專利名稱：：具有改良的聚羥基鏈烷酸產生能力的去調節(jié)的細菌的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基本產生高水平的聚羥基鏈烷酸(PHA)生物高聚物的突變微生物。
背景技術：
：許多微生物合成和積聚作為能量存儲化合物的羥基鏈烷酸聚合物(聚羥基鏈烷酸，PHA)的能力早已得到公認。該類中最常見的化合物為聚(D(-)-3-羥基丁酸)(PHB)。然而，有些種類的微生物積聚共聚物，除羥基丁酸外，該共聚物可包含更長鏈的羥基鏈烷酸。興趣集中于這些PHAs,因為這些生物高聚物為生物相容的、生物可降解的熱塑性塑料，顯示類似于石化基聚合物如聚乙烯和聚丙烯的性質的物理性質。一種產生PHA的示例性細菌，真養(yǎng)沃特氏菌(『m^Mzaewfrap/za)(也稱作真養(yǎng)羅爾斯頓菌(i^f/對Oma￡1^0//^)或真養(yǎng)產堿菌(^/￡^//^"^ew^c^/2M)),適應臨界營養(yǎng)素如磷酸和氮的限制在發(fā)酵期間積聚PHA。由細菌兩步發(fā)酵典型地產生PHA。在第一階段，在包含允許增殖性生長的完全供給營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌。允許細菌繁殖，直到細菌達到足夠的生物量，該生物量通常以每升的干細胞重量來測量。在第二階^R，限制至少一種生長所必需的營養(yǎng)素例如氮或石岸的利用度，這具有限制細胞分裂和誘導PHA產生的作用。當營養(yǎng)限制誘導PHA的積聚時，直到第二階段才發(fā)生相當量的PHA生成。大多數(shù)產生PHA的生物體在非限制生長條件下不產生顯著水平的PHA。例如已報導當在無營養(yǎng)限制的條件下培養(yǎng)時，以干細胞重量的百分比計，沃特氏菌屬(『awferaza)(真養(yǎng)羅爾斯頓菌>[又產生3%的PHA。Repaske等，Xpp/￡>m>owA//cra6z'o/。第32巻第585-591頁，1976年。這需要在存在不限制營養(yǎng)素的水平時產生顯著水平的PHA的修飾細菌。發(fā)明概述本發(fā)明提供分離的營養(yǎng)素去調節(jié)的修飾細菌，該細菌在含允許增殖性生長的足量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基存在下，與未修飾的細菌相比，產生令人驚訝的量的PHA。這樣的細菌在存在不限制重要營養(yǎng)素如氮、磷、鎂、^琉酸鹽和鉀的水平時，產生顯著水平的PHA。本發(fā)明的新型分離細菌(a)在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少10Q/()的聚羥基鏈烷酸(PHA),和(b)在限制4失4旦不顯著限制其它營養(yǎng)素的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少20%的PHA。本發(fā)明任選不包括該領域先前已知的分離細菌，所述細菌在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生約50%或更多的PHA，且該細菌在限制鐵但不顯著限制其它營養(yǎng)素的培養(yǎng)條件下，顯示PHA的產生增長至少約10%。示例性細菌選自羅爾斯頓菌(尺a/對ow'a^ec/e》、產堿桿菌(^4/ca/z'ge"ej1、沃特氏菌，c&力、動膠菌(Zoog7oecr，c/es)、芽胞桿菌(5a"'〃ws、氣單胞菌(Jeramo"os1，c/e力、固氮菌(yl20toi)ac^rspec/e力、芽月包才炎菌(C7oWn'(iwws/ec/e力、i若卡氏菌(A^cw力"j/ec/es)、鹽桿菌(Z/a/o6a"en'ww5^ec/e5")或4叚單』包菌(i^ewcfomo"^^ecz&),或其組合。本發(fā)明的細菌特別不包括已知在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞千重計，產生超過50。/。的PHA的細菌，如廣泛產堿菌(^4/0//^恥1/"fw》和維涅蘭德固氮菌(JzotoZacfervz力/朋必)的突變體(在NADH氧化酶中的突變)。以細胞重量計，廣泛產堿菌產生約88.3。/。的PHB(Lee等，尸o/ym.Degracto,o"Sto6第59巻第387-393頁，1998年)，以細胞重量計，維涅蘭德固氮菌產生約94。/。的PHA(Page等，Ca".A^cro&o/.第41巻第106-114頁，1995年)。這些修飾細菌可去除一種營養(yǎng)素的調節(jié)如磷酸去調節(jié)或氮去調節(jié)，或可去除兩種或多種營養(yǎng)素的調節(jié)如磷酸去調節(jié)和氮去調節(jié)。優(yōu)選，細菌為營養(yǎng)素去調節(jié)的產生PHA的生物體，或被另外改造以包含非天然產生PHA的基因如phaC、A和/或B的PHA陰性突變抹。示例性細菌為2005年6月1日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549Manassas,VA20108，USA的那些細菌，保藏號分別為PTA-6759和PTA-6760。本發(fā)明也提供還顯示以ATCC保藏號PTA-6759保藏的細菌或以ATCC保藏號PTA-6760保藏的細菌的所有筌別特征的分離細菌。這些細菌的示例性實施方案為已保藏的細菌的后代，或保藏的細菌的突變體，其在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，與未修飾的生物體相比，保留已保藏的細菌的鑒別特征，即保留相同或相似的引起PHA產生增加的突變。此外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的分離細菌和培養(yǎng)基的培養(yǎng)物。本發(fā)明還提供用本文所述的本發(fā)明的任一種細菌產生PHA的方法。這樣的產生方法包括在合適的培養(yǎng)基中使細菌生長，以使細菌產生PHA的步驟。另外的任選的步驟包括收獲細菌，和/或從細菌中萃取PHA?；蛘撸绻鸓HA被分泌入培養(yǎng)基內，該方法可包括使細菌在合適的培養(yǎng)基中生長和從培養(yǎng)基中萃取PHA的步驟。只要將足夠的營養(yǎng)素供給給生物體以允許生長或產生PHA，可使用在該領域中所知的任何培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。在一方面，本發(fā)明因此提供在不限制必需營養(yǎng)素(即營養(yǎng)素以從不限制到引起增殖性生長停止的程度這樣的濃度存在)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這樣的細菌的方法。