活性片段的第一正向擴(kuò)增引物、包含SEQIDNO:39或其任何活性片段的笫二正向擴(kuò)增引物以及包含SEQIDNO:40或其任何活性片段的反向擴(kuò)增引物。24.用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的試劑盒，所述試劑盒包含擴(kuò)增反應(yīng)試劑；和選自由引物/探針集CT1、引物/探針集CT2-P1、引物/探針集CT2-P2、引物/探針集CT3、引物/探針集CT4、引物/探針集CT5、引物/探針集CT6、引物/探針集CT7、引物/探針集CT8、引物/探針集CT9、引物/探針集CTIO、引物/探針集CT11和引物/探針集CT(mpx)構(gòu)成的組的至少一個(gè)引物/探針集，其中引物/探針集CTl包括包含SEQIDNO:l或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:2或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:3或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針以及包含SEQIDNO:4或其活性片段的反向互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT2-P1包括包含SEQIDNO:5或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:6或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:7或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT2-P2包括包含SEQIDNO:5或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:6或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:8或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT3包括包含SEQIDNO:9或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:10或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:11或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針以及包含SEQIDNO:12或其活性片段的反向互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT4包括包含SEQIDNO:13或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO'.14或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:15或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT5包括包含SEQIDNO:16或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:17或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:18或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針以及包含SEQIDNO:19或其活性片段的反向互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT6包括包含SEQIDNO:20或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:21或其活性片段的反向引物、包含SEQIDNO:22或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT7包括包含SEQIDNO:23或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:24或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:25或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT8包括包含SEQIDNO:26或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:27或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:28或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT9包括包含SEQIDNO:29或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:30或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:31或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT10包括包含SEQIDNO:32或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:33或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:34或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；引物/探針集CT11包括包含SEQIDNO:35或其活性片段的正向引物、包含SEQIDNO:36或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:37或其活性片段的互補(bǔ)檢測(cè)探針；以及引物/探針集CT(mpx)包括包含SEQIDNO:38或其活性片段的第一正向引物、包含SEQIDNO.'39或其活性片段的第二正向引物、包含SEQIDNO:40或其活性片段的反向引物以及包含SEQIDNO:41或其活性片段的檢測(cè)探針。25.權(quán)利要求24的試劑盒，其中至少一種檢測(cè)探針包含可檢測(cè)標(biāo)記。26.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記直接地附著于至少一個(gè)檢測(cè)探針。27.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可^r測(cè)標(biāo)記間接地附著于至少一個(gè)檢測(cè)探針。28.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是直接地可檢測(cè)的。29.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是間接地可檢測(cè)的。30.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記包含附著在至少一個(gè)檢測(cè)探針的5'末端的熒光部分。31.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述至少一個(gè)檢測(cè)探針進(jìn)一步包含附著在3'末端的淬滅劑部分。32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述熒光部分包含6-羧基熒光素，并且所述淬滅劑部分包含BlackHoleQuencher。33.—種4全測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的方法，所述方法包括以下步驟提供懷疑含有沙眼衣原體核酸的測(cè)試樣品；用至少一種權(quán)利要求1的寡核苷酸接觸所述測(cè)試樣品，從而如果沙眼衣原體核酸存在于測(cè)試樣品中，則所述至少一種寡核苷酸可以與所述沙眼衣原體核酸雜交；以及檢測(cè)與沙眼衣原體核酸雜交的任何寡核苦酸，其中與沙眼衣原體核酸雜交的寡核苷酸的檢出表明測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在。34.—種4全測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的方法，所述方法包^"以下步驟提供懷疑含有沙眼衣原體核酸的測(cè)試樣品；使所述測(cè)試樣品與權(quán)利要求13的寡核苷酸的集合的至少一個(gè)引物集接觸，從而如果沙眼衣原體核酸存在于測(cè)試樣品中，則所述引物集的至少一種引物可以與所述沙眼衣原體核酸雜交；以及檢測(cè)與沙眼衣原體核酸雜交的任何引物，其中與沙眼衣原體核酸雜交的引物的檢出表明測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在。35.—種檢測(cè)測(cè)試樣品中的沙眼衣原體的方法，所述方法包括以下步驟提供懷疑含有沙眼衣原體核酸的測(cè)試樣品；使所述測(cè)試樣品與權(quán)利要求14的寡核苷酸的集合的至少一個(gè)引物/探針集接觸，從而如果沙眼衣原體核酸存在于測(cè)試樣品中，所述引物/探針集的至少一種引物或探針可以與所述沙眼衣原體核酸雜交；以及檢測(cè)與沙眼衣原體核酸雜交的任何引物或探針，其中與沙眼衣原體核酸雜交的引物或探針的檢出表明測(cè)試樣品中沙眼衣原體的存在。36.權(quán)利要求33、34或35的方法，其中檢測(cè)的步驟包括擴(kuò)增所有或部分沙眼衣原體核酸來獲得沙眼衣原體擴(kuò)增子，并檢測(cè)任何沙眼衣原體擴(kuò)增子。37.權(quán)利要求36的方法，其中擴(kuò)增所有或部分沙眼衣原體核酸包括使所述測(cè)試樣品經(jīng)歷在適合的擴(kuò)增條件之下以及在存在適合的擴(kuò)增反應(yīng)試劑的情況下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或Taq-ManTM分析來進(jìn)行。39.權(quán)利要求33、34或35的方法，其中所述測(cè)試樣品包括選自由尿液、精液、唾液、眼睛晶狀體液、淋巴液、子宮頸內(nèi)的、尿道的、直腸的、陰道的、外陰-陰道的和鼻咽的樣品構(gòu)成的組的體液。全文摘要本發(fā)明涉及擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針的寡核苷酸序列，并涉及它們?cè)谏飿悠分猩逞垡略w的選擇性和特異性檢測(cè)的核酸擴(kuò)增方法中的用途。本發(fā)明還提供了以試劑盒形式的寡核苷酸引物集和引物/探針集，用于衣原體感染的檢測(cè)和診斷。本發(fā)明的寡核苷酸引物和探針也可以與其他特異性寡核苷酸引物和探針組合使用，用于同時(shí)檢測(cè)沙眼衣原體和其他目標(biāo)有機(jī)體，例如淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhea)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101305101SQ200680041417公開日2008年11月12日申請(qǐng)日期2006年11月7日優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日發(fā)明者C·布什-多諾文,D·謝爾曼,L·庫,Q·蒙申請(qǐng)人:西門子醫(yī)療保健診斷公司