專利名稱：預防人類沙眼衣原體感染的重組蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因工程領域，具體地涉及基因工程重組蛋白疫苗(下文有時也稱為“基因工程重組蛋白”)，特別是涉及一種預防人類沙眼衣原體感染，尤其是預防泌尿生殖系統(tǒng)感染的重組蛋白疫苗；編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有時也稱為“基因”)；含有該核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，以及該重組蛋白疫苗的制備方法；本發(fā)明還涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預防人類沙眼衣原體感染的疫苗制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。
沙眼衣原體(Chlamydia Trachomatis，下文有時簡稱為“CT”)根據(jù)感染宿主的不同可分為小鼠生物型和人生物型，小鼠生物型可致鼠肺炎而與人類無關，而人生物型有15個血清型A、B、Ba、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3，其都是以人類作為唯一宿主的病原體。
A、B、Ba和C的感染可導致沙眼，人類可通過反復感染沙眼衣原體，出現(xiàn)嚴重的角膜血管翳和形成瘢痕，這種損傷可引起瞼內(nèi)翻倒睫，角膜渾濁加重導致失明。沙眼是世界上致人類失明的最主要的原因。
D～K可導致包涵體性結膜炎、泌尿生殖系統(tǒng)疾病，其泌尿生殖道感染是性傳播疾病，流行病學調(diào)查顯示，美國每年有300-400萬受感染人群。由于衣原體本身具有不易感染鱗狀上皮細胞而易侵犯柱狀上皮細胞的特性，宮頸表皮為柱狀上皮細胞，因而宮頸為CT感染的常見部位，進而CT沿柱狀上皮上行，導致子宮內(nèi)膜炎，輸卵管炎，盆腔炎，并可造成輸卵管性不孕及輸卵管異位妊娠，嚴重威脅婦女健康。
孕期對CT易感性的升高導致孕婦感染率為20-30％，而CT通過垂直傳播又可導致胎兒感染。有學者報道，胎兒通過感染的宮頸，約50-70％成為CT感染新生兒，患有CT包涵體性結膜炎和肺炎。
性病淋巴肉芽腫(LVG)主要也是通過性接觸傳播。男性以腹股溝橫痃為常見，女性以肛門直腸淋巴結腫多見，病變逐步擴及其他淋巴結，有的淋巴結腫脹化膿、穿孔形成瘺管、晚期病變?yōu)橥馍称飨鹌つ[及直腸狹窄。因此，CT感染的危害性是相當大的，正因為如此，沙眼衣原體疫苗的研制顯得尤為重要和迫切。
經(jīng)過幾十年的研究，一直無理想的疫苗問世，其部分原因是由于介導生殖道粘膜抗衣原體感染的宿主的免疫機制尚不完全明了。但根據(jù)基因敲除鼠及T細胞克隆的一些實驗提供證據(jù)表明CD4+T細胞在對衣原體生殖道感染的保護中起主要作用，而CD8+T細胞和體液免疫的作用則次要一些。上述觀點在這一研究領域已取得共識。
目前沙眼衣原體疫苗的研究熱點集中在以下幾個方面DNA疫苗(DNA vaccine)，沙眼衣原體DNA疫苗目前還存在很多問題如僅能誘導部分保護，Thl免疫反應和抗體反應均較弱。
減毒活疫苗(live attenuated chlamydia vaccine)，Hua Su等(HuaSu，Qonald Messer，William Whitmire等，雌性小鼠生殖道的亞臨床衣原體感染產(chǎn)生強烈的保護免疫反應減毒活疫苗菌株開發(fā)的結論(SubclinicalChlamydial Infection of the Female Mouse Genital Tract Generates a PotentProtective Immune ResponseImplications for Development of LiveAttenuated Chlamydial Vaccation Strains)，感染與免疫(Infection andImmunity)，January 2000年，1月，P.192-196，vol.68.)用沙眼衣原體感染后用少量土霉素干涉治療，使小鼠處于輕度感染的亞臨床狀態(tài)，以達到類似于減毒活疫苗的效果，其實驗結果表明與自然感染相比，這種輕度感染后機體產(chǎn)生良好的保護性免疫，由此推斷減毒活疫苗可能具有非常好的前景。但事實上，人們對沙眼衣原體的基因系統(tǒng)尚不完全明了，無法實現(xiàn)減毒突變(attenuating mutation)，因此目前這種疫苗可能會導致嚴重的自身免疫或免疫病理反應。
DC(Dendritic Cells)細胞的回輸(chlamydia-pulsed DC)，Hua Su等用熱滅活的衣原體-脈沖DC(Heat-killed chlamydia-pulse DC)自體回輸?shù)霓k法，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生非常好的免疫效果(Hua su，Ronald Messer，William，等，1998.用使用非活性的衣原體體外裝載的樹狀細胞免疫后的抗衣原體腔道感染的接種(Vaccination against Chlamydial Tract Infection afterImmunization with Dendritic Cells Pulsed Ex Vivo with NonviableChlamydiae).實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)Volume 188，Number 5，September 7，1998 809-818)。就目前來講，用這種方法來實現(xiàn)免疫保護是不現(xiàn)實的，但它提示非活菌感染的免疫一樣可以實現(xiàn)免疫保護。