通過實例，只要在培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素沒有限制到將顯著削弱增殖性生長的濃度，培養(yǎng)過程包括將細菌從一個發(fā)酵罐轉移至另一個發(fā)酵罐(按比例增加)、以及分批或連續(xù)進料。在另一方面，本發(fā)明還提供依照兩步培養(yǎng)法培養(yǎng)本發(fā)明的細菌的方法，在該兩步培養(yǎng)法中，細菌在限制一種或多種必需營養(yǎng)素如無機元素的培養(yǎng)基中經歷第二步的培養(yǎng)。本發(fā)明也提供通過限制細菌未去調節(jié)微量元素產生PHA的改良方法。例如，在充分時期的增殖性生長之后，通過使磷酸去調節(jié)的細菌在含限制水平的除磷之外的元素如鎂、硫酸或鐵(優(yōu)選鐵)的培養(yǎng)基中生長，可達到PHA產生的提高。提供產生由C4和中等鏈長的單體(如大于5個碳的單體單位)組成的PHA共聚物的方法。示例性共聚物包括含C6、C7、C8、CIO、C12、C14、C16和C18共聚物，如3-羥基己酸酯(HH)(C6)、3-輕基庚酸酯(HHp)(C7)和/或3-羥基辛酸酯(HO)(C8),特別為含C4和C6(特別為3-羥基丁酸酯和3-羥基己酸酯或相應的酸)的共聚物，如羥基丁酸酯與羥基己酸酯共聚物(04-C6),最特別為80-98%摩爾范圍的04和2-20%摩爾的C6。在美國專利第6,225,438號中描述了另外的共聚物和合適的培養(yǎng)基。發(fā)明詳述本發(fā)明提供分離的、修飾的"營養(yǎng)素去調節(jié)"的細菌，該細菌在含有允許增殖性生長的足量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基存在下，與未修飾的細菌相比，產生令人驚訝量的PHA。這樣的修飾細菌可被去除一種營養(yǎng)素的調節(jié)，如磷酸去調節(jié)或氮去調節(jié)，或可被去除兩種或多種營養(yǎng)素的調節(jié)如磷酸去調節(jié)和氮去調節(jié)。其它示例性修飾細菌包括鎂去調節(jié)、硫酸去調節(jié)、鉀去調節(jié)或鐵去調節(jié)的生物體。在示例性實施方案中，本發(fā)明的細菌能夠(a)在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少10%、20%、25%,或30%或更高的PHA和(b)在限制鐵但不顯著限制其它營養(yǎng)素的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%,或80。/。或更高的的PHA。這樣的細菌包括產生PHA的在該領域中已知的任何細菌，但特別不包括已知在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生超過50。/。PHA的細菌，如廣泛產石咸菌和維涅蘭德固氮菌的突變體(在NADH氧化酶中的突變)，以細胞重量計，該兩種細菌中的每種細菌均積聚PHB至超過90。/。的水平。甚至在存在包含無限制的重要營養(yǎng)素的豐富培養(yǎng)基時，通過在磷酸去調節(jié)的細菌中產生PHA,本質上發(fā)生PHA的產生。在整個發(fā)酵中利用豐富的培養(yǎng)基或更豐富的、廉價的培養(yǎng)基的能力允許細菌的更快生長、PHA的更高產生，和在降低成本下的更利于PHA工業(yè)化產生的方法(見實施例8和9)。消除限制一種或多種營養(yǎng)素的必要性也允許連續(xù)發(fā)酵(即消除兩步培養(yǎng)法的需要)。當用于本文時，"分離的細菌"指已被鑒別和從其自然環(huán)境的成分中分離的細菌單一菌林的群體。例如，為包含人工培養(yǎng)基的培養(yǎng)組合物的部分的細菌^皮i人為為分離的。當用于本文時，"含不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)基"或"其中營養(yǎng)素水平不受限制的培養(yǎng)基"指含適當補給的所有營養(yǎng)素以允許細菌迅速繁殖的培養(yǎng)基。相似地，"營養(yǎng)素的不限制水平"指在足以支持快速增殖性生長的培養(yǎng)基中的那種營養(yǎng)素的濃度。相反，"限制營養(yǎng)素的培養(yǎng)基"指營養(yǎng)素的水平被減少到引起細菌的增殖性生長基本上停止的濃度的培養(yǎng)基；而"營養(yǎng)素的限制水平"指引起細菌的增殖性生長基本上停止的培養(yǎng)基中的那種營養(yǎng)素的濃度。當用于本文時，"增殖性生長"指如在指數(shù)生長期間觀察到的細菌數(shù)量的快速增長。當用于本文時，"磷去調節(jié)的"細菌指在磷或磷酸調節(jié)中具有缺陷，從而由磷耗盡通常被向上調節(jié)(或被抑制)的一個或多個基因被基本上向上調節(jié)(或被抑制)，結果甚至在沒有磷耗盡時細菌合成PHA的水平增高的細菌。相似地，"氮去調節(jié)的"細菌指在氮調節(jié)中具有缺陷，從而由氮耗盡通常被向上調節(jié)(或被抑制)的一個或多個基因^tt本上向上調節(jié)(或纟皮抑制)，結果甚至在沒有氮耗盡時細菌合成PHA的水平增高的細菌。其它營養(yǎng)素去調節(jié)的細菌的含義與此相似。當用于本文時，"PHA陰性"突變細菌指已被突變，從而不產生PHB或PHA的細菌[見例如Schlegel等，爿rc/.A^ybY^/o/.第71巻第283-4830頁，1970年]。可通過插入期望的PHA^因，例如通過用來自豚鼠氣單胞菌(^eromo"氾cm^e)表達野生型phaC基因的pJRDEE32dB轉化，來從基因上改造這樣的細菌以產生PHA(Fukui等，Ba"eno/.第179巻第4821-4830頁，1997年；和美國專利第5,981,257號)。通過關于如磷去調節(jié)細菌的非限制性實例，這樣的細菌可具有在以下基因或調節(jié)區(qū)中的突變涉及磷或磷酸的檢測，因此當無磷或磷酸時細菌似乎探測磷耗盡的基因或調節(jié)區(qū)(例如啟動子區(qū)、操縱基因、調節(jié)物(regulators)的DNA結合位點等)；或在涉及磷酸轉運的基因或調節(jié)區(qū)；或在激活其它基因對磷耗盡的響應(或相反地抑制基因對磷損耗響應的另一個調節(jié)物)的正磷酸調節(jié)物的基因或調節(jié)區(qū)；或在抑制基因對過量的磷酸的響應(或相反地激活基因對過量的磷酸響應的另一個調節(jié)物)的負磷酸調節(jié)物的基因或調節(jié)區(qū)；或在由這樣的正磷酸調節(jié)物或負磷酸調節(jié)物調節(jié)其轉錄的一個下游基因(或其調節(jié)區(qū))中；或在修飾或調節(jié)主要的正磷酸調節(jié)物或負磷酸調節(jié)物的一個基因(或其調節(jié)區(qū))中。在厭氧和需氧條件下可有不同的調節(jié)途徑。