專利名稱：：熱穩(wěn)定的木糖異構(gòu)酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及熱穩(wěn)定的木糖異構(gòu)酶、以及編碼這種酶的多核苷酸序列及其用途。
背景技術(shù)：
：;Mt異構(gòu)酶(EC5.3.1.5)是在體內(nèi)催化從D-;Mt到D-木酮糖的可逆異構(gòu)化的酶。此外，它能夠在體外催化從D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖，因此也可稱為"葡萄糖異構(gòu)酶"。這后一種活性在工業(yè)中可用于生產(chǎn)高^(guò)t玉iMt漿(highfructosecornsyrups，HFCS)。含有55%或更多果糖的HFCS具有比蔗糖更高的增甜力(sweeteningpower)。因此在食品和飲料工業(yè)中對(duì)于這樣的糖漿有著重要需求，隨著HFCS市場(chǎng)的增長(zhǎng)，對(duì)更有效的^Mt異構(gòu)酶的需求也在增長(zhǎng)。通常，商品化木糖異構(gòu)酶的最適pH范圍是約7.5到約9.0。這把葡萄糖異構(gòu)化過(guò)程中所使用的反應(yīng)溫度限制在約60匸。高于此溫度，由于在還原糖和蛋白之間發(fā)生非酶促反應(yīng)(例如美拉德反應(yīng))，所以形成不希望的褐變產(chǎn)物。令人遺憾的是，此溫度限制不利于高的葡萄糖轉(zhuǎn)化率。事實(shí)上，葡萄糖的異構(gòu)化達(dá)到一種平衡，其在較高溫度下朝果糖方向偏移(Tewari，etal.(1984)J.Solut.Chem.13,523-547)。在60*€時(shí)，生產(chǎn)出只含有約40。/。果糖的糖漿。為了生產(chǎn)具有更高果糖濃度的HFCS，需要另外的色鐠步驟。顯然，希望消除此額外步驟。在較高溫度(例如90-95"C)下進(jìn)行異構(gòu)化會(huì)帶來(lái)HFCS中較高的果糖濃度。有利地是，它還可導(dǎo)致更快的反應(yīng)速率，更高的過(guò)程穩(wěn)定性，降低底物和產(chǎn)物流的粘度，減少微生物污染和更少有形成副產(chǎn)物的問(wèn)題。但令人遺憾的是，大部分商品化木糖異構(gòu)酶在這樣的高溫下不穩(wěn)定。已經(jīng)嘗試獲得熱穩(wěn)定木糖異構(gòu)酶，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或者通過(guò)篩選高度嗜熱生物的木糖異構(gòu)酶活性。例如，US5656497和WO03/062387描述了從高度嗜熱的微生物新阿波羅棲熱袍菌(TT^iTMoto^iwefl/w//to"fl)中分離木糖異構(gòu)酶。來(lái)自新阿波羅棲熱袍菌的;MI異構(gòu)酶在97"C下顯示出活性。但是它們的活性在卯1C下2小時(shí)后降低到只有40%，它們的最適pH仍然很高(高于7)。作為另一個(gè)例子，WO2004/044129確認(rèn)了對(duì)高溫和低pH下保持高水平活性的木糖異構(gòu)酶的需要。參考圖6-9中所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見(jiàn)此文獻(xiàn)中>^開(kāi)的肽只在pH高于5時(shí)具有最佳活性(見(jiàn)圖6B和6D)，在高于卯匸時(shí)不穩(wěn)定(見(jiàn)圖8B和8D;分別在1小時(shí)后和30分鐘后喪失50%的活性)。另夕卜，為了保持高水平活性，這些酶需要鈷(Co2+)的存在作為輔助因子(見(jiàn)圖9A和9B)。令人遺憾的是，不推薦C用于生產(chǎn)供人消費(fèi)的^瞎糖漿。不僅僅是其與一些可能的健康問(wèn)題相關(guān)，而且其使用后培養(yǎng)基的處理還可造成環(huán)境污染。對(duì)特定離子的需要通常取決于木糖異構(gòu)酶的來(lái)源。因此，來(lái)自嗜熱菌種類例如新阿波羅棲熱袍菌和海棲熱袍菌(77^/7MOtogflm"/^/附fl)的基因編碼的;MI異構(gòu)酶通常需要Co2+。在食品相關(guān)的應(yīng)用中Co"的可能替代物包括Mn"和Mg2+。但是，這些通常只在與來(lái)自非嗜熱或輕微嗜熱生物的酶組合時(shí)是有效的。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)Co"與Mn"或Mg"的作用是不可互換的。換句話說(shuō)，特定來(lái)源的木糖異構(gòu)酶的活化只在天然相關(guān)的輔助因子存在下是可能的(Callens，etal.(1986)EnzymeMicrob.Technol.8，696-700;Callens,etal.(1988)EnzymeMicrob.Technol.10，675-700;和Gaikward，etal.(1992)EnzymeMicrob.Technol.14，317-320)。因此，理想情況下，適用于食品工業(yè)的木糖異構(gòu)酶應(yīng)在酸性條件下(即pH約為6或更低)工作以避免褐變反應(yīng)；其應(yīng)在較高>^應(yīng)溫度下(即85X:或更高)保持穩(wěn)定以有益于果糖的形成；應(yīng)不需要使用可能有害的輔助因子例如Co2+;以及應(yīng)高水平表達(dá)以利于生產(chǎn)和降低成本。本發(fā)明的目的^^1_供這樣的酶。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了分離的多肽，特征在于其包含與選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22的序列在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80。/。一致性的M酸序列，以及所述多肽的片段和變體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分離的多核苷酸，特征在于其包含與選自SEQIDNO1、SEQIDNO19和SEQIDNO20的序列在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80%—致性的核苦酸序列，以及所述多核普酸的片段和變體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了表達(dá)栽體，特征在于其包含如上所定義的多核苷酸；還提供了重組宿主細(xì)胞，其包含這種栽體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供生產(chǎn)如上定義之多肽的方法，其包括在足以生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞的步驟以及從培養(yǎng)基中回收所述多肽的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供選擇性結(jié)合如上定義之多肽的抗體。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供生產(chǎn)果糖糖漿的方法，其包括在有效將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的條件下使含有葡萄糖的組合物與如上定義之多肽接觸；還提供可根據(jù)所述方法獲得的果糖糖漿。圖1.以葡萄糖為底物在不同pH和不同離子輔因子存在下對(duì)木糖異構(gòu)酶活性的比較。將SM-1突變體的表達(dá)與從野生型(Spl、Sp2+Sp5)中克隆得到的基因的表達(dá)以及與通過(guò)隨機(jī)誘變產(chǎn)生的其它突變體(l、2、6、16、27+37)表達(dá)進(jìn)行比較(在相同誘導(dǎo)條件下)。在1mMIPTG誘導(dǎo)后，克隆進(jìn)pET22b(+)的基因在BL21Star(DE3)細(xì)胞中表達(dá)。圖2.以葡萄糖為底物在pH6.85的馬來(lái)酸緩沖液中，存在Mg^和Co"的情況下，對(duì)木糖異構(gòu)酶活性的比較。在lmMIPTG誘導(dǎo)后，來(lái)自不同野生型(Spl至Sp8)克隆進(jìn)pET22b(+)的基因在BL21Star(DE3)細(xì)胞中表達(dá)。圖3.SM-1突變體和市售GENSWEETSGI;MI異構(gòu)酶之間熱穩(wěn)定性的比較。在表達(dá)誘導(dǎo)和熱處理(951C30分鐘，板的上部)之后，用葡萄糖作為底物在pH6.85(馬來(lái)酸緩沖液)在Mg"+和Co2+存在下進(jìn)行測(cè)試。制備多個(gè)稀釋度。不作熱處理重復(fù)進(jìn)行測(cè)試作為對(duì)照。這些結(jié)果顯示于板的下半部分。圖4.來(lái)自SM-2突變體的總蛋白質(zhì)提取物的系列稀釋物與來(lái)自Sp2的總蛋白質(zhì)提取物(n.d.-未稀釋;2、4和8是稀釋倍數(shù))在PAGE凝膠上進(jìn)行比較。所有總蛋白質(zhì)提取物在1mMIPTG誘導(dǎo)后獲得。對(duì)應(yīng)于木糖異構(gòu)酶(XIso)的蛋白質(zhì)條帶由箭頭指示。圖5.PAGE^i^，顯示染色后的酶表達(dá)(SM-1、SM-2、Spl、Sp2)(左)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化后的稀釋結(jié)果(右)。圖6.SM-1和SM-2突變體以及Spl和Sp2林在90匸在0到180分鐘的熱穩(wěn)定性比較。發(fā)明詳述介紹本發(fā)明的目的，如上所述，是提供適用于工業(yè)化或商品化生產(chǎn)果糖糖漿的熱穩(wěn)定;Mt異構(gòu)酶(xyloseisomerase,xyloseisomeraseenzyme)。本文所用術(shù)語(yǔ)"熱穩(wěn)定"指當(dāng)暴露于高于60C的溫度2個(gè)小時(shí)仍保持至少40%活性的酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的;Mt異構(gòu)酶在60n到iiox:的溫度范圍中保持穩(wěn)定，更優(yōu)選地，在8ox:到ioo"c的溫度范圍中保持穩(wěn)定。因此其也可稱為"超熱穩(wěn)定"酶。本發(fā)明的酶優(yōu)選地在酸性條件下也是穩(wěn)定的。這意味著當(dāng)它們?cè)诟邷叵陆佑|低于8的pH值2小時(shí)仍應(yīng)保持至少40%的活性。優(yōu)選地，所述酶在pH4.5到8的范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在5到7的范圍內(nèi)、甚至更優(yōu)選在5到6的范圍內(nèi)保#^1定。另外，本發(fā)明的酶優(yōu)選地不需要存在鈷離子作為果糖生產(chǎn)的輔助因子。