專利名稱：：具有β-葡糖苷酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法具有P-葡糖苷酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有P-葡糖苷酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核香酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述纖維素是單糖葡萄糖通過|3-1，4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解(3-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和(3-葡糖芬酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的P-l,4-連接的葡萄糖二聚體。(3-葡糖苦酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的愿望，和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。由于通過多種酵母將葡萄糖而非纖維二糖容易地發(fā)酵成乙醇，在水解結(jié)束時剩余的任何纖維二糖代表著乙醇產(chǎn)率的損失。更重要的是，纖維二糖是內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的強抑制劑。水解期間纖維二糖的積累對于乙醇生產(chǎn)不合需要的。纖維二糖的積累已經(jīng)成為酶水解中的主要問題，因為產(chǎn)生纖維素酶的微生物幾乎不產(chǎn)生|3-葡糖苷酶。|3-葡糖苷酶的低含量導(dǎo)致將纖維二糖水解成葡萄糖的能力不足。已經(jīng)將幾種方法用于在將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖時增加|3-葡糖苷酶的量。一種方法是使用幾乎不產(chǎn)生纖維素酶的微生物產(chǎn)生(3-葡糖苷酶，并且對內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶外源添加(3-葡糖苷酶以增強水解。然而，需要的量對于乙醇操作的商業(yè)生物量成本太高。第二種方法是在用酵母發(fā)酵葡萄糖的同時進行纖維素水解。這種方法#皮稱為同時糖化和發(fā)酵(SSF)。在SSF系統(tǒng)中，葡萄糖的發(fā)酵將葡萄糖從溶液中去除。然而，SSF系統(tǒng)在商業(yè)上尚不可行，因為用于酵母的28。C的操作溫度相對于要求的50。C條件而言太低。第三種克服(3-葡糖苷酶不足的方法是在宿主中過量表達P-葡糖苷酶，由此增加P-葡糖香酶的產(chǎn)率。本領(lǐng)域中有利的是"t是供新的具有改進性質(zhì)的|3-葡糖苷酶，用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成單糖、二糖和多糖。本發(fā)明的目的是提供新的具有P-葡糖苷酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有P-葡糖苷酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；(c)包含A-E陽[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A的多肽；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽包含一個或多個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的變體。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼具有(3-葡糖苷酶活性的多肽，所述多核苦酸選自下組(a)多核苷酸，其編碼的多肽包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70%同一性；和(c)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與以下序列雜交(i)SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(d)多核苷酸，其編碼具有P-葡糖苷酶活性的多肽，其中所述多肽包含A-E-[ST]-[IV]-網(wǎng)匿G-網(wǎng)-Q-[DS]-[ST]畫G-V-[IV]-A。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸37至878。在另一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核香酸171至2753。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達載體和重組宿主細胞，和產(chǎn)生具有p-葡糖苷酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及植物，其包含編碼具有P-葡糖苷酶活性的多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及在將纖維素材料轉(zhuǎn)化成葡萄糖或其它物質(zhì)時，使用具有卩-葡糖苷酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及洗滌劑組合物，其包含具有P-葡糖苷酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基S吏1-19或由SEQIDNO:2的氨基酸1-19組成；涉及編碼前肽(propeptide)的分離的多核香酸，所述前肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20-36或由SEQIDNO:2的氨基酸20-36組成；并且涉及編碼前原肽(prepropeptide)的分離的多核苷酸，所述前原肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l-36或由SEQIDNO:2的氨基酸1-36組成。本發(fā)明進一步涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中將所述基因與編碼信號肽的第一核苷酸序列和編碼前肽的第二核苷酸序列中的一個或兩個可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-19或由SEQIDNO:2的氨基酸1-19組成，所述前肽包含SEQIDNO:1的氨基酸20-36或由SEQIDNO:1的氨基酸20-36組成，其中所述基因?qū)τ诘谝缓偷诙塑账嵝蛄惺峭庠吹?。附圖簡述圖1A和IB顯示巴西青霉(尸e"/cz'〃/ww6raw7^"wm)菌抹IBT20888P-葡糖苷酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序歹ll(分別為SEQIDNOs:1和2)。圖2顯示pCR2.1GH3A的限制圖譜。圖3顯示pKKAB的限制圖譜。圖4顯示pKBKOl的限制圖譜。圖5顯示巴西青霉菌抹IBT20888P-葡糖苷酶在不同pH值的相對活性作為溫度的函數(shù)。圖6顯示巴西青霉菌抹IBT20888f3-葡糖苷酶在不同溫度的相對活性作為pH的函數(shù)。圖7顯示在不同的溫度和pH溫育24小時之后，Novozym188的殘余活性。圖8顯示在不同的溫度和pH溫育24小時之后，巴西青霉菌抹IBT20888卩-葡糖苷酶的殘余活性。圖9顯示在不同的4-硝基苯基-(3-D-吡喃型葡萄糖濃度下，巴西青霉菌株IBT20888(3-葡糖香酶的初始反應(yīng)速率。圖IO顯示在不同的纖維二糖濃度下，巴西青霉菌4朱IBT20888(3-葡糖苦酶的初始反應(yīng)速率。定義P-葡糖苷酶活性術(shù)語"(3-葡糖苷酶"在本文中定義為(3-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21),其催化末端非還原性P-D-葡萄糖殘基的水解，并且釋放j3-D-葡萄糖。纖維二糖酶(cellobiase)與卩-葡糖芬酶同義。就本發(fā)明而言，在25。C使用lmM4-硝基苯基-P-D-p比喃型葡糖苷作為底物在50mM檸檬酸鈉pH4.8中測定P-葡糖苷酶活性。將一單位的P-葡糖苷酶活性定義為在25。C、pH4.8,每分鐘產(chǎn)生l.O微摩爾的4-硝基酚。本發(fā)明的多肽具有的p-葡糖苷酶活性是由SEQIDNO:2的氨基酸37-878所示氨基S吏序列組成的多肽的P-葡糖苷酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,并且甚至最優(yōu)選至少100%。家族3糖苷水解酶或家族GH3:術(shù)語"家族3糖苷水解酶"或"家族GH3"或"Cel3"在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,歷oc/zew.乂280:309-316,和Henrissat,andBairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,/316:695-696屬于4唐香7K解酶家族3的多肽。分離的多肽術(shù)語"分離的多肽"用于本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然地或重組地結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96°/。純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然地或重組地結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。在本文中，術(shù)語"基本上純的多肽"與術(shù)語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。成熟多肽術(shù)語"成熟多肽"在本文中定義為具有p-葡糖苷酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截斷、糖基化、磷酸化等。成熟多肽編碼序列術(shù)語"成熟多肽編碼序列"在本文定義為編碼具有p—葡糖芬酶活性的成熟多肽的核普g臾序列。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度用FASTA程序包3.4版本使用默認參數(shù)測定(PearsonandD.J.Lipman,1988，iW」5"85:2444,andPearson,1990,7We/^cxiyz>￡"z_ymo/ogy183:63)。將自程序包的Smith-Waterman算法(WatermanWa/.,1976，爿dv.MaA.20:367)的配對比對用于百分比同一性的測定。默認參數(shù)包括缺口開啟罰分(gapopenpenalty)-12，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)-2和BLOSUM50比較矩陣。就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度通過Wilbur-Lipman方法(WilburandLipman，1983,/VoceW"g^o/Ae7V加'owa/^catfe^yo/5Wewce"&480:726-730)使用LASERGENEMEGALIGN丁M軟件(DNASTAR，Inc.,Madison，WI)來測定，使用同一性表和以下多重比對參數(shù)缺口罰分(gappenalty)10和缺口長度罰分(gaplengthpenalty)10。配對比對參數(shù)是K元組(Ktuple)=3,缺口罰分=3，和窗口=20。多肽片段術(shù)語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2中成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有(3-葡糖苷酶活性。優(yōu)選地，片段含有至少720個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少760個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少800個氨基酸殘基。亞序列術(shù)語"亞序列(subsequence)"在本文中定義為從SEQIDNO:l的5，和/或3，端缺失一個或多個核苷酸的核香酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有|3-葡糖苷酶活性的多肽片段。優(yōu)選地，亞序列含有至少2160個核苷酸，更優(yōu)選至少2280個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2400個核苷酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語"分離的多核苷酸"用于本文中指，如通過瓊脂糖電泳測定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60°/。純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多核苦酸?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語"基本上純的多核苷酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%,優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然地或重組地結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5，和3'非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98°/。純，最優(yōu)選至少99%,并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開的多核苷酸是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多核芬酸制備物基本上不含與其天然地或重組地結(jié)合的其它多核香酸材料。在本文中，術(shù)語"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核脊酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。cDNA:術(shù)語"cDNA"在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當所述核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明的編碼序列表達所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達盒"同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語"調(diào)控序列，，在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各種調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，4吏得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達。編碼序列當用于本文時術(shù)語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達術(shù)語"表達"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語"表達載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語"宿主細胞"包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。4務(wù)飾術(shù)語"修飾"在本文的意思是，對由SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當用在本文時，術(shù)語"人工變體"的意思是具有P-葡糖苷酶活性的多肽，所述多肽由表達修飾的核苷酸序列的生物產(chǎn)生，所述修飾的核苷酸序列是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的修飾的核苷酸序列；或其同源序列。所述修飾的核苷酸序列通過人為千預(yù)(humanintervention),通過修飾公開于SEQIDNO:1的核苷酸序列或其同源序列來獲得。發(fā)明詳述具有(3-葡糖苷酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及包含下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60%,優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75。/。，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,并且甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有f3-葡糖苷酶活性(下文中的"同源多肽")。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有的氨基S交序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有P-葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另外的優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另外的優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸37至878，或其等位變體；或其具有(3-葡糖苷酶活性的片段。在另外的優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸37至878。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或由其具有P-葡糖苷酶活性的片段組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸37至878或其等位變體組成；或由其具有(3-葡糖苷酶活性的片段組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸37至878組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有p-葡糖苷酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補纟連(J.Sambrook，E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,Mo/ecw/arC7om.wg，^Z^6orato^7Afo"w"/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少IOO個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有(3-葡糖苷酶活性的多肽片段。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸171至2753。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基,列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌抹鑒定和克隆編碼具有(3-葡糖苷酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，^L長度上應(yīng)為至少14,優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35,并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核S交探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以^使用更長的探針，例如，長度是至少600個核苷酸，至少優(yōu)選至少700個核香酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核芬酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有p-葡糖苦酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙蹄酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物的基因組DNA或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:l或其亞序列同源的克隆或DNA,優(yōu)選將所述載體材料用在Sounthem印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在至少非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列、SEQIDNO:1中包含的cDNA序列、它的互補鏈或其亞序列。可使在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸171至2753。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷S復(fù)序列，或其亞序列。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是質(zhì)粒pKKAB中包含的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30860中。對于長度至少IOO個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42。C，在5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25。/。的曱酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的曱酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的曱酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在45。C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在50。CC(氐嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55。C(中嚴緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在6S。C(高嚴緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比根據(jù)Bolton和McCarthy計算法(1962,/Voce^^"gso/AeA^"wa/爿cacfewyo/Sdewcwt75^48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C,在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40，IXDenhardt溶液，1mM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate),1mM磷酸二氬鈉(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所迷載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及具有|3-葡糖苷酶活性的分離的多肽，所述多肽包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]畫G-[IM]-Q-[DSHST]-G-V-[IV]-A。在第四個方面，本發(fā)明涉及人工變體，所述人工變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；或其同源序列。