涉及磷調節(jié)的示例性基因包括與以下基因同源的基因埃希氏大腸桿菌(ECo/Z)基因pstA(phoT)(參與磷酸轉運)、pstB(參與磷酸轉運)、phoW(pstC)(參與磷酸轉運)、phoS(磷酸結合的蛋白)、phoU(參與磷酸轉運)、phoE(夕卜膜孔蛋白(porin))、ugpB(甘油-3-磷酸結合蛋白)、phoR(負磷酸調節(jié)物)、phoB(正磷酸調節(jié)物)、phoM(正磷酸調節(jié)物)、ps正(磷酸饑餓誘導型基因)、phn(psiD)(磷酸饑餓誘導型基因)、phoG(psiH)(磷酸饑餓誘導型基因)。參見在以下文獻中的這樣的基因和途徑的描述如Amemura等，編.細.184:241-250,1984;Makino等,J.M/,麵.190:37-44，1986;Wanner等，"在埃希氏大腸桿菌(五sc/2en'c/H'aco/"中基因表達的磷酸調節(jié)"Esc/zen'c/H'aco/Z朋(iSW/mo"e//Gf(y//^mwhww1326-1333,1987;Yamada等，《/.5a"en'o/.171:5601-5606,1989;Rao等，J.Sa"e"o/.180:2186-2193,1998;Novak等，J.Sa"eno/,181:1126-1133,1999;和Kim等，J.182:5596-5599,2000。參與氮調節(jié)的示例性基因包括AmtA(參與銨轉運)、GInD(尿苷酰轉移酶(uridylyltransferase)/消除尿苦酰(uridylyl)的酶)(涉及感覺細胞內的氮狀況)、GInB(Pll)(涉及感覺細胞內的氮狀況)、GInK(參與氮調節(jié)的信號轉換蛋白)、glnE(腺香腺轉移酶(adeylyltransfemse))、NtrB(為氮調節(jié)物的感覺組氨酸蛋白激酶)、NtrC(為氮反應調節(jié)物的DNA結合蛋白)、rpoN(在某些假單胞菌中)、GInR(在由過量的氮激活的芽胞桿菌屬(萬ac/〃^)中的負氮調節(jié)物)、TnrA(在由氮限制激活的芽胞桿菌屬中的調節(jié)物)、CodY(在由過量的氮激活的芽胞桿菌屬中的負調節(jié)物)。受NtrBC轉錄調節(jié)的基因包括glnALG、glnHPQ、argT、hisJQMP、nasFEDCBA、nac、gltF。參見在以下文獻中對這樣的基因和途徑的描述如Merrick等，MZcra&o/.59:604-622，1995;Atkinson等，A/o/ecw/arA//cro6/o/.29:431-437,1998;Fisher，A/o/ecw/orrA/z'cro6z'o/.32:223-232,1999;和Blauwkamp等，Mo/ecw/wM/cTO^o/.46:203-214,2002。耐抗重金屬羅爾斯頓菌(Wa/Wowaweto〃/^/ram)CH34，以前的真養(yǎng)羅爾斯頓菌和真養(yǎng)產堿菌(及也被稱作鉤蟲貪銅菌(Cw;^m^^wecato?；蛘骛B(yǎng)沃特氏菌)，的基因組已被測序，序列數(shù)據可從能源部的聯(lián)合基因組協(xié)會(JGI)獲得。真養(yǎng)羅爾斯頓菌(以前的真養(yǎng)產堿菌CH34)的基因序列也可從Brookhaven國家實驗室獲得。茄科羅爾斯頓菌(i^/stom'aso/anacean/m)的基因纟且序歹寸可乂人Genoscope禾口NCBI獲得。可例如使用BLAST來搜尋羅爾斯頓菌屬(尺a/stoma)的基因組序列，以用在埃希氏大腸桿菌或其它細菌中的調節(jié)物的同源性來鑒別序列?？赏ㄟ^輻射或其它誘變劑來修飾細菌，或可通過基因工程來修飾細菌。實施例l-3舉例說明具有所需特性的細菌的突變發(fā)生和選擇。簡言之，通過使誘變的細菌在含不限制濃度的磷酸和檢測堿性磷酸酯酶活性的培養(yǎng)基中生長，誘變和選擇用于磷酸去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌(兄ew^^/w)的PHA陰性突變抹。使用類似的方法(例如突變發(fā)生后在含非限量的氮或其它所需營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生長)，獲得其它的營養(yǎng)素去調節(jié)的突變細菌。在活躍的增殖性生長期(也稱為對數(shù)期)，優(yōu)選的突變細菌顯示增強的PHA的基本的產生水平，導致甚至在存在不限制濃度的營養(yǎng)素如磷酸、氮等時，在較早的時間點，就接近PHA的最大積聚。以該方式制備的示例性細菌已于2005年6月1日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),P.O.Box1549Manassas，VA20108,USA，保藏號分別為PTA-6759和PTA-6760。本發(fā)明預期保留相同的或相似的突變導致期望的去調節(jié)特性的這樣細菌的后代或突變體。例如，只要它們保留營養(yǎng)素去調節(jié)的特性，可進一步誘變這樣的細菌，以分離具有另外的所需特性的細菌。也可通過重組基因工程來賦予另外的所需特性。例如，可通過質?；蛑亟M導入具有所需特性的新基因，或可使細菌的基因組中存在的基因或調節(jié)區(qū)突變，以使它們激活或失活。此外，例如通過對突變細菌的基因組或基因產物測序以鑒別突變，或限制片段長度的多形性分析(用限制酶消化以鑒別由突變造成的不同的限制點)，或雜交模式分析(在與探針相同的基因組序列和包含突變的基因組序列之間區(qū)分的雜交條件下，已知序列的探針雜交)，或在該領域中已知的突變檢測的任何其它方法，可鑒定具有引起可觀察到的磷酸去調節(jié)或氮去調節(jié)表型的突變體。對于突變的鑒定，可通過在它們的基因組中插入或刪除，從遺傳上改造野性型細菌，以在相同的區(qū)域(例如調節(jié)區(qū)或基因)包含突變。如果細菌為PHA陰性突變林，例如通過用能產生PHA的、從豚鼠氣單胞菌表達phaC基因的質粒來轉化，優(yōu)選將該細菌另外設計以包含期望的產生PHA的基因例如phaC、A和/或B(Fukui等，丄6a"eno/.179:4821-4830,1997;和美國專利第5,981,257號)。備選的示例性基因包括來自熒光^f艮單胞菌C^ewotomo"osy/womycem)的phaC(美國專利第6,475,734號)或來自嗜水氣單胞菌04eramo"os/^c/rap/Hh)4AK4的phaC(SEQIDNO:1)。見美國專利第5,661,026號和第5,798,235號。細菌本發(fā)明包括能產生聚羥基鏈烷酸的任何細菌。這些細菌包括但不限于屬于以下屬的菌種沃特氏菌屬、產堿桿菌屬、羅爾斯頓菌屬、動'膠菌屬(Zoog7oea)、芽胞桿菌屬、氣單胞菌屬(Xerawo"a力、固氮菌屬(^4zoto^cte〃、梭狀芽月包桿菌屬(C/oyW血附)、諾卡氏菌屬(7Vocw(i/G)、鹽桿菌屬(7/a/o^cten'ww)和假單胞菌屬(尸"wtfow("a力。細菌可為天然的或^皮基因工程改造的。在以上菌屬中，羅爾斯頓菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬和固氮菌屬被典型地使用。真養(yǎng)沃特氏菌，以前被稱為真養(yǎng)羅爾斯頓菌，以前稱為真養(yǎng)產堿菌，被最典型地使用。