表位疫苗(Epitopes vaccine)，主要外膜蛋白(MOMP)是沙眼衣原體的最主要的一種外膜蛋白，很多實驗表明沙眼衣原體的MOMP能產(chǎn)生一定的保護性的免疫。在MOMP中已發(fā)現(xiàn)了20多個具有免疫原性的表位(Linette Ortiz，Karen P.Demick，Jean W.Petersen等，1996.激活來自感染的人的II型HLA-限制性T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白(Chlamydiatrachomatis Major Outer Membrane Protein(MOMP)Epitopes That ActivateHLA Class II-Restricted T Cells from infected Humans)，免疫學雜志(TheJournal of Immunology)，1996，1574554-4567.)，從而為表位疫苗的設計奠定了一定的基礎。
目前的工作核心是如何提高疫苗的免疫原性和保護能力，延長免疫保護的時間。將熱休克蛋白65與已發(fā)現(xiàn)的MOMP上的一些表位相連為達到上述目的提供了一種可能性。
熱休克蛋白(heat shock protein，下文有時簡稱為“HSP”)是存在于多種生物體內(nèi)的一個分子伴侶蛋白質(zhì)家族。在免疫應答的過程中，熱休克蛋白可表現(xiàn)如下三種基本的功能1、協(xié)助抗原性物質(zhì)進入包括樹突狀細胞在內(nèi)的抗原提呈細胞；2、在抗原提呈細胞中和加工處理的抗原物質(zhì)相互作用使之進入MHC I類抗原提呈途徑，進而激活抗原特異性CTL；3、刺激樹突狀細胞表達協(xié)同刺激分子(如B7等)和分泌細胞因子等(SuzueK，Zhou X，Eisen HN，Young RA.Heat shock fusion proteins as vehicles forantigen delivery into the major histocompatibility complex class I presentationpathway.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 Nov 25；94(24)13146-13151)。由于具有上述特點，將熱休克蛋白65與已發(fā)現(xiàn)的MOMP上的一些表位相連形成融合蛋白以達到提高免疫原性和保護能力，以及延長免疫保護的時間的目的。
本發(fā)明之二是提供一種編碼這種重組蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明之三是提供一種含有該核苷酸序列的表達載體。
本發(fā)明之四是提供一種含有該表達載體的宿主細胞。
本發(fā)明之五是提供一種制備該重組蛋白疫苗的方法。
本發(fā)明之六涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預防人類沙眼衣原體感染的疫苗制品中的用途。
本發(fā)明之七涉及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。
因此，正是本發(fā)明人經(jīng)過長期的大量的研究，解決了現(xiàn)有的技術難題，首次開拓性地將卡介苗熱休克蛋白65與沙眼衣原體MOMP上的一些表位相連形成了全新的基因工程重組蛋白，從而提高了抗衣原體感染的疫苗的免疫原性和保護能力，并延長了其免疫保護的時間。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎上，本發(fā)明的其它具有實質(zhì)性特點的方面和創(chuàng)造性的有益效果對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。


圖1是HSP65-Chlamy構建于PET28(a+)的模式圖。
圖2是三輪PCR結果瓊脂糖凝膠電泳照片，Line1DL2000 DNA marker2第一輪PCR 3第二輪PCR 4第三輪PCR。
圖3是pMD18T-chlamy重組質(zhì)粒用EcolRI和HindIII酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳照片，Line1DL2000 DNA marker 2重組質(zhì)粒的酶切鑒定。
圖4是HSP65編碼基因克隆入pET28(a+)的重組質(zhì)粒用NcoLI和EcoRI酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳照片Line1重組質(zhì)粒的酶切鑒定2 DL2000DNA marker。
圖5是pET28(a+)-HSP65-chlamy重組質(zhì)粒用EcolRI和HindIII酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳照片Line1DL2000 DNA marker 2重組質(zhì)粒的酶切鑒定。
圖6是Hela單層細胞上接種CT-D 48～72小時后可見大量包涵體生長(20x)照片，白色箭頭所指為沙眼衣原體包涵體。
圖7是重組蛋白疫苗的表達及純化SDS照片1為蛋白質(zhì)marker，2為目的蛋白的表達，3、4、5為目的蛋白的純化。
圖8是沙眼衣原體感染疫苗免疫后小鼠陰道組織輕度炎癥照片白色線圈內(nèi)示固有層血管擴張充血，散在淋巴細胞浸潤，纖維組織增生。
圖9是沙眼衣原體感染后小鼠陰道組織中度炎癥照片白色線圈內(nèi)示固有層血管有較多淋巴細胞浸潤。
圖10是沙眼衣原體感染后小鼠陰道組織3度炎癥白色線圈內(nèi)示固有層血管有大量淋巴細胞浸潤。
圖11是證明疫苗免疫組的抗體效價明顯高于PBS免疫組的用ELISA法檢測的C57小鼠抗體效價的直方圖1空白對照；2PBS免疫；3疫苗免疫；標本1-10。
“卡介苗熱休克蛋白65”是指來源于卡介苗的分子量為65kDal的熱休克蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
“能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位多肽”是指來源于沙眼衣原體主要外膜蛋白的9個表位相連接而形成的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