優(yōu)選氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的'J、延伸，例如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例^口H.NeurathandR丄.Hill,1979,77ze/Vc^ezVw,AcademicPress,NewYork4苗述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-iV-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、漆唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氬脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸，和3，3-二曱基月甫氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變的性質(zhì)。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(CunninghamandWells,1989，5Wewce244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，(3-葡糖苷酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton"a/.，1996,所o/.CTzem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos"g/,,1992,Sc/e"ce255:306-312;Smithda/.，1992,/Mo/.所o/.224:899-904;Wlodaver^"/.，1992,尸五&5&//.309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-OlsonandSauer，1988,5We"ce241:53-57;BowieandSauer,1989,Prac.A^/.^ca^5W.t/5L486:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman19W，歷oc/^附.30:10832-10837;美國專利No.5，223，409;WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire"a/"1986,G簡46:145;Ner"a/.,1988,房」7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness""/.,1999，A^ww5/o&c/z"o/ogy17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽例如SEQIDNO:2的氨基酸37至878的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10,優(yōu)選9,更優(yōu)選8,更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選l。具有P-葡糖苷酶活性的多肽的來源本發(fā)明的具有P-葡糖苷酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苦酸序列的菌林產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如具有p-葡糖苷酶活性的芽孢桿菌屬(5""7/1)、鏈球菌屬(Streptococcic)、鏈霉菌屬(5^e/towycas1)、葡萄球菌屬(Stop/ococcws)、腸球菌屬(五"feracoccw力、乳4干菌屬(丄acto6ac/〃MS)、乳J求菌屬(丄a"ococcw"、才麥菌屬(CYoWrWww)、土芽孢桿菌屬(Geo6(3c/〃ws)或海洋芽孑包桿菌屬((9ce""o6""'〃w)多肽；或革蘭氏陰性細菌多肽例如具有(3-葡糖苷酶活性的大腸桿菌、假單胞菌屬(/^ewcfowowasO、沙門氏菌屬(5"a/附(9"e〃a)、彎曲4亍菌屬(G3w/73;/0Z^7cter)、蟲累斥干菌屬(//e//co6acfer)、黃4干菌屬(F/"voZ^c/e〃'ww)、斗炎4干菌屬CFwc^oc/eWw附)、泥桿菌屬C^yc^"cter)、奈瑟氏菌屬(A^^en'")或尿枝原體屬(^m3//osmfl)多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有P-葡糖苷酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Ba"7/ws"汰"/o//w7"5)、角舉5定4分芽孑包才干菌(5flc/〃wam_y/o/^rwe/ac/e"s)、4豆芽孑包4干菌CSflc/〃wZ)rev&)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bofc"/wsa>cw/a"s)、克勞氏芽孢桿菌CBac/〃wsc/aww7)、凝結(jié)芽孑包桿菌CSa"7/twcoagw/<ms)、堅強芽孑包桿菌(5ac/〃i^ywzus)、燦爛芽孢桿菌(5ac/〃w/awf船)、遲緩芽孢桿菌(萬""'〃w/e"^s)、地衣芽孢桿菌(5ac/〃wZ/c/^m/ow2&)、巨大芽孢桿菌(Bac/〃wsmegafen.iwz)、短小芽孢桿菌CSa"7/wjto脂7us)、嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(J5ac/〃wsWeara^2ew7op/n7ws)、枯草芽孢桿菌C6ac〃/i^sw^'fc)或蘇云金芽孑包桿菌(5a"'〃"sf/zw"V2g7'era")多肽。在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是具有(3-葡糖苷酶活性的似馬鏈球菌(5^ej9tococcuse《i^/m//^)、酉良膿4連J求菌(5^eptococcwsj9yoge"e力、乳房4連J求菌(5yreptococcwWen'力或馬4連球菌獸瘋亞種(5^印tococcwe《w/subsp.在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是具有p-葡糖苷酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(5^eptomycesac/zramogewe"、除蟲4連霉菌OSfreptomycasm^m"/fo)、天藍色《連霉菌OS^e/tom少cescoe//co/or)、灰色鏈霉菌(5^印tow少casgn、ew力或淺青紫4連霉菌(5^eptowyces//vWam)多肽。本發(fā)明的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽例如具有P-葡糖苷酶活性的念珠菌屬(Co"^/fl)、克魯維酵母屬(火/M;/veram少ce力、畢赤酵母屬Wc/H'a)、酵母屬(&cc/zara，c&s)、裂殖酵母屬(6Wn.zayacc/^蘭ycey)或西洋蓍霉屬(&mnWa)多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽例如具有(3-葡糖香酶活性的枝頂孑包霉屬(」c/'e附o"/w附)、曲霉屬(Jj/erg〃/w力、短梗霉屬(^wreoZ)ay/^/w附)、瞎J求菌屬(O3^3fococcMS)、77///&os7't//Mw、錄孑包屬(^Fiwan'M附)、腐質(zhì)審屬(Z/w附/co/a)、梨孢菌屬(ikfog"apw^e)、毛霉屬(Mwcw)、毀絲霉屬(似^6//0尸/^0^)、新考瑪脂霉屬(7VeocG〃/附os"x)、/^孑包菌屬(7Vewmspora)、擬青霉屬(尸"e"7o附j(luò)Kes)、青霉屬(戶6"/"7//"附)、瘤胃壺菌屬(P/ramyces)、裂褶菌屬(5b/n'zop/z少〃wm)、踝節(jié)菌屬(7^/araw_ycay)、熱子嚢菌屬(777ermoascw"、沖炎孑包殼屬(77z/e/av/a)、彎頸霉屬(7b(y/oc/a(i/wm)或木霉屬(7Wc/2oaferma)多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有(3-葡糖苷酶活性的卡爾酵母(5bcc/2orcwy'cMC(ar/Ae^^m7'》、酉良酒酵母(5""cc/2a;-ow7cas1cerev/w'ae)、4唐4b酵母(Sacc/zaram戸sd/osto"c—、道格拉氏酵母(5^cc/wra附戸scfowg/oy")、克魯弗酵母(5bcc/wramycesA;/i(yven〕、諾地酵母(Sacc/wramyceswor^e服、)或卵形酵母(&cc/wra附y(tǒng)cesovi/femz/力多肽。在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是具有(3-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉(Aperg/〃ws"cw/eo加)、泡盛曲霉(J，rg7'〃tw靜麵cW)、煙曲霉(J，rg7'〃us/^w/g^MS)、臭曲霉(Js/erg/〃usT^e"^"》、日本曲霉C4s/e^g7'〃w/"/o"^"j)、#勾巢曲霉045/6/^7/11m'(iw/am1)、黑曲霉0^/^^///"5"/ger)、米曲霉(J5perg"/wsoryzae)、才干孑包^R鐮孑包(FM5flr/wwZ""nWo/<ie》、禾谷鐮孑包(Fwrar/wmcerea〃s)、庫威鐮孑包(FMan'wmcraoAwe〃em^)、大刀鐮孑包(Fusan'wwcw/附orwn)、禾本一牛鐮孑包(Fwsan'wmgramz'wearaw)、禾赤鐮孑包(Fwsan'w附gra;m'"wm)、異孑包鐮孑包(Fz^an'wm/zetercw/wr"m)、合？欠木鐮孑包CFws"n'ww"egw"d/)、尖鐮孑包(尸wsan'wmoxj^/owm)、多枝鐮孑包(Fusan.wmreric",afwm)、粉紅鐮孑包(Fws"n'wmmsewm)、"t妄骨木鐮孑包CFwan'wwsaw6wc/"wm)、月夫色鐮孑包CFwsan'wmsorcoc/raww)、擬分斗支孑包鐮孑包(Fi^"n'w附s/ora/r/c/2/o/^fes)、石克色鐮孑包(Fws"n.wwsw/p/2wew附)、圓鐮孑包(Fusor/wmtonz/osww)、擬絲孑包鐮孑包(Fwsw'wmfn'c/c^/zec/oz'day)、《裏片鐮孑包(Fusor/w附ve"e"a/ww)、凈爭異腐質(zhì)霉(i/ww/co/a/rao/e"》、逸乾才帛^犬腐質(zhì)霉(//ww/co/a/awMg7."osa)、米4東毛審(iWwcorm/e/ze0、p^^^^iii^CA^ce/fop/zf/zoraAerwcp/7a)、斗且并造月永孑包菌(iVewra^poracra^a)、產(chǎn)紫青霉(尸em'c/〃/wmpw7wrogewww)、p合茨木霧(rn'c/20cferma/zardawwm)、康寧木審(Zh'c/zocferma^ow'"g&)、長枝木霉(7Hc/z6^潔"/0"g/6rac/7/"謂)、里氏木霉(7/c/zoderworeese/)、綠色木霉(7Hc/cxie潔awW刮、T7zW"油(3c/7ra附""'ea、7TnW"v/a瘤孢梭孢殼(T7n'e/a油s/etfeiom'蘭)、毛梭孑包殼(77n'e/aWasetosa)、T7n'e/av/asw雄e削op/n7a、土生梭孑包霉、7Tw'etov/afeTz'co/a、772/e/av/athermophila、T7H'e/頻'av"".o^spora或77z/e/av/cz多狀。在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是具有(3-葡糖苷酶活性的巴西青霉、沙門柏干酪青霉(戶ew/c/〃/wmcamew6eW/)、月交嚢青霉(Pem-c/〃/wmca;ww/a似m)、產(chǎn)黃青霉(尸ew/c,〃/wmc/z^ysogewMm)、Pe剛,c/〃/wmc"reow^rwm、才吉青霉(尸e"/c/〃/wwc/fnVwm)、才奉束青霉(戶ew/"'〃/wwc/aw7brwe)、了貞青霉(戶ew/c"/fiw7cor_y/c|p/z//"w)、皮落青霉(尸em-"7Z/iW7cn^tosw附)、指一犬青霉CPem'd〃/wmWg7'to/^m)、擴展青霉(T^m."'〃/畫ex/ara畫)、繩狀青霉(戶em'c/〃/畫_/^m.cw/as,)、平滑青霉(戶em'"7/Zwwg/a6n/m)、3f立^犬青霉(Pem'c/〃/Mmgraww/a^m)、灰黃青霉(尸em'c/〃/wwg"&e<^/vww)、島青霉(戶em'c/〃/ww/s/aw(i/cww)、意大利青霉(尸e"/c/〃/ww/toZ/ci/m)、孩i紫青霉(尸em.c/肌wmj'a"^n."e〃wm)、4&色青霉(Pe"/c/〃/ww/,Wt/iw)、大孑包青零C^em.cf〃/M附wegasponwO、碎每一木青審(/^"&////"附we//w")、對爭異青審Mota&m)、草酸青審(/^m.c/〃/w附ox"http://cww)、庫欠毛青審(/^"/(^.///"附pwZ7erw/w附)、變,5青零(尸em.c/仏'w附pw/pwresce/w)、產(chǎn)"^"青零(Pem'c/仏'ww/7M,7wroge"w附)、婁J也青霉(戶em'c/〃/w附ro《w^/br〃0、命習(xí)4皮青霉(尸em'c〃Z/wmrMgw/asw附)、小刺青霉(Pem."7/,wm5//"w/oswm)、瓦克曼青霉(i^w'c/〃/ww而A:扁應(yīng)7)或青霉屬菌種CPe"〖"'〃/畫sp.)多肽。在更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有(3-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽。在最優(yōu)選的方面，所述多肽是具有(3-葡糖苷酶活性的巴西青霉IBT20888多肽，例如，SEQIDNO:2的多肽或其成熟多肽。可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學(xué)的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph)，無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌抹在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心中心北區(qū)研究中'"(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核普酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook""/.,1989,見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。切割位點的實例包括但不限于編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martinaa/,，2003，/嵐Mz'c油W.淑ec/mo/.3:568-76;Svetinaa/.，2000,/腸fec/mo/.76:245-251;Rasmussen-Wilson1997,J///.五"W謂.M/cra&W.63:3488-3493;Ward"g/.，1995，腸阮/mo/ogv13:498-503;和Contrerasa/.，1991,所ofec/2"o/ogv9:378-381);由因子Xa蛋白酶在精氨酸殘基之后切割的Ile-(Glu或Asp)隱Gly畫Arg位點(Eaton""/，1986,^ocfew.25:505-512);由腸激酶在賴氨酸之后切割的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(Collins-Racie"a/.,1995,5/otec/2"o/o"13:982-987);由GenenaseI切割的His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點(Carter1989，尸ra如'mv/S^w"wre,Fw"Wo"，"w/Gewe//"6:240-248);由凝血酶在Arg之后切割的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(Stevens2003，Z>wgZXscovwj;fTorW4:35-48);由TEV蛋白酶在Gin之后切割的Glu-Asn畫Leu-Tyr畫Phe-Gln-Gly位點(Stevens，2003,見上)；和由人鼻病毒3C蛋白酶的遺傳工程形式在Gin之后切割的Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(Stevens,2003，見上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明的具有(3-葡糖苷酶活性的多肽的核普酸序列，或由該核芬酸序列組成。在優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由其組成。在另外的優(yōu)選方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-30860中所含質(zhì)粒pKKAB中的序列，或由該序列其組成。在另外的優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)或由其組成。在另外的優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸171至2753或由其組成。在另外的優(yōu)選方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-30860中所含質(zhì)粒pKKAB中包含的成熟多肽編碼區(qū)或由其組成。本發(fā)明還包含編碼下述多肽的核苷S吏序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有(3-葡糖苷酶活性的SEQIDNO:2的片段。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼具有(3-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列或由該核苷酸組成，其中所述多肽包含A-E-[ST]-同-網(wǎng)-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸37至878。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例^口'Innis"a/"1990,PC7:^toAfeAcxisawd^/^Z/caWo",AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接活4匕4爭錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于才亥苦酉吏序列的才廣i曾(NASBA)。可以從青霉屬的菌林，或從其它或相關(guān)的生物克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含下述核苷酸序列或由下述核香酸序列組成的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%,優(yōu)選至少65°/。，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%,甚至更優(yōu)選至少95%,并且最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%同一性的同一性程度，所述多核苦酸編碼活性多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸171至2753。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術(shù)語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:l的多肽編碼區(qū)存在的核苷酸序列，例如其亞序列的勤出上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述核苷酸取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物的密碼子選擇；或者所述核苷酸取代可產(chǎn)生不同的氨基目拼列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例^口,Forda/.，1991,Prafe/"Ex7ms^'o"戶wr訴ca〃o"2:95-107。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，CunninghamandWells,1989,見上文)來鑒定。在后一的技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，并且測試所得突變分子的P-葡糖苷酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVosda/"1992，見上文；Smiths/.,1992，Wlodaver,1992,見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核普酸，所述分離的多核苷酸在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件，更優(yōu)選至少中等嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(SambrookeM/.，1989,見上文)，如本文所定義的。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苦酸171至2753。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核普酸通過以下方法獲得(a)在至少非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有P-葡糖苷酶活性的多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸171至2753。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/"c操縱子、天藍色鏈霉菌(5^印tomyc^6//^/0。瓊脂糖酶基因(^^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因OacS)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(awy丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因("/^竭、解淀粉芽孢桿菌ot-淀粉酶基因(^^g)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pw尸)、枯草芽孢桿菌x少"和矽/S基因和原核P-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroffda/"1978，/VoceW"gs//ze7Va"o朋/爿c"(i柳yo/5We"cast/X475:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoer"a/.，1983,尸racee^'"gso/AeA^/7'o"a/Jc"c/e柳y5b/e"ces80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Useftilproteinsfromrecombinantbacteria"in5We〃fi/c^wer/ca"，1980,242:74-94中；和在Sambrook"a/.,1989,見上文中有所描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(i/z/zwm^w附/e/^)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/"^)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖芬酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56卯0)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(3-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶n、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶m、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉p-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、S良酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氯酶(ADHl,ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos1992,1fea^8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanose^/.,1992,見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3'末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因荻得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺芬酸化序列由GuoandSherman,1995,Mo/ecw/wCe〃w/w傷o/ogy15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相聯(lián)的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列中的5'端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5'端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的。