在例如"伯基氏細菌學鑒定手冊(SEAG五nSM4M/ALOFD五r57M/iV/477J/EA4C7EW(9丄(9Gy)，第八版，TheWilliams&\￥0^113公司/巴爾的摩"中描述了屬于羅爾斯頓菌屬(產堿桿菌屬)的這些細菌的細菌學性質。本發(fā)明的細菌特別不包括已知在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生超過50。/。的PHA的細菌，如廣泛產堿菌和維涅蘭德固氮菌的突變體(在NADH氧化酶中的突變)，以細胞重量計，這兩種細菌各自積聚PHA至超過90。/。的水平。培養(yǎng)基通常以易同化的形式存在的、典型地作為水溶性鹽的、細菌生長期望的必需營養(yǎng)素包括碳源和至少以下的無機元素氮、磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣和鐵，任選具有痕量的錳、鋅、鎳、鉻、鈷和/或銅。碳源為可^C細菌利用的任何物質，包括合成的、天然的或修飾的天然碳源。示例性碳源包括但不限于脂肪酸包括己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸，和更長鏈的脂肪酸；或脂肪酸的鹽、酯(包括與羥基取代酸有關的內酯)、酐、酰胺或囟化物；油包括植物油來源，如玉米油、大豆油、棕櫚仁油、棉籽油、菜籽油、花生油、這些類型植物油的任何的分餾油，和/或其衍生物，和/或其混合物；醇包括曱醇、乙醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇和癸醇、以及異和其它支鏈脂肪酸或醇和醋酸；其它的碳源例如二氧化碳、酵母提取物、糖蜜、蛋白胨，和肉提取物、糖例如阿拉伯醣、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇和力幾醇。示例性氮源包括無機氮化合物例如氨、銨鹽、硝酸鹽，和/或有機含氮化合物例如尿素、玉米漿、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物和肉提取物。示例性無機成分包括鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鉬鹽、鈷鹽、鎳鹽、鉻鹽、硼化合物或碘化合物。任選地，在培養(yǎng)基中可包括維生素。細菌培養(yǎng)方法
技術領域：
：本發(fā)明的營養(yǎng)素去調節(jié)的細菌甚至在不限制必需營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中可達到良好的PHA產生水平。培養(yǎng)細菌的方法簡單地包括使細菌在合適的培養(yǎng)基中生長。細菌甚至在繁殖時將產生顯著水平的PHA?？衫么龠M細菌的增殖性生長的、在該領域已知的和/或本文所描述的任何培養(yǎng)基和合適的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度可依賴于生物體而改變。對于羅爾斯頓菌屬，示例性培養(yǎng)溫度的范圍從約20至40。C,優(yōu)選約25至35。C;而pH值為例如約6至10，優(yōu)選約6.5至9.5。在這些條件下實行需氧培養(yǎng)。使用允許迅速生長和產生PHA的豐富營養(yǎng)基，可設計能顯著降低產生成本的連續(xù)發(fā)酵反應器。(見發(fā)酵技術原理(iV/"c^/^o/Few^"她.o"rec/mo/ogy),第二版,P.F.Stanbury,A.德itaker禾口S.J.Hall,eds.,Butterworth曙Heinemann出版社，1984年，笫16-27頁；Henderson等，AZ/cra&o/ogy143:2361-2371，1997年；Ackermann等，聚合物的降解和穩(wěn)定性(fo(ywwZ)egrad加o"朋dSto6/"(y)59:183-186,1998年。)通過舉例，一步培養(yǎng)法包括將細菌從一個發(fā)酵罐轉移到另一個發(fā)酵罐(按比例放大)，以及分批發(fā)酵或培養(yǎng)基的連續(xù)進料。在其中限制一種或多種必需營養(yǎng)素的第二步培養(yǎng)的缺乏提供細菌的更快生長、PHA的更高產生，和在減少的成本下更有利的PHA的工業(yè)化產生方法。作為選擇，可依照兩步培養(yǎng)法來培養(yǎng)細菌，包括在例如美國專利第5,364，778號或美國專利第5,871，980號或美國專利第6,225,438號中所描述的常規(guī)方法。當不需要利用這樣的兩步培養(yǎng)法來培養(yǎng)本發(fā)明的細菌時，可依照這樣的常規(guī)方法來培養(yǎng)本發(fā)明的細菌。簡言之，在第一階段，在非生長限制條件下生長細菌，允許細菌繁殖直到它達到足夠的生物量，通常用每公升的某個干細胞重量來衡量。在第二階段，限制至少一種生長所需的營養(yǎng)素，因此增殖性生長停止，開始增加PHA的產生。當通過限制氧的供應可能提高PHA的產生時，限制的最實用的營養(yǎng)素為氮、磷或其次優(yōu)選為鎂、硫、鉀或鐵。任何碳源均可用于任一階段。在一些先前的工藝過程中，用于第一階段的培養(yǎng)基包含易代謝的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖，而用于第二階段的培養(yǎng)基包含更復雜的碳源例如脂肪酸或脂肪醇。在一些方法中，通過分離回收細菌細胞，通過常規(guī)的固-液分離方法例如過濾或離心，從在第一階段獲得的培養(yǎng)肉湯過濾，使如此獲得的細胞在第二階段培養(yǎng)?；蛘撸诘谝浑A段的培養(yǎng)中，臨界的營養(yǎng)素-波充分地耗盡，培養(yǎng)肉湯可#1移至第二階段培養(yǎng)，而沒有通過在那里培養(yǎng)的細胞的分離而回收。在一個示例性方法中，最初將細菌置于含充分供應的所有營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中，以允許增殖性生長。當細菌生長并消^/f養(yǎng)素時，至少一種必需營養(yǎng)素如無機元素的供給減少至引起停止增殖性生長和增力口PHA的產生的限制性水平。如果含營養(yǎng)素的培養(yǎng)基再供給細菌，至少該必需營養(yǎng)素在這樣的培養(yǎng)基中連續(xù)受到限制。在備選的示例性方法中，連續(xù)供應或在不同的時間間隔供應培養(yǎng)基，供應的初始培養(yǎng)基包含不限制水平的營養(yǎng)素，在一段時間的充分的增殖性生長之后，在供應的培養(yǎng)基中限制至少一種必需營養(yǎng)素。美國專利號6,225,438描述培養(yǎng)PHA產生細菌的另外的方法，因此細菌產生包含更高水平的中等鏈長單體(如具有大于5個碳的單體單位)的PHA共聚物，導致具有增加的彈性和處理能力的共聚體，在成型和卓越的神莫壓期間減少熱分解，優(yōu)選具有熔點溫度約30至15(TC。