“人沙眼衣原體感染”是指沙眼衣原體通過某種途徑進入人體并感染人的多種器官(如泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、眼瞼結膜等)的狀態(tài)，包括急性感染和慢性感染以及無癥狀攜帶狀態(tài)。
“嚴緊的雜交條件”是指為避免反應體系中非同源性或部分同源性的核酸序列形成雜交復合物而采用的雜交條件，如較高的反應溫度和低離子強度。
″治療″或″預防″包括(1)預防疾病，也就是使疾病的臨床癥狀不會在哺乳動物中發(fā)展，所述的哺乳動物可能與該疾病的病原體接觸或易患有該疾病但不曾經(jīng)歷或顯現(xiàn)出疾病的該癥狀，(2)抑制疾病，也就是阻止或減輕該疾病或其臨床癥狀的發(fā)展，或(3)緩解疾病，也就是引起疾病或其臨床癥狀的退化。
本發(fā)明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位相連接而形成的融合蛋白，其中，所述的能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的多肽可為任何能激活人T細胞的主要外膜蛋白表位的氨基酸序列，優(yōu)選地具有SEQID NO2所示的氨基酸序列或其功能等價物。在本發(fā)明的重組蛋白疫苗中，卡介苗熱休克蛋白65可為來源于卡介苗的分子量為65kDal的熱休克蛋白，其氨基酸序列優(yōu)選地為SEQ ID NO4所示，或其功能等價物。其可以位于該融合蛋白的氨基端，能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位位于該融合蛋白的羧基端。
本發(fā)明的重組蛋白疫苗具有選自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列，該核苷酸序列可以具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示或其功能等價物。
卡介苗熱休克蛋白65是一種來源于卡介苗的蛋白質(zhì)，它和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位多肽相連融合形成的融合蛋白(序列如SEQ ID NO4所示)在進入人體后均可刺激人體DC細胞上調(diào)MHC(I類和II類)和共刺激分子(B7.2)的水平，分泌細胞因子，卡介苗熱休克蛋白65還有一獨特之處，它可以協(xié)助與它形成融合蛋白表位多肽進入包括樹突狀細胞在內(nèi)的抗原提呈細胞，并進入MHC I類途徑加工提呈，進而激活抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)對病原菌進行特異性攻擊和殺傷，而且誘導這種CTL無須借助于外源佐劑或CD4+細胞的參與。
本發(fā)明的重組蛋白疫苗可通過本領域已知的方法，例如按照MolecularCloning一書(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)所述進行生產(chǎn)，以下的實施例詳細地例舉了一種生產(chǎn)本發(fā)明的重組蛋白疫苗的方法。
因此，本發(fā)明還提供了含有上述編碼本發(fā)明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，其可以為本領域常規(guī)的各種原核細胞，真核細胞或哺乳動物細胞；以及該重組蛋白疫苗的基因工程制備方法。
另外，本發(fā)明還涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預防人類沙眼衣原體感染的疫苗制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。本領域技術人員可以理解的是，這些疫苗制品可用本領域周知的各種常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的重組蛋白疫苗可通過皮下注射的方式給人接種，接種的劑量為100-500μg。為了加強效果，可進行2-3次的加強免疫。時間間隔可為2周-2月。
下面結合具體的制備實施例和生物學效果實施例，并參照附圖進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在如下實施例中，所用試劑的來源、商品名和/或有必要列出其組成成分者，均只標明一次。在其后所用相同試劑如無特殊說明，不在贅述上述內(nèi)容。實施例1 表位基因的人工構建將主要外膜蛋白上所選定的表位基因串連在一起，并在氨基端構建EcoRI的酶切位點，在羧基端構建HindIII的酶切位點，獲取可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的編碼基因(以下稱之為“chlamy”)。
具體方法是通過3輪PCR循環(huán)對所選定的表位基因進行人工構建。引物3與引物4互為模板及引物，進行第一輪PCR；再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以引物2及引物5為引物，進行第二輪PCR；再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以引物1及引物6為引物，進行第三輪PCR。
引物序列如下primer1(chlamy-1)5’GAATTCCCGGCATACGGTCGTCATATGCAGGATGCTGAGATGTTCACCAACGCTGCTTGCATGGCT3’primer2(chlamy-2)5’AACGCTGCTTGCATGGCTCTCAACATTTGGGACGAGCTCAACGTACTGTGCAACGCTGCTGAGTTT 3’primer3(chlamy-3)5’TGCAACGCTGCTGAGTITACCATTAACAAGCCGAAAGGTTACGTAGGCAAAGAATTTCCGCTGGCTCTG 3’primer4(an-chlamy-3)5’CTGCCATTCGTGGTAGTCGATAGATGCGTCCTTAGTACCGGTAGCTGCGTCCAGAGCCAGCGGAAATTC 3’primer5(an-chlamy-2)5’GATGTACGGGGTAAACATGTTCAGACGATAAGACAGTGCCAGAGAAGCCTGCCATTCGTGGTAGTC 3’primer6(an-chlamy-1)5’AAGCTTGTAGGTGTCTGCGTCGAAAGAAGCACGAGACCATTTAACACCGATGTACGGGGTAAACAT 3’由引物3和引物4互為模板和引物進行第一輪PCR反應如下在一個500ul微量離心管中加入下列試劑引物3 2.5ul(10u mol/L)引物4 2.5ul(10u mol/L)10x PCR緩沖液(TakaRa公司，成分見產(chǎn)品說明)5μldNTPs(10mmol/L)1μlTaq DNA聚合酶(TakaRa公司)(5u/μl)0.5μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應條件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min。