或者，異源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌p-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(";^r、wpnS、"prM)和枯草芽孢桿菌pw丄另外的4言號欣由SimonenandPalva,1993，7V^cnZ)/0/0g/c"/ievfen^57:109-1374苗述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。在優(yōu)選的方面，信號肽是SEQIDNO:2的氨基酸1至19。在另外的優(yōu)選方面，信號肽編碼區(qū)是SEQIDNO:1的核苷酸6至62，其編碼SEQIDNO:2的氨基酸1至19。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos"a/.，1992，見上文，描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)變成成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶("/7/^)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶0嚴7)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。在優(yōu)選的方面，前肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至36。在另外的優(yōu)選方面，前肽編碼區(qū)是SEQIDNO:1的核苷酸63至170，或其cDNA序列，所述前肽編碼區(qū)編碼SEQIDNO:2的氨基酸20至36。當信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/ac、toe和^p操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(w池heavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核普酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在合適的用于表達的載體中插入包含所述序列的核苦酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的核普酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與合適的表達調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進^f亍重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苦酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的栽體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的d"/基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于am必(乙酰胺酶)、(鳥氨酸氨曱?；D(zhuǎn)移酶)、6ar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、/z//(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、m^D(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyK(乳清酉吏才亥芬-5,-石粦酸脫羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)),sCp危酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的"附^S"禾口基因和吸水鏈霉菌(5^e/to附少c"/^grosco//c^)的本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10,000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對，其與相應(yīng)的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語"復(fù)制起點"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在本文定義為使質(zhì)?；蜉d體能夠體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMBl的復(fù)制起點。用于酵母宿主細胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARS1,ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMA1和ANSI(Gems1991，G簡98:61-67;Cullen"a/.,1987，AWeZd油to，c/215:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠4艮據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴增的選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選4奪含有選擇性標記基因的擴增拷貝，并因而含有多核普酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrookefa/.，1989,見上文)。宿主細月包本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將其有利地用于多肽的重組產(chǎn)生中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語"宿主細胞"包含親本細胞的任何子代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不相同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例如，真核生物。有用的但細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、土芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或尿枝原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實踐中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另外的更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另外的更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另外的更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實踐中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于似馬鏈球菌、g良膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸痘亞種。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘕亞種細胞。細菌宿主細胞可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實踐中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細月包是天藍色鏈霉菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另外的優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見,例^口，ChangandCohen,1979,Mo/ecw/arGe"era/Gewe"cs168:111-115),使用感受態(tài)細胞(參見，例如，YoungandSpizizen,1961，Jowma/^acten'o/ogv81:823-829，或DubnauandDavidoff-Abelson，1971，Jow"a/o/Mo/ecw/w說o/ogy56:209-221)，電穿孔(參見，例如，ShigekawaandDower，1988,肌ofec/zw'^es6:742-751)或接合(參見，例如，KoehlerandThorne,1987,/owma/169:5771-5278)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞'.例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983,JMo/.所o/.166:557-580)或電穿孑L(參見，例如，Dower"a/.，1988,TVwc/e/c16:6127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體孝夸it和電穿孑U;參見，侈寸^口，Gong"a/.,2004,Fo/ZaAfZcn96/0/.fVa/a)49:399-405),接合(參見，例如，Mazodier1989，/Sacte〃'o/.171:3583-3585),或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke""/.，2001，Wa//.爿cac/.Sd.t/&498:6289-6294)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到邗i單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi"a/.，2006,/M/cra6/o/.64:391-397)或接合(參見，i^B口，PinedoandSmets,2005,JV^croWo/.71:51-57)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，侈'Ji口，PerryandKuramitsu，1981,Tawww".32:1295-1297),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，CattandJollick,1991，M/cra&as.68:189-2070),電穿孔(參見，例如，Buckley"a/.,1999，^;//.f"v/ra".M/cra6/o/.65:3800畫3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981,A//cra6/o/.iev.45:409-436)。然而，本領(lǐng)域已知的任何方法可以用于將DNA引入宿主細胞。宿主細胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌"用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和4妄合菌門(Zygomycota)(^口由Hawkswortha/.，/"，J/mwoW/zoroi5&6j^D/"/owar_yo/277eFwwgY,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth&a/.，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfongi)(Hawksworthda/.，1995，見上)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孑包霉目(Endomycetales))、產(chǎn)才旦子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孑包綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，;|尋酵母定義為^口S/d/ogy"wd爿c"v/"eso/}feaW(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.,andDavenport,R.R.，eds,5bc.卻p.Bacfe"W.5y附;,'謂5"e〃'eyNo.9，1980)中所述。在更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(//""化"2//")、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(《/Myverawyc"/"cfe)細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細月包是^rraw'a/^o/y"c"細月包。在另外更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth"，1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(爭rA:朋cfera)、".o拜's、鬼傘屬(Copn'"ws)、革蓋菌屬(On'o/w)、隱球菌屬、i^'kw誠wm、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬CP/w"mc/wete)、射脈菌屬(尸/2/e6/a)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(尸/ewra&s)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(7V謹她s)或木霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另外的最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另外最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(5^rfe"^feraCe一o"'o戶'sgf/vescera、Cer—"'o戶's尸a朋o",齒、Ce一on'o/7i〃'vw/osa、Cer—Wo/w7、sw^;-wy^、Ce—on'o/w/ssw^vem一ora、灰蓋鬼傘(C。戸'"wsc/"erew)、毛革蓋菌(0^o/w/2^y^w力、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(尸/w"erac/7fle^c/z7sos/on'i/m)、輻射射月永菌(P/7/e6/araWato)、尸/ewrafwse^"g"、土生沖炎孑包霉(T7z〖e/aWafe;resWs)、7Vametov〃/osa、！Trametovers/co/or、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton"a/"1984，尸腦eW，o/7V加'o""/」c"^fe，S"'ewces81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮3包屬菌種的合適方法由MalardierW"/.，1989,78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法專爭4匕酵母BeckerandGuarente,Abelson,J.N.andSimon,M.I.，editors,Gw油tol^w/Mo/ecw/"r5/o/ogy，Me/Zzotfe/"JSwzywo/ogy,Volume194，pp182-187，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito"a/.，1983，Towma/5a"en'o/ogy153:163;和Hinnen&，1978,/Voc^W"gj//^7V加'ow"/^cflwfe/^yo/SWewc^y75:1920。產(chǎn)生方法
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：本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選地，所述細胞是青霉屬的細胞，更優(yōu)選地是巴西青霉，并且最優(yōu)選地是巴西青霉IBT20888。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核香酸序列，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷S臾序列編碼由SEQIDNO:2的成熟多肽組成的多肽，和(b)回收所述多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸37至878。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的成分制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，可以通過常^見方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，尸rafe/"A/〃yc加/o",J,C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，將其用編碼本發(fā)明具有(3-葡糖苷酶活性的多肽的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘撸梢詫⒑性撝亟M多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于礎(chǔ):壞抗營養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉才直物的實例是草(grasses)，^口草i也早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass),早熟禾屬(尸oa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(i^Ww^)、黑麥草屬(丄o/Zwm);寒;也型#大草(temperategrass),i口Agrostis;和谷類，例長口，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉才直物的實例是煙草(tobacco),豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins),馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cmciferous)才直物(十字花牙牛(familyBrassicaceae)),如花才耶菜(cauliflower),油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物擬南芥G4ra^'cfo;w"Aa/""a)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fmit)、種子(seed)和塊莖(tuber),以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、口十肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的才直物細月包區(qū)室(compartments),如葉纟錄體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondrial'液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細胞質(zhì)(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細胞也凈皮認為是才直物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、舉月4分(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個表達構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并將所得的修飾植物或植物細胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。表達載體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核香酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸序列所必需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構(gòu)建體和將該構(gòu)建體^J入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選捧，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以把向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague"a/.,1988，戶/朋fP/z;w'ofogV86:506所述。對于組成性表達，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck"a/.，1980,Ce〃21:285-294,Christensenefa/"1992，尸/朋fMa所o/.18:675-689;Zhang"a/.，1991，P/a"fCe〃3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990,爿wiiev.24:275-303)，或來自代:謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Itoa"/.,1994，Mo/.S/o/.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu"a/.，1998,P/aW朋dCe〃尸/，/o/ogy39:885-889)，來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(W"'a/W")的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(ConradWa/.，1998，Jowwa/戶/^w'o/ogv152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen"a/.，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜CSmw/ca"a/w力的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的A"啟動子(Kyozukaefa/.,1993,P/aW/^，Zo/ogv102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavims)腺嘌呤曱基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(MitraandHiggins，1994,P/a"fMo/ecw/"r所o/ogy26:85-93),或來自稻的aW尸基因啟動子(Kagaya1995，Mo/ecw/wawdge"era/ge"erics248:668-674),或傷口i秀導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu"1993,P/a"/Mo/ecw/a廠所o/ogy22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源應(yīng)用的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、才直4勿^敫素(planthormones)長口乙丈希、脫落酉吏(abscisicacid)、赤霉酉交(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，將其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu"a/.