方法包括在具有含6個或更多個碳的碳鏈的脂肪酸和/或脂肪醇和脂肪酸氧化抑制劑存在下培養(yǎng)細菌。用本發(fā)明的細菌可使用這樣的方法。在第二步培養(yǎng)期間，從培養(yǎng)的初始階段到結束階段的任何時間均可添加碳源和脂肪酸氧化抑制劑。優(yōu)選在初始階段添加。依照該方法合適的脂肪酸氧化抑制劑的實例包括但不限于丙烯酸、2-丁酸、2-辛酸、S-苯丙酸、R-苯丙酸、丙炔酸和反式肉桂酸。抑制劑可為酸本身或其鹽。丙烯酸鈉為一種優(yōu)選的脂肪酸氧化抑制劑。可使用一定量的脂肪酸氧化抑制劑，能按期望的量增加3-輕基己酸酯(HHXC6)、3-羥基庚酸酯(HHp)(C7)和/或3-羥基辛酸酯(HO)(C8)共聚物的積聚，但對細胞具有可接受水平的毒性。例如，丙烯酸鈉可以約l-40mM，優(yōu)選約10-35mM和更優(yōu)選25-32mM的濃度用于培養(yǎng)基中。通過營養(yǎng)素限制增強PHA產生本發(fā)明的細菌產生顯著水平的PHA，而在培養(yǎng)期間基本上不需要限制任何必需營養(yǎng)素。然而，通過限制營養(yǎng)素例如限制磷、氮、鎂、硫酸鹽、鉀或鐵，可達到甚至更高水平的PHA產生。優(yōu)選，受限制的營養(yǎng)素為細菌未去調節(jié)的營養(yǎng)素。例如，通過限制磷酸，沒有提高本文所述的一個磷酸去調節(jié)的生物體的PHA產生，但通過限制鐵提高了該生物體的PHA產生。通過限制鐵和其它無機元素的各種組合，可使PHA的產生最大化。在一個實施方案中，限制培養(yǎng)基中的鐵濃度，因此磷酸對鐵的比率為約50或更高，或約350或更高，或約500或更高，或約2,800或更4氐，或約1,400或更低，或約900或更低。示例性范圍包括從約58至約2,773,或約350至約1,400，或約500-900,或約600-800如693。PHA共聚物的提取可由在該領域中已知的任何方法，包括但不限于常規(guī)的固-液分離法如過濾法或離心法，從培養(yǎng)肉湯中收獲細菌。可由在該領域中已知的任何方法，包括以下的示例性方法，從細菌中提取PHA共聚物。從培養(yǎng)肉湯中收獲細菌細胞，用0.1MNaCl、50mMTris-HCl、pH8.0將細胞清洗一次，懸浮于水中，然后凍干。通過在約50:1的氯仿對細胞干重中，回流至少約5小時，將PHA共聚物萃取入氯仿中。將萃取液通過過Whatman弁4過濾紙過濾，干燥至最小體積，通過添加粘性溶液至10倍體積的二乙醚/己烷3/1v/v,使PHA共聚物沉淀。在加蓋的特氟綸離心管中離心這些物質，在整夜真空干燥之前用乙,己烷洗滌一次。通過乙醚/己烷沉淀的固體PHA共聚物在沸騰的丙酮中回流5小時，施行PHA共聚物的進一步分餾。在氮氣下干燥丙酮萃取物，將PHA共聚物溶于氯仿中，用乙醚/己烷沉淀該共聚物?；蛘撸帽苯虞腿「稍锏募毎?，通過在氮氣下干燥、溶于氯仿中、用乙醚/己烷沉淀，分離可溶的PHA共聚物。此外，可用各種已公布的方法從細菌中回收共聚物產物，以產生各種有用的物理形態(tài)的PHA共聚物。這些包括使用氯化溶劑(例如美國專利號4,562，245)、非氯化溶劑(國際公布號97/07230)、邊緣溶劑(美國專利號5,821,299)的化學萃取法、熱的使用和分離PHA微粒的酶、在美國專利號4,910,145中所述的實例，或物理方法如風選法(airclassification)(美國專利號5,849,854)和離心法(美國專利號5,899,339)的使用。PHA產生的定量或對比評價將收獲的細胞干燥、稱重，使用所述的氯化溶劑萃取PHA。在整夜真空下將提取的PHA干燥，稱重以獲得在干燥的生物量中的PHA百分比和在發(fā)酵肉湯中的滴定量?；蛘?，通過氣相色譜(GC)對PHA進行定量和定性分析。培養(yǎng)液在10,000g下離心15分鐘，然后在0.9%氯化鈉溶液中洗涂細胞兩次，凍干過夜。在存在15。/Q(v/v)硫酸時使凍干的細胞材料(8-10mg)經過曱醇分解。依照Brandl等(^4/p/.￡>m>W7.AZ/cra&o/.54:1977,1988)和如(Timm等，4p;/.￡>v/ra".Mzcra^.o/.56:3360,1990)所詳述的，用GC對產生的成分3-羥基鏈烷酸的甲酯進行分析。通過將3L的樣品注入使用0.5m直徑60m長的PermphasePEG25Mx毛細管柱的AgilentTechnologies6850型氣相色譜儀(Waldbronn，Germany),進行GC分析。產生的PHA的用途本發(fā)明也提供由本發(fā)明的細菌產生的PHA。這樣的PHA可轉變成光纖、模制品和薄膜，用于在該領域中已知的PHA或其它塑料的任何應用，包括醫(yī)學材料如外科線或骨骼安置材料、衛(wèi)生制品如尿布或清潔用品、農業(yè)或園藝材料如多層薄膜、緩釋化學制品，或漁業(yè)材料如漁網，和/或包裝材料如瓶子、快餐包裝和盒子。實施例參考以下的非限制性實施例，更詳細地描述本發(fā)明，提供該實施例以更充分地舉例說明本發(fā)明，但該實施例不解釋為限制其范圍。實施例舉例說明營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的分離、用于產生PHA的所述去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的發(fā)酵過程，和通過限制微量元素修飾PHA的產生。實施例l磷酸去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的分離按以下分離磷酸去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌。真養(yǎng)羅爾斯頓菌的PHA陰性突變抹在含酵母提取物(IOmL,3。/。)的100ml搖瓶中培養(yǎng)16-20小時，轉速200rpm,溫度30。C，直到OD6oo超過10。將培養(yǎng)物(3mL)轉移入27mL的無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)中。移除5mL的稀釋細胞以便制平板，作為未突變的對照，暴露殘留的懸浮液(25mL),在暗處連續(xù)攪拌，經過充分的紫外照射，得到1%和10%之間的存活率。將已照射的培養(yǎng)基的lmL等分試樣轉移至在100mL搖瓶中的11mL預熱的富含營養(yǎng)素的培養(yǎng)基(l。/。w/v胰蛋白胨、P/。w/v酵母提取物、0.5。/。w/v牛肉提取物、0.5。/。w/v硫酸銨、pH7)中。用鋁箔包裝燒并瓦，以最小化光修復(photorepair),在暗處振蕩3小時，轉速200rpm，溫度30。C,以使細胞分離和突變體"固定，，。在含比色的堿性磷酸酯酶底物、BCIP(40g/ml)的LB瓊脂(l。/。w/v胰蛋白胨，0.5。/。w/v酵母提取物，0.5%w/v氯化鈉，pH7)上培養(yǎng)分離的細胞，和在30。C培育細胞2到3天。強烈地暗藍色群體被分離，為真養(yǎng)羅爾斯頓菌的假定的磷酸去調節(jié)的菌抹。