形成第一輪PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物1)如下(未寫出其互補鏈)TGCAACGCTGCTGAGTTTACCATTAACAAGCCGAAAGGTTACGTAGGCAAAGAATTTCCGCTGGCTCTGGACGCAGCTACCGGTACTAAGGACGCATCTATCGACTACCACGAATGGCAG第二輪PCR循環(huán)以產(chǎn)物1為模板，分別以引物2和引物5為5′端引物和3′端引物，反應體系如下產(chǎn)物1 1ul10(PCR緩沖液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl引物2和引物5各2.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.3μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應條件94℃，1′；55℃，1′；72℃，1′，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min。形成第二輪PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物2)如下(未寫出其互補鏈)AACGCTGCTTGCATGGCTCTCAACATTTGGGACGAGCTCAACGTACTGTGCAACGCTGCTGAGTTTACCATTAACAAGCCGAAAGGTTACGTAGGCAAAGAATTTCCGCTGGCTCTGGACGCAGCTACCGGTACTAAGGACGCATCTATCGACTACCACGAATGGCAGGCTTCTCTGGCACTGTCTTATCGTCTGAACATGTTTACCCCGTACATC第三輪PCR循環(huán)以產(chǎn)物2為模板，分別以引物1和引物6為5′端引物和3′端引物，反應體系如下產(chǎn)物2 1ul10×PCR緩沖液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl引物l和引物6各2.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.3μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應條件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min。形成第三輪PCR產(chǎn)物(終產(chǎn)物)SEQ ID No1。
三輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果見附圖2。實施例2 表位基因的TA克隆采用TA克隆方法(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)克隆PCR產(chǎn)物，TA克隆的載體為PMD 18-T Vector(TakaRa公司)。具體方法如下一DNA的回收1.將第三輪PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE，150-200mA，0.5小時)；2.從瓊脂糖凝膠上切下含DNA片段的凝膠，放入一離心管中；3.加入3倍體積的溶膠液(北京鼎國公司)，45-55℃水浴5-10min使膠完全融化；
4.加入10ul玻璃奶(北京鼎國公司)，輕彈管底混勻，然后在45-55℃水浴5-10min，期間每2-3min混勻一次；5. 5000g離心60sec，棄上清；6.加400ul漂洗液，輕彈管底混勻玻璃奶，然后同上離心，棄上清；7.再加入400ul漂洗液，輕彈管底混勻玻璃奶，然后同上離心棄上清，并用加樣器盡量除凈漂洗液；然后室溫晾干玻璃奶；8.加10-30ul無菌雙蒸水將玻璃奶懸浮起來，45-55℃水浴5-10min；9. 10000g離心2min，回收上清備用。二連接反應1.取3ul上清液電泳，并在紫外燈下觀察電泳帶，與marker相比較，估計回收DNA濃度；2.連接反應體系Insert DNA(序列參見SEQ ID NO1) 0.05-0.3pmolpMD18-TVect(TakaRa公司) 0.5-1ulSolutionI(TakaRa公司)5ulDH2O up to 10ul16℃反應1h三轉化 感受態(tài)細胞的制備方法是將大腸桿菌JM109(Novagen公司)在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)12-16h；次日從瓊脂平板上取一單菌落于2ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225r/min速度震蕩培養(yǎng)12-16h；取1ml上述培養(yǎng)物接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225r/min的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(大約3h)；將菌液冰浴2h，然后2,500g，4℃離心20min收集菌體；加入100ml冰冷的Trituration緩沖液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45min；1,800g，4℃離心10min，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩沖液懸浮細胞；按每份200ul分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加甘油至終濃度為15％，置-70℃?zhèn)溆谩?br> 