專利名稱：：用于確定ck19表達(dá)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及定量確定生物樣品中CK-19mRNA陽性細(xì)胞的組合物和方法。特別是，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的方法，所述方法基于定量的確定諸如那些來自患癌癥患者的生物樣品中的分子標(biāo)記CK-19。使用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在任何輔助治療啟動(dòng)之前進(jìn)行檢測(cè)，以提供關(guān)于治療有效性的信息。
背景技術(shù)：
：在過去數(shù)年中有越來越多的證據(jù)指出，檢測(cè)和表征乳腺癌患者骨髓或外周血中的腫瘤細(xì)胞，就無病間期和總生存期而言可能是臨床相關(guān)的(A.C.Lambrechts等；1998)。此外，最小殘余疾病(MRD)的預(yù)期評(píng)估可提供關(guān)于輔助療法有效性的信息(K.Pantel等；2003)。因此，用于早期檢測(cè)循環(huán)癌細(xì)胞的高靈敏的方法對(duì)于早期診斷和更有效的治療MRD非常重要。中間纖維細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)在多數(shù)上皮性腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定和豐富的表達(dá)，并且是用于檢測(cè)乳腺癌患者外周血中潛伏腫瘤細(xì)胞的最常用的標(biāo)記之一(S.Braun等；2000;Y.H.Datta等；1994;A.Schoenfield等；1997)。本發(fā)明者最近已證明，在外周血中對(duì)CK-19mRNA陽性細(xì)胞的檢測(cè)，代表在任何輔助治療啟動(dòng)之前對(duì)患有可手術(shù)的乳腺癌的患者的結(jié)果的最強(qiáng)有力的確定之一，具有CK-19mRNA陰性的患者有更多的機(jī)會(huì)長(zhǎng)期生存和無病間期(A.Stathopoulou等；2002)。此外，在早先的研究中我們發(fā)展出了定量方法，所述方法基于熒光標(biāo)記CK-19mRNA特異性雜交探針的實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR方法(A.Stathopoulou等；2003)。應(yīng)用這種方法，在I/II期(可手術(shù)的)或IV期(轉(zhuǎn)移的)的乳腺癌患者和在健康的獻(xiàn)血者中，我們發(fā)現(xiàn)在外周血樣品中陽性細(xì)胞分別為70/337(20.77%)和2/89(2.2%)。這樣，當(dāng)截?cái)嗨?cutofflevel)定為0.6MCF-7細(xì)胞當(dāng)量/5ngRNA(該方法的檢測(cè)極限)時(shí)，我們觀察到對(duì)于正常獻(xiàn)血者的假陽性率(2.2。/。)。通過使用這一統(tǒng)計(jì)性的計(jì)算截?cái)帱c(diǎn)，一些患者和健康獻(xiàn)血者的外周血樣品被視為陰性，盡管它們?cè)诤芨叩慕徊纥c(diǎn)(Cps)顯示出CK-19擴(kuò)增曲線。這些擴(kuò)增曲線應(yīng)歸于從造血細(xì)胞(J,A.L6pez-Guerrero等;1997)、CK-19a和CK-19b假基因(P.Ruud等；1999;E.S.Savtchenko等；1988)或者的低水平異常轉(zhuǎn)錄的CK-19的擴(kuò)增，或者污染的基因組DNA的擴(kuò)增，這些基因組DNA是和總RNA—起從我們的樣品中提取的。然而，對(duì)于已發(fā)現(xiàn)非常接近這個(gè)截?cái)帱c(diǎn)的樣品，這個(gè)"灰色地帶，，結(jié)果的闡釋對(duì)于我們的早期乳腺癌患者的治療非常關(guān)鍵(V.Boziondlou等；在印刷)。因此，依然需要改進(jìn)在生物樣品中定量測(cè)定mRNA轉(zhuǎn)錄本的引物和方法。特別是需要改進(jìn)用于在可手術(shù)的癌癥患者外周血中測(cè)定CK-19mRNA陽性細(xì)胞的引物和方法，所述方法與以前所知引物和方法相比，顯示出減少的背景、高靈敏度和低頻率的假P曰性。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明一方面涉及能雜交到基因的粑標(biāo)序列的引物對(duì)，所述基因包含至少一個(gè)內(nèi)含子，其中所述引物的至少有一個(gè)包含至少一處跨越內(nèi)含子的位點(diǎn)。優(yōu)選引物的至少一個(gè)具有的序列與可能的假基因有低同源性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因是人CK-19基因。另一方面，本發(fā)明提供了使用一對(duì)引物定量測(cè)定樣品中來自基因的mRNA的改進(jìn)方法，其中所述基因包含至少一個(gè)內(nèi)含子序列，所述樣品包含基因組基因和任選的一個(gè)或多個(gè)假基因，其中所述引物的至少一個(gè)包含至少一處跨越內(nèi)含子的位點(diǎn)，該方法包含這樣的步驟(i)形成反應(yīng)混合物，其包含核酸擴(kuò)增試劑、根據(jù)本發(fā)明的引物對(duì)和測(cè)試樣品；(ii)將該混合物置于擴(kuò)增條件下，以產(chǎn)生與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的至少一個(gè)拷貝的核酸序列；和(iii)在PCR過程中使用實(shí)時(shí)監(jiān)控測(cè)定樣品中的mRNA量。優(yōu)選的基因是人CK-19基因和優(yōu)選的樣品是血液樣品、來自骨髓的樣品或取自淋巴結(jié)的樣品。使用CK-19引物和本發(fā)明的方法，基于在患癌癥患者的生物樣品中定量測(cè)定分子標(biāo)記CK-19來早期檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)可以比使用先前已知的方法和引物具有更高的精度。令人驚訝的，觀察到的背景和該方法的靈敏度有顯著的改善。在另一方面，本發(fā)明涉及在患癌癥患者中確定輔助療法前景的診斷方法，其包括這樣的步驟(i)提供來自患者的生物樣品；(ii)從生物樣品中分離核酸；(Hi)當(dāng)該核酸的起源是RNA時(shí)，任選的反轉(zhuǎn)錄分離出的核酸；(iv)形成反應(yīng)混合物，其包含核酸擴(kuò)增試劑、本發(fā)明的引物對(duì)和在步驟(ii)中分離出的核酸的等分試樣；(v)將該混合物置于擴(kuò)增條件下，以產(chǎn)生與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的至少一個(gè)拷貝的核酸序列；(vi)在PCR過程中^f吏用實(shí)時(shí)監(jiān)控來定量樣品中CK-19mRNA陽性細(xì)胞；和(vii)基于樣品中CK-19mRNA陽性細(xì)胞的數(shù)量確定輔助療法前景。使用本發(fā)明的診斷方法使能夠在患者的生物樣品中檢測(cè)更小量的CK-19mRNA陽性細(xì)胞。另外，假陽性確定的頻率是非常低的。這意味著可在疾病發(fā)展的較早時(shí)期可以做出可靠的判斷，從而使對(duì)患者的預(yù)期顯著改善。在另一方面，本發(fā)明提供持家引物對(duì)。此持家引物對(duì)雜交到持家基因上，所述持家基因?qū)τ谥付?xì)胞類型/生物體是普遍存在的。因?yàn)槟軌虮苊饧訇幮缘陌l(fā)生，使用持家引物對(duì)可顯著改進(jìn)定量實(shí)時(shí)PCR的適用性。另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的引物對(duì)和根據(jù)本發(fā)明的方法所需的部分或全部的試劑。本發(fā)明還提供了在諸如血液的生物流體中測(cè)定CK-19mRNA存在的方法。該方法包括下列步驟的至少一個(gè)和優(yōu)選所有的步驟a)從生物流體中分離上皮單核細(xì)胞，b)將分離的單核細(xì)胞與抗體相接觸，所述抗體優(yōu)選特異性的結(jié)合上皮單核細(xì)胞表達(dá)的抗原。優(yōu)選的，該抗體結(jié)合在固體支持物上并且這種接觸足以形成細(xì)胞、抗體和固體支持物之間的結(jié)合復(fù)合物，c)將結(jié)合復(fù)合物與任何未結(jié)合物質(zhì)分離，d)將核酸從與復(fù)合物結(jié)合的上皮單核細(xì)胞中分離出來，e)形成反應(yīng)混合物，其包含核酸擴(kuò)增試劑、本文公開的引物對(duì)和分離自上皮單核細(xì)胞的核酸，f)將該混合物置于擴(kuò)增條件下，以產(chǎn)生與CK-19靶標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸序列的至少一個(gè)拷貝；和g)使用PCR而且優(yōu)選使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定在生物流體中CK-19mRNA的量。圖1描述CK-19cDNA和CK-19a假基因序列的比對(duì)以及方案A和B中所用引物與探針的雜交位點(diǎn)。位點(diǎn)I和位點(diǎn)II分別代表在外顯子1/2和外顯子2/3之間的連接；圖2是通過使用具有同樣雜交探針的引物的四個(gè)組合對(duì)基因組DNA的實(shí)時(shí)PCR，[A)CK19-do2/ckl9畫for2、B)CK19-do2/ckl9-for、C)CK19-do/CK19-for、D)CK19-do/CK19-for2I;和圖3是顯示由方案A和B獲得的CK-19mRNA陽性細(xì)胞水平的圖表，表示為MCF-7細(xì)胞當(dāng)量/5將RNA。圖4是典型的PBGD實(shí)時(shí)PCR圖。該圖顯示持家基因的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線，所述曲線是使用本發(fā)明的持家引物對(duì)產(chǎn)生，使用本發(fā)明的TaqMan探針檢測(cè)并且使用來自有效擴(kuò)增PBGD基因的5個(gè)健康捐獻(xiàn)者(正常樣品l-5)的生物樣品(夕卜周血)。在圖中可以看出，在這兩個(gè)含有基因組DNA(DNA分離自健康個(gè)體)的樣品中沒有出現(xiàn)擴(kuò)增。這是持家引物設(shè)計(jì)的結(jié)果，使不會(huì)擴(kuò)增基因組DNA。PCR反應(yīng)的相應(yīng)的陰性對(duì)照(NC)不含有核酸模板。圖5是PBGDPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳(2。/0)。將實(shí)際的PCR產(chǎn)物加到瓊脂糖凝膠里。將10nl反應(yīng)(總體積的一半)上樣并且使用標(biāo)準(zhǔn)溴化乙錠染色。樣品1-5對(duì)應(yīng)于圖4中的正常樣品1-5,而陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)于圖4中的陰性對(duì)照。圖6是顯示從外周血(PB)中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的某些實(shí)驗(yàn)步驟的示意圖。圖7是顯示^f吏用單克隆抗體Ber-EP4和免疫》茲珠上皮富集試劑盒進(jìn)行免疫》茲富集的示意圖。圖8A-C是參照以下實(shí)施例部分中三組樣品的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表。圖8A(第1組二PB添加已知量的MCF-7細(xì)胞，免疫磁富集)，圖8B(第二組-PBS添加已知量的MCF-7細(xì)胞)，圖8C(第三組，與第一組相同，除開沒有免疫磁富集)。發(fā)明詳述(曰嚴(yán)方法，所述基因包括至少一個(gè)內(nèi)含子。定量檢測(cè)mRNA可使用任何可用的定量測(cè)定PCR產(chǎn)物的技術(shù)來完成。優(yōu)選的方法是實(shí)時(shí)PCR,但任何其他合適的方法，如竟?fàn)幮訮CR技術(shù)是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？赡苡扇魏魏线m的方法來實(shí)現(xiàn)這種定量測(cè)定，方法的選擇是在本
