專利名稱：用于檢測(cè)沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的納米金試紙及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病的檢測(cè)裝置領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)沙眼衣原體感染的試紙。
背景技術(shù)：
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, Ct)具有獨(dú)特的發(fā)育周期，有原體 (Elementary Body)和網(wǎng)狀體(Reticulate Body)兩種形式。其獨(dú)特的生命周期是原體感染細(xì)胞發(fā)育為網(wǎng)狀體，網(wǎng)狀體再分裂為原體釋放，進(jìn)而再次感染細(xì)胞的循環(huán)過(guò)程。Ct是一種在人體內(nèi)長(zhǎng)期生存并又廣泛傳播的病原體，是我國(guó)性傳播疾病(sexually transmitted diseases, STDs)的主要病原之一，它在一定條件下能引起異位妊娠、早產(chǎn)、流產(chǎn)及尿道感染等多種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，Ct感染尚與許多自身免疫疾病發(fā)病有關(guān)，如衣原體感染后可引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征等。A、B、C或Ba抗原型Ct感染還可導(dǎo)致一種致盲性慢性傳染性結(jié)膜角膜炎，即沙眼。 發(fā)展中國(guó)家常見，多發(fā)于兒童及少年時(shí)期，潛伏期為5 14天。病情發(fā)展后出現(xiàn)流淚、畏光、癢澀感、異物感、燒灼感和干燥感等癥狀，分泌物粘稠、結(jié)膜充血顯著、乳頭增生、濾泡形成或瘢痕形成。嚴(yán)重者可引起諸多后遺癥與并發(fā)癥，如瞼內(nèi)翻及倒睫、瞼球粘連、實(shí)質(zhì)性角結(jié)膜干燥癥、慢性淚囊炎和角膜潰瘍等，導(dǎo)致視力受損，反復(fù)發(fā)作最終致盲。典型的沙眼在臨床上容易診斷，輕型早期病例則較困難，易與其他結(jié)膜病相混淆，需要借助特殊儀器及多年臨床經(jīng)驗(yàn)才能正確的診斷。實(shí)驗(yàn)室檢查有助于確立沙眼的診斷，如結(jié)膜刮片后行Giemsa 染色可見沙眼包涵體，或用熒光抗體染色、酶聯(lián)免疫測(cè)定、聚合酶鏈反應(yīng)等方法檢測(cè)到沙眼衣原體抗原等。但這些方法需要特殊儀器和專業(yè)人員，且操作復(fù)雜、耗時(shí)，費(fèi)用昂貴，不能滿足準(zhǔn)確、靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)的檢查要求。Ct 主要夕卜膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)具有 5 個(gè)保守區(qū)禾口 4 個(gè)可變區(qū)。由于其保守結(jié)構(gòu)和好的免疫原性，MOMP是檢測(cè)Ct的最理想的抗原之一。目前市面上只有檢測(cè)Ct MOMP的ELISA試劑盒出售，未見有檢測(cè)Ct MOMP的納米金快速檢測(cè)試紙報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種納米金試紙，該試紙可用于檢測(cè)沙眼衣原體MOMP 抗原。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
由底板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，硝酸纖維素膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線由濃度大于或等于lmg/mL的抗體II包被而成，質(zhì)控線由濃度大于或等于1. 5mg/mL的羊抗鼠IgG多克隆抗體包被而成；所述結(jié)合墊由濃度大于或等于6Pg/mL抗體I包被而成，所述抗體II為沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG，所述抗體I為納米金標(biāo)記的沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG，所述抗體I和所述抗體II的效價(jià)均為1:200000。本發(fā)明的目的之二在于提供一種用于檢測(cè)沙眼衣原體MOMP抗原的納米金試紙的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單，適用于大規(guī)模應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為 所述的納米金試紙的制備方法，具體步驟為 a硝酸纖維素膜和結(jié)合墊的處理
將濃度大于或等于lmg/mL的抗體II噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線，將濃度大于或等于1. 5mg/mL的羊抗鼠IgG多克隆抗體噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，干燥后得含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；將玻璃纖維素膜浸于濃度大于或等于6Pg/mL的抗體 I中，干燥后得結(jié)合墊；
b納米金免疫層析試紙的組裝