轉化的方法是將200ul感受態(tài)細胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巰基乙醇，混合后，加入10μl連接反應液(含重組質(zhì)粒)，溫和混勻，置冰上30min；42℃ 45sec，然后迅速放回冰中1-2min；加入2ml LB培養(yǎng)液，37℃以225r/min的速度振蕩培養(yǎng)1h；4,000g離心10sec，棄上清，用200ul LB培養(yǎng)液重懸菌體；將菌液鋪于含有適當抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置20-30min，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)12-16h。
四鑒定用限制性內(nèi)切酶消化的方法初步鑒定重組克隆。并由北京鼎國生物技術發(fā)展中心進行DNA的測序。測序結果無誤(具體序列參見SEQ ID No.1)。重組的pMD-18-chlamy質(zhì)粒用EcoRI和HindIII酶切后釋放出chlamy(300bp)片段見附圖3。
五菌種及保存重組質(zhì)粒冰凍保存于-20℃。含重組質(zhì)粒的菌株在含20％甘油培養(yǎng)液中保存于-20℃或-70℃。
提取結核分枝桿菌基因組DNA的方法參照Molecular Cloning一書(J.Sambrook，從哺乳動物分離高分子量DNA(Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)。
通過PCR自結核分枝桿菌分離熱休克蛋白65(HSP65)結構基因。5′端引物序列為5′CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3′，3′端引物序列為5′GAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3′。
所述PCR操作程序是在一個500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA 5μl(mmol/L)10×PCR緩沖液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl5′端和3′端引物(0.01 mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應條件94℃，30sec；55℃，1min；72℃，2min，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min。
采用TA克隆方法克隆PCR產(chǎn)物，DNA的提取、連接及轉化方法見實施例2用限制性內(nèi)切酶NcoI(TakaRa公司)和EcoRI(TakaRa公司)消化含HSP65的重組pMD18-T載體和pET28a(+)(Novagen公司)，反應體系如下7μl質(zhì)粒DNA1μl 10x緩沖液(TakaRa公司)1ul 0.1％BSA(TakaRa公司)0.5μl限制性內(nèi)切酶NcoI(10單位/μl)0.5μl限制性內(nèi)切酶EcoRI(10單位/μl)37℃4h提取HSP65DNA插入片段和酶切后的pET28a(+)線性載體(方法見實施例2。在電泳后紫外燈下估算這兩種DNA的濃度。建立連接反應體系如下pET28a(+)線性質(zhì)粒DNA 5ulHSP65DNA插入片段3ul10x T4DNA連接酶緩沖液1ulT4DNA連接酶1ul 16℃12h連接后的轉化方法見實施例2。具體序列參見SEQ ID No3(1-1638bp)。酶切鑒定結果見附圖4。實施例4構建卡介苗熱休克蛋白65-可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位多肽融合蛋白的基因提取插入了HSP65基因的表達載體pET28a(+)質(zhì)粒(見實施例3)，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII(TakaRa公司)消化該重組質(zhì)粒和插入了可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位基因(chlamy)的pMD18-T(見實施例2)，反應體系如下8μg質(zhì)粒(重組HSP65的pET28a或重組chlamy的pMD 18-T)1μl 10x緩沖液(TakaRa公司)0.5μl限制性內(nèi)切酶EcoRI(10單位/μl)0.5μl限制性內(nèi)切酶HindIII(10單位/μl)混合后37℃溫育30-120min。
如上述，用同樣的方法提取酶切后的線性質(zhì)粒pET28a(+)和chlamy插入片段。并將二者進行連接連接反應質(zhì)粒DNA(0.5μg/μl)3μlDNA插入片段(序列參見SEQ ID NO.2)(300ng/μl)5μl10xT4DNA酶連接緩沖液1μlT4 DNA連接酶1μl混合后置14-16℃水浴6-12h。
將該重組pET-28a(+)質(zhì)粒轉化JM109大腸桿菌。方法同前。
卡介苗熱休克蛋白65-可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位多肽融合蛋白的基因的測序由北京鼎國生物技術發(fā)展中心承擔，結果表明，所得到的卡介苗熱休克蛋白65可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位多肽融合蛋白的基因和設計的完全一致。重組的pET-28a(+)-HSP65-chlamy質(zhì)粒用EcoRI和HindIII酶切后釋放出chlamy(300bp)片段見附圖5。