技術(shù)領(lǐng)域：
之內(nèi)的。本發(fā)明還提供檢測(cè)包含至少一個(gè)內(nèi)含子的基因mRNA的存在的診斷方法和試劑盒。因此，在第一方面提供了能雜交到基因靶標(biāo)序列的引物對(duì)，所述基因包含至少一個(gè)內(nèi)含子，所述引物其中至少有一個(gè)包括至少一個(gè)跨內(nèi)含子位點(diǎn)。此處描述的引物可能包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或核酸類似物，如不帶電荷的核酸類似物包括WO92/20702所公開的肽核酸(PNA)或US5185444、5034506和5142047所描述的嗎啉代(morpholino)類似物。可以使用多種技術(shù)常規(guī)合成這種序列。在備選的實(shí)施方案中該引物包含標(biāo)簽。如此處所用的"靶標(biāo)序列"是指這樣的序列，其被本文提供的序列檢測(cè)、擴(kuò)增、同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)，或者與本文提供的序列互補(bǔ)，或另外的在其天然態(tài)具有至少一個(gè)內(nèi)含子，即如同基因組DNA或染色體外DNA。雖然術(shù)語靶標(biāo)序列有時(shí)指的是單鏈的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到該靶標(biāo)序列可以是雙鏈的。該靶標(biāo)序列特別是CK19基因的mRNA-轉(zhuǎn)錄本。在優(yōu)選的實(shí)施方案中提供的引物對(duì)分別具有根據(jù)SEQIDNO:1(5'CGGGACAAGATTCTTGGT-S，正向)和SEQIDNO:2(5'CGTTGATGTCGGCCTCCA-S'反向)的序列，所述引物可用來擴(kuò)增CK19靶標(biāo)序列。應(yīng)該理解，序列SEQIDNO:l和2是本發(fā)明引物對(duì)的優(yōu)選實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明，該引物對(duì)的主要特點(diǎn)是在于它包含至少一個(gè)跨內(nèi)含子位點(diǎn)。這提供了只與從其中剪接出內(nèi)含子的序列(如mRNA、cDNA)結(jié)合的引物。應(yīng)該理解的是所述"剪接，，可能自然的發(fā)生，即提供在生物樣品中的mRNA檢測(cè)。然而，該術(shù)語也涵蓋了改造的序列，其具有內(nèi)含子"被剪接出"的序列，如cDNA?？鐑?nèi)含子位點(diǎn)可以只包括內(nèi)含子兩端位點(diǎn)的一個(gè)堿基，使引物在所用條件下僅結(jié)合無內(nèi)含子的序列。正向和反向引物的一方或雙方可包含一個(gè)或多個(gè)跨內(nèi)含子位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，只有一個(gè)引物包含一個(gè)跨內(nèi)含子位點(diǎn)，并且在特定優(yōu)選的實(shí)施方案中正向引物包含跨內(nèi)含子位點(diǎn)。在本公開中正向引物是其延伸與乾標(biāo)核酸編碼鏈為同一方向的引物。相反，反向引物是其延伸與靶標(biāo)核酸非編碼鏈為同一方向的引物。因此，引物以它們的3'端彼此相對(duì)匹配。本發(fā)明的引物的另一個(gè)特點(diǎn)是其引物序列不雜交或結(jié)合于靶標(biāo)特定基因的假基因。這一第二特點(diǎn)只在假基因存在的情況下是必需的，并且構(gòu)建這種序列需要可能的假基因的序列是已知的或者能夠在序列數(shù)據(jù)庫找到它。在本發(fā)明這方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)引物對(duì)從而使所述引物的至少一個(gè)在可能的假基因3，端包含至少一個(gè)錯(cuò)配，并且優(yōu)選有兩個(gè)或者3個(gè)錯(cuò)配。在本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，引物中至少有一個(gè)在CK-19、CK-19a假基因3'端包含至少一個(gè)錯(cuò)配。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了使用本發(fā)明？1物檢測(cè)測(cè)試樣品中mRNA的方法，其步驟包括(i)形成反應(yīng)混合物，其包含核酸擴(kuò)增試劑、本發(fā)明的引物對(duì)和測(cè)試樣品；(ii)將該混合物置于擴(kuò)增條件下，以產(chǎn)生與靼標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸序列的至少一個(gè)拷貝；和(iii)使用實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控定量樣品中的mRNA。在本說明中"測(cè)試樣品"和"生物樣品"可互換使用。在此背景下"測(cè)試樣品"是指懷疑含有靶標(biāo)序列的任何東西。測(cè)試樣品可以來自任何生物源，諸如血液、骨髓、淋巴結(jié)、支氣管肺泡灌洗物、唾液、咽喉擦拭物、眼晶狀體液、脊髓液、汗液、痰液、尿液、乳液、腹水、勦液、滑液、腹膜液、腦脊液、羊水、組織如乳腺組織等；或者發(fā)酵肉湯、細(xì)胞培養(yǎng)物、化學(xué)反應(yīng)混合物等。肺細(xì)胞或組織也可加以利用。最典型的測(cè)試樣品是來自血液，如外周血、骨髓或淋巴結(jié)。可從來源獲得該試驗(yàn)樣品后直接使用或經(jīng)預(yù)先處理改變樣品特性后再使用。因此，可將試驗(yàn)樣品在使用前預(yù)處理，例如從血液制備血漿、打碎細(xì)胞、從固體物質(zhì)制備流體、稀釋粘性流體、過濾流體、蒸餾流體、濃縮流體、滅活干擾組分如上皮細(xì)胞、加入試劑提純核酸等。優(yōu)選實(shí)施方案中的預(yù)處理是離心法。"生物流體"是具有(或者制備為)流體態(tài)的生物樣品。實(shí)例包括外周血、血漿、或從細(xì)胞或組織獲得的提取物。當(dāng)為了擴(kuò)增靶標(biāo)序列所必要時(shí)，即當(dāng)靶標(biāo)序列的性質(zhì)為RNA的情況下，本發(fā)明的方法中包括任選的反轉(zhuǎn)錄步驟。這個(gè)稱為反轉(zhuǎn)錄的過程，是在依賴RNA的DNA聚合酶(被稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的酶)的指導(dǎo)下進(jìn)行的。該過程還需要緩沖液和試劑，如dNTP來反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄試劑盒是商業(yè)上可獲得的，并且它在此過程實(shí)施的
技術(shù)領(lǐng)域：
之內(nèi)。發(fā)明中所用的核酸擴(kuò)增試劑包括眾所周知的試劑，并且可能包括有聚合酶活性的酶，例如Taq-聚合酶這種的熱穩(wěn)定聚合酶(并在必要時(shí)，如監(jiān)測(cè)mRNA時(shí)，有反轉(zhuǎn)錄酶的活性)、酶輔因子如鎂或錳、鹽類和三磷酸脫氧核苷(dNTP)，但不僅限于此。術(shù)語"擴(kuò)增條件"一般被定義為這樣的條件，即此條件促進(jìn)引物序列與靶標(biāo)序列的雜交或退火并且促進(jìn)？1物序列隨后的延伸。本領(lǐng)域眾所周知的是，這種退火依賴于幾個(gè)參數(shù)，包括溫度、離子強(qiáng)度、序列長(zhǎng)度、序列的互補(bǔ)性和G:C含量。例如，降低互補(bǔ)核酸序列環(huán)境的溫度會(huì)促進(jìn)退火。對(duì)于任何給定的序列，可由任何已知的方法來估計(jì)解鏈溫度或Tm。通常情況下，診斷應(yīng)用會(huì)采用接近解鏈溫度(即相差10。C之內(nèi)的)的雜交溫度。離子強(qiáng)度或"鹽"濃度也會(huì)影響解鏈溫度，因?yàn)樾〉年栯x子趨于通過中和磷酸二酯主鏈上的負(fù)電荷來穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)。典型的鹽濃度取決于陽離子的性質(zhì)和化合價(jià)，但是是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解的。同樣的，高G:C含量和增加的序列長(zhǎng)度穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)也是公知的，這是因?yàn)镚:C對(duì)含有3個(gè)氬鍵而A:T對(duì)只有2個(gè)氫鍵，并且因?yàn)楦L(zhǎng)的序列有更多的氫鍵可以把序列拉到一起。因此，高的G:C含量和更長(zhǎng)的序列長(zhǎng)度通過提高解鏈溫度影響雜交條件。一旦序列被選擇用于給定的診斷應(yīng)用，其G:C含量和長(zhǎng)度將是已知的，并且能作為準(zhǔn)確確定應(yīng)該采用何種雜交條件。由于通常是為了酶活性而最優(yōu)化離子強(qiáng)度，剩下的唯一可變的參數(shù)是溫度。通常，選擇的雜交溫度接近或正好處于引物或探針的解鏈溫度。因此，為特定引物、探針、或引物和探針組確認(rèn)合適的雜交條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的。使用任何合適的方法和更詳細(xì)公開于下的探針能夠在靶標(biāo)序列擴(kuò)增期間或隨后檢測(cè)如上所生產(chǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還公開了任何序列特異性探針，如雜交探針、Taqman探針或分子信標(biāo)型探針以檢測(cè)/定量擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，可以使用探針來確保特異性。所述^:針可能具有根據(jù)SEQIDNO:3和4的序列以檢測(cè)CK19基因的擴(kuò)增。構(gòu)建檢測(cè)靶標(biāo)序列的擴(kuò)增的探針在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)。優(yōu)選標(biāo)記的探針。該標(biāo)記可以是直接檢測(cè)的或者間接檢測(cè)的，前者例如具有熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、螢光粒子等，后者具有特異性結(jié)合配偶體和核酸。優(yōu)選標(biāo)記是能夠直接檢測(cè)的，并且特別優(yōu)選的標(biāo)記是熒光染料、如SybrGreenI、FAM、HEX、VIC、fluorosceinLCRed610、LCRed640、LCRed670、LCRed705、和其它本領(lǐng)域已知的熒光染料。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針可能最初是擴(kuò)增反應(yīng)混合物的一部分，在此情況下期望選擇這樣的條件，從而使該探針序列具有比引物序列更低的解鏈溫度。這樣，能初步選擇溫度使得該探針不雜交到靶標(biāo)序列，即超過該探針的解鏈溫度。在合成靶標(biāo)序列的拷貝之后，可以降低溫度以使探針雜交到新合成的靶標(biāo)序列，假設(shè)這個(gè)耙標(biāo)序列原本存在于此試驗(yàn)樣品，并且隨后這個(gè)靶標(biāo)序列可能的存在將具可檢測(cè)性?；蛘?，該探針是被分開加入的。優(yōu)選的，該探4f不雜交到與引物序列相對(duì)應(yīng)的序列。在本發(fā)明這一第二方面的另一個(gè)變體中，方法的步驟(i)可以還包含持家引物對(duì)，該持家引物對(duì)雜交到持家基因以確保試驗(yàn)樣品中存在可擴(kuò)增材料，和為了避免假陰性結(jié)果。