更優(yōu)選地，它們能夠只4吏用Mn"和/或Mg"作為輔助因子將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖。最后，當(dāng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組:技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，本發(fā)明的酶優(yōu)選以與其它已知木糖異構(gòu)酶等價(jià)或更高的水平表達(dá)。如權(quán)利要求中所定義的以及下文詳細(xì)描述的多肽和多核苷酸滿足了本發(fā)明的這些目的。多肽在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了木糖異構(gòu)酶多肽(本文也稱為木糖異構(gòu)酶)，以及其生物學(xué)、工業(yè)和商業(yè)有用的片段和變體，以及包含其的組合物。本文所用術(shù)語(yǔ)"多肽"指任何大于10個(gè)、優(yōu)選大于100個(gè)M酸的肽鏈，不論其處于非折疊、部分折疊還是完全折疊的狀態(tài)。完全折疊的多M可稱為"成熟"多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽可以是"獨(dú)立的"或者可以是更大蛋白質(zhì)(例如前體或融合蛋白)的一部分。實(shí)際上包括另外的M酸序列可以是有利的，所述另外的序列^^有分泌或先導(dǎo)序列、輔助純化的序列(例如多組氨酸戎基)或用于在重組生產(chǎn)中保#^、定的另外序列。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供分離的多肽，其包含以下部分或由其組成(a)與選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22的M酸序列在其整個(gè)長(zhǎng)度上具有至少80%—致性、優(yōu)選至少85%一致性、更優(yōu)選至少卯％—致性、更優(yōu)選至少95%—致性、更優(yōu)選至少97%—致性、更優(yōu)選至少99%—致性以及最優(yōu)選完全一致的氨基酸序列；(b)由下述分離多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與選自SEQIDNO1、SEQIDNO19和SEQIDNO20的核苷,列在其整個(gè)長(zhǎng)度上具有至少80%—致性、優(yōu)選至少85%—致性、更優(yōu)選至少卯％—致性、更優(yōu)選至少95%—致性、更優(yōu)選至少97%—致性、更優(yōu)選至少99%—致性以及最優(yōu)選完全一致的核苷酸序列；或(c)由下述分離多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與編碼根據(jù)(a)之多肽的核苷酸序列在其整個(gè)長(zhǎng)度上具有至少80%—致性、優(yōu)選至少85%—致性、更優(yōu)選至少90%—致性、更優(yōu)選至少95%一致性、更優(yōu)選至少97%—致性、更優(yōu)選至少99%—致性以及最優(yōu)選完全一致的核普酸序列。義之多肽的變體，在本文中，術(shù)語(yǔ)"變體"指通過(guò)替換、缺失和/或添加至少一個(gè)氨基酸而不同于參考多肽但保留其必要特性的多肽。一般來(lái)說(shuō)，差異限于使得參考多肽的序列與變體的序列整體上非常類似，在許多情況下，具有完全一致的大區(qū)域。才艮據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選變體具有與參考多肽相似或相同的功能特征，例如僅包含沉默替換、添加或缺失的變體。舉例來(lái)說(shuō)，優(yōu)選變體可包含保守性M酸替換，其中一個(gè)殘基被另一個(gè)具有相似特征的殘基取代。這種替換的例子包括Ala、Val、Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；堿性殘基Lys和Arg之間；以及^香殘基Phe和Tyr之間的改變。本發(fā)明還涉及任何上述多肽的片段。片段是具有與參考多肽的部分(但不是全部)M斷列完全相同之M^列的多肽。片段可以是"獨(dú)立的"，或包含在更大的多肽中，以形成其部分或區(qū)域。典型片段的例子包括截短型多肽、由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或者在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的降解多肽、以及具有結(jié)構(gòu)或功能特征的片段(例如包含a螺旋、P片層、親水區(qū)、疏水區(qū)、底物結(jié)合區(qū)等的片段)。優(yōu)選地，本發(fā)明的片段是上文定義的任何多肽(或其變體)的片段，其包含至少50個(gè)、更優(yōu)選至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。理想地，它們能夠催化從葡萄糖到果糖的轉(zhuǎn)化。相對(duì)于具有選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22的M酸序列的成熟多肽，上文所述的同源物、變體和片段優(yōu)選保留至少20%、更優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少卯％、最優(yōu)選100°/。的葡萄糖異構(gòu)酶活性。本發(fā)明的多肽可以以任何合適方式制備，其包括例如，重組表達(dá)或合成生產(chǎn)。這樣的方法是本領(lǐng)域^^P的?？乖涂贵w本發(fā)明還涉及來(lái)源于上述多肽的抗原和能夠與其反應(yīng)的抗體?？乖?或"抗原性肽，，)是全長(zhǎng)多肽序列(例如多肽SEQIDN02、21或22)的片段，其包含至少6個(gè)、優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)連續(xù)氨基酸。它應(yīng)包括該序列的表位(即當(dāng)處于完全折疊狀態(tài)時(shí)位于多J!^面的序列的區(qū)域)，使得針對(duì)該片段的抗體能夠與全長(zhǎng)序列(或者與來(lái)自其并含有所i^位的任何序列或部分序列)形成特異性免疫復(fù)合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"指能夠特異性結(jié)合這類抗原的分子，即免疫球蛋白分子或者這類分子的免疫活性部分，其能夠與上文定義之抗原或包含這些抗原的多肽形成免疫復(fù)合物。它們可包括但不限于，多克隆、單克隆、嵌合和單鏈抗體，可使用許多公知技術(shù)中任一種來(lái)產(chǎn)生(例如標(biāo)準(zhǔn)多克隆或單克隆抗體制^^技術(shù))。多核苷酸在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了能夠編碼如上文所定義之木糖異構(gòu)酶的多核苷酸，以及所述多核苷酸的生物學(xué)、工業(yè)和商業(yè)有用的片段和變體，以及包含其的組合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"指含有至少10個(gè)、優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸堿基的任意核苷酸鏈.所述核苷酸堿基可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，因此所述多核苷酸可以是RNA或DNA分子(不論單鏈或雙鏈形式)。多核苷酸的例子包括但不限于，未加工RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因組DNA和合成DNA。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含以下部分或由其組成(a)與選自SEQIDNO1、SEQIDNO19和SEQIDNO20的多核苷酸序列在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80%—致性、優(yōu)選至少85%—致性、更優(yōu)選至少卯％—致性、更優(yōu)選至少95%—致性、更優(yōu)選至少97%—致性、更優(yōu)選至少99%—致性以及最優(yōu)選完全一致的多核苷酸序列；(b)編碼與選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22的^J^酸序列在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80。/。一致性、優(yōu)選至少85%—致性、更優(yōu)選至少90%—致性、更優(yōu)選至少95°/。一致性、更優(yōu)選至少97%—致性、更優(yōu)選至少99%—致性以及最優(yōu)選完全一致的多肽的核苷酸序列；(c)與(b)中定義之多核苷酸在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80%—致性、優(yōu)選至少85%—致性、更優(yōu)選至少90%—致性、更優(yōu)選至少95%—致性、更優(yōu)選至少97%—致性、更優(yōu)選至少99%—致性以及最優(yōu)選完全一致的核苷酸序列；或(d)與上文(a)-(c)中定義的任一多核苷酸互補(bǔ)、或雜交(優(yōu)選在嚴(yán)^fr下)的核香紗列。為了便于參考，由SEQIDNOl、19和20定義的多核苷酸序列表示為DNA序列。當(dāng)然應(yīng)理解，這些序列只代表本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述序列的其它形式(包括，例如，它們的RNA等價(jià)物)也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供編碼上文定義之任一多肽變體、多肽片段、前體或融合蛋白的多核苷酸。另外，本發(fā)明提供這些多核苷酸和上文(a)-(d)中定義之多核苷酸的變體和片段。在本文中術(shù)語(yǔ)"變體"指由于至少一個(gè)核苷酸的替換、缺失和/或添加而不同于參考多核苷酸但仍保持其必要特性的多核普酸。核苦酸序列的改變可以改變或者不改變(例如由于遺傳密碼的冗余)所編碼多肽的M酸序列。如果核苷酸序列的變化確實(shí)導(dǎo)致所編碼Jl&酸序列的改變，則此改變優(yōu)選將不影響所得多肽的功能特征(例如，所述改變將限于保守性JL&酸替換)。術(shù)語(yǔ)"片段"指具有與參考多核普酸的部分(但不是全部)核苷^列完全相同的核苷^列的多核苷酸。