7.加入磷酸鹽緩沖液來充滿柱，蓋上柱的上蓋，打開出口；8.讓柱開始以最小100個柱床體積/h流動，最短流動30min；9.如果柱中介質(zhì)的容積需要調(diào)整，關閉柱的出口，打開柱的上蓋，加入更多的介質(zhì)，然后應該再以最大流速沖洗柱至少30min。用金屬離子給介質(zhì)充電在螯合介質(zhì)能夠被用于純化過程以前，必須用所選擇的金屬離子為其充電。
1.用至少5個柱床體積的雙蒸水洗柱2.將3-5個柱床體積的20mM金屬離子溶液加到柱中；50mM鎳離子溶液的配制NiSO4.6H2O 13.1g雙餾水加到1000ml。
3.用5個柱床體積的洗脫緩沖液洗柱洗脫緩沖液20mM Tris，pH7.90.5M Nacl1M imidazole6M urea4.用10個柱床體積的結合緩沖液洗柱。
結合緩沖液20mM Tris，pH7.90.5M NaCl5mM imidazole6M urea吸附1.將樣品加到金屬螯合的柱中，并以預先確定的最佳流速讓其流過柱床；2.用含16mM咪唑的結合緩沖液洗柱，一直到流出物的吸收值回到基線水平。洗脫 用洗脫液洗脫時，會出現(xiàn)一個峰值，繼續(xù)洗脫直到吸收值不在下降為止，用容器接取不同時段的流出液，并進行SDS電泳，判定純化效果純度可達98％以上。純化后的SDS-PAGE見附圖7。
咪唑洗脫液20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl，
1M imidazole，6M urea。實施例7 衣原體培養(yǎng)純化一培養(yǎng)1.在24孔板中加入Hela細胞(吉林大學新民校區(qū)基礎醫(yī)學院免疫教研室)1-2×105個/孔，1-2d融合成致密的單層。
培養(yǎng)液用IMDM(Iscove′s modified Dulbecco′s medium，GIBCO)+10％的胎牛血清(天津TBD生物技術發(fā)展中心)100ug慶大霉素/ml。
2.棄取培養(yǎng)液，將菌種(北京協(xié)和醫(yī)院，D型沙眼衣原體)接種于細胞單層上，室溫下3000r/min/h，移去用于保存菌種的蔗糖-磷酸鹽運送液(簡稱SPGSucrose蔗糖75g，KH2PO40.52g，Na2HPO41.22g，glutamic acid 0.72g，H2O to 1 liter，pH7.4-7.6)。
3.加入衣原體生長液1ml IMDM+10％的胎牛血清100ug慶大霉素/ml 1ug/ml的放線菌酮。48-72h后倒置顯微鏡下可看到超過90％的細胞中長出衣原體，移去生長液，加入少許冷的SPG，用吸管反復吹吸將細胞移下。胞懸液存于-70℃冰箱中。
純化(密度剃度離心法)1.細胞懸液用超聲波處理(20秒)2.懸液離心500g 15min 4℃取上清3.上清被平鋪在8ml 35％(vol/vol)腎造影劑(76％，上?；春Ｖ扑帍S)上.
35％腎造影劑65％0.01M HEPES含0.1M NaCl4. 4℃離心43000g 1h5.沉淀物被SPG重新懸起，集中在一起混勻.
6.混勻物被鋪在不連續(xù)的密度的造影劑上.
13ml 40％，8ml 44％，5ml 52％，4℃離心43000g 1h，EB位于44/52％的造影劑界面上。
7.收集3倍體積SPG稀釋，離心30000g 30min8.沉淀物用SPG重懸，儲存于-70℃。
Hela單層細胞接種沙眼衣原體48～72h后可見包涵體生長見附圖6。實施例8 疫苗免疫后，小鼠生殖道衣原體感染的保護性實驗一材料1.C57雌性小鼠(中國軍事醫(yī)學科學院)6-8周齡2.D型衣原體3.抗原HSP65及可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的融合蛋白(以下稱”HSP65chlamy”)、PBS二方法1.將20只小鼠隨機分兩組，一組為疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組于0、14、21d每只鼠在四個腋窩處注射共注射50ug。而PBS組用同樣的方法等體積注射PBS。
2.在第21d每只鼠注射5mg黃體酮3.在第28d陰道接種衣原體1.5×104IFU4.在第35d，將20只鼠的陰道、子宮、輸卵管取出，進行組織病理學檢查。比較疫苗免疫組與PBS免疫組的病理情況。三 病理分級標準0正常1+最小反應(少量的炎癥細胞)2+輕度反應(炎癥細胞增加，伴有輕度間質(zhì)增厚，并擴散到周圍脂肪組織)3+中等反應(炎癥細胞顯著存在，伴有臨近脂肪組織的清除)4+嚴重反應(中度到嚴重的反應廣泛存在，伴受影響組織的清除，伴有臨近脂肪組織的多病灶壞死)。三實驗結果及結論PBS免疫組10例生殖系統(tǒng)標本卵巢和子宮內(nèi)膜均正常；陰道的炎癥反應7例為3+，3例為2+疫苗免疫組10例生殖系統(tǒng)標本卵巢和子宮內(nèi)膜均正常；陰道的炎癥反應2例為2+，8例為1+結論免疫了該疫苗后，小鼠的生殖系統(tǒng)的炎癥減輕，疫苗產(chǎn)生了一定的保護作用。
各級炎癥反應的病理切片見附圖8、9、10。實施例9 疫苗免疫后，小鼠足底實驗一材料1.C57雄性小鼠(中國軍事醫(yī)學科學院)，6-8周齡2.D型衣原體3.抗原HSP65及可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的融合蛋白(以下稱“HSP65chlamy”)、PBS。二方法1.將20只小鼠隨機分兩組，一組為疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組于0、14、21d每只鼠在四個腋窩處注射共注射50ug。而PBS組用同樣的方法等體積注射PBS。
2.在第28d每只小鼠左后腳掌足底皮下注射25ulPBS，右后腳掌皮下注射25ul 2×104IFU熱滅活的CT(56℃30min)。