所述持家引物對(duì)可以是商業(yè)上可獲得的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的持家引物對(duì)(購自羅氏應(yīng)用科學(xué)(RocheappliedScience))。或者，本發(fā)明者所確定的持家引物對(duì)可用于本發(fā)明的方法中。因此，在本發(fā)明第三個(gè)方面提供了持家引物對(duì)，其分別分別具有根據(jù)SEQIDNO5和6序列的正向和反向引物。在本發(fā)明的上下文中，"持家引物對(duì)"和"引物對(duì)"并不相同。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"持家引物對(duì)"意指這樣的引物對(duì)，它能夠雜交到對(duì)于給定細(xì)胞普遍存在的基因的靶標(biāo)序列。換言之，"持家引物對(duì)，，能在本發(fā)明的方法或試劑盒中用作內(nèi)部對(duì)照，即作為陰性對(duì)照。所述的本發(fā)明的持家引物對(duì)雜交到持家基因PBGD:人非紅細(xì)胞生成膽色素原脫氨酶(PBGD;羥曱基膽色烷合酶；登記號(hào)X04808)，血紅素生物合成途徑的第三個(gè)酶，其催化四個(gè)膽色素單位原的逐步縮合以產(chǎn)生羥甲基膽色烷，該羥甲基膽色烷又由同合成酶轉(zhuǎn)化為尿卟啉原III。持家基因是細(xì)胞必不可少的基因，因此在任何條件下始終存在。本發(fā)明者所設(shè)計(jì)的PBGDmRNA擴(kuò)增的持家引物對(duì)是正向(HGF1)5'畫GGTGGGTGTGCTGCACGAT-3，(SEQIDNO5)和反向(HGR)5,國(guó)ATCTTCATGCTGGGCAGGGA-3'(SEQIDNO6)。所述持家引物對(duì)適合本發(fā)明的方法和試劑盒。然而，根據(jù)本發(fā)明第三方面的持家引物對(duì)的用途不僅限于所述方法和試劑盒，而是每當(dāng)所檢驗(yàn)樣品(細(xì)胞)中普遍包含編碼人非紅細(xì)胞生成膽色素原脫氨酶基因的時(shí)候可以使用。在實(shí)時(shí)PCR雜交探針中，關(guān)于權(quán)利要求1的引物對(duì)，可如前述的使用Taqman4笨針或分子信標(biāo)型探針使PCR產(chǎn)物可視化。一個(gè)優(yōu)選的Taqman探針是6FAM-ATGAAGGATGGGCAACTGTACCTGACTGG-TMR。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，可以在檢測(cè)生物樣品中的PBGD或任何其他合適的持家基因的擴(kuò)增的靶標(biāo)序列中使用任何雜交探針組代替上文所述的Taqman揮:針。此外，利用本領(lǐng)域公知的PCR儀器中可用的不同熒光通道的存在(具有3-6個(gè)熒光通道的儀器是商業(yè)上可獲得的)，持家基因的擴(kuò)增能與CK-19基因或任何其他合適的靶標(biāo)基因的擴(kuò)增在同一個(gè)運(yùn)行中完成，因?yàn)榭稍谠S多不同的情況下使用持家引物對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照。優(yōu)選以避免擴(kuò)增基因組DNA或cDNA的方式設(shè)計(jì)持家引物，以避免樣品中污染的基因組DNA的非特異性擴(kuò)增。這原則上可使用如設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的CK-19引物所使用的相同的標(biāo)準(zhǔn)用于設(shè)計(jì)持家引物來完成。本發(fā)明的第四方面公開了在患癌癥患者中確定輔助療法前景的診斷方法，包括步驟為(i)提供來自患者的生物樣品；(ii)從生物樣品中分離核酸;(iii)形成反應(yīng)混合物，其包含核酸擴(kuò)增試劑、權(quán)利要求l的引物對(duì)和在步驟(ii)中分離出的核酸的等分試樣；(iv)將該混合物置于擴(kuò)增條件下，以產(chǎn)生與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸序列的至少一個(gè)拷貝；(v)用實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控定量樣品中的CK-19mRNAP日性細(xì)胞；和(vi)基于樣品中CK-19mRNA陽性細(xì)胞的量確定輔助療法的前景。在本發(fā)明這一方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物對(duì)具有根據(jù)SEQIDNO:1和2的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品來自血液、骨髓或淋巴結(jié)，并且在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中樣品是血液，如外周血樣品。然而在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌，優(yōu)選可手術(shù)性的乳腺癌。通常，也可使用本發(fā)明的診斷方法在上皮來源的癌癥類型中基于CK-19標(biāo)記來檢測(cè)/定量循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC),所述上皮來源的癌癥類型包括但不限于鱗狀上皮細(xì)胞如鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤和鱗狀細(xì)胞癌、過渡性上皮細(xì)胞如移行細(xì)胞乳頭狀瘤和移行細(xì)胞癌、基底細(xì)胞如基底細(xì)胞癌、腺上皮如腺瘤、嚢腺瘤和腺癌、腎小管上皮細(xì)胞如腎小管性腺瘤、腎細(xì)胞癌和格拉維茨肺瘤、肝細(xì)胞如肝細(xì)胞腺瘤和肝細(xì)胞癌、膽管上皮細(xì)胞如膽管腺瘤和膽管細(xì)胞型肝癌、以及黑色素細(xì)胞如黑色素細(xì)胞痣和惡性黑色素瘤。在本發(fā)明的第四個(gè)方面，可與早先所述的"測(cè)試樣品，，相同，對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)先處理。因此，在優(yōu)選的方面示例性的血液樣品是在核酸分離之前先被離心以分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。這可能利用本領(lǐng)域公知的任何分離技術(shù)來完成，如聚糖體富集、PAX基因血液收集系統(tǒng)、免疫磁性分離和富集，并且優(yōu)選的離心技術(shù)是梯度離心。在本發(fā)明的這個(gè)方面的上下文中，"核酸擴(kuò)增試劑"和"擴(kuò)增條件"是與如上文所述相同的。在本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了試劑盒用于發(fā)明第四個(gè)方面的診斷方法。所述試劑盒包含本發(fā)明的引物、雜交于癌細(xì)胞上的其他標(biāo)記物的更多任選的引物和擴(kuò)增試劑。所述擴(kuò)增試劑和引物對(duì)可以被分開的提供，或者當(dāng)合適的時(shí)候被混合在一起。在這方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，更多的引物序列雜交到CK19。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，更多的引物序列雜交到HER2/neu和細(xì)胞角蛋白，如CK20、CK8等、乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物、GABAAn、B305D-C、PIP、S100A9、S100A14、PSA、粘蛋白、癌胚抗原、人絨毛膜促性腺激素的|i-亞基、乳腺球蛋白(mammaglobin)、表皮生長(zhǎng)因子、Ep-CAM和其他幾個(gè)本領(lǐng)域公知的mRNA標(biāo)記。另外的標(biāo)記的選擇和組合是在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的。引物的組合任選的取決于癌癥類型的指征。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中引物對(duì)具有SEQIDNO:1和2的序列。由癌癥細(xì)胞上超過一個(gè)的標(biāo)記被檢測(cè)這一事實(shí)決定，兩個(gè)或更多的引物的組合可確保發(fā)生的假陰性結(jié)果減少。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包含內(nèi)部對(duì)照以避免假陰性結(jié)果，其中此內(nèi)部對(duì)照優(yōu)選是持家引物對(duì)。所述持家引物對(duì)優(yōu)選具有SEQIDN05和6的序列。在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒'的另一種實(shí)施方案中，所有成分是凍干的。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或更多(例如全部)的凍干的物質(zhì)是混合的。在這種情況下，使用者如臨床醫(yī)生，可以簡(jiǎn)單的將該混合物溶解在合適的緩沖液中，并在擴(kuò)增之前加入所測(cè)試的樣品。除簡(jiǎn)化操作程序之外，冷凍干燥使試劑的儲(chǔ)存更為穩(wěn)定。本發(fā)明的額外的CK-19引物由前述情況顯而易見的是，本發(fā)明涵蓋范圍廣泛的能檢測(cè)人CK-19基因(包括其PCR-可擴(kuò)增的片段)的適當(dāng)"修飾過的"引物(或修飾過的引物對(duì))。優(yōu)選這種修飾過的引物或其引物對(duì)，在公開于此的特異引物雜交條件的一個(gè)或者組合之下，完全有能力特異結(jié)合CK-19單巴標(biāo)(例如，圖1所示序列)。通過"特異雜交"意i，在特定的雜交條件下，目標(biāo)引物或引物對(duì)能與CK-19靶標(biāo)形成結(jié)合復(fù)合物，此復(fù)合物能夠被PCR-擴(kuò)增以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。優(yōu)選的，相對(duì)于用標(biāo)準(zhǔn)方法如定量瓊脂糖凝膠電泳所確定的任何其他擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度約為卯％，優(yōu)選大約95%的豐度或更高。如果使用一個(gè)引物或者引物對(duì)能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)，其為"合適的"。在開始進(jìn)行有關(guān)例證性引物修飾的進(jìn)一步討論前，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供引物，該引物具有在SEQIDN0:1或SEQIDNO:2中所示的至少約8個(gè)核堿基(nucleobase)(即連接的核苷)的序列。優(yōu)選的，引物中的一個(gè)或兩個(gè)都至少包括約IO個(gè)或約12個(gè)這樣的核堿基，更優(yōu)選至少約15個(gè)高達(dá)約18個(gè)這樣的堿基。具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2完全序列的引物對(duì)于許多發(fā)明應(yīng)用更為優(yōu)選。其他合適的引物包括具有額外序列多達(dá)約20個(gè)至約30個(gè)核堿基(優(yōu)選從序列的5，端排列)的那些引物。其他根據(jù)本發(fā)明的合適的引物包括那些跨越約8個(gè)至約18個(gè)核堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸序列，其包括選自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示序列的至少八(8)個(gè)連續(xù)的核堿基，優(yōu)選至少約10個(gè)至約15個(gè)核堿基，更優(yōu)選約16或17個(gè)堿基。