示例性磷酸去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌為保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),P.O.Box1549Manassas,VA20108,USA的那些細菌，保藏號為PTA-6759。實施例2氮去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的分離按以下分離氮去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌。真養(yǎng)羅爾斯頓菌的PHA陰性突變株在含酵母抽提物(IOmL,3。/。)的100ml搖瓶中培養(yǎng)16-20小時，轉速200rpm，溫度30。C，直至OD細超過IO。將培養(yǎng)物(3mL)轉移至27mL的無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)中。移除5mL的稀釋細胞以便制平板，作為未突變的對照，暴露殘留的懸浮液(25mL)，在暗處連續(xù)攪拌，經過充分的紫外照射，得到在1%和10%之間的存活率。將已照射的培養(yǎng)基的1mL等分試樣轉移至在1OOmL搖瓶中的11mL預熱的富含營養(yǎng)素的培養(yǎng)基(l。/ow/v胰蛋白胨、l%w/v酵母提取物、0.5。/。w/v牛肉提取物、0.5。/。w/v硫酸銨、pH7)中。用鋁箔包裝燒瓶，以最小化光修復，在暗處振蕩3小時，轉速200rpm,溫度3(TC,以使細胞分離和突變體"固定"。在含200mM的銨類似物甲胺和復合氮源例如0.1Q/。w/v甘氨酸的最少量的瓊脂上培養(yǎng)分離的細胞，在3(TC時培育至少3天。分離看來生長良好的菌落，作為假定的氮去調節(jié)的菌種。實施例3雙去調節(jié)的(既磷酸去調節(jié)的又氮去調節(jié)的)真養(yǎng)羅爾斯頓菌的分離按以下分離磷酸和氮均去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌。來自實施例l的真養(yǎng)羅爾斯頓菌DSM541的磷酸去調節(jié)的突變體在含10mL3%酵母抽提物的100ml搖瓶中培養(yǎng)16-20小時，轉速200rpm,溫度30。C，直至OD6Qo超過10。將3mL的培養(yǎng)物轉移至27mL的無菌磷酸緩沖鹽水中。移除5mL的稀釋細胞以便制平板，作為未突變的對照，暴露殘留的懸浮液(25mL)，在暗處連續(xù)攪拌，經過充分的紫外照射，得到的存活率在1%和10%之間。將已照射的培養(yǎng)基的lmL等分試樣轉移至在100mL搖瓶中的llmL預熱的富含營養(yǎng)素的培養(yǎng)基(P/。w/v胰蛋白胨、l%w/v酵母提取物、0.5。/。w/v牛肉提取物、0.5。/。w/v石克酸銨、pH7)中。用鋁箔包裝燒瓶，以最小化光修復，在暗處振蕩3小時，轉速200rpm，溫度3(TC，以使細胞分離和突變體"固定"。在含200mM的銨類似物曱胺和復合氮源例如0.1%w/甜氨酸的最少量的瓊脂上培養(yǎng)分離的細胞，在3(TC時培育至少3天。分離看來生長良好的菌落，作為假定的雙去調節(jié)的e粦酸和氮均去調節(jié)的)菌抹。示例性的^^酸和氮調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌為于2005年6月l號為保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549Manassas,VA20108，USA的那些細菌，保藏號為PTA-6760。實施例4具有PHA^基因的解除營養(yǎng)素調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的轉化例如，通過用質粒pJRDEE32dl3表達來自豚鼠氣單胞菌的野生型phaC基因來轉化(Fukui等，丄Ba"eho/179:4821-4830,1997;和美國專利第5,981,257號)，用各種產生PHA的基因轉化營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌細胞，以使PHA能夠產生。在該領域中已知各種轉化方法，例如Park等(說ofec/2"o/ogyrec/"/^^9:31-34,1995)所述的電穿孔法或用Friedrich等(J.Sarfer/o/ogy147:198-205,1981)所述的￡.co//S17-1的直4妻卑爭運結合(transconjugation)。然后在含不限制濃度的去調節(jié)的營養(yǎng)素例如磷(或雙去調節(jié)的營養(yǎng)素例如磷和氮)的培養(yǎng)基中使細菌生長，然后按以下陳述測量PHA的積聚。實施例5PHA積聚的測量離心細菌，用0.1MNaCl、50mMTris8.0洗滌一次，離心，懸浮于2-3mL的水中，冷凍和凍干2天。使千燥的細胞在lmL氯仿加lmL15。/(K琉酸的甲醇溶液中在10(rC反應4小時。添加lmL的氯仿加lmL的lMNaCl使樣品相分離。用無水硫酸鈉處理氯仿相至干燥，取出lmL，在氮氣下或通宵加罩在樣品瓶中干燥。將樣品溶于lmL的丙酮加lg/L苯曱酸曱酯中并加蓋?；蛘撸瑢?00^L的10g/L苯甲酸甲酯直接加入lmL的氯仿中；然后加蓋和分析樣品。使用30m長，0.32mmlD,0.25nm膜厚的SupelcowaxlO柱，使用氦氣，以lcmV秒的流速等于20cm/秒的線流速，在HP5890GC上分析樣品。注射器溫度設置在225。C,FID檢測器溫度^:置在300。C。在lpL注射(50:1分流)之后爐箱溫度保持在80。C維持2分鐘，以10。C/min升溫至230°C，在230。C保持12分鐘?；蛘?，使用和以上相同的程序，但最終溫度在230。C保持7分鐘，在J&WDB-5MS(零件122-5531,30m長，0.25mm直徑，O.lum膜厚)上分析樣品。3-羥基鏈烷酸和3-羥基鏈烷酸曱酯，用作標準物，購自Sigma(目錄弁H6501dl-(3-羥基丁酸，目錄#H40233-羥基羊脂酸曱酯，目錄#H37733-鞋基癸酸甲酯，目錄弁H35233-羥基月桂酸曱酯，目錄#H42733-羥基豆蔻酸甲酯，目錄#H45233-羥基棕櫚酸甲酯)，從在月桂酸上生長的嗜水氣單胞菌處理的PHA共聚物鑒別3-羥基己酸甲酯。實施例6用于產生聚-3-羥基鏈烷酸(PHA)的磷酸去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的發(fā)酵使用植物油、脂肪酸、脂肪醇和酯作為給料底物，實施^皮設計能夠產生羥基丁酸酯與羥基己酸酯共聚物的重組的磷酸去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的分批主合料培養(yǎng)物。