3.在72h測量腳掌的厚度。三 實驗結果及結論1.PBS組左腳平均厚度2.8±0.2cm，右腳平均厚度3.1±0.42.疫苗組左腳平均厚度2.95±0.3，右腳平均厚度6.7±0.2實驗結果表明疫苗免疫組的小鼠的右腳注射了CT-D后，其腫脹的程度要明顯高于注射了PBS的左腳，也明顯高于PBS免疫組。實施例10 疫苗免疫后，CTL殺傷實驗一材料1.C57雄性小鼠，6-8周齡2.D型衣原體3.抗原HSP65及可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的融合蛋白(以下稱“HSP65chlamy”)、PBS二方法1.將20只小鼠隨機分兩組，一組為疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組于0、14、21d每只鼠在四個腋窩處注射共注射50ug。而PBS組用同樣的方法等體積注射PBS。
2.條件培養(yǎng)基(condition medium)的制備取一只正常小鼠，斷頸處死后，酒精消毒腹部，用經(jīng)過消毒處理的器具取出脾臟，放入無菌平皿中，轉移入超凈臺，用毛玻璃研碎，用完全培養(yǎng)液懸浮脾細胞，紗布過濾，2500r/min，5min，除去上清，用0.83％氯化銨1ml重懸，冰上2min，2500r/min，5min，除去上清，用完全培養(yǎng)液懸浮脾細胞，將其移入培養(yǎng)瓶中，并加入25ug刀豆蛋白A(ConA)，再加入完全培養(yǎng)液至總體積為5ml。培養(yǎng)37℃24h，2500r/min，5min，收集上清即為條件培養(yǎng)基。
3.靶細胞的抗原裝載提呈及Na251CrO4的標記1)將已在100ml培養(yǎng)瓶中長成稀疏單層約2×106個細胞時，倒出培養(yǎng)液，加入無血清IMDM+10％條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)16-24h。
2)1ml 5×106IFU熱滅活的CT EBs中加入5ul的lipofectin，混勻，5min，然后加入1)中，37℃ 4h。
3)倒出瓶中液體，用0.25％胰酶(華美生物工程公司)消化，加入5ml完全培養(yǎng)液，計數(shù)，1200r/min，10min，重懸于100ul完全培養(yǎng)液中，轉移至無菌塑料管中，并加入100ul Na251CrO4(含200uCi)(PerkinElmer公司)，震蕩培養(yǎng)1h。
4)完全培養(yǎng)液洗3-4次。
5)用完全培養(yǎng)液將細胞的濃度調(diào)成1×105個細胞/ml。
4.將疫苗免疫和PBS免疫鼠的脾和淋巴節(jié)取出，研磨，脾細胞的處理如上述，并將脾和淋巴節(jié)細胞計數(shù)，調(diào)成2×107個細胞/ml。向96孔板中加入脾和淋巴細胞100ul，均設3個濃度梯度分別為2×107，1×107，5×106，設3復孔。
5.將標記好的B16細胞100ul加入含有效應細胞的孔中，并另設3復孔的自發(fā)釋放(100ul的靶細胞+100ul完全培養(yǎng)液)和最大釋放(100ul的靶細胞+100ul 2mol鹽酸)。
6. 37℃ 5％CO2，12-16h。
7.將96孔培養(yǎng)板以150g離心5min。
8.取100ul上清，將其移至塑料管(用于γ計數(shù))9.用γ計數(shù)儀測定各管的cpm值。
10.殺傷率的計算殺傷率＝(實驗孔值-自發(fā)釋放孔值/最大釋放孔值-自發(fā)釋放孔值)*100％三 實驗結果及結論實驗結果表明疫苗免疫組的脾細胞和淋巴細胞對靶細胞具有一定的殺傷作用，在效靶比為100∶1的情況下，殺傷率平均為50-60％。而對照組的殺傷率平均為5-10％。實施例11 ELISA檢測免疫疫苗后C57小鼠抗體效價一材料C57小鼠(雄性6-8周齡)、衣原體CT-D、PBS、包被緩沖液1％BSA、羊抗鼠IgG-HRP(北京鼎國公司)、OPD-底物緩沖液(0.2M Na2HPO425.7ml；0.1M檸檬酸24.3ml)二方法1.將純化后的衣原體置于56℃水浴中，30min。經(jīng)預實驗后，1∶80用包被緩沖液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g加水至1000ml)稀釋。
2.包被加入96孔板，100ul/孔。4℃，過夜。
3.洗滌洗液洗板3次，5min/次。
4.封閉加1％BSA封閉，200ul/孔。40℃，1h。
5.洗滌洗液洗板3次，5min/次。
6.加樣將PBS免疫及疫苗免疫鼠(免疫方法同前)各10只的血清用樣品稀釋液做100倍稀釋，100ul/孔。設復孔。40℃，30min。
7.加酶標抗體將羊抗鼠IgG-HRP(北京鼎國生物，0.1ml，1∶1000)用洗液稀釋500倍，100ul/孔。40℃，30min。
8.洗滌洗液洗板三次，5min/次。
9.顯色新鮮配制OPD-底物緩沖液，100ul/孔。室溫避光反應5-10min。
10.終止加2mol/L H2SO4，50ul/孔。
11.測A490。
實驗結果及結論1 空白對照0.003±0.0008；2 PBS免疫組0.1038±0.0095；3 疫苗免疫組0.435±0.012。
實驗結果表明疫苗免疫組的抗體效價明顯高于PBS免疫組序列表<110>北京迪威華宇生物技術有限公司<120>預防人類沙眼衣原體感染的重組蛋白疫苗及其用途<130><160>4<170>Patent Inversion 3.1<210>1<211>312<212>DNA<213>Chlamydia trachomatis<220><221>CDS<222>(1)..