本發(fā)明的更多例證性引物對(duì)包括一個(gè)或多個(gè)合適的引物，其中DNA序列(或有時(shí)為RNA序列)具有在如圖1所示外顯子1/2交界兩側(cè)(CK-19cDNA的約449至455位核苷酸)的至少四(4)個(gè)連續(xù)的核堿基，優(yōu)選五(5)、六(6)、七(7)、八(8)或九(9)個(gè)連續(xù)的核堿基。此外合適的引物在其各自的3，端包括至少約l、2、3或4個(gè)核苷酸，所迷核苷酸不雜交于如圖1所示的相應(yīng)的CK-19假基因cc序列(即不能與之形成氫鍵)。優(yōu)選的，這樣的非雜交核苷酸將跨越CK-19cDNA的約568至571位核苷酸。即通過核苷酸取代或在某些情況下的缺失，在選擇的一個(gè)雜交條件或組合的雜交條件下，引物對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)引物的3，端將無法與CK-19假基因完全雜交。在本發(fā)明范圍內(nèi)額外的合適的引物包括那些具有從SEQIDNO:1或SEQIDNO:2代表序列之一的5，-末端開始至少約10個(gè)額外的核苷酸(例如l、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)核苷酸)的引物。盡管其對(duì)于許多用途較少優(yōu)選，本發(fā)明也涵蓋合適的引物，其具有來自SEQIDNO:l或SEQIDNO:2代表序列之一的3，-末端的至少約5(五)個(gè)額外的核苷酸(例如1、2、3、4或5個(gè)核苷酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本申請(qǐng)后，會(huì)明白廣泛的其他引物和引物對(duì)在本發(fā)明范圍內(nèi)。這樣的實(shí)施方案包括(而非限制于)合適的引物，其中在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸將4皮A、G、C、T或U取代。也可以考慮在由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2代表的序列中適當(dāng)缺失一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)序列(連續(xù)或不連續(xù)的)。還應(yīng)理解的是，核苷是堿基-糖的組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。兩類最常見的這樣的雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是核普，其還包括共價(jià)連接到核普的糖部分的磷酸基團(tuán)。對(duì)于那些包括戊呋喃基(pentofuranosyl)糖的核苷，磷酸基團(tuán)可以與糖的無論是2、3或5位羥基部分連接。在形成寡核苷酸的過程中，磷酸基團(tuán)將相鄰核苷彼此共價(jià)連接，以形成線性多聚體化合物。然后，這線性多聚體結(jié)構(gòu)各自的兩端，可以進(jìn)一步接合以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但是，一般優(yōu)選打開的線性結(jié)構(gòu)。此外，線性結(jié)構(gòu)也可能具有內(nèi)部堿基互補(bǔ)性，并可能因此以一種方式折疊以產(chǎn)生雙鏈結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi)部，磷酸基團(tuán)通常被認(rèn)為形成寡核苷酸的核苷間(internucleoside)主鏈。正常的鍵合或女RNA和DNA的主鏈?zhǔn)?，至5'的磷酸二酯鍵合。修飾的CK-19引物主鏈本發(fā)明范圍內(nèi)的引物和引物對(duì)的額外實(shí)例包括具有4務(wù)飾的主鏈或非天然的核苷間鍵合的寡核苷酸。如本說明書所定義，具有修飾的主鏈的寡核苷酸包括那些在主鏈中保留磷原子和那些在主鏈中沒有磷原子的。出于本說明書的目的，和有時(shí)如在本領(lǐng)域所參考的，其核苷間主鏈沒有磷原子的修飾的寡核苷酸也可以被視為寡核苷。因此，本發(fā)明包含引物和引物對(duì)，其中一個(gè)或兩個(gè)引物包括修飾的寡核苷酸主鏈。這類主鏈包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二疏代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸鹽包括3，-亞烴基磷酸酯、5，-亞烴基磷酸酯和手性磷酸鹽、次磷酸鹽，氨基磷酸酯包括3，-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸和硼烷磷酸鹽(borano-phosphate)，其具有這些的普通3'-5'鍵、2，-5'鍵連接的類似物，以及具有反極性(其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的連接是3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵)的那些。具有反極性的額外的寡核苷酸包括在最3，端的核苷酸間鍵合包含單個(gè)的3'至3'鍵合，即可能是無堿基(堿基丟失或在其位置上有羥基基團(tuán))的單個(gè)相反的核苷殘基。還包括各種鹽、混合的鹽和游離酸的形式。例如，參見下列專利3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5，177，196、5，188，897、5，264，423、5，276，019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5，536，821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5，194，599、5，565，555、5，527，899、5,721,218、5，672，697和5,625,050以及本文中公開的參考文獻(xiàn)。本發(fā)明另外的目標(biāo)是提供適當(dāng)?shù)囊锖鸵飳?duì)，其中引物的一個(gè)或兩個(gè)均不包含磷原子。這類實(shí)施方案具有由短鏈烷烴或環(huán)烷基核普酸內(nèi)鍵合、混合雜環(huán)原子和烷基或環(huán)烷基核苷酸內(nèi)鍵合，或一個(gè)或更多的短鏈雜環(huán)原子或雜環(huán)核苷酸內(nèi)鍵合形成的主鏈。其中包括那些嗎啉代鍵合(如上所討論的，所形成部分是來自核苷的糖部分)；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲乙?；?formacetyl)和硫代曱乙?；?thioformacetyl)主鏈；亞曱基甲乙酰基和硫代甲乙?；麈湥缓艘阴；?riboacetyl)主鏈；含烯烴的主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞胺和亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽和磺胺類藥物的主鏈；酰胺主鏈；以及其他具有混合的N、O、S和CH2成分部分。參見，例如，下列專利5,034,506、5，166，315、5，185，444、5，214，134、5，216，141、5,235,033、5,264,562、5，264，564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5，610，289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5，633,360、5,677,437、5,792,608、5，646，269、5，677，439以及其內(nèi)公開的參考文獻(xiàn)。在一些發(fā)明實(shí)施方案中，使一個(gè)或兩個(gè)引物帶有新的基團(tuán)(即不與天然存在的核苷相締合)是有用的。這樣一個(gè)寡聚化合物，其已被證明具有優(yōu)良雜交特性的擬寡核苷酸，被稱為肽核酸(PNA，參見上述討論)。在PNA化合物中，使用含有酰胺的主鏈，特別是氨乙基甘氨酸主鏈代替寡核苷酸的糖-主鏈。保留核堿基并且使其直接或間接地結(jié)合于主鏈酰胺部分的氮雜原子。參見，例如，下列專利5,539,082、5,714,331和5,719,262以獲得制作和使用PNA化合物的額外的信息。根據(jù)發(fā)明更多的合適的引物和引物對(duì)，包括具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜環(huán)原子主鏈的寡核苷，并且特別是-CH2-NH-0-CHr、-CH2-N(CH3)-0-CH2-(稱為亞曱基(曱基亞胺)或MMI主鏈)、-CH2-0-N(CH3)-CH2、-CH2-N(CH3)N(CH3)CH2-和-ON(CH3)-CH2-CH2-和-0-P-0-CH2-。同樣優(yōu)選的是具嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。參見前面的討論和美國(guó)專利號(hào)5,034,506。也參見美國(guó)專利號(hào)5,489,677和5，602，240。修飾的CK-19引物糖基在一些發(fā)明的實(shí)施方案中，對(duì)引物和引物中的寡核苷酸進(jìn)行修飾，使具有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分可能是有用的。優(yōu)選的，具有這種修飾的寡核苷酸在其2，位包括下列之一OH;F;O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基和炔基可以被d至d。烷基或C2至d。烯基和炔基取代，或不被取代。額外的修飾包括0(CH2)nOmCH3、O(CH2nOCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2和0(CH2)nON[(CH2)nCH32,其中n和m是從1到約10。其他例證性的寡核苷酸在其2，位包含下列情形之一C,至C，。的低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多聚-烷氨基、取代硅、RNA切割基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、或核酸插入劑。額外的修飾包括2'-曱氧乙氧基(2，-0-CH2CH20CH3，也稱為2，-0-(2-甲氧乙基)或2'-MOE)(Martin等人，Helv.CWm.Acta,1995，78，486-504)即烷氧烷氧基團(tuán)。更多的說明性^f務(wù)飾優(yōu)選包括2，-二曱氨基氧乙氧基，即如以下實(shí)例所述的0(CH2)2ON(CH3)2基團(tuán)，也稱為2，-DMAOE，和2'-二甲氨基-乙氧乙氧基(也稱為2'-0-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE),即2'0-CH2-0-CH2-N(CH3)2。其他合適的引物和引物對(duì)是在本發(fā)明范圍之內(nèi)的。這些包括那些有修飾的引物，所述修飾包括2'-曱氧基(2'-0-CH3)、2'-氨基丙氧基(2，-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2-CH=CH2)、2'0-烯丙基(2'國(guó)0-CHrCH-CH2)和2'-氟基(2，-F)。該2'-修飾可能在阿糖基(arabino)(上方)位置或者核糖基(ribo)(下方)位置上。一個(gè)實(shí)例性的2'-阿糖基修飾是2'-F。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行，特別是在核苷酸3，末端或者以2'-5'鍵合的寡核苷酸中的3，位糖苷，和核苷酸5，末端的5，位。寡核苷酸可能也具有擬糖類，如環(huán)丁基部分代替戊呋喃基糖苷。