植物油包括玉米油、豆油、棕櫚油、棕櫚仁油、棉籽油、菜籽油、花生油、它們的分餾油、它們的混合油。糖酸、葡萄糖和糖蜜，一些養(yǎng)料需要選擇菌抹在特殊養(yǎng)料上生i。一首先在3(TC在100mL的營養(yǎng)肉湯中使該菌抹生長至OD6oo為2.0。然后使用該肉湯接種，并使用以下培養(yǎng)基在3L的種子培養(yǎng)發(fā)酵罐中生長菌種發(fā)酵Na2HP04KH2P04(NH4)2S04MgS04.7H20(20g/100ml)微量元素CoCl2.6H200.218gFeCl3.6H2016.2gCaCl2.2H2010.3gNiCl2.6H200.118gCuS04.5H200,156g用0.1NHC1稀釋至1L在121。C保持20min將培養(yǎng)基滅菌;50mg/L卡那霉素。操作條件溫度初始pHpH控制點通風攪拌ll.Og/L1.90g/L12.87g/L5ml/L5mL/L冷卻，并添加30g/:Ui物油和30°C6.8用7y。NH4OH調至6.80.6wm500rpm當OD6oo-69.9時，收獲培養(yǎng)物。使用175mL的培養(yǎng)物接種至主發(fā)酵罐中達3.5L。使用NovaBiomedical300BioprofileAnalyzer測量培養(yǎng)基中的磷酸濃度，顯示從未被限制。Na2HP044.36g/LKH2P041.90g/L(NH4)2S042.91g/L消泡劑3ml/LMgSO4.7H2O(20g/100mL)5mL/L微量元素5mL/L操作條件溫度28。C初始pH6.8pH控制點用14%NH4OH調至6.8通風0.6wm攪拌400rpm背壓1-2psi用總共l10g/L植物油進料時間Oh0.56ml/L2h0.924h1.286h1.678h2.0210h2.3712-60h2.67菌種也在限制磷酸的培養(yǎng)基中生長，在該培養(yǎng)基中在培養(yǎng)期間，通常在20h和36h培養(yǎng)時間之間，添加的^5粦的完全利用誘導野生型菌才朱以增加PHA的產生。限制磷酸的培養(yǎng)基Na2HP043.85g/LKH2P040.67g/L(NH4)2S042.91g/L消泡劑3mL/LMgSO4.7H2O(20g/l00ml)5mL/L微量元素5mL/L種子發(fā)酵罐的5。/。v/v的接種操作條件溫度30-34。C持續(xù)16h，然后28。C3刀始pH6.8pH控制點用14%NH4OH調至6.8通風0.6wm撹拌400rpm背壓1-2psi用總共110g/L植物油進料時間Oh0.56ml/L2h0.924h1.286h1.678h2.02纖2.3712掘2.67更豐富的培養(yǎng)基允許細胞在最短的滯后時間內生長。在更高磷酸濃度的細胞生長基本上是為了在細胞生長的所有時間產生PHA和積聚PHA。在更高磷酸濃度的細胞生長產生的PHA為由限制磷酸時的細胞生長產生的PHA的量的165。/。。通過對比，具有非去調節(jié)背景的產生PHA的真養(yǎng)羅爾斯頓菌在高磷酸的培養(yǎng)基中產生的PHA僅為在限制磷酸的培養(yǎng)基中產生的PHA的55。/。。這是笫一次證明在真養(yǎng)羅爾斯頓菌的活性生長期(對數(shù)期)顯著水平的基本PHA產生，不管存在磷酸的不限制性濃度，均導致在更早的時間點接近PHA的最大摻入。實施例7用于產生PHA的氮去調節(jié)的、雙去調節(jié)的，和其它營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的發(fā)酵真養(yǎng)羅爾斯頓菌的氮去調節(jié)的菌抹、雙去調節(jié)的菌抹(磷酸和氮均去調節(jié))，和其它營養(yǎng)素去調節(jié)的菌抹在實施例6所述的不限制性營養(yǎng)肉湯中生長，以比天然的真養(yǎng)羅爾斯頓菌產生更高的濃度PHA。實施例8用于產生PHA的在豐富培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的發(fā)酵營養(yǎng)素去調節(jié)的菌林不需要通過限制營養(yǎng)素的誘導來產生大量的PHA。因此，當保持高PHA產生，因此在給定的培養(yǎng)容器中增加PHA的總滴定量時，可添加豐富營養(yǎng)源的復合培養(yǎng)基以增加生物總量的產生。豐富的培養(yǎng)基可包括酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸、牛肉提取物和其它的有機氮源、磷酸和其它營養(yǎng)素。實施例9用于產生PHA的在更豐富的廉價培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌的發(fā)酵營養(yǎng)素去調節(jié)的菌抹不需要通過限制營養(yǎng)物而誘導，以產生大量的PHA;然而，添加昂貴的豐富的培養(yǎng)基源還不經濟。營養(yǎng)素可由更經濟的供應品來補給，通過供給例如磷酸、銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、玉米漿、大豆水解物、粗甘油、乳清、工業(yè)用油、醣類或蛋白質廢液，或其它更便宜的簡單的或復合的培養(yǎng)基，不用考慮由于過度供給關鍵營養(yǎng)而抑制PHA的產生。實施例IO通過限制微量元素在營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌中的高水平PHA產生的誘導真養(yǎng)羅爾斯頓菌的磷酸去調節(jié)和氮去調節(jié)的菌抹分別在不限制磷酸和不限制氮的培養(yǎng)基中為PHA的基本產生者。當給予沖直物油時，通過限制培養(yǎng)基中的微量元素，增加PHA的產生。磷酸去調節(jié)的或磷酸和氮軍區(qū)調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌，和能夠產生輕基丁酸酯與羥基己酸酯共聚物(C4C6)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌在包含以下成分的培養(yǎng)基中生長Na2HP047.70g/LKH2P041.34g/L(NH4)2S042.91g/LMgS04.7H20(20g/100mL)5mL/L需要時加入消泡劑微量元素O-lmL/LCoCl2.6H20FeCl3.6H20CaCl2.2H20NiCl2.6H200.218g16.2g10.3g0.118gCuS04.5H200.156g用0.1NHC1稀釋到1L用植物油分批給予細菌。典型水平為5mL/L微量元素、3.85g/LNa2HPO*0.67g/LKH2P04。發(fā)現(xiàn)了PHA水平超過85。/。重量的細胞。作為對照，^疇酸去調節(jié)的細胞在限制磷酸的培養(yǎng)基中積聚了35%PHA,在不限制性培養(yǎng)基中積聚了49。/。PHA。未去調節(jié)的細胞在不限制性培養(yǎng)基中不積聚PHA,在限制微量元素的培養(yǎng)基中僅積聚1.9%PHA。