分別將樣品墊、結(jié)合墊、含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘在所述底板上，得用于檢測(cè)沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原的納米金試紙，所述硝酸纖維素膜上所述質(zhì)控線靠近吸收墊端，所述檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端。所述的納米金試紙的制備方法，所述檢測(cè)線與質(zhì)控線的距離為0. 8厘米，所述檢測(cè)線與質(zhì)控線距硝酸纖維素膜的邊距分別為0. 85厘米。所述的納米金試紙的制備方法，步驟a中，將濃度為lmg/mL的抗體II噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線，將濃度為1. 5mg/mL的羊抗鼠多克隆抗體噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，并在37°C干燥1小時(shí)，得含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜。所述的納米金試紙的制備方法，步驟a中，將玻璃纖維素膜浸于濃度大于或等于 6Pg/mL的抗體I中，并在37°C干燥4小時(shí)后得結(jié)合墊。本發(fā)明的目的之三在于提供一種所述的納米金試紙的新應(yīng)用，該應(yīng)用為檢測(cè)沙眼衣原體MOMP抗原提供了新的途徑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述的納米金試紙?jiān)跈z測(cè)沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四在于提供沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆抗體I和抗體II 的聯(lián)合運(yùn)用，該運(yùn)用為制備特異性和敏感性佳的檢測(cè)試紙?zhí)峁┝诵滤悸贰？贵wI和抗體II的配對(duì)在制備檢測(cè)沙眼衣原體納米金試紙的試劑中的應(yīng)用，所述抗體I為納米金標(biāo)記的沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG，所述抗體 II為沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG。本發(fā)明的有益效果在于用于檢測(cè)沙眼衣原體MOMP抗原的納米金試紙，沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆抗體I和抗體II配對(duì)，通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)抗體
納米金標(biāo)記條件及捕獲抗體II的用量及試紙的干燥條件，研制的試紙?jiān)?分鐘內(nèi)檢測(cè)出結(jié)
果，特異性高、靈敏度好。與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相比，用于檢測(cè)沙眼衣原體MOMP抗原的納米金快速檢測(cè)試紙具有無(wú)需特殊儀器和設(shè)施，無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快，操作簡(jiǎn)單方便，檢測(cè)條件無(wú)特殊要求，顯色穩(wěn)定，試紙易于長(zhǎng)期保存，以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于沙眼衣原體感染的臨床診斷和普查、自查，可為沙眼衣原體感染的及時(shí)對(duì)癥治療贏取寶貴時(shí)間，并極大地減輕社會(huì)和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，有著良好的應(yīng)用前景。試紙檢測(cè)沙眼衣原體 MOMP的靈敏度為0. lng/ml，檢測(cè)值范圍0-200ng/ml，特異性為98. 5% ；5分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。


圖1為本發(fā)明檢測(cè)沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的納米金試紙的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為圖1沿A-A向剖視圖。
具體實(shí)施例方式1試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備
沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆抗體IgG (抗體II)，貨號(hào)C55180M，由Biodesign 公司生產(chǎn)，效價(jià)為1:200000 ；羊抗鼠多克隆抗體(羊抗鼠多克隆抗體)，貨號(hào)101-0301，天津生物科技有限公司生產(chǎn)；所述沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆抗體IgG (抗體I )，貨號(hào) C55135M，效價(jià)為 1:200000，由 Biodesign 公司生產(chǎn)。2納米金試紙的制備方法
(1)硝酸纖維素膜和結(jié)合墊的預(yù)處理
將濃度大于或等于lmg/mL的沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆抗體II用XYZ-3000 三維噴點(diǎn)儀噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線，將濃度大于或等于1. 5mg/mL的羊抗鼠多克隆抗體(101-0301蛋白抗體)用XYZ-3000三維噴點(diǎn)儀噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，噴涂了抗體的硝酸纖維素膜在37°C封閉、洗滌并干燥lh，得復(fù)合硝酸纖維素膜；將玻璃纖維素膜浸于納米金標(biāo)記濃度大于或等于6Pg/mL的沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆抗體I中，在37°C干燥4h后得復(fù)合結(jié)合墊；
(2)納米金免疫層析試紙的組裝