參見，例如，下列專利4,981,957、5，118，800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5，514，785、5，519，134、5，567,811、5,576,427、5，591，722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,792,747和5,700,920。才艮據(jù)本發(fā)明的更多引物，包括一個(gè)或多個(gè)具有鎖定的核酸(LNA)的引物。優(yōu)選的LNA的特點(diǎn)是2'-羥基基團(tuán)鍵合到糖環(huán)3'或4'碳原子上，從而形成了雙環(huán)糖基部分。該鍵合優(yōu)選橋接2'氧原子和碳原子的亞甲基(-CHr)n基團(tuán)，其中n為1或2。LNA及其制備描述在國(guó)際公布專利申請(qǐng)?zhí)朩O98/39352和WO99/14226以及如下列美國(guó)專利和專利出版物中6,794,499、6,670,461、2003/0082807(Xylo-LNA)、2003/0087230(L畫ribo-LNA)和2003/0224377。修飾的CK-19引物核堿基應(yīng)該理解，寡核苷酸也寸能包括核堿基(參考本領(lǐng)域通常簡(jiǎn)稱為"堿基")的修飾或取代。如本文所用，"未經(jīng)修飾，，或"天然的"核堿基包括噤呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G),以及嘧淀堿基胸腺嘧咬(T)、胞嘧咬(C)和尿嘧咬(U)。被修飾的核堿基包括其他人工合成和天然的核堿基諸如5-曱基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥曱基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-曱基和其他烷基的衍生物、腺嘌呤和鳥噤呤的2-丙基和其他烷基的衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧咬、5-囟代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-CEC-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及其他嘧咬堿基的炔衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧咬和胸腺嘧咬、5-假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-閨代、8-氨基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其它8位取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-卣代特別是5-溴代、5-三氟甲基和其他5位取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺噤呤和3-脫氮雜鳥嘌呤及3-脫氮雜腺嘌呤。更多的被修飾的核堿基包括三環(huán)嘧咬諸如吩巧惡嗪胞苷(lH-嘧啶并[5，4-b[1，4苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(lH-嘧啶并[5-，4-1)[1，4苯并噻臻-2(3H)-酮)、G-磁夾(clamp)例如取代的吩噴、噪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-吡啶并[5，4-b1，4)苯并^惡溱-2(3H)-酮)、^唑胞苷(2H-吡啶并[4，5-b)吲味-2-酮))、吡咬并吲咮胞苷(H-吡啶并[3'，2':4，Spyrrolo[2，3-dlpyri畫midin-2國(guó)酉同)。被修飾的核堿基也可以包括其中嘌呤或嗜咬堿基被其他雜環(huán)化合物取代的那些，例如7-脫氮雜-腺噪呤、7-脫氮雜鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。更多的核堿基包括那些公開于美國(guó)專利號(hào)3，687，80、公開于高分子科學(xué)和工程的簡(jiǎn)明百科全書，第858-859頁，Kroschwitz，J.I.，JohnWiley和Sons編輯，1990，s，由Englisch等人，AngewandteChemie，國(guó)際編輯，1991,30，613所乂A開的那些，以及由Sanghvi,Y.S.，第15章，反義研究和應(yīng)用，第289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編輯，CRCPress,1993所公開的那些。額外的修飾包括5位取代的嘧咬、6-氮雜嗜咬和N-2、N-6和0-6位取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺噤呤、5-丙基尿嘧啶和5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶的取代已顯示能增加核酸雙螺旋的穩(wěn)定性0.6-1.2攝氏度。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，編輯,反義研究和應(yīng)用，CRCPress,BocaRaton,1993，第276-278頁)，并且是說明性的堿基取代，特別當(dāng)與2，-0-甲氧乙基糖修飾組合時(shí)。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)3，687，808，以及美國(guó)專利號(hào)4,845,205、5,130,302、5,134,066、5，175，273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5，681，941、5，750，692。本發(fā)明的引物或引物對(duì)如果包括至少一種前述的寡核苷酸修飾，則其是"被^f務(wù)飾的，，。顯而易見的是，被特定4務(wù)飾的引物和引物對(duì)并非最適用于某些發(fā)明的實(shí)施方案，如進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。然而，例如，可以使用被修飾的引物作為電泳標(biāo)記，和/或作為"反義"成份。對(duì)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，其中增加靶標(biāo)親和力和特異性是有用的或在增強(qiáng)力度時(shí)是有幫助的，由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所代表的一個(gè)或兩個(gè)序列可以被修飾為包含至少1個(gè)LNA,例如，l(一)、2(二)、3(三)、4(四)或5(五)個(gè)這樣的LNA。參見，例如，Vester，B和J.Wengel(2004)Biochemistry43:13233;以及其引用的涉及LNA寡核苷酸制備和使用的另外公開的參考文獻(xiàn)。正如上面所討論的，本發(fā)明也提供了在生物流體中測(cè)定CK-19mRNA存在的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟(a)-(g):a)從生物流體中分離任何單核細(xì)胞。該分離步驟可以用幾乎任何能夠從生物流體中分離細(xì)胞的方法，如過濾和/或離心進(jìn)行。在已選定離心的實(shí)施方案中，往往會(huì)優(yōu)選使用聚糖體或其他適合細(xì)胞分離的梯度。使用聚糖體Histop叫ue-1077系統(tǒng)(希格瑪公司，St.Louis，MO(USA))對(duì)于許多應(yīng)用是優(yōu)選的，例如其中生物流體是外周血的那些。b)將分離出來的單核細(xì)胞與特異結(jié)合上皮單核細(xì)胞表達(dá)抗原的多克隆或單克隆抗體(或其抗原結(jié)合片段，如Fab，F(xiàn)(ab，)2、單鏈抗體等)相接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白，例如在細(xì)胞表面或胞漿中。舉例說明的抗體是特異結(jié)合CDC326抗原的，例如，ber-EP4、B302(323/A3)、B29.1(VU-ID9)、VU-1D9、HEA125。這些和其他合適的抗體可從各種商業(yè)來源獲取，如Abeampic(劍橋，英國(guó))、DakoUKLTD.(劍橋郡，英國(guó))、和圣克魯斯生物技術(shù)公司(圣克魯斯，CA(USA))?？贵w(或抗原結(jié)合片段)可與任何合適的固體支持物(例如玻璃纖維濾紙、硝酸纖維素、燒結(jié)微晶玻璃、塑料、合成高分子纖維素、醋酸纖維素、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或聚偏乙烯氟化物)預(yù)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，固體支持物是珠子的形式，優(yōu)選其包含磁性或順磁性物質(zhì)。優(yōu)選的珠子是Dynal制造的。優(yōu)選的是，該方法的接觸步驟足以在細(xì)胞、抗體和固體支持物之間形成結(jié)合復(fù)合物。C)將結(jié)合復(fù)合物與任何未結(jié)合的物質(zhì)分離，例如，通過過濾和/或離心的方法。d)將核酸從與復(fù)合物結(jié)合的上皮單核細(xì)胞中分離出來(例如，RNA，諸如mRNA)。通常情況下，并如上文所述的，從由細(xì)胞分離出的RNA制備cDNA，e)形成反應(yīng)混合物，其包括核酸擴(kuò)增試劑、公開于此的引物對(duì)(例如具有SEQIDNo.l和2中表現(xiàn)序列的引物)和分離自上皮單核細(xì)胞的核酸，f)將該混合物置于擴(kuò)增條件下，以產(chǎn)生與CK-19靶標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸序列的至少一個(gè)拷貝；和g)使用PCR，優(yōu)選使用實(shí)時(shí)PCR,檢測(cè)生物樣品中CK-19mRNA的量。如果期望，可以確定生物流體中CK-19mRNA的量。術(shù)語"特異的結(jié)合"或類似的術(shù)語意指此處公開的分子，其結(jié)合另一個(gè)分子，從而形成特異的結(jié)合對(duì)。然而，如通過這些方法，例如免疫印跡ELISA、RIA、遷移滯后試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、竟?fàn)幵囼?yàn)、飽和度試驗(yàn)或其他本領(lǐng)域周知的蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定，該分子不識(shí)別或結(jié)合其他分子。通常參見，Harlow和Lane在抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1988)及其為檢測(cè)分子間特異結(jié)合方法的舉例引用的參考文獻(xiàn)。在前述方法的實(shí)施方案沖，其中固體支持物是磁珠，該方法還包括加強(qiáng)結(jié)合復(fù)合物的磁場(chǎng)以從任何未結(jié)合物質(zhì)分離該復(fù)合物的方法。接著可使用標(biāo)準(zhǔn)方法處理分離的珠子復(fù)合物以分離細(xì)胞(并從其中制備核酸)。參見例如，來自Dynal的信息(上皮富集的免疫不茲珠)。該方法是靈活的，并且與公開于此處的一個(gè)引物對(duì)的使用或引物對(duì)的組合使用是相容的。特定引物對(duì)的使用將取決于計(jì)劃的用途。但是對(duì)于許多實(shí)施方案，SEQIDNo:1和SEQIDNo,2所代表的引物將是足夠的。優(yōu)選的生物流體是外周血。如果期望，該方法很容易適應(yīng)于包括使用一個(gè)或多個(gè)合適的對(duì)照測(cè)定，如實(shí)施例中所提到的那些。舉例來說，其對(duì)于制作實(shí)施方案中CK-19表達(dá)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線是有用的，在所述實(shí)施方案中使用者希望不僅檢測(cè)而且對(duì)特定生物樣品中的單核細(xì)胞定量。