優(yōu)選的片段包含至少5個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)核普酸，僅僅作為舉例，其可用作鑒定或合成全長(zhǎng)多核苷酸序列的引物。以這種方式，有多種可用且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的獲得全長(zhǎng)多核苷酸序列的方法。所有上述多核苷酸可以是"獨(dú)立的"或它們可包含一個(gè)或多個(gè)另外的核苷酸序列。這些另外的序列可以是非編碼序列(例如rho依賴或非rho依賴型終止信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Kozak序列、增強(qiáng)子序列、mRNA穩(wěn)定序列、內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號(hào))。它們也可編碼另外的氨基酸(例如輔助最終多肽純化的標(biāo)記序列)。本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)任何合適方式制得，其包括，例如，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)或合成生產(chǎn)(例如通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)或基于核酸序列的擴(kuò)增(NucleicAcidSequence-basedAmplification,NASBA))。這些方法是本領(lǐng)域>{^的。載體、宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明的多肽可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員>^知的方法制備，所述方法尤其包括通過(guò)用適當(dāng)表達(dá)載體(即用包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體)遺傳^tit宿主細(xì)胞。因此，^JL明還提供(a)包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)栽體；(b)包含根據(jù)(a)a達(dá)載體的宿主細(xì)胞；和(c)通it4合適條件下培養(yǎng)根據(jù)(b)的宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。本文所用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"指適于維持、擴(kuò)增或表達(dá)特定多核苷酸序列和/或適于在選定宿主中表達(dá)特定多肽的任何載體。某些載體能夠在所述宿主中自主復(fù)制，而其它一些載體必須整合進(jìn)宿主并與其一同復(fù)制。通常，本發(fā)明的載體是克隆栽體，其含有必需調(diào)控區(qū)(例如誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子)以啟動(dòng)和調(diào)節(jié)所克隆多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯。所述載體優(yōu)選地還含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，其允許容易選擇已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(例如通過(guò)生物殺滅劑或病毒抗性或通過(guò)對(duì)重金屬的抗性)。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體可選自任意的本領(lǐng)域已知的大量適合載體。僅僅作為舉例，這些包括染色體、附加體和病毒來(lái)源的載體(例如來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒、來(lái)自噬菌體、來(lái)自轉(zhuǎn)座子、來(lái)自酵母染色體元件或來(lái)自病毒的栽體，所述病毒例如乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)以及來(lái)源于其組合的載體，例如來(lái)源于質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的栽體(例如粘粒和噬菌粒)。載體的選擇可取決于所用宿主的類型。優(yōu)選地，表達(dá)載體是質(zhì)粒。本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)多種公知常規(guī)技術(shù)中的任一種插入到所選擇的表達(dá)載體中(例如見(jiàn)下文SambrookJ.，F(xiàn)ritschE.FandManiatisT.(1989)"MolecularCloning:aLaboratoryManual"2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress(ISBN0國(guó)88989-509-8))?？赏ㄟ^(guò)多種公知方法中的任一種將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。僅僅作為舉例，這些方法包括磷酸鈞轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位(transvection)、顯微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、綴合(conjugation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕標(biāo)記(scrapeloading)、彈道導(dǎo)入(ballisticintroduction)和感染。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"用于指能夠接受、維持并增殖重組表達(dá)載體的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞適于大量生產(chǎn)重組多肽。合適宿主的例子包括(但不限于)細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、埃希氏菌屬、鏈霉菌屬、藍(lán)細(xì)菌和芽孢桿菌屬的細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母(克魯弗氏酵母屬(Kluveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、亞羅酵母屬(Yarrowia)、畢赤酵母屬(Pichia))的細(xì)胞，擔(dān)子菌(basidimycete)(念珠菌屬(Candida)、曲霉屬(Aspergillus)、頂孢霉屬(Acremonium)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、線黑粉酵母屬(Filibasidium)、鐮孢霉屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、大角間座殼屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、鏈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、棵節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子嚢菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和木霉屬(Trichoderma))的細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞例如果蠅屬(Dros叩hila)S2和灰翅夜蛾屬(Spodoptera)Sf9的細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；植物細(xì)胞例如棵子植物或被子植物細(xì)胞；和藻類細(xì)胞。這些細(xì)胞的培養(yǎng)物在許多保藏單位中是公眾可方便獲得的，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國(guó)微生物菌種保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ)、皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)、和農(nóng)業(yè)研究月良務(wù)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCentre,NRRL)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是細(xì)菌或真菌細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(五.CWZ)或枯草芽孢桿菌(5flci7/Mss"似/to)細(xì)胞。為了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽，在合適條件下培養(yǎng)如上文所定義的宿主細(xì)胞。合適條件的選擇顯然取決于所使用的宿主細(xì)胞，但是可包括，例如選擇合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和pH。對(duì)于每種類型的宿主細(xì)胞，合適的培養(yǎng)M是本領(lǐng)域中已經(jīng)建立的。僅僅作為舉例，所述細(xì)胞可培養(yǎng)于搖瓶中或者小規(guī)?；虼?，發(fā)酵罐中(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批和固態(tài)發(fā)酵罐)。根據(jù)一個(gè)替代實(shí)施方案，本發(fā)明的多肽還可例如ZubayG(Ann.Rev.Genet.7，267-287(1973))所i^體外翻譯?？捎萌我庖阎夹g(shù)實(shí)現(xiàn)所述多肽的回收和純化。這些包括離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)、色鐠和沉淀。如果所述多肽在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生并分泌1培養(yǎng)基，可直接從所述培養(yǎng)基中將其回收。如果所述多肽不分泌，可從細(xì)胞裂解物中將其回收。