分別將樣品墊、復(fù)合結(jié)合墊、復(fù)合硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘在所述底板上，得用于檢測(cè)沙眼衣原體MOMP抗原的納米金試紙，所述復(fù)合硝酸纖維素膜上所述質(zhì)控線靠近吸收墊端，所述檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端。用LN-5000切割機(jī)切割成0. 4cm寬的試紙條，將其裝入塑料盒中，密封包裝，內(nèi)置干燥劑，4°C保存。如圖1和圖2所示，本實(shí)施例的用于檢測(cè)沙眼衣原體MOMP抗原的納米金試紙，包括背襯7和依次固定設(shè)置在背襯上的樣品墊1、結(jié)合墊2、檢測(cè)墊3和吸收墊6 ；背襯7為一面涂有不干膠的聚氯乙烯(PVC)板，樣品墊1和結(jié)合墊2為玻璃纖維素膜，檢測(cè)墊3為硝酸纖維素膜，吸收墊6為吸水濾紙；檢測(cè)墊3貼附于背襯7涂有不干膠的一面上，結(jié)合墊2位于檢測(cè)墊3上部與其部分重疊，吸收墊6位于檢測(cè)墊3上部與其部分重疊，樣品墊1位于結(jié)合墊2上部與其部分重疊，采用此結(jié)構(gòu)，可以使檢測(cè)試紙具有較好的層析效果，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，檢測(cè)快速；檢測(cè)墊3上橫向設(shè)置有抗沙眼衣原體MOMP的單克隆抗體II檢測(cè)線 4，檢測(cè)墊3上位于吸收墊6側(cè)與檢測(cè)線4間隔并列設(shè)置有多克隆抗體質(zhì)控線5 ；結(jié)合墊2上設(shè)置有納米金標(biāo)記的抗沙眼衣原體MOMP的單克隆抗體I結(jié)合層8。本實(shí)施例中，所述檢測(cè)線與質(zhì)控線的距離為0. 8厘米，所述檢測(cè)線與質(zhì)控線距硝酸纖維素膜的邊距分別為0. 85厘米。當(dāng)然，設(shè)置為其他距離同樣可以實(shí)現(xiàn)。3納米金試紙的原理和結(jié)果判定(1)納米金試紙的原理和測(cè)試方法
將抗體II包被于檢測(cè)線，羊抗鼠多克隆抗體包被于質(zhì)控線；玻璃纖維素膜浸于抗體I 中，得結(jié)合墊。使用時(shí)，將檢測(cè)試紙的樣品墊端放入待檢標(biāo)本中，標(biāo)本被樣品墊吸收并通過(guò)毛細(xì)作用向檢測(cè)試紙的吸收墊端層析，當(dāng)上移到結(jié)合墊時(shí)，如果標(biāo)本溶液中含有沙眼衣原體 MOMP抗原，其可與納米金標(biāo)記的抗體I發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，該復(fù)合物繼續(xù)上移，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)墊上的檢測(cè)線時(shí)，沙眼衣原體MOMP抗原的另一結(jié)合位點(diǎn)可與抗體II 發(fā)生特異性結(jié)合，形成“抗體-抗原-抗體”雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，從而使納米金聚集在檢測(cè)線上，使檢測(cè)線顯紅色，多余的未與沙眼衣原體MOMP抗原結(jié)合的抗體I則繼續(xù)上移，到達(dá)質(zhì)控線時(shí)，與多克隆抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，從而使納米金聚集在質(zhì)控線上，使質(zhì)控線顯紅色，因此，當(dāng)檢測(cè)試紙上的檢測(cè)線與質(zhì)控線均顯紅色時(shí)，判為陽(yáng)性結(jié)果；反之，如果標(biāo)本溶液中不含有沙眼衣原體MOMP抗原，則在檢測(cè)線處，不能形成“抗體-抗原-抗體”雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，檢測(cè)線不顯紅色，而納米金標(biāo)記的抗沙眼衣原體MOMP的單克隆抗體I上移到質(zhì)控線處，可形成抗原-抗體復(fù)合物，使質(zhì)控線顯紅色，因此，當(dāng)檢測(cè)試紙上的檢測(cè)線不顯紅色而質(zhì)控線顯紅色時(shí)，判為陰性結(jié)果；當(dāng)檢測(cè)試紙的質(zhì)控線不顯紅色時(shí)，不管檢測(cè)線是否顯紅色，結(jié)果都判為操作失誤或檢測(cè)試紙失效，需重新檢測(cè)。(2)抗體配對(duì)的篩選
根據(jù)上述“納米金試紙的制備方法”及“納米金試紙的原理和測(cè)試方法”，分別采用了 Biodesign公司生產(chǎn)的貨號(hào)為C55i;35M (抗體I )、C86818M及C55180M (抗體II)進(jìn)行抗體配對(duì)，具體為
A抗體C55135M標(biāo)記在納米金上，抗體C55180M噴涂在硝酸纖維素膜上，兩者配對(duì)的靈敏度和特異性好。B將C55180M標(biāo)記在納米金上，C55135M噴涂在硝酸纖維素膜上，靈敏度較A降低 30%。C將抗體C55135M標(biāo)記在納米金上，抗體C86818M噴涂在硝酸纖維素膜上，或者反之均未配對(duì)成功。D將抗體C55180M標(biāo)記在納米金上，抗體C86818M噴涂在硝酸纖維素膜上，或者反之均未配對(duì)成功。另外，將Biodesign公司生產(chǎn)的上述3個(gè)抗體，分別與Santa Cruz Biotechnology, Inc.公司生產(chǎn)的sc_708M配對(duì)均未成功。4效果評(píng)定 (1)敏感性試驗(yàn)
將陽(yáng)性標(biāo)本作梯度稀釋，用上述“納米金試紙的原理和測(cè)試方法”進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)本中的沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的濃度為0. lng/ml時(shí)和 200ng/ml均可見兩條清晰的紅色條帶；當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)本中的沙眼衣原體MOMP抗原的濃度小于 0. lng/ml或大于200ng/ml時(shí)，僅可見C線出現(xiàn)清晰的紅色條帶。表明此方法能夠檢出MOMP 抗原的濃度為0. lng/ml時(shí)的陽(yáng)性標(biāo)本，檢測(cè)值范圍0-200ng/ml，具有較強(qiáng)的敏感性。(2)特異性試驗(yàn)