下面的實(shí)施例說明如何制作一個(gè)舉例說明性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中外周血被加入了MCF-7細(xì)胞。應(yīng)該理解的是可以使用其他細(xì)胞制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣應(yīng)該理解的是，一旦制備了標(biāo)準(zhǔn)曲線，不必在每次執(zhí)行該方法的時(shí)候重復(fù)。例如，在其發(fā)明用于臨床背景的實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)曲線可制作一次(或最多少數(shù)幾次)，其中一種或少數(shù)幾種類型的生物樣品(如來自患者的外周血)被測(cè)定。如果需要的話，前述方法還可以適應(yīng)于包括公開于此的一種或多種持家基因的使用。使用公開于此的探針，可以檢測(cè)并任選的定量擴(kuò)增的CK-19靼序列。從前述情況顯而易見的是，本發(fā)明是靈活的，并且可用于探測(cè)和任選的定量在各種生物樣品中，包括正常和異常(如癌)的組織表達(dá)的CK-19。對(duì)于正常組織，有以下實(shí)例毛嚢、分泌細(xì)胞的汗腺、Merkell細(xì)胞、乳腺管的管腔上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜及內(nèi)子宮頸的表面粘膜和腺體、外子宮頸、卵巢表面間皮、輸卵管上皮、細(xì)胞-和合體細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、羊膜、臍帶表面上皮、前列腺管腔與基底細(xì)胞、睪丸膜上皮、輸出小管、附睪管、腎小嚢(Bowman'scapsul)e、腎的近曲小管、遠(yuǎn)曲小管和集合管、尿道上皮、膽管和膽膀胱的上皮、舌頭的鱗狀上皮細(xì)胞、舌頭的味蕾細(xì)胞、舌頭的腺體分泌細(xì)胞和舌頭的腺體導(dǎo)管、食道的鱗狀上皮細(xì)胞和粘膜下腺、胃的表面粘膜和腺體、大腸和小腸的表面粘膜和隱窩、胰導(dǎo)管、唾液腺的分泌細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞，甲狀腺上皮、氣管表面粘膜和腺體、支氣管粘膜和腺體、肺泡、胸膜-間皮、哈塞耳氏小體和胸腺上皮細(xì)胞。對(duì)于非正常組織，下列清單是說明性的人乳腺腫瘤、纖維性瘤、纖維嚢性疾病、葉狀嚢性肉瘤、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌、髓樣癌和轉(zhuǎn)移、侵襲性癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、純?cè)话?、具有派杰?Paget'sdisease)的組織、甲狀腺腺瘤、結(jié)腸腺癌、胃腺癌和肺腺癌，卵巢癌和膀胱癌、畸胎瘤、胚胎癌、睪丸癌、表皮腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌、以及角膜眥疣。前述本發(fā)明的某些方面已公開于2005年8月17日提交的希臘專利申請(qǐng)GR20050100430，和于2006年4月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/795,149，其中每項(xiàng)都以其整體被引入作為參考。本文引用的所有參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容被整體引入作為參考。已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的敘述，參考其優(yōu)選的實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考本公開內(nèi)容進(jìn)行修飾和改善而不悖離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)驗(yàn)材料和方法A.細(xì)胞^羊品使用表達(dá)CK-19基因的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(來自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；ATCC)作為陽性對(duì)照并如前所述進(jìn)行培養(yǎng)(A.Stathopoulou等人；2001)。B.臨床才羊品在EDTA中的外周血來自手術(shù)后I/II期(早期)的160例乳腺癌患者和62例健康的女性志愿者(年齡18-65歲)。為了減少來自皮膚上皮細(xì)胞的血液的污染，最初抽取的5ml血被丟棄并且在抽出針頭之前收集管的末端是斷開的。來自健康捐獻(xiàn)者和患者的外周血樣品用相同的方式收集和處理。所有的患者和捐獻(xiàn)者都給出了他們的知情同意書并且此研究已經(jīng)由參與機(jī)構(gòu)的倫理和科學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。如以前所述(A.Stathopoulou等人；2001),用聚糖體泛影鈉-1077(希格瑪化學(xué)公司(SigmaChemicalCompany),LTD,英格蘭)梯度離心的方法在靜脈穿刺后一個(gè)小時(shí)之內(nèi)分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，細(xì)胞在提取總RNA之前保存在-80。C。C.總RNA分離和cDNA合成用TrizolLS試劑(英杰公司(Invitrogen，Corp.)，Carlsbad,USA)根據(jù)其廠商說明書進(jìn)行總RNA分離。所有的RNA制備和操作步驟在無RNA酶的條件下于層流凈化通風(fēng)柜中進(jìn)行。分離的RNA溶解在RNA存儲(chǔ)緩沖液里(Ambion，USA)并且在使用之前保存于-70。C。RNA濃度用RiboGreenRNA定量試劑盒(分子探針，Eugene,OR，USA)測(cè)定，使用熒光定量PCR分析儀(羅氏診斷(RocheDiagnostics),Manheim，德國(guó))作為簡(jiǎn)單的熒光計(jì)。用下面的方法進(jìn)行RNA定量在焚光定量PCR分析儀的玻璃毛細(xì)管中加入5pL試劑盒供應(yīng)的已知濃度的RNA溶液、或其稀釋液、或未知樣品，并一起加入5jiL的RiboGreen熒光團(tuán)。通過焚光定量PCR分析儀在實(shí)時(shí)熒光計(jì)算模式(范圍為5-500ng/mL)的方式下測(cè)量RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光值來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。一式三份的測(cè)量樣品的焚光并且用此標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算其RNA濃度。用熱轉(zhuǎn)錄RT-PCR系統(tǒng)(英杰公司，USA)來執(zhí)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。使用從MCF-7細(xì)胞制備的總RNA作為陽性對(duì)照。從5jig總RNA合成cDNA，所述總RNA是才艮據(jù)廠商說明書從健康志愿者和乳腺癌患者的PBMC分離。在cDNA的制備中，通過實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增人黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因檢驗(yàn)RNA的完整性，根據(jù)廠商說明書使用熒光定量PCR分析儀-h-HPRT基因裝置(羅氏診斷)進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增。然而，因?yàn)楫?dāng)前的科學(xué)數(shù)據(jù)顯示以單個(gè)持家基因進(jìn)行的歸一化是不適當(dāng)?shù)腫C.Tricarico等人；2002和K.Dheda等人；20041，我們的研究結(jié)果并沒有以HPRT基因的量進(jìn)行歸一化，而是如先前所述，以被用于cDNA合成的總RNA量來進(jìn)行(A.Stathopoulou等人；2003)。D.最佳B方案的引物設(shè)計(jì)使用的新引物對(duì)CK19-do2和CK19-for2的寡核苷酸序列(B方案)，最初是通過引物Premier5軟件(PremierBiosoftInternational,PaloAlto,CA，USA)在硅片上進(jìn)行設(shè)計(jì)和評(píng)估，以避免引物二聚體的形成、假啟動(dòng)位點(diǎn)和形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此外，正向引物(CK19-for2)被選定在內(nèi)含子-夕卜顯子交界處的位置上，從而完全避免雜交到基因組CK-19DNA。而且，引物和探針被設(shè)計(jì)以區(qū)分在BLAST序列相似性搜索工具(NCBI，NIH)的搜索找到的高度同源的CK-19a假基因(見圖1)。尤其是,設(shè)計(jì)反向引物(CK19-do2)在CK-19mRNA的特定位點(diǎn)，以在其3，端有兩個(gè)相對(duì)CK-19a假基因的錯(cuò)配(圖1)，從而使TaqDNA聚合酶不可能延伸和避免了來自CK-19a假基因擴(kuò)增的假陽性結(jié)。雜交探針(TIBmol，柏林，德國(guó))同樣如先前所述(A方案)(A.Stathopoulou等人；2003)。在微量化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(FORTH,Crete,希臘)合成引物。所有引物和雜交探針序列如表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表1.在本研究中用于B方案的引物和雜交探針序列。a用熒光素標(biāo)記；b用LCRed640(TIBMOLBIOL)標(biāo)記在評(píng)估關(guān)于基因組DNA的新引物對(duì)的特異性的過程中，我們對(duì)分離自健康捐獻(xiàn)者外周血的基因組DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所述擴(kuò)增使用先前用過的(CK19-do和CK19-for)和新設(shè)計(jì)的引物(CK19-do2和CK19-for2)的4種組合。D.優(yōu)化對(duì)CK-IBmRNA的實(shí)時(shí)RT-PCR(B方案)基于PCR過程中對(duì)熒光標(biāo)記的特異雜交探針CK-19的實(shí)時(shí)監(jiān)控進(jìn)行定量。通過熒光定量PCR分析儀軟件將熒光上升到高于背景噪聲的點(diǎn)(交叉點(diǎn)，Cp)作為曲線的第二最大導(dǎo)數(shù)進(jìn)行最佳定量。CK-IBmRNA的實(shí)時(shí)RT-PCR使用熒光定量PCR分析儀-系統(tǒng)(羅氏診斷)進(jìn)行。對(duì)于A方案，使用如先前所述(A.Stathopoulou等人；2003)的引物(CK19-do和CK19-for)和雜交探針(CK19-FL和CK19-LC)。對(duì)于B方案，使用我們新設(shè)計(jì)的引物CK19-do2和CK19-for2和與A方案中相同的雜交探針；見表l。實(shí)時(shí)PCR在熒光定量PCR分析儀玻璃毛細(xì)管中以20pL的總體積進(jìn)行對(duì)于PCR，將2jiL的cDNA放入18jiL反應(yīng)體積中，該反應(yīng)體積包含2nL無Mg2十的PCR合成緩沖液(10x)、1pL的MgCl2(50mM)、0.4fiL的dNTP(10mM)、0.3的BSA(10pg/mL)、0.2fiL的TaqplatinumDNA聚合酶(5U/jiL)(英杰公司，USA)、1pL的正義引物CK19-for2(3HM)、1nL的反義引物CK19-do2(3pM)、lfiL雜交探針CK19-FL(3jiM)、1nL的雜交探針CK19-LC(3jiM)和DEPC-H20(加入最終體積中)。