如果所述多肽在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(即體外)中產(chǎn)生，可直接從產(chǎn)生它的反應(yīng)混合物中回收。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在相同條件下生產(chǎn)時(shí)，本發(fā)明的多肽(尤其是SEQIDNO19和SEQIDNO20的多核普酸編碼的多肽)可以比從野生型新阿波羅棲熱袍菌(T7iw附oto^1中分離到的木糖異構(gòu)酶序列以高得多的水平表達(dá)。本發(fā)明的多肽，例如才艮據(jù)上述方法得到的那些多肽，可用于例如將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的工業(yè)中，因此可用于生產(chǎn)果糖糖漿。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于生產(chǎn)果糖糖漿的方法，其包括在使葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的有效條件下將含葡萄糖的組合物與上文所述多Abf目接觸的步驟。本發(fā)明的果糖糖漿優(yōu)選含有以重量計(jì)至少30%的果糖，更優(yōu)選至少40%的^#，更優(yōu)選至少50%的^#。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的果糖糖漿是高果糖玉米糖漿(HFCS)。高果糖玉米糖漿通常含有以重量計(jì)41-43%的果糖。優(yōu)選地，本發(fā)明的高果糖玉^J瞎?jié){含有以重量計(jì)至少50%、更優(yōu)選至少55%的^瞎。在上述方法中用作底物的含葡萄糖組合物可以是允許生產(chǎn)如上文所定義之果糖糖漿的任何含有足夠量葡萄糖的組合物，例如葡萄糖糖漿。但是優(yōu)選地，所述含葡萄糖組合物是包含至少90%、更優(yōu)選至少95。/。葡萄糖(以重量計(jì))的葡萄糖糖漿?？稍诒绢I(lǐng)域已建立的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下將葡萄糖轉(zhuǎn)化為^t。但是優(yōu)選地，在范圍是6or至iior、更優(yōu)選范圍是8ot;至ioon、更優(yōu)選范圍是85*C至951C的反應(yīng)溫度下進(jìn)行。所述反應(yīng)混合物的pH優(yōu)選范圍是4.5到8，更優(yōu)選5到7，更優(yōu)選5到6,最優(yōu)選5.2到5.7。除了所述多肽，所述反應(yīng)混合物還應(yīng)含有木糖異構(gòu)酶輔助因子。這優(yōu)選選自Mg2+、Mn"和其混合物。所述多肽可以是游離的(例如分批或連續(xù)加入)或是固定化的。根據(jù)上述方法獲得的果糖糖漿也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。它們可用于例如食品和飲料工業(yè)，用于生產(chǎn)蛋糕、焙烤產(chǎn)品、軟飲料和其它消費(fèi)品。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的產(chǎn)品和方法有許多優(yōu)點(diǎn)。以下是這些優(yōu)點(diǎn)的不完全列表-本發(fā)明的木糖異構(gòu)酶在高溫下穩(wěn)定；-其在低pH下穩(wěn)定；—其不需務(wù)使用有潛在危險(xiǎn)的輔助因子例如Co2+;一其對(duì)Mi^+有非常強(qiáng)的親和性；—其以與其它^異構(gòu)酶等價(jià)或更高的水平表達(dá)；—其允許產(chǎn)生高含量的果糖糖漿；-使用本發(fā)明的酶生產(chǎn)的果糖糖漿不需要進(jìn)一步純化(例如通過(guò)另外的色諳步驟)；-在葡萄糖轉(zhuǎn)化為^J瞎期間減少或消除了褐變反應(yīng)；-增加>^應(yīng)速率；-減少微生物污染；-等等。一般定義本文所用術(shù)語(yǔ)"一致性"指兩個(gè)或更多個(gè)多肽或多核苷酸序列之間的關(guān)系。具體地，它指這些序列之間的序列相關(guān)性程度。兩個(gè)序列之間的相關(guān)性程度(或"一致性百分?jǐn)?shù)")很容易通過(guò)已知方法使用廣泛可用的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行計(jì)算。一個(gè)這樣方法的例子是ClustalW方法，其可從www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html得到。為便于參考，具有特定程度一致性的序列在本文中被稱為"同源物"。在提到多核苷酸序列時(shí)，表述"在所述序列全部長(zhǎng)度上的一致性"指在該序列整個(gè)開(kāi)放讀碼框上與參考序列具有特定程度一致性的序列。術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"指可與參考序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸序列。"完全互補(bǔ)"序列是每個(gè)核酸威基都與其參考序列上對(duì)應(yīng)威基互補(bǔ)的序列(例如G對(duì)C和A對(duì)T)。對(duì)于雜交來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)*件"指雜交只在序列間有至少95%、優(yōu)選至少97。/。一致性的時(shí)^L發(fā)生。雜交M是本領(lǐng)域/^知的，例如見(jiàn)Sambrook，etal.(同上)。如本文所用的與多肽和多核苷酸相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"分離"是指從它們的天然或原始環(huán)境中改變和/或移出的化合物。例如，天然存在于活生物體中的多核苷酸或多肽不是"分離的"。但是，與其天然狀態(tài)下共同存在的材料分開(kāi)的相同多核苷酸或多肽被稱為"分離的"。另外，導(dǎo)入生物體(例如通過(guò)轉(zhuǎn)化或遺傳操作)的多核普酸或多肽是"分離的"，即使其仍然存在于所述生物中。本文所用的表述"編碼多肽的多核苷酸"指能夠編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，其或者是在單個(gè)連續(xù)區(qū)域中或者^(guò)1在不連續(xù)區(qū)域中(例如，由整合的謹(jǐn)菌體、整合的插入序列、整合的載體序列或整合的轉(zhuǎn)座子序列分隔開(kāi)的多核苷酸)，任選地還帶有其它的可含有編碼和/或非編碼序列的區(qū)域。通過(guò)下述實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)視作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。除非另外詳細(xì)描述，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施下述實(shí)施例，所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員iH^且常規(guī)的。實(shí)施例l.合適的木糖異構(gòu)酶多核苷酸序列的鑒定介紹實(shí)施下述步驟以產(chǎn)生能夠編碼適于工業(yè)應(yīng)用的木糖異構(gòu)酶的多核苷酸序列(i)將從新阿波羅棲熱袍菌(r/renif/i^r/w//towfl)(DSM-5068)和高溫厭氧芽^f菌(T7iei7MOfliM^ra6fl"eWw附sp.)(DSM-8685)的木糖異構(gòu)酶基因木糖異構(gòu)酶基因獲得的重組嵌合體形式的突變克隆入合適質(zhì)粒表達(dá)載體中，并將此栽體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的模式菌林中；(ii)使用來(lái)自許多野生型菌林(Spl到Sp8)的;Mt異構(gòu)酶基因重復(fù)步驟(i)。這些菌株包括其;Mt異構(gòu)酶基因序列被用做產(chǎn)生步驟(i)嵌M基礎(chǔ)的菌林(分別為Sp2和Spl)。(m)比較步驟(i)的嵌合突變體酶和步驟(ii)的野生型;MI異構(gòu)酶的表達(dá)和活性?；钚苑矫?，所述比較集中于在高溫、低pH和存在Co"、Mg"和Mi^+離子(單獨(dú)或組合)的情況下從葡萄糖糖漿向^t糖漿的轉(zhuǎn)化。(iv)確定嵌合突變體;Mt異構(gòu)酶基因的核苷酸序列，并預(yù)測(cè)其對(duì)應(yīng)的M酸序列；(v)進(jìn)行多輪隨機(jī)誘變以提高步驟(i)的嵌合突變體;Mt異構(gòu)酶的特性；(vi)表達(dá)新的突變體，針對(duì)所期望特性進(jìn)行篩選；(vii)確定新選擇的突變體木糖異構(gòu)酶基因的核苷酸序列，推導(dǎo)其所編碼酶的Jl&酸序列。材料和方法木糖異構(gòu)酶基因的細(xì)菌野生型來(lái)源從DSMZ(DeutscheSammlungvonMicroorganismenundZellkulturenGmbH,Braunschweig,Germany)購(gòu)買(mǎi)下述菌林高溫厭氧芽孢桿菌(T7^/7iMMiw恥/Y^""er/"附)(DSM-8685),下文稱之為Spl。新阿波羅棲熱袍菌(T7^rwW收"wea/w/iYfl/ifl)(DSM-5068)，下文稱之為Sp2。77imM做朋era6actei"/"iw幼mMosn(/iiJ^/ies(DSM畫(huà)2229)，下文稱之為Sp3。T^r附oflWflm^icten'w附sflcc/ffliY/j^/cw挑(DSM-7060)，下文稱之為Sp4。海棲熱袍菌(77^miW^flwfln7/附a)(DSM國(guó)3109)，下文稱之為Sp5。枯草芽孢桿菌(5flc,7,"s柳似i7,:s)(DSM-4424),下文稱之為Sp6。嗜熱棲熱菌(T7^mi"stenwo/^i7ws)(DSM-579)，下文稱之為Sp7。下述菌林獲得自國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心ARS培養(yǎng)物保藏中心(Peoria，Illinois,USA):節(jié)桿菌(Jr幼n^fl"w)(NRRL-B3728)，下文稱之為Sp8。生長(zhǎng)^fr:Spl到Sp5菌林生長(zhǎng)于厭氧^f;Sp6、Sp7和Sp8菌林生長(zhǎng)于有氧條件。DSM菌林的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和溫度條件是DSMZ網(wǎng)頁(yè)上所建議的(http:〃www.dsmz.de/strains)。