，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白l基因的第一內(nèi)含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Jgrai)"cter/MW)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孑L(Gasser"a/.，1990,Sc&"ce244:1293;Potrykus,1990，歷。/rec/wo/ogy8:535;Shimamotoda/.，1989,淑w338:274)。目前，才艮癌土i襄才干菌(Jgra6acten'wmfwmey^dera)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見HooykasandSchilperoort，1992,P/a^Mo/ecw/wS/o/o^19:15-38)，而且它也可以用于專^ft單子葉植物，雖然對于這些植物其它的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA包覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,P/朋/1Jo翻a/2:275-281;Shimamoto,1994，Cwr腦f(9p油wB/o/ec/2朋/ogy5:158-162;Vasiletal.,1992，所o/rec/z"o/ogy10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法，是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh"a/.，1993，尸/"w/Mo/ecw/"rS/o/ogy21:415-428所描述。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，其包含編碼本發(fā)明具有P-葡糖芬酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。去除或減少P-葡糖普酶活性本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時，與親本細胞相比突變的細胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法，例如插入、破壞、取代或缺失，通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達來構(gòu)建突變細胞。在優(yōu)選的方面，所述核苦酸序列是失活的。待修飾或失活的核苦酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對活性關(guān)鍵的部分，或表達編碼區(qū)所必需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷s交序列表達的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子?？梢酝ㄟ^向親本細胞施以誘變，并且選^^奪其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行核苷酸序列的》t飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過將所述DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-曱基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞碌u酸氫鈉、曱酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時孵育待誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過引入、取代或去除基因中的一個或多個核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的調(diào)節(jié)元件，可以實現(xiàn)所述核苷酸序列的^f'務(wù)飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開讀框。按活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進行，即，直接在表達待修飾核苷酸序列的細胞上進行，但優(yōu)選如下文所示例的那樣在體外進行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細胞表達的便利方法的實例是基于基因取代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核芬酸序列還編碼標記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。在特別優(yōu)選的方面，用選擇性標記如本文所述的那些來破壞所述核香酸序列。或者，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術(shù)來進行所述核香酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述序列可以在細胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進一步涉及親本細胞的突變細胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失，這導(dǎo)致與親本細胞相比突變細胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷性突變細胞作為表達同源和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生同源或異源多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)突變細胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語"異源多肽"在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾而將天然序列改變的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術(shù)操作宿主細胞的結(jié)果將表達在量上改變的天然蛋白。在進一步的方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及感興趣的蛋白產(chǎn)物的細胞，來產(chǎn)生基本上無(3-葡糖苷酶活性的蛋白產(chǎn)物的方法在發(fā)酵之前、之中，或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制(3-葡糖苷酶活性的物質(zhì)(agent),從發(fā)酵液中回收感興趣的產(chǎn)物，和任選地將回收的產(chǎn)物進行進一步純化。在進一步的方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無(3-葡糖苷酶活性的蛋白產(chǎn)物的方法在允許所述產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)細胞，將得到的培養(yǎng)液進行組合的pH和溫度處理以基本上減少p-葡糖苷酶活性，和從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物?；蛘?，可以將從培養(yǎng)液回收的酶制備物進行組合的pH和溫度處理。所述組合的PH和溫度處理可任選地與(3-葡糖苷酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個方面，可能去除至少60%,優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%,并且最優(yōu)選至少99%的p-葡糖芬酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得(3-葡糖苷酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在9-10的pH和至少65。C的溫度進行一段足夠的時間以達到期望的效果，通常10至30分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進行。用于產(chǎn)生基本上無(3-葡糖苷酶產(chǎn)物的本發(fā)明的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或4直物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chkinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過氧化酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。(3-葡糖苷酶缺陷性細胞也可以用于表達在制藥上引起興趣的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長因子、受體等?？衫斫獾氖切g(shù)語"真核多肽，，不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加修飾，或通過其它這樣的修飾以增強活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等。在進一步的方面，本發(fā)明涉及基本上無P-葡糖苷酶活性的蛋白產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明分離的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語"富含"表示所述組合物的(3-葡糖苷酶活性，以例如至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增加。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、j3-葡糖苷酶、卣素過氧化酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、'禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢詫ㄓ谒鼋M合物中的多肽依照本領(lǐng)域內(nèi)已知方法穩(wěn)定。以下提供的實施例是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法決定。用途本發(fā)明還涉及使用具有p-葡糖苷酶活性的多肽或其組合物的方法，如下所述。將生物質(zhì)降解為單糖、二糖和多糖本發(fā)明還涉及用于降解和轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在有效量的具有(3-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白處理所述纖維素材料。本發(fā)明的多肽和宿主細胞，如本文所述，可用于從生物質(zhì)產(chǎn)生作為化學(xué)或發(fā)酵原料的單糖、二糖和多糖，用于乙醇、塑料或其它產(chǎn)物或中間物的產(chǎn)生。具有(3-葡糖苷酶活性的多肽可以是去除或不去除細胞的粗發(fā)酵液形式，或是半純化或純化的酶制備物形式。P-葡糖苷酶蛋白還可以是單成分制備物、多成分蛋白制備物，或多成分和單成分蛋白制備物的組合?；蛘?，本發(fā)明的宿主細胞可以在使用生物質(zhì)的發(fā)酵方法中用作具有|3-葡糖苷酶活性的多肽的來源。宿主細胞還可含有天然的或異源的基因，所述基因編碼纖維素分解蛋白以及其它在生物質(zhì)加工中有用的酶。具體而言，本發(fā)明的多肽和宿主細胞可用于通過部分或完全降解纖維素或半纖維素來增加加工殘余物(干燥的酒糟、來自酉良造的酒糟(spentgrainsfrombrewing)、甘蔗渣等)的價值。生物質(zhì)可以包括但不限于木材資源、城市固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物(參見，例如Wiselogel"a/.，1995，inHandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman,editor),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman,1994，5/<9/^y<9M/-ce7fec/wo/ogv50:3-16;Lynd,1990,飾tec/wo/ogy24/25:695-719;Mosierda/.，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics，inj(iv朋c&s1B/oc/zem/ca/￡wgz>7een'"g/8fofec/mo/ogy，T.Scheper,managingeditor,Volume65，pp.23-40,Springer-Verlag,NewYork)。生物質(zhì)初生細胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細胞壁(secondarycellwall)在細胞停止生長后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過聚合木質(zhì)素共價交聯(lián)至半纖維素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性P-(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要作為平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，纖維素分解蛋白可以是將纖維素材料加工成葡萄糖中，或?qū)肜w維素材料加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，它們的聚合物或如下所述源自它們的產(chǎn)物中涉及的任何蛋白。如上所述，本發(fā)明的宿主細胞可以用作具有|3-葡糖苷酶的多肽的來源，和作為天然或異源纖維素分解蛋白以及在生物質(zhì)加工中有用的其它酶的來源。纖維素分解蛋白還可以是單成分制備物，例如，纖維素；多成分制備物，例如，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶；或多成分和單成分蛋白制備物的組合。在酸性、中性或堿性中任一種的pH范圍內(nèi)，纖維素分解蛋白可具有活性，即，水解纖維素。纖維素分解蛋白可以是真菌或細菌來源，其可以從微生物中獲得或分離并且純化，所述微生物已知能夠產(chǎn)生纖維素分解酶，例如，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鬼傘屬、梭孢殼屬、鐮孢屬、毀絲霉屬、枝頂孢霉屬、頭孑包屬(Cep/w/o5pon'wm)、柱頂孑包屬(》Sc_yto//<i&w)、青霉屬或曲霉屬的菌種(參見，例如，EP458162)，特別是由選自以下菌種的菌抹產(chǎn)生的那些特異腐質(zhì)霉(重新歸類為5byta/W/wmAermop/n7wm,參見例如，美國專利No.4,435,307)、灰蓋鬼傘、尖鐮孢、嗜熱毀絲霉、巨多孔菌(Men)^7wg/ga"&w》、土生梭孢霉、枝頂孢霉屬菌種(」d/c/ro/^05porMm、ylcre/woMZ'w柳oZc/av<^Mm、Jcrewow/wm//wA:erfow/ae、鄉(xiāng)工灰斗支丁貞孑包霉(Jcre附ow/w附roseogn、eww)、Jcre附ow/w附/"co/orofw附牙口^cre附cw/w附/Mra似附；優(yōu)選地選自以下菌種特異腐質(zhì)霉DSM1800、尖鐮孢DSM2672、嗜熱毀絲霉CBS117.65、頭孢屬菌種(C印/^/w;wr/wwsp.)RYM-202、枝頂孢霉屬菌種CBS478.94、枝頂孢霉屬菌種CBS265.95、^cw朋/ww/era/c/"wmCBS169.65、爿cremom'wwacwwom.wwAHU9519、頭孑包屬菌種CBS535.71、^crewow/wm6n3c/^/e"/wmCBS866.73、^cr^mow/wm(^'c/ro附asporw附CBS683.73、爿"e膨w/訓(xùn)06c/ava/謂CBS311,74、爿cre,m.訓(xùn)//"/fe加m'aeCBS157.70、紅灰枝頂孢霉CBS134.56、^crcmom'ww/"co/ora^mCBS146.62和Jcmwom'Mm/wrammCBS299.70H。纖維素分解蛋白還可以獲得自木霉屬(特別是綠色木霉、里氏木霉和康寧木霉)、嗜堿的芽孢桿菌屬(alkalophilicfiac/〃w)(參見，例如，美國專利No,3，844，890和EP45S162)和鏈霉菌屬(參見，例如，EP458162)。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的變體。特別適合的纖維素分解蛋白是^5成性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實例是EP495,257、EP531,372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實例是纖維素酶變體，例如在WO94/07998、EP531,315、美國專利No.4，435，307、美國專利No.5,457,046、美國專利No.5,648,263、美國專利No.5,686,593、美國專利No.5，691，178、美國專利No.5,763,254、美國專利No.5,776,757、WO89/09259、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解蛋白可以使用本領(lǐng)域已知的方法，通過在含有合適的碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述微生物菌抹產(chǎn)生(參見，例如，Bennett,J.W.andLaSure,L.(eds.),M,Ge恥M畫—&AcademicPress,CA,1991)。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的成分制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。適合于培養(yǎng)和纖維素分解蛋白產(chǎn)生的溫度范圍和其它條件是本領(lǐng)域已知的(參見，i列^;口，Bailey,.E.，andOllis，D.F.,S/oc/zewz'c"/五"g/weer/"g尸w"d"wew/^/5，McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。發(fā)酵可以是任何培養(yǎng)細胞而致使纖維素分解蛋白的表達或分離的方法。因此，發(fā)酵可以被理解為包括在合適培養(yǎng)基中和允許表達或分離纖維素分解蛋白的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的、規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生得到的纖維素分解蛋白可以通過常規(guī)方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。其后可將回收的蛋白通過多種層析方法進一步純化，例如，離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。纖維素分解蛋白可能水解或總是水解羧曱基纖維素(CMC)，從而減少溫育混合物的粘度。產(chǎn)生的粘度的減少可以通過振動粘度計測定(例如，來自Sofraser，F(xiàn)rance的MIVI3000)。依照纖維素酶粘度單位(CellulaseVicosityUnit;CEVU)測量的纖維素酶活性測定，通過測量樣品減少羧曱基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來定量樣品中存在的催化活性的量。所述測定在適合于纖維素分解蛋白和底物的溫度牙口pH進4亍。3寸于CelluclastTM(NovozymesA/S，Bagsvard，Denmark),所述測定在40。C在0.1M磷酸pH9.0緩沖液中進行30分鐘，使用CMC作為底物(33.3g/L羧甲基纖維素Hercules7LFD)和大約3.3-4.2CEVU/ml的酶濃度。相對于公告的酶標準例如CELLUZYMEStandard17-1194(從NovozymesA/S,Bagsvaerd，Denmark獲得)計算CEVU活性。適合在本發(fā)明中使用的纖維素分解制備物的實例包括，例如，CELLUCLAST(可從NovozymesA/S獲得)和NOVOZYM188(可從NovozymesA/S獲得)。其它可以使用的商業(yè)上能夠獲得的包含纖維素酶的制備物包括CELLUZYME、CEREFLC)tm和ULTRAFLOtm(NovozymesA/S)，LAMINEXtm和SPEZYMECP(GenencorInt.)，和ROHAMENT7069W(R6hmGmbH)。將纖維素酶以大約0.001%至大約5.0%的固體重量，更優(yōu)選大約0.025%至大約4.0%的固體重量，和最優(yōu)選大約0.005%至大約2.0%的固體重量的有效量添加。如上所述，在本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解蛋白可以是單成分制備物，即，基本上無其它纖維素分解成分的一種成分。所述單一成分可以是重組成分，即，通過克隆編碼單一成分的DNA序列，其后用所述DNA序列轉(zhuǎn)化細胞并且在宿主中表達產(chǎn)生(參見，例如，WO91/17243和WO91/17244)。單成分纖維素分解蛋白的其它實例包括但不限于JP-07203960-A和WO-9206209中公開的那些。宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對于宿主是異源的)，但是在特定條件下宿主也可以是同源宿主(酶對于宿主是天然的)。單成分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液純化這種蛋白來制備。在本發(fā)明方法的實踐中有用的單成分纖維素分解蛋白的實例包括但不限于內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和在降解纖維素生物質(zhì)中有用的其它酶。術(shù)語"內(nèi)切葡聚糖酶"在本文定義為內(nèi)-l,4-(3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l,4-卩-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物、地衣淀粉、與{3-1，3葡聚糖混合的P-l,4鍵例如谷類p-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其它含有纖維素成分的植物材料中1,4-(3-D-糖苷鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。就本發(fā)明而言，才艮據(jù)Ghose,1987，ow/C7^肌59:257-268的方法，使用羧甲基纖維素(CMC)水解來測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。將一單位的內(nèi)切葡聚糖酶活性定義為在50。C、pH4.8每分鐘產(chǎn)生l.O樣i摩爾還原糖。術(shù)語"纖維二糖水解酶"在本文定義為1，4-(3-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2丄91),其催化纖維素、纖維寡糖或任何含(3-l，4-連接的葡萄糖的聚合物中1,4-p-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原端釋放纖維二糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)由Lever"a/.，1972,加/.