PCR反應(yīng)在95。C進(jìn)行10分鐘變性之后開始(熱啟動(dòng)PCR)并且以在40。C進(jìn)行30秒冷卻終止。循環(huán)方案由在95。C進(jìn)行10秒變性、在55。C進(jìn)行20秒退火以及在72。C進(jìn)行20秒延伸并且重復(fù)50次組成。在每次退火步驟的最后進(jìn)行O秒熒光檢測(cè)。對(duì)于定量測(cè)定，通過外部標(biāo)準(zhǔn)cDNA獲得外部校準(zhǔn)曲線。從lxl06MCF-7細(xì)胞(用血球計(jì)數(shù)器檢驗(yàn))制備總RNA。這個(gè)RNA制品在DEPC處理過的水中的一系列稀釋液，其對(duì)應(yīng)著1-1000MCF-7細(xì)胞，能用來進(jìn)行cDNA合成。這些cDNA以等分試樣保存在-20。C并在本研究中始終作為外部標(biāo)準(zhǔn)物。通過標(biāo)示對(duì)應(yīng)每個(gè)外部標(biāo)準(zhǔn)cDNA的MCF-7細(xì)胞數(shù)相對(duì)其交叉點(diǎn)的值(Cp)來建立這個(gè)校準(zhǔn)曲線。對(duì)于所有測(cè)試的樣品，如先前所述，以每5照總RNA的MCF-7細(xì)胞當(dāng)量表示循環(huán)CK-19mRNA陽性細(xì)胞數(shù)(A.Stathopoulou等人；20(B)，所述數(shù)值是由熒光定量PCR分析儀軟件3,1依據(jù)外部標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線確定的。為了確?？蓴U(kuò)增的原料在所有的物種都存在并且為了避免假陰性結(jié)果，在所有樣品中進(jìn)行對(duì)持家基因人黃噤呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增(熒光定量PCR分析儀-h-HPRTgeneset,羅氏應(yīng)用科學(xué)(RocheAppliedScience))。使用下列方案擴(kuò)增持家基因。實(shí)時(shí)PCR在熒光定量PCR分析儀玻璃毛細(xì)管中以20fiL的總體積來進(jìn)行。對(duì)于PCR，將2jaL的cDNA放入IS卞L反應(yīng)體積中，該反應(yīng)體積包含2nL無Mg2+的PCR合成緩沖液(IOx)、l的MgCl2(50mM)、0.4jiL的dNTP(10mM)、0.3fiL的BSA(10pg/mL)、0.2jiL的TaqplatinumDNA聚合酶(5U/jiL)(英杰公司，USA)、各1jiL的持家基因正義和反義引物(3pM)、1jiL雜交探針CK19-FL(3nM)、2jiL的Taqman探針(6FAM-ATGAAGGATGGGCAACTGTACCTGACTGG-TMR)(3fiM)和DEPC-H20(加入最終體積中)。PCR反應(yīng)發(fā)卻終止。循環(huán)方案由在95。C進(jìn)行10秒變性、在55。C進(jìn)行20秒退火以及在72。C進(jìn)行20秒延伸并且重復(fù)50次組成。在每次退火步驟的最后進(jìn)行0秒熒光檢測(cè)。預(yù)防措施為了減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，RNA提取、cDNA合成、實(shí)時(shí)RT-PCR步驟的預(yù)備以及熱循環(huán)都在分開的房間進(jìn)行。PCR混合物的預(yù)備在通風(fēng)拒里進(jìn)行(BioTechneHepa，TECHNE，劍橋，UK)并且我們?cè)谡麄€(gè)過程中的每次提取或合成步驟使用過濾嘴和包括陽性和陰性樣品對(duì)照。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用McNemar和Fischer精確檢驗(yàn)比較用兩組引物對(duì)在同一cDNA中進(jìn)行CK-19mRNA檢測(cè)的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。使用成對(duì)非正態(tài)分布群體的Wilcoxon檢驗(yàn)比較由兩種方案評(píng)估的我們的樣品中CK-19陽性細(xì)胞水平。(P<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著)。數(shù)據(jù)分析由Statmost統(tǒng)計(jì)軟件包執(zhí)行(Statmost,DataMostCorp，itJSA)。結(jié)果A.對(duì)CK-19和基因組DNA的B方案的實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)CK-19的實(shí)時(shí)RT-PCR優(yōu)化的B方案的特異性是通過在基因組DNA樣品中應(yīng)用4組引物[A)CK19-do2/CK19-for2、B)CK19-do2/CK19-for、C)CK19畫do/CK19-for、D)CK19-do/CK19-for2來評(píng)估的(見圖2)。引物對(duì)CK19-do2/CK19-for2顯示沒有任何產(chǎn)物的擴(kuò)增，而其他三組顯示出擴(kuò)增。B.為CK-19優(yōu)化B方案實(shí)時(shí)RT-PCR通過為CK-19設(shè)計(jì)新的高特異性引物對(duì)，我們改善了我們先前報(bào)道過的實(shí)時(shí)試驗(yàn)(A.Stathopoulou等人；2003)。對(duì)關(guān)于B方案的PCR反應(yīng)條件稍作修改是必要的擴(kuò)增溫度降低到60至55。C并且將擴(kuò)增時(shí)間從10秒增力口至l]20禾少。我們通過在4個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析cDNA外部標(biāo)準(zhǔn)(制定如上文所述)來評(píng)估B方案的CK-19實(shí)時(shí)PCR的分析靈敏度和線性度。來自這些數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)曲線顯示，在整個(gè)定量測(cè)定范圍是線性的(1-1000MCF-7細(xì)胞)和在所有情況下大于0.99的相關(guān)系數(shù)，暗示確切的對(duì)數(shù)線性關(guān)系。校準(zhǔn)曲線的平均斜率和截距分別是-3.226±0.14(CV=4.3%，11=4)和32.30±0.22(CV-0.7%，n=4)，而PCR的效率表示成E=10"斜率-1(I.R.Peters等人；2004),其數(shù)值為1.04±0.06(CV=2.9%，n=4)。該方法的分析檢測(cè)極限定義為第一個(gè)外部標(biāo)準(zhǔn)(lMCF-7細(xì)胞當(dāng)量)的Cp標(biāo)準(zhǔn)差的3.3倍除以校準(zhǔn)曲線的平均斜率(DL=3.3標(biāo)準(zhǔn)差/斜率)，其^皮發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于0.4MCF-7細(xì)胞當(dāng)量。為了確定B方案的試驗(yàn)內(nèi)精確度，在對(duì)應(yīng)1、10、100和1000個(gè)MCF-7細(xì)胞的四個(gè)cDNA樣品中定量測(cè)定CK-19mRNA，所述測(cè)定在同一輪試驗(yàn)、平行的6個(gè)測(cè)定、在熒光定量PCR分析儀中進(jìn)行。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表2.CK-19mRNA的實(shí)時(shí)RT-PCRB方案的試驗(yàn)內(nèi)(within-run)和試-驗(yàn)間(between-run)精確度。表2證明校準(zhǔn)曲線所確定的MCF-7細(xì)胞測(cè)定內(nèi)的CV值范圍從2.9。/。到25%，而相應(yīng)的Cp值范圍從0,21。/。到1.25%。此外，為了確定此測(cè)定的試-瞼間精確度，同樣的cDNA樣品以等分試樣凍存(-2(TC)并且在一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)、在4個(gè)不同的日子、用4個(gè)單獨(dú)的測(cè)定進(jìn)行分析。表2顯示了校準(zhǔn)曲線所確定的MCF-7細(xì)胞試驗(yàn)間的CV值范圍從6.7。/。到18.9%，而相應(yīng)的Cp值范圍從0.76。/。到1.12%。C.比較的定量測(cè)定在外周血樣品中的CK-19mRNA陽性細(xì)胞對(duì)CK-19實(shí)時(shí)RT-PCR的優(yōu)化過的B方案的特異性和敏感度進(jìn)行關(guān)于A方案方面的評(píng)估。兩個(gè)定量方案都應(yīng)用于總共222例外周血樣品，它們來自62例健康女性捐血者和160例可手術(shù)性的(I/II期)乳腺癌患者。通過HPRT持家基因的表達(dá)，所有這些樣品的RNA質(zhì)量和cDNA合成^皮檢驗(yàn)。各個(gè)樣品的總RNA由RiboGreen使用熒光計(jì)定量測(cè)定。使用同樣量的RNA進(jìn)行cDNA合成并且用于歸一化我們的定量RT-PCR數(shù)據(jù)(A.Stathopoulou等人；2003)。通過再次檢查89例來自健康志愿者的外周血樣品中的62例來評(píng)估新的引物組的特異性，所述外周血樣品是我們先前用A方案已分析過的(A.Stathopoulou等人；2003)。通過應(yīng)用A方案，根據(jù)本測(cè)定的分析截?cái)帱c(diǎn)，這89例樣品中的2例被認(rèn)為是陽性的(Cp-32.17士0.70，CV(%)=2.2),而當(dāng)分析B方案的時(shí)候，62例樣品中沒有一例(包括兩例陽性樣品)顯示任何擴(kuò)增。通過用兩種方案分析160例可手術(shù)性乳腺癌患者的外周血樣品來評(píng)估優(yōu)化方法的敏感度。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表3.對(duì)檢測(cè)外周血樣品中的CK-19陽性細(xì)胞的實(shí)時(shí)PCR的A方案和B的比較。一致性89.2%(198/222)，(P=0.0022，McNemar&Fischer精確檢驗(yàn))。如表3中所見，這些樣品中的33例(20.6%)#皮發(fā)現(xiàn)是陽性的。在灰色地帶并且經(jīng)A方案表征為陽性的二十例樣品經(jīng)B方案發(fā)現(xiàn)為陰性的，而4例樣品使用A方案表征為陰性，因?yàn)樗鼈兘o出的擴(kuò)增曲線具有高于截?cái)帱c(diǎn)的Cp，而使用B方案發(fā)現(xiàn)其為陰性的。通過將所有檢驗(yàn)的外周血樣品包括進(jìn)來(健康捐獻(xiàn)者11=69和乳腺癌患者11=160)，對(duì)于兩種方案有29例樣品為陽性和169例為陰性，因此兩種方案之間的陽性率和陰性率有89.2%(198/222)的一致性(McNemar和Fisher精確檢驗(yàn)，n=222，P-0.0022)(表3)。如圖3中可見由這兩種方案獲得的CK-19mRNA陽性細(xì)胞水平表示成MCF-7細(xì)胞當(dāng)量/5figRNA的相關(guān)性非常好(r=0.986，n=29)如圖3中可見，并且沒有顯著的不同(成對(duì)數(shù)據(jù)的Wilcoxon檢驗(yàn)，n=29，P=0.164)。上皮細(xì)胞的免疫磁富集檢驗(yàn)3組樣品以評(píng)估從外周血分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的新方案的有效性。圖6顯示了伴隨隨后操作的各個(gè)樣品組。第一組(圖6中顯示為組A)第一組由添加了已知量的MCF-7細(xì)胞的外周血樣品組成。將這些樣品加入聚糖體Histopaque-10T7系統(tǒng)(希格瑪公司，St.Louis,MO)并且在1500rpm離心30分鐘。