采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂和肉湯培養(yǎng)Sp8。用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主菌株大腸桿菌TOP10(Invitrogen)和BL21Star(DE3)(Invitrogen)分別用作克隆和表達(dá)用途的宿主菌林。在標(biāo)準(zhǔn)Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)在液體或固體平板，在需要時(shí)，所述培養(yǎng)基中加入了100jig/ml羧爺青霉素(SIGMA)。'基因組DNA提取獲自Spl至Sp8菌林的細(xì)菌培養(yǎng)物的約300mg細(xì)菌沉淀被用來(lái)進(jìn)行基因組DNA提取，其通過(guò)"WizardMagnetic-DNAPurificationSystemForFood"試劑盒(Promega)進(jìn)行。通過(guò)不銹鋼珠和打漿器(BeatBeater)進(jìn)行細(xì)胞的;W^破碎。用ddH20洗脫DNA，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳進(jìn)行定量，取小份試樣直接用于PCR。引物設(shè)計(jì)Spl至Sp8菌林的木糖異構(gòu)酶基因的DNA序列獲自Genbank。設(shè)計(jì)互補(bǔ)于每個(gè)基因末端部分的正向和反向PCR引物。將編碼pET22b(+)的限制性位點(diǎn)Ndel上游和Sacl下游的序列的5，尾分別加到正向和反向引物上。所設(shè)計(jì)的反向引物在栽體所編碼的多組氨酸區(qū)之前含有兩個(gè)終止密碼子。上文所述的尾隨后用作"通用"正向和反向引物，例如用于回收和進(jìn)一步克隆隨機(jī)誘變的基因。使用熱力學(xué)預(yù)測(cè)(可見(jiàn)，例如，Tinoco，etal.(1973)NatureNewBiol.246,40-41;Gralla,etal.(1973)J.Mol.Biol.73，497-511;Papanicolau,etal.(1983)NucleicAcidsRes.12，31-44;和Freier，etal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.83,9373-9377)和自制軟件設(shè)計(jì)引物。制得下述引物<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注意設(shè)計(jì)了相同的引物用于擴(kuò)增Sp3和Sp4的;Mt異構(gòu)酶基因，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗤哪┒诵蛄?。木糖異?gòu)酶基因的擴(kuò)增和克隆PCR反應(yīng)混合物，50nl體積，含有10ng基因組DNA、15pmol每種引物、10nlPlatinumPfx擴(kuò)增緩沖液、0.3mM每種dNTP、1mMMgS04、1.25單位PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)。熱循環(huán)^lt由以下組成，最初變性步驟941C5分鐘，然后是50個(gè)循環(huán)的941C15秒、54和64匸之間的退火溫度(取決于引物對(duì))30秒和681C2分鐘。通過(guò)取小份反應(yīng)試樣在1.3%TAE瓊脂糖凝膠上電泳iM^測(cè)1.4kb產(chǎn)物的擴(kuò)增。使用QIAquickPCR純化試劑盒或QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，然后將其克隆入pET22b(+)的Ndel和SacI位點(diǎn)。所使用的限制性酶購(gòu)買(mǎi)自Promega、Fermentas或NewEnglandBioLabs。4吏用限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離片段，用Shrimp堿性磷酸酶(Promega)對(duì)載體去砩酸化，用T4DNA連接酶(NewEnglandBioLabs)連接DNA片段，以上均使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)完成(Sambrook，etal.同上)，并遵從制造商的建議(在需要時(shí)有小的改動(dòng))。通過(guò)電穿孔將克隆進(jìn)pET22b(+)的木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21Star(DE3)細(xì)胞。按照AusubelI.等所述的方案完成細(xì)胞準(zhǔn)備("CurrentProtocolsinMolecularBiology"(1994-2000)JohnWileySonsInc.(ISBN0-471-50338-X))。約150pi細(xì)胞懸液在2mm電極間隙杯中用GenePulserII裝置(Bio-Rad)進(jìn)行電穿孔。i殳置工作^^lt為2.5kV，25fiF和200Ohm。，序列分析和比較使用下述程序比對(duì)一些木糖異構(gòu)酶基因的序列(來(lái)自Genbank):ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html);NCBIBlast2(www.ebi.ac.uk/blastall/index.html);和EMBOSS(http:Vemboss.sourceforge.net)。此比對(duì)提供了工具，用以預(yù)測(cè)所需特性和鑒定可能的穩(wěn)定mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)可抑制翻^始和正確終止。嵌合突變體的生產(chǎn)基于上述比對(duì)，在不破壞正確讀碼框的情況下，使用改造的PCR引物將Bdl限制性位點(diǎn)引入到Sp2和Spl的木糖異構(gòu)酶基因中。通過(guò)PCR，制備了包含Sp2;Mt異構(gòu)酶基因的完整5，部分和3'末端部分中Bcll位點(diǎn)的DNA片段。也制備了包含Spl木糖異構(gòu)酶基因的完整3，部分和5，末端部分中Bcll位點(diǎn)的DNA片段。在與上勤目同^H^下使用PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)在56n退火溫度下實(shí)現(xiàn)這些擴(kuò)增。通過(guò)QIAquick^J&提取試劑盒純化DNA產(chǎn)物。然后用20單位Bcll(Fermentas)在55"C切割500ng每種擴(kuò)增片段3個(gè)小時(shí)。如上文所i^凝膠純化期望的限制性產(chǎn)物，并取其小份進(jìn)行連接?？偭?00ng的DNA;^終體積20nl的反應(yīng)中。16C過(guò)夜孵育后，通過(guò)在70n加熱10分鐘終止所述Jl應(yīng)，立即置于冰上，通過(guò)QIAquickPCR純化試劑盒進(jìn)行純化。使用"通用引物"和上述PCR方案回收連接產(chǎn)物。通過(guò)QIAquick^^提取試劑盒純化預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，用Ndel和Sacl消化，然后克隆進(jìn)pET22b(+)的相應(yīng)限制性位點(diǎn)。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化入TOP10或BL21StarTM(DE3)大腸桿菌細(xì)胞，在含IOO嗎/ml羧千青霉素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上孵育過(guò)夜。隨機(jī)誘變將隨機(jī)突變導(dǎo)入被克隆進(jìn)pET22b(+)的Ndel和Sacl限制性位點(diǎn)內(nèi)的;Mt異構(gòu)酶嵌合基因突變體中。用上文所述"通用引物"進(jìn)行PCR。所述反應(yīng)混合物，根據(jù)Cadwell和Joyce的方案(1992-PCRMeth.Appl.2,28-33)，在50jil反應(yīng)體積中含侖2ng嵌合基因DNA、30pmol毒種引物、50mMKC1、10mMTris-HCl(pH8.3)、7.0mMMgCl2、0.5mMMnCl2、1mMdCTP、1mMdTTP、0.2mMdATP、0.2mMdGTP和2.5單位AmpliTaqDNA聚合酶(AppliedBiosystems)。在最初的94C3分鐘的變性步驟后，設(shè)置循環(huán)"為40個(gè)循環(huán)的941C30秒、54C30秒和72X:i分鐘。將反應(yīng)物在1.3%瓊脂糖^^上進(jìn)行電泳來(lái)檢測(cè)1.4kb產(chǎn)物的擴(kuò)增。使用QIAquick⑧a^提取試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后將其連入去磷酸化pET22b(+)的Ndel和Sacl位點(diǎn)，如上所述。對(duì)于下述多輪隨機(jī)誘變，使用來(lái)自所選突變體的基因作為模板。進(jìn)行3輪隨機(jī)誘變。每次篩選約10000個(gè)樣品的庫(kù)，選擇最佳候選物，對(duì)其進(jìn)行下一輪誇變。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21Star(DE3)細(xì)胞，在含100照/ml羧千青霉素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上孵育過(guò)夜。寡核苷酸合成和DNA測(cè)序由MWG(Ebersberg，Germany)進(jìn)行PCR引物合成和DNA測(cè)序。在96孔板中培養(yǎng)重組克隆，細(xì)胞熱裂解和對(duì)葡萄糖異構(gòu)化檢測(cè)將單菌落轉(zhuǎn)移到96孔板中，每個(gè)孔含有100nlLB和終濃度為100ng/ml的羧節(jié)青霉素。在軌道搖床上以200rpm37C過(guò)夜培養(yǎng)平板使得細(xì)胞生長(zhǎng)。將55jil培養(yǎng)物從每個(gè)孔轉(zhuǎn)移到另一個(gè)板中。母板保存于+4"C，以保存原始克隆。將5fi1LB基質(zhì)中的IPTG溶液加入子板中，使得IPTG終濃度為1mM。所iiil又在軌道搖床上以200rpm37"C培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)。進(jìn)行95C30分鐘的熱處理步驟，然后加入60jtl包含葡萄糖作為底物的緩沖溶液(見(jiàn)下文)。