腸c/j綴47:273-279和由Tilbeurgh"a/.,1982,F五^SZe欲ra149:152-156;vanTilbeurghandClaeyssens，1985，187:283-288描述的方法測定纖維二糖水解酶活性。將本發(fā)明的多肽與纖維素分解蛋白結(jié)合使用，以將生物質(zhì)底物的纖維素和/或半纖維素成分降解成糖，如上所述(參見，例如，Brigham""/.,1995,inZ/awt^ooA:o"A.oW/zaw/(CharlesE.\Vyman，editor),pp.119-141,Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Lee，1997,c/owrw"/o/^/o/ec/wo/o^56:1-24)。本發(fā)明的方法可進一步包括使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法回收降解的纖維素材料。具有葡糖苷酶活性的多肽和纖維素分解蛋白的最優(yōu)量依賴于幾種因素，所述因素包括但不限于纖維素分解蛋白成分的混合物、纖維素底物、纖維素底物的濃度、纖維素底物的預(yù)處理、溫度、時間、pH和發(fā)酵生物的內(nèi)含物(例如，用于同時糖化和發(fā)酵的酵母)。術(shù)語"纖維素分解蛋白"在本文定義為在測試條件下能夠水解或轉(zhuǎn)化或降解纖維素的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合物。它們的量通常通過普通測定法例如BCA(二金雞寧酸(bicinchoninicacid)，P.K.Smithda/.，1985,爿"a/.傷oc/zem.150:76)測量，并且優(yōu)選添加的量與祐L7JC解的生物質(zhì)的量成比例。在優(yōu)選的方面，每克的纖維素材料具有|3-葡糖苷酶活性的多肽的量是每克的纖維素材料大約0.01至大約2.0mg,優(yōu)選大約0.025至大約1.5mg，更優(yōu)選大約0.05至大約1.25mg,更優(yōu)選大約0.075至大約1.25mg，更優(yōu)選大約0.1至大約1.25mg，甚至更優(yōu)選大約0.15至大約1.25mg，并且最優(yōu)選大約0.25至大約1.0mg具有f3-葡糖苷酶活性的多肽。在另外的優(yōu)選方面，每克的纖維素材料纖維素分解蛋白的量是每克的纖維素材料大約0.5至50mg，優(yōu)選大約0.5至40mg,更優(yōu)選大約0.5至25mg，更優(yōu)選大約0.75至20mg，更優(yōu)選大約0.75至15mg，甚至更優(yōu)選大約0.5至10mg,并且最優(yōu)選大約2.5至10mg纖維素分解蛋白。本發(fā)明的方法可以用于將纖維素材料加工成許多有用的物質(zhì)，例如，有機產(chǎn)品、化學(xué)品和燃料。除乙醇之外，能夠從纖維素產(chǎn)生的某些日用和專用化學(xué)品包括木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、賴氨酸、有機酸(例如，乳酸)、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糖醛、聚羥鏈烷酸酯/鹽(polyhydroxyalkanoate)、順，順-己二烯二酸和動物飼料(Lynd，L.R.,Wyman,C.E.,andGerngross，T.U"1999,腸com膨d/(vE"g/"ee〃'wg,腸阮/wo/.15:777-793;Philippidis,GP.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,inZ/awcfeooA:5/oef/za"o/:尸radwc"c"朋dWfe加'ow，Wyman，C.E.,ed.，Taylor&Francis,Washington,DC179-212;和Ryu,D.D.Y"andMandels,M.，1980，Cellulases:biosynthesisandapplications,M/craZ).7k;/2"o/.，2:91-102)。在從可發(fā)酵的糖合成多種有機產(chǎn)物之上延伸出潛在副產(chǎn)(potentialcoproduction)的益處。在生物加工之后剩余的富含木質(zhì)素的殘余物能夠轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素衍生的化學(xué)品，或用于動力產(chǎn)生。設(shè)備進行。這種設(shè)備可包括間歇攪拌反應(yīng)器(batch-stirredreactor)、帶有超濾的連續(xù)^L動才:ti半反應(yīng)器(continuousflowstirredreactorwithultrafiltration)、連纟賣5舌塞式流動柱反應(yīng)器(continuousplug-flowcolumnreactor)(Gusakov,A.V.，andSinitsyn,A.R,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Af/croZ).7^c/wc>/.7:346-352)、研磨反應(yīng)器(attritionreactor)(Ryu,S.K.,andLee,J.M"1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Wotec/zwo/.歷固g.25:53-65)或帶有電磁場引發(fā)的強烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P"Davydkin，I.Y"Davydkin，V.Y.,Protas，O.V"1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,jpp/.B/oc/zew.B/ofec/wo/,56:141-153)。常規(guī)方法包括但不限于糖化、發(fā)酵、獨立水解和發(fā)酵(SHF)、同時糖化和發(fā)酵(SSF)、同時#唐化和共同發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandcofermentation;SSCF)、〉'昆合水角年和發(fā)酵(hybridhydrolysisandfermentation;HHF)和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用獨立的加工步驟，首先將纖維素酶水解成葡萄糖，其后將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。在SSF中，將纖維素的酶水解和葡萄糖發(fā)酵成乙醇組合在一步中(Philippidis,G.R，1996，Cellulosebioconversiontechnology,inT/aw必ooA:朋S/oef/zawo/:尸/WwWo""wdW/iz加'o",Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共同發(fā)酵(Sheehan,J.，andHimme,M.,999，Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol，說o/ec/z"o/.15:817-827)。HHF包4舌在相同反應(yīng)器中，但是在不同的溫度進行的兩個獨立步驟，即，高溫酶糖化和之后在發(fā)酵菌株能夠耐受的低溫的SSF。DMC將所有三個過程(纖維素酶產(chǎn)生、纖維素水解和發(fā)酵)結(jié)合在一步中(Lynd，L.R.，Weimer,P.J.，vanZyl，W.H.，andPretorius，I.S.，2002,Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology,Aficra6i'o/.Mo/.￡!'o/.i^ev/ews66:506-577)。"發(fā)酵"或"發(fā)酵方法"指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。膠方法包括但不限于，用以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵方法，所述產(chǎn)物包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有才幾酸(例如，乙酸、丙酮酸、己二酸、抗壞血酸、^f寧檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、蟻酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，曱烷、氫(H2)、二氧化碳(C02)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵方法還包括在消耗性醇工業(yè)(consumablealcoholindustry)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品工業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的發(fā)酵方法。本發(fā)明進一步涉及用于產(chǎn)生物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)包括(a)在有效量的具有p-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)中的糖化纖維素材料；和(c)從發(fā)酵中回收所述物質(zhì)。具有(3-葡糖苷酶活性的多肽可以是含有或不含細胞的粗發(fā)酵液形式，或是半純化或純化的酶制備物形式。P-葡糖苷酶蛋白可以是單成分制備物、多成分蛋白制備物，或多成分和單成分蛋白制備物的纟且合。所述物質(zhì)可以是任何源自發(fā)酵的物質(zhì)。在優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是醇。應(yīng)該理解的是，術(shù)語"醇，，包括含有一個或多個羥基部分的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，醇是阿拉伯糖醇。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是丁醇。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是乙醇。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是甘油。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是曱醇。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是1,3-丙二醇。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是山梨糖醇。在另外的更優(yōu)選的方面，醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du，J.，andTsao,G.T.，1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,in^civ(3"ces所oc/zew/ca/五wg/"een."g/S/c^ec/zwo/ogy，Scheper,T.,ed.,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Silveira,M.M.,andJonas,R.，2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,jp//.Af/croZ^.o/.59:400-408;Nigam，R,andSingh,D.,1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol—asugarsubstitute,iVoc&w5wc/ew/M^y30(2):117-124;Ezeji，T.C.，Qureshi，N.andBlaschek,H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyC/o血.(i/畫Z)咖"'wcA://BA101and*recoverybygasstripping,Jowma/o/Af/croZ/(9/(3gy"/^/5/ofec/wo/ogK19(6):595-603。在另外的優(yōu)選方面，所述物質(zhì)是有機酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是乙酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是丙酮酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是己二酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是抗壞血酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是檸檬酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是2,5-二酮-D-葡萄糖酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是乙酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是反丁烯二酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是葡糖二酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是葡萄糖酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是葡糖醛酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是戊二酸。在另外的優(yōu)選方面，有機酸是3-羥基丙酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是衣康酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是乳酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是蘋果酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是丙二酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是草酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是丙酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是琥珀酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是木糖酸。參見，例^口,Chen，R.，andLee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,祝oc/z柳.所o/ec/z"o/.63-65:435-448。在另外的優(yōu)選方面，所述物質(zhì)是酮。應(yīng)該理解的是術(shù)語"酮"包括含有一個或多個酮部分的物質(zhì)。在另外的更優(yōu)選的方面，酮是丙酮。參見，例如QureshiandBlaschek,2003，見上文。在另外的優(yōu)選方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另外的更優(yōu)選的方面，有機酸是天冬氨酸。在另外的更優(yōu)選的方面，氨基酸是谷氨酸。在另外的更優(yōu)選的方面，氨基酸是甘氨酸。在另外的更優(yōu)選的方面，氨基酸是賴氨酸。在另外的更優(yōu)選的方面，氨基酸是絲氨酸。在另外的更優(yōu)選的方面，氨基酸是蘇氨酉交。參見，例i口，Richard,A"andMargaritis，A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,a"<i5we"g/"een'"g87(4):501-515。在另外的優(yōu)選方面，所述物質(zhì)是氣體。在另外的更優(yōu)選的方面，氣體是甲烷。在另外的更優(yōu)選的方面，氣體是H2。在另外的更優(yōu)選的方面，氣體是C02。在另外的更優(yōu)選的方面，氣體是CO。參見，例如，Kataoka,N.,A.Miya，andK.Kiriyama,1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,5We"ce朋d7fec/wo/ogy36(6-7):41-47;和GunaseelanV.N.inVol.13(1-2)，pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。物質(zhì)從纖維素材料的產(chǎn)生通常需要四個主要步驟。這四個步驟是預(yù)處理、酶水解、發(fā)酵和回收。下文示例的是用于產(chǎn)生乙醇的方法，但是應(yīng)理解的是可將類似的方法用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，例如，上述的物質(zhì)。預(yù)處理。在預(yù)處理或預(yù)水解步驟中，加熱纖維素材料以分解木質(zhì)素和糖結(jié)構(gòu)，水解大多數(shù)半纖維素，并且使纖維素級分易于被纖維素分解酶接近。直接用蒸汽進行加熱，或在漿中進行加熱，還可在所述漿中向材料添加催化劑以加速反應(yīng)。催化劑包括強酸，例如硫酸和so2,或堿，例如氫氧化鈉。預(yù)處理步驟的目的是促進酶和微生物的滲透。還可對纖維素生物質(zhì)進行水熱蒸汽噴發(fā)子貞處理(hydrothermalsteamexplosionpre-treatment)(參見美國專利ApplicationNo.20020164730)。糖化。在酶水解步驟中(也稱糖化)，將如本文所述的酶添加至預(yù)處理的材料以將纖維素級分轉(zhuǎn)化成葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在攪拌釜式反應(yīng)器或發(fā)酵罐中在受控的pH、溫度和混合條件下進行。糖化步驟可持續(xù)多至200小時。糖化可以在大約30。C至大約65。C，特別是大約50°C的溫度，和大約4至大約5的pH，特別是大約pH4.5進行。為了產(chǎn)生酵母能夠代謝的葡萄糖，水解通常在具有(3-葡糖苷酶活性的多肽存在下進行。發(fā)酵。在發(fā)酵步驟中，通過發(fā)酵生物如酵母將預(yù)處理和酶水解步驟后從纖維素材料釋放的糖發(fā)酵成乙醇。發(fā)酵還可與酶水解在相同的容器中同時進行，也在受控的pH、溫度和混合條件下。當糖化和發(fā)酵在相同的容器中同時進行時，通常將該方法稱為同時糖化和發(fā)酵或SSF?？梢詫⑷魏魏线m的纖維素底物或原料使用在本發(fā)明的發(fā)酵方法中。底物通?；谄谕陌l(fā)酵產(chǎn)物選擇，即，基于從發(fā)酵獲得的物質(zhì)選擇，并且使用的方法是本領(lǐng)域熟知的。適合于在本發(fā)明的方法中使用的底物的實例包括含有纖維素的材料，例如木材或植物殘余物或低分子糖DP1-3,其獲得自能夠由發(fā)酵微生物代謝的經(jīng)過加工的纖維素材料，并且所述底物可以通過直接添加至發(fā)酵培養(yǎng)基來供應(yīng)。術(shù)語"發(fā)酵培養(yǎng)基，，應(yīng)理解為意指在添加發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，例如，從糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及在同時糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。"發(fā)酵微生物"指適合于在期望的發(fā)酵方法中使用的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明合適的發(fā)酵微生物能夠?qū)⑻前l(fā)酵，即直接地或間接地轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物，所述糖例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖。發(fā)酵微生物的實例包括真菌生物，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬亞種(Sacc/zaramFMspp.)的菌株，并且具體而言為釀酒酵母。商業(yè)上能夠獲得的酵母包括，例如，RedStar/TM/LesaffreEthanolRed(可從RedStar/Lesaffre，USA獲得)FALI(可從BumsPhilpFoodInc.,USA的分公司Fleischmann,sYeast獲得)、SUPERSTART(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB,Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬亞種。在更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Sacc/zaramycesafota"ciw)。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(&cc/7"ra/^ycasmwwm)。在另夕卜的優(yōu)選方面，酵母是克魯維酵母屬亞種(K/wyveramyc"spp)。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是馬克思克魯維酵母(X/w"eram，"mw:dam^)。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母(《/"，^^2>^"1/^^7/力。在另外的優(yōu)選方面，酵母是念珠菌屬亞種(OmA^spp)。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶念珠菌(Cam//(ia/wei^/ofra//C(^;s)。在另夕卜的更4尤選的方面，酵母是C""&<iaZraMfcae。在另外的優(yōu)選方面，酵母是C/av/woraspp。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是C7"v^;ora/ww'taw/<3e。在另夕卜的更4尤選的方面，酵母是C/av&jwraopw"""e。在另外的優(yōu)選方面，酵母是管嚢酵母屬亞種(尸ac/7^o/e"spp)。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是管嚢酵母CPflc/z;^o/ewtow7op/H7w)。在另外的優(yōu)選方面，酵母是酒香酵母屬亞種(^^o"wwy/cwspp)。在另外的更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(&"a朋固ycesc/a騰m'〖)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,inB/0ef/2aw0/:/Voc/w"/o"L^7/za"o":Wyman,C.E.，ed.，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能夠有效地將葡萄糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括，例如，Zywomo"asmoW/"和CVa^r/c^'M/Mf/^rwoce〃ww(Philippidis，1996,見上文)。本領(lǐng)域熟知的是上述生物還能夠用以產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。釀酒酵母中異源基因的克隆(Chen，Z.,Ho,N.W.Y.,1993，CloningandimprovingtheexpressionofJ^.c/z/aWi^/"51xylosereductasegeneinY"Chen,Z,Brainard,A.P.,1998，GeneticallyengineeredSacc/zarawycayyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,J;//.￡>v/rcw.AfifcroZn'o/.64:1852-1859)，或細菌中例如大腸桿菌(Beall，D.S.,Ohta,K.,Ingram,L.O.,1991，Parametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinant￡sc/e"'c/n'flco//，說'ofec/.B/oewg.38:296-303)、催產(chǎn)克雷伯氏菌o豐oca)(Ingram,L.O.，Gomes，P.F.，Lai,X.，Moniruzzaman，M.，Wood,B.E.，Yomano，L.P"York,S.W.