(312)<223><400>1gaa ttc ccg gca tac ggt cgt cat atg cag gat gct gag atg ttc acc 48Glu Phe Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr1 5 10 15aac gct gct tgc atg gct ctc aac att tgg gac gag ctc aac gta ctg 96Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn Ile Trp Asp Glu Leu Asn Val Leu20 25 30tgc aac gct gct gag ttt acc att aac aag ccg aaa ggt tac gta ggc144Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly35 40 45aaa gaa ttt ccg ctg gct ctg gac gca gct acc ggt act aag gac gca192Lys Glu Phe Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala50 55 60tct atc gac tac cac gaa tgg cag gct tct ctg gca ctg tct tat cgt240Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg65 70 75 80ctg aac atg ttt acc ccg tac atc ggt gtt aaa tgg tct cgt gct tct288Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp 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Glu Lys Glu Lys Ala Ser515 520 525Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe His Met Ala Ser530 535 540Glu Phe Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr545 550 555 560Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn Ile Trp Asp Glu Leu Asn Val Leu565 570 575Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly580 585 590Lys Glu Phe Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala595 600 605Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg610 615 620Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser625 630 635 640Phe Asp Ala Asp Thr Tyr Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His645 650 655His His His
權利要求
1.一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位相連接而形成的融合蛋白。
2.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其具有選自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID No4所示的氨基酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
3.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述的能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位的多肽具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列。
4.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中，卡介苗熱休克蛋白65位于該融合蛋白的氨基端，能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位位于該融合蛋白的羧基端。
5.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，它具有SEQ ID No4所示的氨基酸序列。
6.編碼權利要求1至5中任意一項所述的重組蛋白疫苗的核苷酸序列。
7.按照權利要求6所述的核苷酸序列，其具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
7.按照權利要求6所述的基因，它具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
8.含有權利要求5-7中任一項的核苷酸序列的表達載體。
9.含有權利要求10表達載體的宿主細胞。
10.按照權利要求9所述的宿主細胞，其為原核細胞，真核細胞或哺乳動物細胞。
11.一種制備權利要求1-5中任一項的重組蛋白疫苗的方法，包括培養(yǎng)如權利要求9或10所述的宿主細胞。
12.權利要求1-5中任一項所述的重組蛋白在制備用于預防人類沙眼衣原體感染的疫苗制品中的用途。
13.按照權利要求12所述的用途，其中所述的人類沙眼衣原體感染是泌尿生殖系統(tǒng)感染。
14.一種用于預防人類沙眼衣原體感染的疫苗制品，含有權利要求1-5中任一項所述的重組蛋白和載體或賦形劑。
15.按照權利要求12所述的疫苗制品，其中所述的人類沙眼衣原體感染是泌尿生殖系統(tǒng)感染。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位相連接而形成的融合蛋白；編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列；含有該核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，以及該重組蛋白疫苗的制備方法。本發(fā)明的融合蛋白在應用于人體后可有效地預防沙眼衣原體感染。
文檔編號C07K14/195GK1478549SQ0214197
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權日2002年8月29日
發(fā)明者王麗穎, 楊思睿, 于永利 申請人:北京迪威華宇生物技術有限公司