將板密封，在60X:烘箱中放置2CK24小時(shí)。使用Kennedy和Chaplin提出的硫酸方法(1975-CarbohydrateRes.40,227-233)定量檢測(cè)D-果糖在室溫下將之冷卻下來(lái)后，加入120^1的66%硫酸，緊密密封每個(gè)板，在60"C孵育30-60分鐘。通it^^l讀數(shù)器(BMG)上使用405nm濾光片讀數(shù)確定顯色程度。從母板回收所選擇的在確定閾值之上的樣品，在更大的體積中培^4L后進(jìn)一步進(jìn)行研究(見(jiàn)下文)。每個(gè)板上帶有"空"pET22b(+)或克隆進(jìn)pET22b(+)的來(lái)自Spl至Sp8的木糖異構(gòu)酶基因的BL21Star(DE3)細(xì)胞粗提物被用作參考對(duì)照。所有涉及微板的操作均手動(dòng)進(jìn)行，或者通過(guò)HT自動(dòng)工作站(Beckman誦Coulter)進(jìn)4亍。在50ml管中培養(yǎng)重組克隆，細(xì)胞酶促裂解和對(duì)葡萄糖異構(gòu)化的檢測(cè)單菌落來(lái)源的細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)物在3ml含終濃度100將/ml羧千青霉素的LB中培養(yǎng)過(guò)夜。取一百微升接種于含有10ml含100ng/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基的50ml聚丙烯管中，使之在軌道搖床上以250rpm在37X:培養(yǎng)20小時(shí)。加入IPTG至終濃度1mM，在軌道搖床上以250rpm在37t:繼續(xù)生長(zhǎng)8小時(shí)。棄去上清，加入1/5培養(yǎng)體積的BugBusterHT(Novagen)以及1/75培養(yǎng)體積的rLysozymeTM(Novagen)裂解沉淀。后一組分在臨用前以1:750(w/v)溶解于50mMTrisClpH7.8。裂解在室溫進(jìn)行30分鐘。不時(shí)人工搖動(dòng)管。室溫以4200xg離心樣品10分鐘，然后將60jil的上清轉(zhuǎn)移到96孔1。進(jìn)行95"C30分鐘的熱處理步驟，然后加入60fil底物和緩沖溶液。將板密封，置于60匸孵箱20-24小時(shí)。在室溫下將所iMl冷卻下來(lái)后，加入120nl66%的石克酸，將板緊緊密封，在601C孵育30-60分鐘。通it^^l讀數(shù)器(BMG)上使用405nm濾光片讀數(shù)確定顯色程度。使用如上所述的相同酶活性對(duì)照。市售;MI異構(gòu)酶制備物，如GENSWEET⑧SGI(Genencor)用作參考對(duì)照。用于酶測(cè)試的緩沖液條件在100mM馬來(lái)酸緩沖液pH6.85或50mM醋酸鈉緩沖液115.2中進(jìn)行酶測(cè)試。在加入細(xì)胞裂解粗提取物后，最終pH值顯示提高約0.5-0.6個(gè)pH單位。加入D-葡萄糖作為底物，其終濃度為12.5%。通妙入終濃度為10mM的MgS04、終濃度0.5mM的CoCl2和終濃度5mM的MnCl2確定金屬陽(yáng)離子的作用。單獨(dú)或組合評(píng)價(jià)所述離子的作用(MgS04+CoCl2和MgS04+MnCl2)。結(jié)果與討論最佳木糖異構(gòu)酶突變體，為清楚起見(jiàn)下文稱之為SM-1，由SEQIDNO1給定的序列編碼(其中下劃線顯示導(dǎo)入的Bell位點(diǎn)，其如上所述連接原始的Spl和Sp2片段)，其推斷出的蛋白質(zhì)序列表示為SEQIDNO2。所述突變體在細(xì)M中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，已除去了pET22b(+)載體的Ndel和Sad限制性位點(diǎn)之間編碼的pelB前導(dǎo)肽。此突變體和其它所有突變體以類似于天然的構(gòu)象產(chǎn)生，即沒(méi)有任何M或氣基端延伸。對(duì)SM-1以及也克隆在pET22b(+)/BL21Star(DE3)系統(tǒng)中的其它物種(Spl至Sp8)基因編碼的木糖異構(gòu)酶的性能進(jìn)行比較。具體來(lái)說(shuō)，在不同緩沖液條件和存在不同離子組合的情況下監(jiān)測(cè)酶活性(圖1和圖2)。通過(guò)PAGE分析對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步分析。在601C測(cè)試酶性能，但之前經(jīng)過(guò)951C30分鐘的加熱步驟，其不只裂解生長(zhǎng)于銜&的細(xì)菌細(xì)胞，還消除了不耐熱蛋白以及具有低效熱性能的突變木糖異構(gòu)酶的背景。從所示數(shù)據(jù)中明顯看出，在這些條件下，所選突變體SM-1顯示了相比于市售木糖異構(gòu)酶如GENSWEETSGI更高的耐熱性(圖3)。所述突變體的耐熱性非常類似于來(lái)自新阿波羅棲熱袍菌(Sp2)和海棲熱袍菌(Sp5)的超嗜熱^瞎異構(gòu)酶。當(dāng)與其它高嗜熱物種比較時(shí)，以葡萄糖作底物的所述酶的性能在pH7.5以及Mg"和Co"存在下更高，在pH5.7以及Mg^和/或Mi^+存在下(單獨(dú)或組合)高了更多(圖1)。所選突變體SM-1的蛋白質(zhì)表達(dá)類似于新阿波羅棲熱袍菌(Sp2).由于這些原因，由所選突變體SM-1產(chǎn)生的木糖異構(gòu)酶可用于在高溫、低pH和不存在Co&離子條件下將葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為^J瞎。實(shí)施例2.木糖異構(gòu)酶的^E介紹進(jìn)行測(cè)試以更好地表征兩種新的改進(jìn)的木糖異構(gòu)酶SM-1(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1和2)SM-2(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO19和21)為了比較，對(duì)兩種野生型酶也進(jìn)行了相同的測(cè)試Spl(來(lái)自非熱穩(wěn)定高溫厭氧芽孢桿菌的;Mt異構(gòu)酶)Sp2(來(lái)自熱穩(wěn)定新阿波羅棲熱袍菌的木糖異構(gòu)酶)如下有三個(gè)目的*酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)凝膠染色評(píng)估所表達(dá)酶的濃度。然后將每種酶稀釋以得到相同的最終質(zhì)量濃度。酶熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。將酶在90X:孵育6個(gè)不同時(shí)間(其時(shí)間范圍為30-180分鐘)后測(cè)定其活性。通過(guò)用硫酸對(duì)酶產(chǎn)物染色和用620nm濾光片讀取吸光度來(lái)進(jìn)行活性測(cè)量。'質(zhì)量特異性酶活性評(píng)價(jià)。測(cè)試不同的條件(pH從5.2到6.85，輔助因子Co-Mn-Mg,溫度60"C，孵育時(shí)間24小時(shí))。通過(guò)HPLC分析進(jìn)行活性測(cè)量。木糖異構(gòu)酶突變體表達(dá)水平的PAGE分析如上所述進(jìn)行SM-2和Sp2的細(xì)胞培養(yǎng)和表達(dá)誘導(dǎo)，其具有如下改動(dòng)將單菌M種于含10mlLB培養(yǎng)基+100jig/ml的羧芐青霉素的50ml聚丙烯管，使之在軌道搖床上以250rpm在37"C生長(zhǎng)48-72小時(shí)。加入IPTG達(dá)到終濃度為1mM，在軌道搖床上以250rpm在37n進(jìn)行約24小時(shí)的誘導(dǎo)步驟。取5毫升在+4t:以4200xg離心20分鐘。棄去上清，加入1ml的BugBusterHT(Novagen)和70jil的rLysozyme(Novagen)到所述沉淀，后者在臨用前溶解(1:750(w/v)溶于50mMTrisClpH8.0)。渦旋混合后，室溫進(jìn)行25分鐘裂解。定時(shí)用手搖動(dòng)管。所述樣品以4200xg在4匸再次離心20分鐘。粗提物，即上清，含有待研究的可溶性蛋白組分，將其保存于+4匸。對(duì)于PAGE分析，使用預(yù)制的NuPAGE⑧NovexBis-Tris凝膠(Invitrogen)，10%聚丙烯酰胺，1mm$，j，10孑匕il15孑匕，在XcellSureLockMini-cell中進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳(Invitrogen)。在水上，3或2nl粗提物被等分到1.5ml聚丙烯管中。加ddH20至6.5Hi體積。加1fil的NuPAGE⑧還原劑10x(Invitrogen)和2.5pi的NuPAGELDS樣品緩沖液4x(Invitrogen)至10pi^H^積。用移液器混勻樣品，并離心下來(lái)。緊密閉合所述管，樣品在7ox:水浴變性io分鐘。在NuPAGEMOPSSDS電泳緩沖液1x(Invitrogen)中進(jìn)行電泳。內(nèi)槽中所含的200ml緩沖液補(bǔ)充500nl的NuPAGE⑧還原劑10x(Invitrogen)。使用微量加樣器加入2至5fil之間的變性樣品。3jil的SeeBluePlus2預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen)用作蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。木糖異構(gòu)酶基因的預(yù)期分子質(zhì)量是約50kDa。根據(jù)說(shuō)明，電泳在200伏恒壓進(jìn)行50分鐘。在輕微攪拌下每個(gè)^在20ml的SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)中染色1小時(shí)，在蒸餾7JC中脫色約1小時(shí)。結(jié)果在圖4中顯示。酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化如上所ii^達(dá)SM-1、SM誦2、Spl和Sp2酶。使用Novogen的BugBusterHT方法提取它們。然后在BugBusterHT試劑中按如下稀^^^取物SM誦11:1，SM誦21:8，Spl1:5和Sp21:1。圖5顯示亂歐染色后表達(dá)的酶(左)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化后的稀釋結(jié)果(右)。如圖中所見(jiàn)，SM-2具有比野生型熱穩(wěn)定酶Sp2高得多的表達(dá)水平。熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)每種酶在90t:在lml管中(150jU)孵育0、30、60、卯、120、150和180分鐘。