，1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,所o/ec/zMo/.58:204-214)和Z戸謂cwos(Zhang,M.,Eddy，C.，Deanda,K.,Finkelstein,M.,andPicataggio，S.，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZ少脂,"os1歸緣、,5Wewce267:240-243;Deanda,K.，Zhang,M.,Eddy,C.，andPicataggio,S.,1996,Developmentofanarabinose-fermentingwoZ/tostrainbymetabolicpathwayengineering,￡>7v/nM/craZ^o/.62:4465-4470)中異源基因的克隆致使能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化成乙醇(共同發(fā)酵)的生物體的構(gòu)建。通常將酵母或其它微生物添加至降解的纖維素或水解產(chǎn)物，并且將發(fā)酵持續(xù)進行大約24小時至大約96小時，例如大約35至大約60小時。溫度通常在大約26。C至大約40。C,具體而言在大約32。C，并且在大約pH3至大約pH6，具體而言大約pH4-5。在優(yōu)選的方面，將酵母或其它微生物添加至降解的纖維素或水解產(chǎn)物，并且將發(fā)酵持續(xù)進行大約24至大約96小時，例如通常為35-60小時。在優(yōu)選的方面，溫度通常在大約26至大約40。C，具體而言為大約32。C,并且pH通常在大約pH3至大約pH6，優(yōu)選為大約pH4-5。優(yōu)選地將酵母或其它微生物以大約105至1012,優(yōu)選為大約107至101G，特別是大約5xl(f活菌計數(shù)每ml發(fā)酵液的量應(yīng)用。在乙醇產(chǎn)生階段期間，酵母細胞計數(shù)應(yīng)該優(yōu)選在大約107至101()，特別是大約2x108。使用酵母用于發(fā)酵的進一步指導(dǎo)可參見例如"TheAlcoholTextbook"(EditorsK.Jacques,T.P.LyonsandD.R.Kelsall，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)，將其作為參考并入本文。本領(lǐng)域中最廣泛使用的方法是同時糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中沒有糖化的保持階段(holdingstage),意味著共同添加酵母和酶。對于乙醇產(chǎn)生，在發(fā)酵之后蒸餾醪液以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即可飲用中性酒精(potableneutralspirits),或工業(yè)乙酉事?？梢詫l(fā)酵刺激物與本文所述的任何酶方法組合使用，以進一步改進發(fā)酵方法，具體而言，改進發(fā)酵微生物的性能，例如，速率增加和乙醇產(chǎn)率。"發(fā)酵刺激物"指發(fā)酵微生物生長的刺激物，所述發(fā)酵微生物具體而言是酵母。優(yōu)選的生長發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物。維生素的實例包括多種維生素(multivitamin),生物素、泛酸(pantothenate)、煙酸、中肌醇、硫胺素、吡口多醇、對氨基苯曱酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見，例如，Alfenoreefa/.，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002),將其作為參考并入本文。礦物的實例包括能夠4是供營養(yǎng)的礦物和礦物鹽，例如P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu?；厥?。將醇從發(fā)酵的纖維素材料分離并且通過常規(guī)的蒸餾方法純化。能夠獲得純度高至96體積％乙醇的乙醇，其能夠用作例如燃料乙醇，飲用乙醇，即可飲用中性酒精，或工業(yè)乙醇。對于其它物質(zhì)，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、蒸餾或提取。在本發(fā)明的方法中，可向纖維素分解蛋白和(3-葡糖苷酶多肽補充一種或多種額外的酶活性以改進纖維素材料的降解。優(yōu)選的額外的酶是半纖維素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質(zhì)酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或它們的混合物。在本發(fā)明的方法中，可以將額外的酶在發(fā)酵之前或發(fā)酵期間添加，包括在發(fā)酵微生物的增殖期間或之后。本文引用的酶可以源自或獲得自任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母或哺乳動物來源。術(shù)語"獲得"在本文的意思是所述酶可從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的微生物中分離。術(shù)語"獲得"在本文中還意指所述酶可在宿主生物中以重組方法產(chǎn)生，其中所述以重組方法產(chǎn)生的酶對于該宿主生物是天然的或異源的或具有修飾的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代了一個或多個氨基酸，即，以重組方法產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段或是由本領(lǐng)域已知的核酸改組方法產(chǎn)生的酶。在天然酶的含義內(nèi)包括天然變體，在異源酶的含義內(nèi)包括以重組方法獲得的變體，例如通過定位誘變或改組獲得的變體。所述酶還可以是純化的。術(shù)語"純化的，，用于本文涵蓋不含其它成分的酶，所述其它成分來自所述酶源自的生物。術(shù)語"純化的"還涵蓋下述酶，所述酶不含來自獲得該酶的天然生物的成分。所述酶可以是純化的，僅存在小量的其它蛋白質(zhì)。表述"其它蛋白質(zhì)"具體涉及其它酶。術(shù)語"純化的"用于本文還指去除存在于本發(fā)明酶來源的細胞中的其它成分，特別是其它蛋白質(zhì)，并且最特別是其它酶。酶可以是"基本上純的"，即，不含來自產(chǎn)生該酶的生物的其它成分，所述生物即，例如，用于以重組方法產(chǎn)生酶的宿主生物。在優(yōu)選的方面，酶是至少75%(重量/重量)，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少98%，或最優(yōu)選至少99%純。本發(fā)明中使用的酶可以是任何適合于在本文所述的方法中使用的形式，例如，含有或不含細胞的粗發(fā)酵液，干燥粉末或顆粒，無粉塵(non-dusting)顆粒，液體，穩(wěn)定化的液體或保護酶(protectedenzyme)。顆?？梢岳缦衩绹鴮＠鸑os.4,106,991和4,661,452中公開的來產(chǎn)生，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法來包覆。液體酶制備物可以例如^4居已經(jīng)確定的方法通過添加穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，所述穩(wěn)定劑例如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有機酸。保護酶可以根據(jù)EP238,216中公開的方法來制備。洗滌劑(detergent)組合物可以將本發(fā)明的具有(3-葡糖苷酶活性的分離的多肽添加至洗滌劑組合物，并且因此成為所述洗滌劑組合物的成分?？梢詫⒈景l(fā)明的洗滌劑組合物例如配制為手洗或機洗的洗滌劑組合物，包括適于預(yù)處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和添加了漂洗劑的織物柔軟劑組合物，或?qū)⑵渑渲茷橛糜谕ǔ＜彝ビ脖砻媲謇聿僮鞯南礈靹┙M合物，或配制用于手洗或機洗的洗碟(dishwashing)操作。在具體的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的具有j3-葡糖苷酶的多肽的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一個或多個其它酶，例如蛋白酵、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(ambinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或過IU七物酶。通常選擇的酶的性質(zhì)應(yīng)該與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH,與其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶成分應(yīng)該以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。微生物來源是優(yōu)選的。其中包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源)和鐮孢屬蛋白酶，在WO89/06270和WO94/25583中描述。有用的蛋白酶的實例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和W098/34946中描述的變體，特別是在一個或多個以下位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase、Duralase、EsperaseTM禾口KannaseTM(NovozymesA/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM牙口FN3TM(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶:合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自如下的脂肪酶腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬(r/zemwmyc"))，例如，來自疏棉狀腐質(zhì)霉(細毛嗜熱霉(r/a"wg/mww")如EP258068和EP305216中所述，或來自特異腐質(zhì)霉如WO96/13580中所述，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產(chǎn)堿假單胞菌(尸fl/ca"ge"es)或類產(chǎn)堿假單胞菌(尸戸ew^a/c^geM&s)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(Pcepac/a)(EP331376)、施氏假單胞菌(Ps似teen〕(GB1,372,034)、熒光假單胞菌(i5/wwe"e"力、假單胞菌屬菌種CPwwobmowww.)菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、H^co似/"era"(WO96/12012)、芽孢桿菌屬脂肪酶，例如，來自枯草芽孢桿菌(Dartoisa/.,1993,"5/op/z;^/c"爿cto,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(WO91/16422)的脂肪酶。其它實例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括LipolaseTM、Lipex和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。淀粉酶:合適的淀粉酶(a和/或P)包括細菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的a-淀粉酶，例如，地衣芽孢桿菌的特殊菌林，在GB1,296,839中有更詳細的描述。有用的淀粉酶的實例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上能夠獲得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶:合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬或木霉屬菌屬的纖維素酶，例如，產(chǎn)生自特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開于美國專利No.4,435,307、美國專利No.5,648,263、美國專利No.5,691,178、美國專利No.5,776,757和WO89/09259。特別合適的纖維素酶是堿性或中性纖維素酶，其具有保護顏色的益處(colorcarebenefits)。這種纖維素酶的實例是在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實例是纖維素酶變體，例如在WO94/07998、EP0531315、美國專利No.5，457，046、美國專利No.5,686,593、美國專利No.5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括Celluclast、CelluzymeTM和Carezyme(NovozymesA/S)、Clazinase和PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.)和KAC-500(B)TM(KaoCoiporation)。過氧化物酶/氧化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬的過氧化物酶，例如，來自灰蓋鬼傘及其變體，如在wo93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。商業(yè)上能夠獲得的過氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。通過添加含有一種或多種酶的單獨的添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中?？蓪⒈景l(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨的添加劑或組合的添加劑)配制成例如，顆粒、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，具體為無粉塵顆粒，液體，具體為穩(wěn)定的液體，或漿。例如，可以如美國專利Nos.4,106,991和4,661,452中所公開的產(chǎn)生無粉塵顆粒，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法包覆。蠟制包覆材料(waxycoatingmaterial)的實例是具有1000至20000的平均摩爾量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);具有從16至50個的環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有從12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。適合于流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜涂覆材料的實例提供于GB1483591。例如，可根據(jù)已經(jīng)建立的方法通過添力口多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定液體酶制劑?？梢愿鶕?jù)公開于EP238,216中的方法來制名—呆護酶。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%的水和0-30%的有才幾;容劑，或非水的(non-aqueous)。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，其可以是非離子的，包括半極性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。所述表面活性劑通常以按重量計0.1%至60%的水平存在。當包括于此時，所述洗滌劑將通常含有大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、a-烯烴磺酸酯(olefmsulfonate)、烷^i^克酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸鹽(alcoholethoxysulfate)、仲鏈烷磺酸鹽(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸，或肥皂(soap)。當包括于此時，洗滌劑將通常含有大約0.2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二曱基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物("葡糖酰胺(glucamide)")。洗滌劑可以含有0-65。/。的洗滌劑增清劑(builder)或復(fù)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯(phosphonate)、碳酸鹽(carbonate)、檸檬S吏鹽、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例是羧曱基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、馬來S^/丙蹄酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包含H202源例如過硼酸鹽或過^友酸鹽，其可以與形成過酸的漂白激活劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯石黃酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合。或者，漂白體系可以包含過氧酸，例如，酰胺、二酰亞胺(imide)或砜類型的過氧酸。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸書f生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4-曱酰苯基硼酸(4-formylphenylboronicacid),并可例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制所述組合物。洗滌劑還可以含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如，織物整理劑(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、防污再沉積劑、染料、殺菌劑、光亮劑(opticalbrightener)、水溶助劑(hydrotrope)、晦暗抑制劑(tarnishinhibitors)或香泮牛。在洗滌劑組合物中的任何酶，特別是本發(fā)明的酶，可以按相當于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量添加。本發(fā)明的酶可以額外地并入7>開于WO97/07202的洗滌劑配制物，WO97/07202在本文中作為參考文獻并入。其它用途本發(fā)明的具有(3-葡糖苷酶活性的多肽還可以與其它糖原水解酶和相關(guān)的酶組合使用，如本文所述，在紡織品的處理中作為生物拋光劑和用于減少絨毛(ftizz)、起球、紋理變形和石洗(stonewashing)(N.K.Lange,inP.Suominen，T.Reinikainen(Eds.)，7Hc/zocfe，aree化/ce〃w/os&y朋d/^/ro/osas,FoundationforBiotechnicalandIndustrialFermentationResearch,Helsinki,1993，pp.263-272)。此外，描述的多肽還可與其它糖原水解酶和相關(guān)的酶組合使用，如本文所述，在木材加工中用于生物制漿或剝皮(debarking),在造紙中用于纖維改性、漂白和降低精煉能源消耗，使用在對廢水循環(huán)重要的白水處理中，使用在木質(zhì)纖維素纖維循環(huán)再生例如脫墨和二次纖維加工中，和使用在木材殘余物利用中(S.D，MansfieldandA.R.EsteghlalianinS.D,Mansfieldand丄N.Saddler(Eds.)，7^/7//c加'cvw五"z戸ayto丄z'g"c^〃w/os7'(^，ACSSymposiumSeries855,Washington,D.C,2003,pp.2-29)。信號肽和前肽本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至19或由SEQIDNO:2的氨基酸1至19組成的信號肽。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸20至36或由SEQIDNO:2的氨基酸20至36組成的前肽。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至36或由SEQIDNO:2的氨基酸1至36組成的前原肽。在優(yōu)選的方面，信號肽由包含SEQIDNO:1的核苷酸6至62或由SEQIDNO:1的核苷酸6至62組成的多核苷酸編碼。在另外的優(yōu)選方面，前肽由包含SEQIDNO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列組成的多核苷酸編碼。在另外的優(yōu)選方面，前原肽由包含SEQIDNO:1的核苷酸1至108或由SEQIDNO:1的核苷酸1至108組成的多核香酸編碼。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因與第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的一個或兩個可操作地連接，所述第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至19或由SEQIDNO:2的氨基酸1至19組成的信號肽，其允許蛋白質(zhì)分泌至培養(yǎng)基中，所述第二核苷酸序列編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸20至36或由SEQIDNO:2的氨基酸20至36組成的前肽，其中所述基因?qū)τ诘谝缓偷诙塑账嵝蛄惺钱愒吹摹Ｔ趦?yōu)選的方面，所述第一核苷S臾序列包含SEQIDNO:1的核苷酸6至62或由SEQIDNO:1的核苷酸6至62組成。在另外的優(yōu)選方面，所述第二核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列組成。本發(fā)明還涉及包含這些核酸構(gòu)建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。第一和第二核苷g臾序列可以分別地與其它調(diào)控序列或組合地與其它調(diào)控序列一起與異源基因可操作地連接。這些其它調(diào)控序列在上文中描述。如前文所述，當信號肽區(qū)和前肽區(qū)二者均存在于蛋白質(zhì)的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著蛋白質(zhì)的氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。所述蛋白質(zhì)對于宿主細胞可以是天然的或異源的。術(shù)語"蛋白質(zhì)"在本文的意思不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語"蛋白質(zhì)"還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質(zhì)獲得，其中一個或多個對于宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質(zhì)進一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)天然存在的等位基因變異和工程的變異。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報道蛋白(reporter)。在更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在甚至更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶?；蚩梢詮娜魏卧?