將單核細(xì)胞層移走，用PBS洗兩次，用PBS/0.1%小牛血清白蛋白稀釋至1ml,并且與上皮富集的免疫磁珠(在20jiL體積中有1x107個(gè)珠子)孵育同時(shí)搖動(dòng)1小時(shí)。將此細(xì)胞懸液在磁體上放置至少6分鐘然后小心的移走上清。用1mlPBS/0.1。/。小牛血清白蛋白清洗結(jié)合磁珠的細(xì)胞三次并用試劑盒提供的裂解結(jié)合緩沖液進(jìn)行裂解。裂解細(xì)胞的懸液(有珠子附著)在處理之前儲(chǔ)存在-80。C。MCF-7上皮細(xì)胞通過免疫磁性捕獲被富集，此過程使用單克隆抗體Ber-EP4以及根據(jù)廠商說明書(Dynal)的免疫》茲珠上皮富集試劑盒。廠家顯示有多達(dá)51og上皮細(xì)胞的富集和70%可獲得的產(chǎn)量，可利用這一試劑盒獲得無珠子的腫瘤細(xì)胞(Dynal)。Ber-EP4抗體識(shí)別上皮細(xì)胞表面上和細(xì)胞質(zhì)中的兩種糖蛋白，此上皮細(xì)胞是除了鱗狀上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和壁細(xì)胞的表層之外的。第二組(圖6中顯示為組B)第二組由通過在PBS中添加已知量的MCF-7細(xì)胞所制備的樣品組成，并且接下來是如第一組同樣的操作。這組樣品被用作這樣情形的參考，即在使用(第一組)或不使用(第三組)免疫磁富集的聚糖體分離后，恢復(fù)MCF-7細(xì)胞。第三組(圖6中顯示為組C)第三組由添加了已知量的MCF-7細(xì)胞的外周血樣品組成，將其加入聚糖體Histopaque-1077系統(tǒng)(希格瑪公司，St.Louis，MO)并且在1500rpm離心30分鐘。將單核細(xì)胞層移走，用PBS和PBMC洗兩次，儲(chǔ)存在-80。C直到處理。mRNA分離和反轉(zhuǎn)錄。用TrizolLS試劑(英杰公司)根據(jù)其廠商說明書進(jìn)行總RNA分離。所有的RNA制備和操作步驟在無RNA酶的條件下于層流凈化通風(fēng)拒中進(jìn)行。分離的RNA溶解在RNA存儲(chǔ)緩沖液(Ambion，USA)并且在使用之前保存于-70。C。用NanoDrop分光光度計(jì)ND-1000(NanoDrop)測(cè)定RNA濃度。用SuperscriptIIIPlatinum兩步qRT-PCR試劑盒(英杰公司)實(shí)施RNA的逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)PCR(定量PCR)。CK-19的實(shí)時(shí)RT-PCR在熒光定量PCR分析儀玻璃毛細(xì)管中以20fiL的總體積來進(jìn)行。對(duì)于PCR，將2jiL的cDNA放入18nL反應(yīng)體積中，該反應(yīng)體積包含2jiL無Mg"的PCR合成緩沖液(10x)、1jiL的MgCl2(50mM)、0.4jiL的dNTP(10mM)、0.3的BSA(10jig/mL)、0.2jiL的TaqplatinumDNA聚合酶(5U/jiL)(英杰公司，USA)、1nL的正義引物CK19曙for2(3jiM)、1的反義引物CK19-do2(3jiM)、1jiL的雜交探針CK19-FL(3pM)、1的雜交探針CK19-LC(3jiM)和DEPC-H20(加入最終體積中)。PCR反應(yīng)發(fā)起于在95。C進(jìn)行10分鐘變性之后(熱啟動(dòng)PCR)并且終止于在40。C進(jìn)行30秒冷卻步驟。循環(huán)方案由在95。C進(jìn)行10秒變性步驟、在55。C進(jìn)行20秒退火以及在72。C進(jìn)行20秒延伸并且重復(fù)50次。在每次退火步驟的最后進(jìn)行0秒熒光檢測(cè)?，F(xiàn)在參照?qǐng)D8A-C,可見當(dāng)添加MCF-7細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的聚糖體分離之后通過免疫磁富集時(shí)獲得高敏感度。在這些實(shí)驗(yàn)中，能實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)極限低至1MCF-7細(xì)胞/mlPB。見圖8A。發(fā)明的額外的用途本發(fā)明公開了，例如，適合于定量檢測(cè)患者生物樣品中所識(shí)別的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。例如患乳腺癌的患者。優(yōu)選的發(fā)明方法使用本發(fā)明的引物對(duì)利用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增特異的CK-19mRNA轉(zhuǎn)錄本。CK-19,作為在腫瘤中豐富表達(dá)的上皮標(biāo)記，也是在有上皮來源的腫瘤的患者生物樣品中識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物(單獨(dú)的或者和其它探針組合)，所述上皮來源包括子宮內(nèi)膜(JiXQ等人，GynecolOncol.2006Feb;100(2):355-60)、結(jié)腸(YehCS等人，IntJOncol.2006Feb;28(2):411-20;WangJY等人，WorldJSurg.2006Jun;30(6):1007-13)、胃(WuCS等人，IntJCancer.2006Jul15;119(2):373-9)、頭和頸(TaoL等人，BrJCancer.2006Apr24;94(8):1164-9)、前列腺(O'HaraSM等人，ClinChem.2004May;50(5):826-35)和由各種類型的腫瘤導(dǎo)致的惡性胸腔積液(XeF等人，JZhejianqUnivSci.2004Oct;5(10):1286-9)。這類生物樣品可包括外周血、骨髓、淋巴結(jié)、脊髓液和眼晶狀體液。為了從來自患有上述腫瘤的患者樣品中鑒定到CK-19mRNA陽性循環(huán)胂瘤細(xì)胞的存在，可以使用公開與此的一種或幾種方法的組合。例如，收集臨床樣品，和利用分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備總RNA。例如，可以使用上面列出的免疫磁性純化策略。如果期望，可以定量RNA，并長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在-70。C?；蛘?，可使用RNA(5ng)來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA(靶標(biāo)序列)?？梢允褂脕碜越】等说臉悠纷鳛閷?duì)照，并且將其與臨床樣品用相同的方式并行處理。應(yīng)該理解的是，如果檢驗(yàn)的對(duì)照樣品具有已知的CK-19表達(dá)譜則不需要做這類對(duì)照。合成的cDNA可用于通過引物對(duì)和上述雜交探針利用實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)擴(kuò)增CK-19序列。如SEQIDNo.l和2提出的引物對(duì)的使用對(duì)于許多應(yīng)用是優(yōu)選的。可以如此申請(qǐng)?jiān)缦人?，通過從1x106MCF-7細(xì)胞分離的RNA制備的外部標(biāo)準(zhǔn)cDNA制作外部校準(zhǔn)曲線用于定量。討論本發(fā)明者發(fā)明了特異和敏感的方法來定量乳腺癌患者外周血樣品中的循環(huán)CK-19mRNA陽性細(xì)胞(A.Stathopoulou等人；2003)。盡管這個(gè)測(cè)定的假陽性很低，因?yàn)?9例健康捐血者中只有2例(2.2%)被檢測(cè)到CK-19mRNA陽性，但是卻有含有擴(kuò)增的cDNA序列的樣品被認(rèn)為是陰性，因?yàn)樗鼈儽粰z測(cè)到的非常高的交叉點(diǎn)在該實(shí)驗(yàn)的分析檢測(cè)極限之下。對(duì)患者樣品的評(píng)估結(jié)果顯示，Cp值略低于截?cái)帱c(diǎn)的擴(kuò)增曲線已證實(shí)是非常難和關(guān)鍵的。這個(gè)"灰色決定地帶"使得我們?nèi)ピO(shè)計(jì)和評(píng)估新的一套引物(CK19-do2和CK19-for2)。我們的主要目標(biāo)是避免因被基因組DNA污染或者反常表達(dá)引起的假陽性，和因?yàn)樵谖覀兊臉悠分蟹浅５偷某跏糃K-19mRNA含量引起的假陰性。通過對(duì)純基因組DNA進(jìn)行新舊CK-19引物對(duì)的4個(gè)不同組合的檢驗(yàn)，我們已經(jīng)明確表明此新引物與這一雜交探針對(duì)的組合是高度特異的，并且不會(huì)被高濃度基因組DNA和CK-19假基因的存在所影響。通過對(duì)來自先前同樣研究過的健康志愿者亞組(11=62)的樣品進(jìn)行再次檢驗(yàn)，我們可以看到測(cè)定的特異性明顯改善，因?yàn)檫@些樣品沒有CK-19mRNA的可擴(kuò)增產(chǎn)物。通過在實(shí)時(shí)PCR中定量CK-19mRNA時(shí)使用這種新的高特異性的引物對(duì)，本發(fā)明者已經(jīng)相當(dāng)大的改良了這種方法的特異性。這樣，可以獲得陽性和陰性樣品之間的清楚分布，并且完全避免了對(duì)前面測(cè)定中的灰色地帶結(jié)果的困難的說明。對(duì)于大多數(shù)樣品而言，兩對(duì)引物幾乎可以得到相同結(jié)果。在所檢驗(yàn)的總共222例樣品中，兩對(duì)引物都檢測(cè)出29例陽性樣品和169例陰性樣品一致性89.2%(198/222)。但是，對(duì)于10例陽性樣品(其濃度非常接近A方案中方法的分析檢測(cè)極限，并因此位于"灰色地帶")，通過B方案檢測(cè)出4個(gè)是真陽性(40%)，而6個(gè)被發(fā)現(xiàn)是假陽性(60%)。在其它組的其濃度比檢測(cè)極限略低的19個(gè)樣品中，通過A方案發(fā)現(xiàn)其為陰性，2例通過B方案^J^5i是假陰性(10.5。/。)。這樣，如通過A方案所確定的，小百分比的患者樣品(29/222)(13%)處于CK-19檢測(cè)的"灰色地帶，，，可以-故B方案更確切的表征為陽性或陰性，因?yàn)檫@一方案不受與總RNA共同提取出來的痕量基因組DNA的影響。下列參考文獻(xiàn)的回顧將增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的理解。A.C.Lambrechts，L.J.Veer,S.Rodenhuis，Ann.Oncol.9(1998)1269-1276.K.P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結(jié)合內(nèi)皮單核細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白的單克隆抗體。35.權(quán)利要求34的方法，其中該單克隆抗體是Ber-EP4。36.權(quán)利要求31-35的方法，其中該固體支持物是免疫磁珠。37.權(quán)利要求36的方法，其中該方法的步驟c)還包括加強(qiáng)結(jié)合復(fù)合物的磁場(chǎng)以從任何未結(jié)合的材料分離復(fù)合物。38.斥又利要求31-36的方法，其中引物對(duì)是由SEQIDNo:1和SEQIDNo.2代表的序列。39.權(quán)利要求31-38的方法，其中生物流體是外周血。全文摘要本發(fā)明公開了定量確定生物樣品中的CK-19mRNA陽性細(xì)胞的方法。此方法可被用于，例如用外周血檢測(cè)患者中的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，此方法可被用于在輔助治療開始之前檢測(cè)癌癥，從而提供有關(guān)治療功效的信息。本發(fā)明方法的實(shí)踐是敏感、可靠和容易執(zhí)行的。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101365800SQ200680037658公開日2009年2月11日申請(qǐng)日期2006年8月16日優(yōu)先權(quán)日2005年8月17日發(fā)明者A·斯塔索普洛,D·馬弗魯?shù)纤?E·利亞尼多,V·喬治格里亞斯申請(qǐng)人:麥蒂克西斯股份有限公司