然后，將60nl熱處理的酶提取物和60jil底物緩沖液(馬來(lái)酸+Co+Mg+25。/n葡萄糖，pH6.85)置于徵敗一，在60x:孵育8小時(shí)，以評(píng)價(jià)殘余酶活性。最后，再在6ox:與120^硫酸(66%)孵育1小時(shí)。通過(guò)用硫酸染色酶產(chǎn)物和使用620nm濾光片的吸光度讀數(shù)獲得活性測(cè)定。結(jié)果顯示于圖6。如預(yù)期的，參考酶Spl不是熱穩(wěn)定的，在4艮短時(shí)間內(nèi)喪失活性。SM-2顯示熱穩(wěn)定性，其等效于野生型熱穩(wěn)定酶Sp2。有趣的是，SM-1具有比Sp2高得多的穩(wěn)定性。質(zhì)量特異性酶活性的評(píng)價(jià)如上所述制備稀釋的酶提取物。然后，將100nl的每種提取物與400pl的每種緩沖液1-12(如下表所示)在60X:孵育24小時(shí)。如下所述制備所述緩沖液醋酸鈉/醋酸緩沖液底物(pH5.2)1.000ml^fife溶液的成分276.4g—7JC合二葡萄糖52.50ml醋酸(CH3COOH)溶液(0.2M)197.50ml醋酸鈉溶液(0.2M)底物n°l=加100mlMgS04溶液(0.2M)底物n°2=加100mlMnCl2溶液(0.1M)底物n°3=加100mlMgS04溶液(0.2M)+100mlMnCl2溶液(0.1M)底物N°4=加10mlCoCl2*6H20溶液(0.1M)底物N°5=加10mlCoCl2*6H20溶液(0.1M)+100mlMgS04溶液(0.2M)底物N°6=加10mlCoCl2*6H20溶液(0.1M)+100mlMnCl2溶液(0.1M)馬來(lái)酸緩沖液底物(PH6.85)1.000ml^i^溶液的成分276.4g—水合葡萄糖23.2g馬來(lái)酸底物n°8=加100mlMgS04溶液(0.2M)底物n。9=加100mlMnCl2溶液(0.1M)底物n°10=加100mlMgS04溶液(0.2M)+100mlMnCl2溶液(0.1M)底物n°ll=加10mlCoCl2*6H20溶液(0.1M)底物n°12=加10mlCoCl2*6H20溶液(0.1M)+100mlMgS04溶液(0.2M)底物n°13=加10mlCoCl2*6H20溶液(0.1M)+100mlMnCl2溶液(0.1M)用氫氧化鈉溶液(8M)在25"C調(diào)節(jié)pH到6.85孵育之后，過(guò)濾每個(gè)樣品，通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如這些結(jié)果所示，即使在低pH和不存在Co的情況下(測(cè)試1-3),本發(fā)明的酶(SM-1和SM-2)仍保持高水平的活性(例如，在測(cè)試2和3中，分別比參考熱穩(wěn)定酶Sp2高16倍和17倍以上)。事實(shí)上，SM-1在低pH和不存在Co的情況下(測(cè)試2，活性=21.1)具有與Sp2酶在較高pH和存在Co的情況下(測(cè)試11，活性=23.88)相當(dāng)?shù)男阅?。SM-l和SM-2對(duì)Mn離子也顯示出非常強(qiáng)的親和性。序列表seq.id.no.1atggctgaattctttccagaaatcccgaaagtgcagttcgaaggcaaagaaagcacaaatccacttgcgttc;aagttctacgatccagaagagatcatcgacggcaaacccctcaaggaccatctgaagttctccgttgccttctggcacaccttcgtgaacgagggaagggatcccttcggagacccaacggccgatcgt(xatggaacaggtacaccgatccaatggacaaggcttttgcaagggtggacgccctttttgaattctgcgaaaaactcaacatcgagtacttctgcttccacgacagagacatcgctcccgagggaaaaacgctgagggagacaaacaaaattttggacaaatggggtactgcaaacctcttttcccacccaaggtacatgcatggtgcagcgacaacctgcagtgctgatgtttttgcgtacgcggccgcccaggtgaaaaaggcagagaaggatacgaaacactcctcaacacggaccttggattcgaacttgaaaacctcgcccgcttcctcagaatggctgtggattatgcaaaaaggatcggtttcacgacttcgacgttgcaaccgcctatgccttcctgaagagccacggtctagatgagtacttcaagttcaacattgaagcgaaccacgcgacacttgccggtcacacattccagcacgaactgaggatggcaaggatcctcggaaaacttggaagcaaacgaacatctacgacacaacacttgccatgtacgaagtgatcaagatggggggatttgacaaaggcggccttaacttcgatgcaaaagtaagacgtgcttcatttgagccagaagatcttttcttaggtcacatagctggaatggattcttttgcaaaaggcttcaaggttgcttacaagcttgtgaaagatggcgttttcgacaagtttatcgaggaaagatacgcaagctacaaagatggcattggcgctgatattgtaagtggaaaggctgacttcaagagccttgagaagtatgcattagagcacagcagtatttgtttgcagaatgaSEQ.ID.NO.2MAEFFPEIPKVQFEGKEST肌AFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRP麗RYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNK1LDKWERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEmCELGGEGYTSWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFL也PKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFN正ANHATLAGHTF,LRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDSFAKGFKVAYKLVKDGVFDKF正ERYASYKDGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQ酒KSGRQELLESILNQYLFAESEQ.ID.NO.3ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAATGTATCTAAASEQ.ID.NO.4AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCATTCTGCAAACAAATACTGATTSEQ.ID.NO.5ASEQ.ID.NO.6AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCACCTCAGTTCCAGAATGGTCSEQ.ID.NO.7ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAACGTATCTAAASEQ.ID.NO,8AGCTTGTCqACGAGCTCTTTATTATTCTGCAAACAAATACTGATTTAGSEQ.EXNO.9ASEQ.TD.NO.10AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCACCTCAGTTCTGCTATTGTCTTCSEQ.ID.NO.11SEQ.ED.NO.12AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATTATACTTCTAAAATGTATTGGTTCAATATSEQ.ID.NO.13ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTACGAGCCCAAACCGGASEQ.ID.NO.14AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCACCCCCGCACCCCCAGSEQ.ID.NO.15ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGTTCAGCCGACCSEQ.ID.NO.16AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATTAGCGGGAGCCGAGCAGSEQ.ID.NO.17ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGSEQ.ID.NO.18AGCTTGTCGACGAGCTCTTTASEQ.ID.NO.19ATGGCTGAATTCTTTCCAGAAATCCCGAAAGTACAGTTCGAAGGCAAAGAAAGCACAAATCCACTTGCGTTCAAGTTCTACGATCCAGAAGAGGTCATCGACGGCAAACCCCTCAAGGACCATCTGAAGTTCTCCGTTGCCTTCTGGCACACCTTCGTGAACGAGGGAAGGGATCCCTTCGGAGACCCAACGGCCGATCGTCCATGGAACAGGTACACCGATCCAATGGACAAGGCTTTTGCAAGGGTGGACGCCCTTTTTGAATTCTGCGAAAAACTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACAGAGACATCGCTCCCGAGGGAAAAACGCTGAGGGAGACAAACAAAATTTTGGACAAAGTAGTGGAGAGAATCAAAGAGAGAATGAAAGACAGCAACGTGAAGCTCCTCTTGGGTACTGCAAACCTCTTTTCCCACCCAAGGTACATGCATGGTGCAGCGACAACCTGCAGTGCTGATGTTTTTGCGTACGCGGCCGCCCAGGTGAAAAAGGCCCTTGAGATCACCAAAGAACTTGGAGGAGAAGGGTACGTATTCTGGGGTGGAAGAGAAGGATACGAAACACTCCTCAACACGGACCTTGGATTCGAATTTGAAAACCTCGCCCGCTTCCTCAGAATGGCTGTGGATTATGCAAAAAAGATCGGTTTCACGACTTCGACGTTGCAACCGCCTATGCCTTCCTGAAGAGCCACGGTCTAGATGAGTACTTCAAGTTCAACATTGAAGCGAACCACGCGACACTTGCCGGTCACACATTCCAGCACGAACTGAGGATGGCAAGGATCCTCGGAAAACTTGGAAGCATCGACGCCAACCAGGGAGATCTCCTGCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCAACGAACGTCTACGACACAACACTTGCCATGTACGAAGTGATCAAGATGGGGGGATTTGACAAAGGCGGCCTTAACTTCGATGCAAAAGTAAGACGTGCTTCATTTGAGCCAGAAGATCTTTTCTTAGGTCACATAGCTGGAATGGATTCTTTTGCAAAAGGCTTCAAGGTTGCTTACAAGCTTGTGAAAGATGGCGTTTTCGACAAGTTTATCGAGGAAAGATACGCAAGCTACAAAGATGGCATTGGCGCTGATATTGTAAGTGGAAAGGCTGACTTCAAGAGCCTTGAGAAGTATGCATTAGAGCACAGCCAGATTGTCAACAAATCAGGAAGACAAGAGCTATTGGAGTCAATCCTAAATCAGTATTTGTTTGCAGAATGASEQ.ID.NO.20ATGGCTGAATTCTTTCCAGAAATCCCGAAAGTACAGTTCGAAGGCAAAGAAAGCACAAATCCACTTGCGTTCAAGTTCTACGATCCAGAAGAGGTCATCGACGGCAAACCCCTCAAGGACCATCTGAAGTTCTCCGTTGCCTTCTGGCACACCTTCGTGAACGAGGGAAGGGATCCCTTCGGAGACCCAACGGCCGATCGTCCATGGAACAGGTACACCGATCCAATGGACAAGGCTTTTGCAAGGGTGGACGCCCTTTTTGAATTCTGCGAAAAACTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACAGAGACATCGCTCCCGAGGGAAAAACGCTGAGGGAGACAAACAAAATTTTGGACAAAAACCTGCAGTGCTGATGTTTTTGCGTACGCGGCCGCCCAGGTGAAAAAGGCCCTTGAGATCACCAAAGAACTTGGAGGAGAAGGGTACACATCCTGGGGTGGAAGAGAAGGATACGAAACACTCCTCAACACGGACCTTGGATTCGAATTTGAAAACCTCGCCCGCTTCCTCAGAATGGCTGTGGATTATGCAAAAAAGATCGGTTTCACGACTTCGACGTTGCAACCGCCTATGCCTTCCTGAAGAGCCACGGTCTAGATGAGTACTTCAAGTTCAACATTGAAGCGAACCACGCGACACTTGCCGGTCACACATTCCAGCACGAACTGAGGATGGCAAGGATCCTCGGAAAACTTGGAAGCATCGACGCCAACCAGGGAGATCTCCTGCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCAACGAACGTCTACGACACAACACTTGCCATGTACGAAGTGATCAAGATGGGGGGATTTGACAAAGGCGGCCTTAACTTCGATGCAAAAGTAAGACGTGCTTCATAAAGGCTTCAAGGTTGCTTACAAGCTTGTGAAAGATGGCGTTTTCGACAAGTTTATCGAGGAAAGATACGCAAGCTACAAAGATGGCATTGGCGCTGATATTGTAAGTGGAAAGGCTGACTTCAAGAGCCTTGAGAAGTATGCATTAGAGCACAGCCAGATTGTCAACAAATCAGGAAGACAAGAGCTATTGGAGTCAATCCTAAATCAGTATTTGTTTGCAGAATGASEQ.ID.NO.21MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRP額RYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKWERIKERMKDSNVKLLLGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALErnCELGGEGYWWGGREGYETLLNTDLGFEFENLARFLRMAVDYAKKIGFTGQFL1EPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHEL腿認(rèn)LGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDSFAKGFKVAYKLVKDGWDKF正ERYASYKDGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQ醒KSGRQELLESILNQYLFAESEQ.ID.NO.22MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKWERIKERMKDSNVKLLLGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYTSWGGREGYETLLNTDLGFEFENLARFLRMAVDYAKKIGFTGQFL正PKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGIITFQI孤RMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGI-IIAGMDSFAKGFKVAYKLVKDGVFDKF正ERYASYKDGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQ麗KSGRQELLESILNQYLFAE權(quán)利要求1.一種分離的多肽，其特征在于其包含與選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22的序列在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80％一致性的氨基酸序列，其片段和變體。2.—種分離的多肽，其包^i自SEQIDN02、SEQIDN021和SEQIDN022的M^f列，其片段和變體。3.—種分離的多肽，其選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22，其片段和變體。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的多肽，其特征在于其能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為果糖。5.—種分離的多核苷酸，其特征在于其編碼權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的多肽。6.—種分離的多核苷酸，其特征在于其在所述序列4^P長(zhǎng)度上與權(quán)利要求5的多核苷酸具有至少80%的一致性。7.—種分離的多核苷酸，其特征在于其包含權(quán)利要求5或6的多核苷酸。8.—種分離的多核苷酸，其特征在于其包含與選自SEQIDNOl、SEQIDNO19和SEQIDNO20的序列在所述序列全部長(zhǎng)度上具有至少80%—致性的核普酸序列，其片段和變體。9.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDNO1、SEQIDNO19和SEQIDN020的核苷,列，其片段和變體。10.—種分離的多核普酸，其選自SEQIDNO1、SEQIDNO19和SEQIDNO20,其片段和變體。11.一種分離的多核苷酸，其特征在于其與權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多核苷酸互補(bǔ)。12.—種分離的多肽，其由權(quán)利要求5-11中任一項(xiàng)的多核苷酸所編碼。13.—種表達(dá)載體，其特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求5-11中任一項(xiàng)的多核香酸。14.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于其包含權(quán)利要求13的載體。15.—種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-4或12中任一項(xiàng)所述多肽的方法，其包括在足以生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞的步驟；和從培養(yǎng)基中回收所述多肽的步驟。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法可獲得的多肽。17.選擇性結(jié)合權(quán)利要求1到4、12或16中任一項(xiàng)所述多肽的抗體。18.—種生產(chǎn)^t糖漿的方法，其包括在有效使葡萄糖轉(zhuǎn)化為^t的條件下將含葡萄糖的組合物與根據(jù)權(quán)利要求1到4、12或16中任一項(xiàng)所述多IM目接觸的步驟。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于反應(yīng)溫度范圍是在60匸到iior;，優(yōu)選80"c到ioo"c。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其特征在于所述^JL混合物的pH范圍是在4.5到8，優(yōu)選5到7，更優(yōu)選5到6。21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述反應(yīng)在存在至少一種選自Mg"和Mn"的二價(jià)陽(yáng)離子的情況下進(jìn)行。22.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)所述方法可獲得的果糖糖漿，優(yōu)選高^(guò)t糖漿，更優(yōu)選高果糖玉米糖漿。全文摘要本發(fā)明涉及分離的多肽，其包含與選自SEQIDNO2、SEQIDNO21和SEQIDNO22的序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，還涉及編碼這樣多肽的多核苷酸以及其在生產(chǎn)果糖糖漿中的用途。文檔編號(hào)C12N9/92GK101283096SQ200680037384公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年9月6日優(yōu)先權(quán)日2005年9月6日發(fā)明者克勞迪奧·梅倫迪,蒂齊亞納·焦萬(wàn)尼尼,路易吉·孔奇利奧申請(qǐng)人:卡吉爾公司