、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例材料作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑等級的商業(yè)產(chǎn)品。DNA測序使用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA，USA)使用染料終止劑化學(xué)(dyeterminatorchemistry)(Gieseckeda/.,1992,Jewr""/Afe/ZwA38:47-60)進4亍DNA測序。用序列特異性引物孑吏用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)來裝配序列。菌抹使用巴西青霉菌抹IBT20888(IBTCultureCollectionofFungi,TechnicalUniversityofDenmark,Copenhagen,Denmark)作為(3-葡斗唐香酶的來源。將米曲霉BECH2(WO00/30322)用于巴西青霉菌抹IBT20888p-葡糖苷酶的表達。培養(yǎng)基和溶液TE由10mMTris-1mMEDTA組成。LB培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化鈉。LB平板由如下物質(zhì)組成每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15g細菌用瓊脂(BactoAgar)。STC由如下物質(zhì)組成1.2M山梨糖醇、10mMTris-HCl和10mMCaCl2,pH7，5。PEG;容液由如下物質(zhì)組成60°/。PEG4000、10mMTris-HCl和10mMCaCl2,pH7.5。YPM培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成每升10g酵母提取物、20g蛋白胨和2。/。麥芽糖。實施例l:從巴西青霉分離基因組DNA才艮氺居Carlsen，994，Ph.D.thesis,DepartmentofBiotechnology,TheTechnicalUniversityofDenmark,使巴西青霉菌抹IBT20888的孢子在稻(rice)上增殖。用20ml的0.1%Tween20回收孢子，并且以1><106個孢子每ml的濃度接種至500ml帶擋板的搖瓶中100ml含有1%葡萄糖的MandelsandWeber培養(yǎng)基中(MandelsandWeber,1969,C/ze肌《Ser95:394414),所述培養(yǎng)基每升補充有0.25g酵母提取物和O.75g細菌用蛋白胨(Bactopeptone)。在30。C，150rpm有氧培養(yǎng)24小時之后收獲真菌菌絲體。通過NalgeneDS0281-5000濾器(NalgeNuncInternationalCorporation,Rochester,NY,USA)過濾直至干燥來收集菌絲體，并且在液氮中冷凍。將冷凍的菌絲體在千燥水冷的研缽中研磨成粉，并且分裝至螺口小管中。將粉末懸浮在總體積40ml的50mM3-(環(huán)己基氨基)-l-丙磺酸(CAPS)-NaOHpH11緩沖液中，所述緩沖液含有0.5。/o十二烷基硫酸鋰(lithiumdodecylsulfate)和0.5mMEDTA。將懸液置于60°C2小時，并且周期性地通過倒置使其重懸。向懸液添加等體積的用0.1MTris堿中和的酚:氯仿(l:l體積/體積)，并且將小管在轉(zhuǎn)輪(rotatingwheel)上在37。C混合2小時。在SorvallH1000B轉(zhuǎn)子中以2500rpm離心10分鐘之后，將水相(上相)再次用酚:氯仿(l:l體積/體積)再提取(re-extract),并且在15,000xg離心5分鐘。將二次體取的水相添加至2.5M乙酸銨(原液10M)并且置于-20。C直至冷凍。融化之后，將提取物在冷轉(zhuǎn)子中以15,000xg離心20分鐘。棄去沉淀(主要為rRNA),并且通過添加0.7體積的異丙醇使上清中的核酸沉淀。在15,000離心15分鐘之后，用5ml700/。乙醇將沉淀洗滌三次(不重懸)，幾乎徹底地風(fēng)干，并溶解在1.0ml0.1XTE中。將溶解的沉淀轉(zhuǎn)移至兩個1.5ml微量離心管中。通過添加乙酸銨(0.12Sml)至2.0M和乙醇至630/。(1.07ml)，并且在SorvallMC12V微量離心機(KendroLaboratoryProducts,Asheville,NC,USA)中以最高速離心10分鐘，將沉淀溶液析出。將沉淀用70%乙醇洗滌兩次，徹底風(fēng)干，并溶解在500ii10.1XTE中。實施例2:制備基因組DNA文庫使用TOPOShotgunSubcloningKit(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)構(gòu)建基因組文庫。簡而言之，通過在10psi氮下噴霧15秒來剪切總細胞DNA,并使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-lmMEDTA二鈉(TAE)緩沖液在1%瓊脂糖凝膠上進行大小分級。使用MiniEluteTMGelExtractionKit(QIAGENInc,Valencia,CA,USA)將遷移在3-6kb大小范圍的DNA片段切除和洗脫。將洗脫的片段如上使用1%瓊脂糖凝膠再次進行大小分級，并且使用MinffiluteGelExtractionKit將遷移在3-6kb大小范圍內(nèi)的DNA片段切除并且洗脫。將洗脫的DNA片段平端化修復(fù)，并且使用壞堿性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase)(RocheAppliedScience,Manheim，Germany)去石粦酸化。將平端DNA片段根據(jù)制造商的說明書克隆至pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化至電感受態(tài)大腸桿菌TOP10細胞，并且鋪板至補充有每ml100pg氨節(jié)青霉素的LB平板。電穿孔產(chǎn)生了15,300個克隆。實施例3:巴西青霉P-葡糖苷酶的純化將巴西青霉菌抹IBT20888培養(yǎng)在5升生物反應(yīng)器中的4升Mandels和Weber培養(yǎng)基(MandelsandWeber,1969，見上文)中，所述培養(yǎng)基每升補充有1g酵母提取物、3g細菌用蛋白胨、30g纖維素和10g木聚糖。根據(jù)Carlsen,1994，見上文，使孢子在稻上增殖。以lxl(^個孢子每ml接種生物反應(yīng)器。通過添加2MNH4OH或2MHC1將pH保持在5.0。將溫度保持在30°C。通氣是每分鐘4升和300-500rpm。111小時之后，將培養(yǎng)終止，并且將培養(yǎng)液通過3皮璃纖維濾器(GD120，Advantec，Japan)過濾。在室溫在50mM檸檬酸鈉pH4.8中測量j3-葡糖苷酶活性。底物是在50mM檸檬酸鈉pH4.8中的1mM4-硝基苯基-(3-D-吡喃型葡糖苷。(3-葡糖苷酶水解在4-硝基苯酚和葡萄糖之間的葡糖苷配基鍵(agluconicbond)。釋放的4_硝基苯酚在堿性溶液中呈黃色，并且能夠以分光光度計在405nm測定。將一國際單位的活性(U)定義為在pH4.8、25。C每分鐘釋放1微摩爾4-硝基苯酚的酶量。用SDS-PAGE測定蛋白濃度。將15(il樣品添加至Eppendorf管中15^的SDS-PAGE樣品緩沖液(1.17M蔗糖、1MTris—HCL，pH8.5、278mMSDS、2.05mMEDTA、0.88mMBrilliantBlueG和0.2M二碌^蘇糖醇)，并且加熱至70。C，持續(xù)10分鐘。在加熱之后，將稀釋的樣品加樣至預(yù)制的4-12。/。Bis-Tris予貞制凝月交(pre隱castgel)(Invitrogen，Groningen,TheNetherlands)。另夕卜，將Mark12蛋白標準混合物(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)力口樣至所述;IO交。在XcellSureLockTM凝膠設(shè)備(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)中在200V跑膠50分鐘。電泳緩沖液由標準緩沖液(lMMOPS、1MTRIS和1%SDS)的20倍稀釋液制成。將0.5ml體積的NuPAGEAntioxidant(Invitrogen,Carlsbad,CA:USA)添加至上部(陰極)緩沖液槽(bufferchamber)。在電泳之后，將凝膠在染色溶液中溫育60分鐘，所述染色溶液由溶解于10%乙酸、40%曱醇和50%1120中的0.1%(重量/體積)CoomassieBrilliantBlue(考馬斯亮藍)R-250組成。凝膠的脫色在10%乙酸、30%曱醇和60%H20中進行。在純化之前，使用配有10kDa截留(cut-of0的PM10膜的Amicon超濾單元(Millipore，Bedford,MA,USA)將濾液濃縮并且將緩沖液交換成20mM三乙醇胺(TEA)-HC1pH7.5。在室溫使用FPLC系統(tǒng)進行酶純化(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden)。在各純化步驟之間，使用10kDa截留的3.5mlMicrosep超濾單元(PallLifeSciences,AnnArbor,Ml,USA)或Amicon超濾單元，將匯集級分中的緩沖液交換成樣品緩沖液。在280nm監(jiān)控(3-葡糖苷酶的洗脫。將存留物(retentate)(38.5ml)加樣至填充有75mlQSepharoseHP的XK26柱(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden)上。用180ml樣品緩沖液洗滌該柱。樣品緩沖液是20mMTEA-HC1pH7.5。用多至50%的梯度(在800ml的過程中)的含1MNaCl的20mMTEA-HC1pH7.5將酶洗脫(Theenzymewaselutedwithagradientupto50%(over800ml)of20mMTEA-HC1pH7.5with1MNaCl)。收集10ml的級分，測定P-葡糖苷酶活性，并且匯集級分81至85。將來自前述步驟的存留物(2.0ml)加樣至Superdex7510/300GL柱(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden),使用含200mMNaCl的100mMNaCH3C02pH4.8作為樣品緩沖液。用60ml的相同緩沖液洗脫酶。收集2ml的級分，測定(3-葡糖苷酶活性，并且基于活性和純度(SDS-PAGE)匯集級分6至9。使用10mMNaCH3C02pH4.8作為樣品緩沖液，將來自Superdex75步驟的存留物(14ml)加樣至6mlRESOURCEQ柱(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden)。用30ml樣品緩沖液洗滌該柱。用多至50%的梯度(在180ml的過程中)的500mMNaCH3C02pH4.8將酶洗脫。收集2ml的級分，測定(3-葡糖苷酶活性，并且基于活性和純度(SDS-PAGE)匯集級分49至61。使用10mMNaCH3C02pH4.8作為樣品緩沖液，將來自RESOURCEQ步驟的存留物(12ml)加樣至另一個6mlRESOURCEQ柱(AmershamBioscience,Uppsala，Sweden)。用30ml樣品緩沖液洗滌該柱。用多至50%的梯度(在300ml的過程中)的500mMNaCH3C02pH4.8將酶洗脫。收集2ml的級分，測定(3-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和純度(SDS-PAGE)匯集級分63至67。使用10mMNaCH3C02pH4.0作為樣品緩沖液，將來自RESOURCEQ步驟的存留物(10.5ml)加樣至10mlSourceS柱(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden)。用31.5ml樣品緩沖液洗滌該柱。用多至15%的梯度(在120ml的過程中)的1MNaCH3C02pH4.0，其后再用15%至100%的梯度(在90ml的過程中)的1MNaCH3CO2pH4.0將酶洗脫。收集2ml的級分，測定卩-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和純度(SDS-PAGE)匯集級分93至107。使用含200mMNaCl的100mMNaCH3C02pH4.8作為樣品緩沖液，將來自SourceS步驟的存留物(2ml)加樣至Superdex200HI0/300GL柱(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden)。用50ml相同的H沖液將酶洗脫。收集0.5ml的級分，測定P-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和純度(SDS-PAGE)匯集級分28至31。使用1M(NH4)2S04、50mMNaCH3CO2pH4.8作為樣品緩沖液，將來自Superdex200步驟的存留物(8.0ml)加樣至1mlPhenylS印haroseHP柱(AmershamBioscience,Uppsala,Sweden)。用17.0ml的樣品緩沖液洗滌該柱。用多至100%的梯度(在70ml的過程中)的50mMNaCH3C02pH4.8將酶洗脫。收集0.5ml的級分，測定(3-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和純度(SDS-PAGE)匯集級分73至78。純化的(3-葡糖苷酶的SDS-PAGE顯示僅在大約115kDa的一條帶。使用正F凝月交、pH3-9和pis3.5—9.3的標準混合物(standardmix),用PharmaciaPhastSystem進行等電聚焦。通過用于PhastGel正F介質(zhì)的銀方法將凝膠染色。測定等電點為大約3.9。實施例4:N-末端測序?qū)⒓兓陌臀髑嗝筽-葡糖苷酶(實施例3)的100等分試樣添加至Eppendorf管中100^的SDS-PAGE樣品緩沖液(4ml0.5MTRIS-HC1pH6.8,20ml10%SDS,20ml甘油(87%),56mlMilliQ濾過的H20和15粒(gmins)的溴酚藍)，并且加熱至95。C持續(xù)4分鐘。在加熱之后，將稀釋樣品的四個20Ml等分試樣分別加至預(yù)制4-20%SDS聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA,USA)。除了四個含有樣品的泳道之外，另有一個Markl2蛋白標準混合物。在XcellSureLockTM凝膠設(shè)備中跑膠90分鐘，初始功率為40mA,最高135V。在電泳之后，將凝膠在印跡溶液中溫育5分鐘，所述印跡溶液由含有6%曱醇的10mMCAPSpH11組成。將ProBlott膜(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA，USA)在純曱醇中潤濕1分鐘，之后置于印跡溶液中5分鐘從而用含有6%曱醇的10mMCAPSpH11將膜飽和。如下在SemiDiyBlotterII裝置(KemEnTec，Copenhagen,Denmark)中進4亍電印跡。將六張在印跡溶液中潤濕的Whatmanno.1紙置于印跡設(shè)備的陽極，接著是ProBlott膜、聚丙烯酰胺凝膠和六張用印跡溶液潤濕的Whatmanno.1紙。放置陰極使其與上層(upperstack)的Whatmanno.1紙接觸，由此裝配印跡裝置。將11.3kg的重量置于所述印跡設(shè)備頂部。在175mA的電流進行電印跡180分鐘。在電印跡之后，在溶解于60%曱醇、1%乙酸、39%H20中的0.1%(重量/體積)CoomassieBrilliantBlueR-250中將ProBlott膜染色1分鐘。ProBlott膜的脫色在40%含水曱醇中進行5分鐘，之后在去離子水中清洗該膜。最后將ProBlott膜風(fēng)干。對于N-末端氨基酸測序，將兩片由115kDa條帶組成的ProBlott膜切下并且置于AppliedBiosystemsProciseProteinSequencer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)的印跡盒(blottingcartridge)中。根據(jù)制造商的說明書使用PVDF膜樣品(PulsedliquidPVDF)的方法運行文件(methodrunfile)來進行N-末端測序。通過將層析圖中峰的保留時間與標準層析圖中PTH-氨基酸的保留時間進行比較，從所得層析圖推斷N-末端氨基酸序列。4吏用Procise494HTSequencingSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)直接測定純化巴西青霉(3-葡糖苷酶的N-末端氨基酸序列。測定的N-末端序列是Ala陽Ile-Glu-Ser-Phe-Ser-Glu-Pro-Phe-Tyr-Pro-Ser-X-X-Met陽Asn(SEQIDNO:2的氨基酸37至52)。X定義為未確定的氨基酸殘基。實施例5:PCR擴增基于純化巴西青霉j3-葡糖苷酶的N-末端氨基酸序列(實施例4)，使用CODEHOP策略(Rose"a/.,1998,7Vwc/e/cW仏26:1628-35)設(shè)計如下所示的正向引物。使用codehop策略，從其它(3-葡糖苷酶的數(shù)據(jù)庫信息來設(shè)計如下所示的反向引物。正向引物5'-GCGCTATCGAGTCTTTCTCTGARCCNTTYTA畫3'(SEQidNO:3)反向引物5'-gtcggtcatgacgaagccnkgraancc-3'(seqidno:4)其中r二a或g,yk:或t，k二g或t而n二a、c、g或t使用大約1|ug的巴西青霉基因組DNA作為模板制備擴增反應(yīng)物(30jil)。此外，每個反應(yīng)含有以下成分正向引物30pmo1，反向引物30pmo1,dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200|iM,IXAmpliTaq聚合酶緩沖液(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA,USA)和0.5單位的AmpliTaq聚合酶(5.0U/pl，AppliedBiosystems,FosterCity，CA,USA)。將反應(yīng)在Robocycler(Stratagene,LaJolla，CA，USA)中溫育，程序為96°C3分鐘和72°C3分鐘的1個循環(huán)；95。c0.5分鐘、56。c0.5分鐘和72。c1.5分鐘的34個循環(huán)；72°c7分鐘的1個循環(huán)；和6。C的保溫循環(huán)(soakcycle)。在第一個循環(huán)中在72。C添加Taq聚合酶。使用TAE緩沖液在2。/。瓊脂糖凝膠(Amresco，Solon,OH,USA)上分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物。從凝膠上切下大約840bp的條帶并且使用MiniEluteGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)根據(jù)制造商的說明書來純化。其后根據(jù)制造商的說明書將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中以產(chǎn)生名為pCR2.1GH3A(圖2)的載體，并且通過DNA測序分析來確認其與家族3糖基水解酶一致。實施例6:篩選基因組文庫進行菌落轉(zhuǎn)移檢測(colonylift)(Maniatis"o/.，1982，Afo/ecw/"rCfom'"g，JZ^oratoaM朋wa/，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork),并且將DNA在80。C交聯(lián)至HybondN+膜(Amersham,ArlingtonHeights,IL)上2小時。使用0.2XSSC(0.03MNaCl、0.003M檸檬酸鈉)、0.2%SDS將來自菌落轉(zhuǎn)移檢測的膜預(yù)潤濕。將預(yù)潤濕的濾紙(filter)置于68°C搖動水浴中的具有每張濾紙7.5ml雜交溶液(6XSSPE、7%SDS)的燒杯中0.5小時。使用與載體同源的如下所示引物通過PCR擴增從pCR2.1GH3A擴增實施例5中描述的PCR擴增的亞克隆產(chǎn)物。5'-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTA陽3'(SEQIDNO:5)5'-ATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGAT-3'(SEQIDNO:6)使用大約50ngpCR2.1GH3A作為模板制備擴增反應(yīng)物(30pl)。此外，每個反應(yīng)含有以下成分每種引物50pmol,IXTaq緩沖液(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各15pmol，和0.5單位的TaqDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA,USA)。將反應(yīng)在Robocycler中溫育，程序為94。C1分鐘的1個循環(huán)；和94。C30秒、55。C60秒和72。C1分鐘的20個循環(huán)。之后將加熱塊轉(zhuǎn)入4。C保溫循環(huán)。使用TAE緩沖液將反應(yīng)產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上分離，將1kb產(chǎn)物條帶從所述凝膠上切離并且使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)根據(jù)制造商的"i兌明書純化。使用StratagenePrime-ItIIKit(Stratagene,LaJolla，CA,USA)根據(jù)制造商的說明隨機引物標記大約40ng。使用MinElutePCRPurificationKit(QIAGENInc.,Valencia,CA，USA)從未并入的核苷酸分離放射標記的基因片段。通過添加5.0MNaOH至終濃度0.5M使放射性探針變性，并且將所述探針以大約0.5x106cpm每ml雜交溶液的活性添加至雜交溶液。將混合物在搖動水浴中在68。C溫育10小時。溫育之后，在68。C在0.2XSSC、0.2°/。SDS中將膜洗滌三次。其后將膜在印跡紙上干燥15分鐘，巻入SaranWrapTM，并且在-80。C過夜曝露于帶有增感屏的X-射線片(Kodak,Rochester,NY，USA)。將產(chǎn)生與探針雜交信號的菌落接種至1mlLB培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補充有100嗎/ml氨千青霉素，并且在37。C培養(yǎng)過夜。制備各溶液的稀釋液，并且將100|il鋪板至補充有100pg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。選擇使各產(chǎn)生大約40菌落每平板的陽性樣品的稀釋物用于二次轉(zhuǎn)移檢測。如上制備、雜交和探測(probe)所述轉(zhuǎn)移檢測物。將每個陽性平板中的兩個菌落接種至3ml補充有100嗎/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并且在37。C培養(yǎng)過夜。使用BioRobot9600(QIAGENInc，Valencia,CA,USA)根據(jù)制造商的規(guī)程從每個菌落制備小量制備的(miniprep)DNA。通過五coRI消化和瓊脂糖凝膠電泳測定每個插入序列(insert)的大小。命名為AB1和AB2的兩個克隆各含有大約4.5kb的插入序列。測序揭示所述克隆是同一的，并且在下文將它們稱作pKKAB(圖3)。實施例7:表征編碼(3-葡糖苷酶的巴西青霉基因組序列使用具有染料終止劑化學(xué)的引物步移技術(shù)(primerwalkingtechnique)(Gieseckee/W.，1992，Wro/.AfeAocfe38:47-60)，用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)進行來自pKKAB的巴西青霉(3-葡糖苦酶基因的DNA測序。基因組編碼序列(SEQIDNO:1)和推定的氨基酉1^列(SEQIDNO:2)示于圖1A和1B。2751bp的基因組編碼序歹'J(包括終止密碼子)編碼計算分子量為96,725Da的878個氨基酸的多肽，所述編碼序列#1兩個57bp(85-141bp)和57bp(312-368bp)的內(nèi)含子中斷?；虻摹?。G+C含量是51.9%,并且成熟蛋白編碼區(qū)(SEQIDNO:1的核苷酸171至2753)的。/oG+C含量是52。/。。使用SignalP軟件程序(Nielsen"a/.，1997,Prafe/"10:l-6)預(yù)測了19個殘基的信號肽?；?3-葡糖苷酶的N-末端序列，殘基20至36似乎組成在成熟期間以蛋白水解的方式切割的前肽區(qū)。預(yù)測的成熟蛋白含有842個氨基酸。用FASTA程序包3.4版(PearsonandD.J,Lipman,1988,/WAS"85:2444,andPearson,1990,MeAoA五"zywo/ogy183:63)使用默認參數(shù)進行在公開數(shù)據(jù)庫中的相似序列搜索。