用上述“納米金試紙的原理和測(cè)試方法”進(jìn)行檢測(cè)，分別檢測(cè)單純皰疹病毒(HSV)、人乳
6頭瘤病毒(HPV)、生殖道支原體(⑶)、奈瑟淋病雙球菌(NG)陽(yáng)性血清，結(jié)果顯示僅沙眼衣原體陽(yáng)性血清可見兩條清晰的紅色條帶，其它血清均僅在C線處出現(xiàn)一條清晰的紅色條帶， 表明本試紙具有很好的特異性，其特異性為98. 5%。( 3)干燥時(shí)間和溫度對(duì)檢測(cè)時(shí)間的影響
硝酸纖維素膜在4°C冷凍干燥Ih和37°C干燥Ih檢測(cè)時(shí)間無(wú)顯著差異，5min內(nèi)出檢測(cè)結(jié)果。結(jié)合墊在4°C冷凍干燥4h，與37°C干燥4h，金的釋放程度和速度前者較后者好，但無(wú)顯著差異，5min內(nèi)出檢測(cè)結(jié)果。從降低成本角度考慮，選擇37°C作為硝酸纖維素膜和結(jié)合墊干燥時(shí)間。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的納米金試紙，由底板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，硝酸纖維素膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線由濃度大于或等于lrng/mL的抗體II包被而成，質(zhì)控線由濃度大于或等于 1. 5mg/mL的羊抗鼠IgG多克隆抗體包被而成；所述結(jié)合墊由濃度大于或等于6Pg/mL抗體 I包被而成，所述抗體II為沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG，所述抗體I為納米金標(biāo)記的沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG，所述抗體 I和所述抗體II的效價(jià)均為1 200000。
2.權(quán)利要求1所述的納米金試紙的制備方法，其特征在于具體步驟為a硝酸纖維素膜和結(jié)合墊的處理將濃度大于或等于lmg/mL的抗體II噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線，將濃度大于或等于1. 5mg/mL的羊抗鼠IgG多克隆抗體噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，干燥后得含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；將玻璃纖維素膜浸于濃度大于或等于6Pg/mL的抗體 I中，干燥后得結(jié)合墊；b納米金免疫層析試紙的組裝分別將樣品墊、結(jié)合墊、含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘在所述底板上，得用于檢測(cè)沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原的納米金試紙，所述硝酸纖維素膜上所述質(zhì)控線靠近吸收墊端，所述檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米金試紙的制備方法，其特征在于所述檢測(cè)線與質(zhì)控線的距離為0. 8厘米，所述檢測(cè)線與質(zhì)控線距硝酸纖維素膜的邊距分別為0. 85厘米。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米金試紙的制備方法，其特征在于步驟a中，將濃度為 lmg/mL的抗體II噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線，將濃度為1. 5mg/mL的羊抗鼠多克隆抗體噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，并在37°C干燥1小時(shí)，得含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米金試紙的制備方法，其特征在于步驟a中，將玻璃纖維素膜浸于濃度大于或等于6Pg/mL的抗體I中，并在37°C干燥4小時(shí)得結(jié)合墊。
6.權(quán)利要求1所述的納米金試紙?jiān)跈z測(cè)沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原中的應(yīng)用。
7.抗體I和抗體II的配對(duì)在制備檢測(cè)沙眼衣原體納米金試紙的試劑中的應(yīng)用，所述抗體I為納米金標(biāo)記的沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG，所述抗體II 為沙眼衣原體檢測(cè)沙眼衣原體抗原鼠抗人單克隆抗體IgG。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)沙眼衣原體感染的試紙，由底板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，硝酸纖維素膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線由濃度大于或等于1mg/mL的沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原鼠抗人單克隆蛋白抗體IgG(抗體Ⅱ)包被而成，質(zhì)控線由濃度大于或等于1.5mg/mL的羊抗鼠IgG多克隆抗體包被而成；所述結(jié)合墊由濃度≥6μg/mL納米金標(biāo)記的沙眼衣原體MOMP抗原鼠抗人單克隆蛋白抗體IgG(抗體Ⅰ)包被而成；試紙檢測(cè)沙眼衣原體MOMP的靈敏度為0.1ng/ml，檢測(cè)值范圍0-200ng/ml，特異性為98.5%；5分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102411055SQ201110219629
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者方立超, 李艷, 程平, 蔣麗莉, 賀娟, 鄧均, 鄭峻松, 黃輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)