另外，對于表達來自豚鼠氣單胞菌(Fukui等，Sac&ho/.179:4821-4830，1997;和美國專利第5,981,257號)的野生型phaC基因(pIRDEE32dl3)的磷酸去調節(jié)的突變體，在同樣量的生物量中，在限制磷酸的條件下，與35。/。PHA的PHA產生相比，在培養(yǎng)基中限制80%的微量元素改善74%PHA的PHA產生。使用其中加入2X磷酸的對照培養(yǎng)基和其中調節(jié)微量元素的量的測試培養(yǎng)基，在3.5L初始體積中使用含豚鼠氣單胞菌phaC基因的質粒轉化的真養(yǎng)羅爾斯頓菌(在實施例l中所迷)發(fā)酵。給予細菌玉米油，用氫氧化銨中和酸。與對照培養(yǎng)基相比，限制測試培養(yǎng)基中的微量元素導致細胞的PHA含量加倍。在對照培養(yǎng)基中限制微量元素的量至20%的量，足以支持細胞生長等同于在對照培養(yǎng)基上生長，與此同時還提供細胞的增加的PHA含量。下面的表l顯示限制微量元素對磷酸去調節(jié)的細胞生長和PHA積聚的效果與微量元素之間的關系。當在限制磷酸的條件下培養(yǎng)時，細胞包含35。/。重量的PHA(每個細胞千重(DCW)的PHA重量)，具有0.51gPHA/L/h的產率，產生39.3g/L的PHA。嚴格地限制微量元素在90%或更多，當供應過量的磷酸時，能使每個細胞的PHA高積聚，但限制細胞生長和PHA產生。耗盡80。/。的微量元素使得細胞完全生長和84.1g/L的PHA產生(73.6o/。重量的PHA和1.17gPHA/L/h的產率)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例ll通過限制鐵在營養(yǎng)素去調節(jié)的真養(yǎng)羅爾斯頓菌中的修飾的PHA產生在微量元素的變化量的進一步測試中，含20%鐵的培養(yǎng)基存在于對照培養(yǎng)基中，但全量的其它微量元素產生同樣的結果。這些結果顯示鐵的限制提供增加PHA產生的預期效果。下面陳述表明增加的PHA積聚的用于培養(yǎng)的示例性磷酸對鐵的比率(摩爾濃度/摩爾濃度)。表明修飾的PHA積聚的發(fā)酵培養(yǎng)基包含磷酸(41.6mM)和鐵(0.06mM),其比率為693:1。也可能減少一半的鐵濃度或加倍磷酸至1,387:l的比率。磷酸對鐵的比率可從約58:l至約2773:l變化。磷對鐵的示例性比率不受限制。在該領域中的一項技術可測定這樣的比率。貫穿該申請，引用了各種出版物。全部這些出版物的公開，包括但不限于本文引用的公開的特定方面，通過引用結合到該申請中，以便更充分地描述技術人員已知的該領域的狀況，在這里作為本文描述的和要求保護的發(fā)明日期。本專利文件的公告包含受版權保護的材料。版權擁有者不反對專利文件或專利公告中的任一項的傳真復制，當它出現(xiàn)在專利與商標局的專利文件或記錄中時，但無論如何另外保留所有的版權。已舉例說明和描述本發(fā)明的詳細實施方案，其對本領域的那些技術人員是顯而易見的在不偏離本發(fā)明的精神和范圍時，可做各種其它的改變和修飾。因此，在附加的權利要求中有意覆蓋在本發(fā)明范圍內的所有這樣的改變和修飾。權利要求1.分離的營養(yǎng)素去調節(jié)的細菌，所述細菌能夠(a)在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少10％的聚羥基鏈烷酸(PHA)，和(b)在限制鐵但不顯著限制其它營養(yǎng)素的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少20％的PHA，其中所述細菌不包括廣泛產堿菌(Alcaligeneslatus)和具有NADH氧化酶突變的維涅蘭德固氮菌(Azotobactervinlandii)突變體。2.分離的細菌，所述細菌顯示以ATCC保藏號PTA-6759保藏的細菌的所有鑒別特征。3.分離的細菌，所述細菌顯示以ATCC保藏號PTA-6760保藏的細菌的所有鑒別特征。4.權利要求l的細菌，所述細菌為沃特氏菌屬(PTaw^ra/a)、羅爾斯頓菌屬(尺a/對om'a)、芽胞桿菌屬(Bac/〃M),諾卡氏菌屬(JVocarato)、氣單月包菌屬(^4ero附o"oy)或棄i單月包菌屬(尸sew(iowo"as)菌種。5.權利要求l的細菌，所述細菌為磷酸去調節(jié)的沃特氏菌屬菌種。6.權利要求2的細菌，所述細菌為磷酸去調節(jié)的沃特氏菌屬菌種。7.權利要求1的細菌，所述細菌為磷酸去調節(jié)的和氮去調節(jié)的細菌。8.權利要求2的細菌，所述細菌為磷酸去調節(jié)的和氮去調節(jié)的細菌。9.權利要求1的細菌，所述細菌包含非天然的產生PHA的基因。10.權利要求2的細菌，所述細菌包含非天然的產生PHA的基因。11.權利要求3的細菌，所述細菌包含非天然的產生PHA的基因。12.權利要求9的細菌，其中所述產生PHA的基因選自phaA、phaB或phaC基因。13.—種產生PHA的方法，所述方法使用的細菌能夠(a)在不限制營養(yǎng)素水平的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少10%的聚羥基鏈烷酸(PHA)，和(b)在限制鐵但不顯著限制其它營養(yǎng)素的培養(yǎng)條件下，以細胞干重計，產生至少20。/。的PHA，其中所述細菌不包括廣泛產堿，菌和具有NADH氧化酶突變的維涅蘭德固氮菌突變體，所述方法包括所述細菌在培養(yǎng)基中生長的步驟，以使所述細菌產生PHA。14.一種產生PHA的方法，所述方法使用的細菌顯示以ATCC保藏號PTA-6759保藏的細菌的所有鑒別特征，所述方法包括所述細菌在培養(yǎng)基中生長的步驟，以使所述細菌產生PHA。15.—種產生PHA的方法，所述方法使用的細菌顯示以ATCC保藏號PTA-6760保藏的細菌的所有鑒別特征，所述方法包括所述細菌在培養(yǎng)基中生長的步驟，以使所述細菌產生PHA。16.權利要求13的方法，其中所述細菌在不限制必需營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。17.權利要求16的方法，所述方法還包括在限制一種或多種無機元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細菌的步驟。18.權利要求17的方法，其中所述受限制的元素為鐵。19.權利要求13的方法，其中所述培養(yǎng)基包含植物油。20.權利要求14的方法，其中所述培養(yǎng)基包含植物油。全文摘要提供具有改良的聚-3-羥基鏈烷酸(PHA)產生特性的突變細菌和產生及使用它們的方法。文檔編號C12N15/74GK101300354SQ200680041297公開日2008年11月5日申請日期2006年9月8日優(yōu)先權日2005年9月8日發(fā)明者P·R·格林,R·I·約翰遜,S·A·鄧申請人:梅雷迪安公司