將得自所述程序包的Smith-Waterman算法(Waterman"/.,1976，A/v.M"仇20:367)的配對比對用于測定百分比同一性。默認參數(shù)包括缺口開啟罰分-12,缺口延伸罰分-2和BLOSUM50比較矩陣。比對顯示編碼具有p-葡糖苷酶活性的GH3A多肽的巴西青霉基因的推定的氨基酸序列與粗糙脈孢菌^f叚設(shè)蛋白(登錄號Q7RWP2)的推定的氨基酸序列共享63.8%同一性(包括缺口)，而與A;erg/〃wsce〃w/o(y"cus的表征的糖基水解酶家族3卩-葡糖苷酶(登錄號ABB07868)共享61.8%同一性。將含有質(zhì)粒pKKAB的大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)以NRRLB-30860保藏在農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604),保藏日為2005年7月8日。實施例8:構(gòu)建米曲霉P-葡糖苷酶表達質(zhì)粒曲霉屬表達質(zhì)粒pJaL721(WO03/008575)由表達盒組成，所述表達盒基于黑曲霉中性淀粉酶II啟動子，其融合至構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序列(NA2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子(Tamg)。質(zhì)粒上還存在來自構(gòu)巢曲霉的選^^標記am^S,其允許以乙酰胺作為唯一氮源生長；和來自釀酒酵母的URA3標記，其使得pFF缺陷的大腸桿菌菌抹DB6507(ATCC35673)能夠生長。使用釀酒酵母URA3基因作為選擇標記如下所述進行大腸桿菌DB6507的轉(zhuǎn)化。通過Mandel和Higa,1970，JMo/.45:154的方法將大腸桿菌DB6507制成感受態(tài)。在固體M9培養(yǎng)基(J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis,1989,Mo/eew/arC7om."g'^Z"6orato^yMa做a/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)上選擇轉(zhuǎn)化體，所述培養(yǎng)基每升補充有1g酪蛋白氨基酸(casaminoacids)、500fig硫胺素和10mg卡那霉素。將P-葡糖苷酶基因如下所述克隆至pJaL721中。使用以下兩種寡核苷酸引物通過PCR從巴西青霉擴增P-葡糖苷酶基因正向PCR:5，-AAnTGATCACACCATGCAGGGTTCTACAATCnTCTGCC-3，(SEQIDNO:7)反向PCR:5，-TTAACTCGAGTTACTCCAATTGTGAGCTCAGCGG-3，(SEQIDNO:8)為了促進克隆，將限制酶位點插入各引物的5，端，其中正向引物含有5c/I位點，而反向引物含有屈ol位點。在所述PCR反應(yīng)中使用AB克隆(實施例6)作為模板。反應(yīng)在含有1.0單位Phusion(FinnzymesOy,Espoo，F(xiàn)inland)、IXPhusion緩沖液HF(FinnzymesOy,Espoo，F(xiàn)inland),25ng克隆AB、dNTP每種250|iM和如上所述兩種引物各50pmol的50pi體積中進行。擴增在PTC-220DNAEngineDyadPetierThermalCycler(MJResearch,Inc.,Waltham,MA,USA)中進行，程序為95°C5分鐘的1個循環(huán)；94。C0.5分鐘、58。C0.5分鐘和68。C4.0分鐘的24個循環(huán)；和68°C15分鐘的1個循環(huán)。使用熱啟動PCR技術(shù)(Chou"1992，A^c/ez'ci饑20:1717)，并且在第一循環(huán)進行1分鐘之后添加Phusion聚合酶。PCR反應(yīng)產(chǎn)生長度為大約2700bp的單一DNA片段。將所述片段用Bc/I和為ol消化，并且通過瓊脂糖凝膠電泳分離、純化，并克隆至用BawHI和屈ol消化的pJaL721中，產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pKBKOl(圖4)。通過DNA測序確認pKBKOl中(3-葡糖苦酶基因的序列。實施例9:巴西青霉(3-葡糖苷酶在米曲霉中的表達用5fig的pKBKOl^口Christensene/a/"1988，6:1419-1422所述轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2(WO00/30322)。將轉(zhuǎn)化體在50ml試管中10ml的YPM培養(yǎng)基中在30。C培養(yǎng)4天。將全部培養(yǎng)液在12,100jcg離心并且移出上清。使用CriterionXTPrecastGel，XTMES緩沖液中的10%Bis畫Tris凝膠(BioRadLaboratories,Hercules,CA，USA)根據(jù)制造商的說明書通過SDS-PAGE分析上清。將10pl體積的上清與9|Lil樣品緩沖液(0.125MTris-HClpH6.8，20%甘油和4.6%SDS)和1pi1M二硫蘇糖醇混合，并且加熱至96。C持續(xù)5分鐘。在28個上清的8個中，通過SDS-PAGE在標準35kDa至150kDa的范圍能夠看到大約115kDa的一個條帶。產(chǎn)生大約115kDa條帶的上清還包含P-葡糖苷酶活性，如實施例3中測定。條帶的強度越高，在相同上清中測量的P-葡糖苷酶活性越高。將一個轉(zhuǎn)化體命名為米曲霉KBKOl。實施例10:產(chǎn)生和純化重組巴西青霉p-葡糖苷酶在生物反應(yīng)器中將米曲霉轉(zhuǎn)化體KBKOl在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，每升所述培養(yǎng)基由下述組成60g蔗糖、10gMgSO(H20、10gKH2P04、15gK2S04、20g檸檬酸、50g酵母提取物、0.5ml痕量金屬和1ml聚氧丙烯酸(pluronicacid)。所述痕量金屬每升由下述組成14.28gZnS04'7H20、2.50gCuS04'5H20、2.5gNiCl2.6H20、13.8gFeS04'7H20、8.5gMnS04.H20和3.0g檸檬酸。1天之后，將麥芽糖溶液進料至生物反應(yīng)器，所述溶液每升由下述組成350g75。/。麥芽糖溶液、5g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml痕量金屬和5ml聚氧丙歸酸。5天之后終止培養(yǎng)。通過離心和過濾將生物質(zhì)從2.5升發(fā)酵液中去除。用去離子水使所得上清成為5升，并且在具有OS10C7210kDa膜的Filtron(Filtron,USA)上超濾。將所得1.2升體積調(diào)節(jié)至pH8.5。如實施例3中所述測量|3-葡糖苷酶活性。如實施例3中所迷測定蛋白質(zhì)濃度。如實施例3中所述進行SDS-PAGE分析。在280nm監(jiān)測p-葡糖苷酶的洗脫。將|3-葡糖苷酶溶液加樣至用25mMTrispH8.5預(yù)平衡的Q-SepharoseFastFlow柱(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)。用25mMTrispH8.5中0至1M的NaCl梯度(5個柱體積)洗脫p-葡糖苷酶。將含有(3-葡糖香酶的級分匯集成105ml的體積。將來自Q-Sepharose步驟的匯集物的一部分(40ml)進一步在SephacrylS-200柱上純化，所述柱在0.1M乙酸鈉pH6.0中預(yù)平衡。用體積為68ml的相同緩沖液洗脫(3-葡糖香酶。從280nm的吸光度和由(3_葡糖苷酶初級結(jié)構(gòu)計算的消光系數(shù)測定蛋白質(zhì)含量。在純化之后進行SDS-PAGE。將樣品用等體積的2X樣品緩沖液和1/5體積的1%PMSF煮沸2分鐘，并且加樣至Novex的4-20%Tris-甘氨酸凝膠上。將凝膠用GdCodeBlueStainReagent染色，并且用水脫色。SDS-PAGE顯示了一個大約115kDa的條帶。實施例11:表征純化的重組巴西青霉(3-葡糖苦酶關(guān)于最適pH、最適溫度、溫度穩(wěn)定性和底物特異性表征了實施例10中描述的純化的重組巴西青霉p-葡糖苷酶。最適pH和最適溫度。在20。C至90。C的溫度和3.0至8.0的pH值測量卩-葡糖苷酶活性。在MilliQ水中稀釋純化的p-葡糖苷酶以保證測定中產(chǎn)生的4-賄基苯酚在標準曲線之內(nèi)。底物是調(diào)節(jié)至pH3.18、4.16、4.86、6.17的50mM檸檬酸鈉中的1mM4-硝基苯基-P-D-吡喃型葡萄糖苷，和調(diào)節(jié)至pH7.07和8.13的50mM碳酸鈉中的1mM4-硝基苯基-(3-D-吡喃型葡萄糖苷。將活性測量持續(xù)10分鐘，并且用0.5M甘氨g^/NaOHpH10及2mMEDTA終止反應(yīng)。圖5顯示巴西青霉菌抹IBT20888(3-葡糖苷酶在不同pH值的相對活性作為溫度的函數(shù)。圖6顯示巴西青霉菌林IBT20888P-葡糖苷酶在不同溫度的相對活性作為pH的函lt。Novozym188和巴西青霉菌抹IBT2088813-葡糖苷酶的溫度穩(wěn)定性。在24小時期間，在溫度20。C至67.5。C和pH值3至8測試巴西青霉(3-葡糖苷酶和Novozym188(NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)的穩(wěn)定性。將酶制備物在溫育緩沖液中稀釋2000倍。pH3至pH6的溫育緩沖液包含調(diào)節(jié)至期望pH的10mM種檬酸鈉，而pH7和pH8的溫育緩沖液包含調(diào)節(jié)至期望pH的10mM碳酸鈉。在IO分鐘期間在室溫測量殘余活性。底物是調(diào)節(jié)至pH4.80的50mM檸檬酸鈉中的1mM4-硝基苯基-P-D-吡喃型葡萄糖香，并且用含有2mMEDTA的0.5M甘氨酸/NaOHpH10終止反應(yīng)。圖7顯示在不同溫度和pH溫育24小時之后Novozym188的殘余活性(n=2)。圖8顯示在不同溫度和pH溫育24小時之后巴西青霉菌抹IBT20888(3-葡糖苷酶的殘余活性(1!=3)。在24小時的時間內(nèi)，巴西青霉菌抹IBT20888的p-葡糖苷酶在高至60。C在pH4至pH6穩(wěn)定。在24小時的時間內(nèi)，Novozym188在高至50。C在pH4和pH5穩(wěn)定，在高至40°C在pH6穩(wěn)定。巴西青霉菌抹IBT20888|3-葡糖香酶的動力學(xué)參數(shù)。底物是4-硝基苯基-(3-D-吡喃型葡萄糖苷。使用50mM檸檬酸鈉pH4.80中濃度為0.07-2mM的4-硝基苯基-P-D-吡喃型葡萄糖苷來測量動力學(xué)參數(shù)。在室溫測量活性2分鐘，再用0.5M甘氨酸/NaOHpH10及2mMEDTA終止反應(yīng)，并且如實施例3中所述進行測量。從四個獨立的酶稀釋物測定Michaelis-Menten常數(shù)km和最大反應(yīng)速率。在測定動力學(xué)參數(shù)時將顯示底物抑制的測量省略。從Lineweaver-Burk作圖測定的參數(shù)是km=0.077±0.021mM和V醒=78.2±7.2U/mg酶。使用Hanes作圖測定參數(shù)產(chǎn)生小于1%的參數(shù)偏差。圖9顯示巴西青霉菌抹IBT20888(3-葡糖苷酶在不同4-硝基苯基-p-D-p比喃型葡萄糖濃度的初始反應(yīng)速率。底物是纖維二糖。使用50mM乙酸鈉pH4.80中濃度為0.08-10mM的纖維二糖測量動力學(xué)參數(shù)。在室溫測量活性5分鐘，并用0.5M甘氨酸/NaOHpH10及2mMEDTA終止反應(yīng)，其后加熱至65。C持續(xù)10分鐘。隨后用1MHC1將pH調(diào)節(jié)至pH7.1，并且用EcolineS+Glucose(DiaSysDiagnosticsSystemsGmbH,Holzheim,Germany)測量。用非線性曲線擬合器(non-linearcurvefitter)使用Marquardt-Levenberg算法(SigmaPlot9.01，SystatSoftware,Inc.)來測定Michaelis-Menten參數(shù)。測定了纖維二糖水解的Michaelis-Menten常數(shù)km和最大反應(yīng)速率分別是1.58mM和28U/mg。將1單位定義為每分鐘水解1孩i摩爾纖維二糖的酶量。圖10顯示巴西青霉菌抹IBT20888j3-葡糖苷酶在不同纖維二糖濃度的初始反應(yīng)速率。生物材料的保藏已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約規(guī)定，將以下生物材料保藏在農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心,NorthernRegionalResearchCenter,1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604，并且個與以下登錄號保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌TOP10pKKABNRRLB-308602005年7月8曰該菌抹于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，由專利與商標委員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權(quán)的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物為所保藏菌林的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律的要求，可以獲得該保藏物。然而，應(yīng)當理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，實施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。此處，本發(fā)明中所描述的和要求的并非是要用本文所公開的具體方面來限定范圍，因為這些方面意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等價的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準。本文引用了許多參考文獻，其中公開的全部內(nèi)容并入作為參考。權(quán)利要求1.具有β-葡糖苷酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少70％同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；(c)多肽，其包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A；和(d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。2.權(quán)利要求l的多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70。/。，優(yōu)選至少75。/。，更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，并且最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成；或包含其具有(3-葡糖苷酶活性的片段或由其具有(3-葡糖苷酶活性的片段組成。4.權(quán)利要求3的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽或由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。5.權(quán)利要求l的多肽，所述多肽由在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。6.權(quán)利要求1-5中任一項的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸37至878。7.權(quán)利要求1-5中任一項的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核香酸171至2753。8.權(quán)利要求l的多肽，其中所述多肽是變體，所述變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸37至878。9.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽由質(zhì)粒pKKAB中包含的多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-30860中。10.權(quán)利要求l的多肽，其包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]陽A。11.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-10中任一項的多肽的核苦酸序列。12.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求11的多核苷酸，所述多核芬酸與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列指導(dǎo)多肽在表達宿主中產(chǎn)生。13.重組表達載體，其包含權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體。14.重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體。15.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-10中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。16.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-10中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核芬酸序列；和(b)回收所述多肽17.用于產(chǎn)生親本細胞突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1-10中任一項的多肽的核苷酸序列，其導(dǎo)致突變體與親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽。18.通過權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的突變細胞。19.權(quán)利要求18的突變細胞，所述突變細胞還包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。20.用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求19的突變細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。21.通過以下方法獲得的分離的多核苷酸(a)在優(yōu)選至少中嚴緊條件，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交多核苦酸，所述多核苷酸編碼具有P-葡糖苷酶活性的多肽。22.權(quán)利要求21的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苦酸171至2753。23.核酸構(gòu)建體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因與編碼信號肽的第一核苷酸序列和編碼前肽的第二核苷酸序列中的一個或兩個可操作地連接，所述第一核苷酸序列由SEQIDNO:1的核芬酸171至2753組成，第二核苷酸序列由SEQIDNO:1的核苷酸171至2753組成，其中所述基因?qū)τ诘谝缓偷诙似账嵝蛄惺峭庠吹摹?4.重組表達載體，其包含權(quán)利要求23的核酸構(gòu)建體。25.重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求23的核酸構(gòu)建體。26.用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求25的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。27.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-10中任一項的具有(3-葡糖苷酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞包含編碼具有(3-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。28.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其已經(jīng)使用多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1-10中任一項的具有p-葡糖苷酶活性的多肽。29.洗滌劑組合物，所述洗滌劑組合物包含權(quán)利要求1-10中任一項的具有(3-葡糖苷酶活性的多肽和表面活性劑。30.用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在有效量的權(quán)利要求1-10中任一項的具有p-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白處理所述纖維素材料。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述一種或多種纖維素分解酶選自下組纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。32.權(quán)利要求30或31的方法，還包括用有效量的選自下組的一種或多種酶處理纖維素材料半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或它們的混合物。33.權(quán)利要求30-32中任一項的方法，其中所述方法是預(yù)處理方法、同時糖化和發(fā)酵方法(SSF)中的步驟或混合水解和發(fā)酵方法(HHF)中的步驟。34.權(quán)利要求30-34中任一項的方法，還包括回收降解的纖維素材料。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述降解的纖維素材料是糖。36.權(quán)利要求30-35中任一項的方法，其中所述具有J3-葡糖苷酶活性的多肽和/或纖維素分解蛋白是含有或不含細胞的發(fā)酵液形式。37.用于產(chǎn)生物質(zhì)的方法，其包括(a)在有效量的權(quán)利要求1-10中任一項的具有P-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一種或多種纖維素分解蛋白糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物來發(fā)酵步驟(a)中糖化的纖維素材料；和(c)從發(fā)酵回收所述物質(zhì)。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述一種或多種纖維素分解酶選自下組纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。39.權(quán)利要求37或38的方法，還包括用有效量的選自下組的一種或多種酶處理纖維素材料半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或它們的混合物。40.權(quán)利要求37-39中任一項的方法，其中步驟(a)和(b)在同時糖化和發(fā)酵中同時地進行。41.權(quán)利要求37-40中任一項的方法，其中所述物質(zhì)是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。42.權(quán)利要求37-41中任一項的方法，其中所述具有(3-葡糖苷酶活性的多肽和/或纖維素分解蛋白是含有或不含細胞的發(fā)酵液的形式。全文摘要本發(fā)明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于制備和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N15/56GK101287751SQ200680037147公開日2008年10月15日申請日期2006年8月4日優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日發(fā)明者保羅·哈里斯,克里斯琴·克羅申請人:諾維信股份有限公司