專利名稱：熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。一般而言，本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄酶，和用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子(尤其是信使RNA分子)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)突變或經(jīng)修飾增加了熱穩(wěn)定性、降低了末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、和/或增加了保真度的逆轉(zhuǎn)錄酶，和使用這些逆轉(zhuǎn)錄酶或組合物來(lái)進(jìn)行核酸分子(特別是cDNA分子)的生成、擴(kuò)增、或測(cè)序的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)這些方法生成的核酸分子，和這些核酸分子用于生成期望多肽的用途。本發(fā)明還關(guān)注包含這些酶的組合物或試劑盒。
背景技術(shù)：
cDNA和cDNA文庫(kù)在檢查生物體、組織、或細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)時(shí)，常常希望測(cè)定它的遺傳內(nèi)容。生物體的遺傳構(gòu)架編碼在生物體的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞所含脫氧核糖核苷酸(DNA)的核苷酸堿基雙鏈序列中。特定DNA區(qū)段或基因的遺傳內(nèi)容通常在生成基因所編碼的蛋白質(zhì)時(shí)顯現(xiàn)出來(lái)。為了生成蛋白質(zhì)，通過(guò)RNA聚合酶生成DNA雙螺旋的一條鏈的互補(bǔ)拷貝，產(chǎn)生特定序列的核糖核酸(RNA)。由于它包含來(lái)自DNA的、用于生成蛋白質(zhì)的遺傳信息，因此將RNA的這種特定類型稱為信使RNA(mRNA)。
在指定的細(xì)胞、組織、或生物體中，存在無(wú)數(shù)種mRNA，每一種都編碼一種單獨(dú)的和特定的蛋白質(zhì)。這一事實(shí)為對(duì)研究組織或細(xì)胞中的遺傳表達(dá)感興趣的研究人員提供了有力工具?？梢苑蛛xmRNA分子，并通過(guò)多種分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步操作，從而能夠闡明細(xì)胞、組織、或生物體的全部功能遺傳內(nèi)容。
研究基因表達(dá)的一種常用方法是生成互補(bǔ)DNA(cDNA)克隆。在該技術(shù)中，由生物體的細(xì)胞或組織的提取物分離來(lái)自生物體的mRNA分子。這種分離常常采用復(fù)合了胸苷(T)寡聚物的固相層析基質(zhì)，諸如纖維素或瓊脂糖。由于大多數(shù)真核mRNA分子的3’末端包含一串腺苷(A)堿基，而且A堿基與T配對(duì)，因此可以快速的將mRNA分子與組織或細(xì)胞提取物中的其它分子和物質(zhì)純化分開(kāi)?？梢允褂媚孓D(zhuǎn)錄酶(RT)由這些純化的mRNA分子生成cDNA拷貝，產(chǎn)生單鏈cDNA分子。通常將這步反應(yīng)稱為第一條鏈反應(yīng)。然后可以通過(guò)DNA聚合酶的作用將單鏈cDNA轉(zhuǎn)變成最初mRNA的(從而也是生物體基因組中所包含的、編碼該mRNA的最初雙鏈DNA序列的)完整雙鏈DNA拷貝(即雙鏈cDNA)。然后可以將蛋白質(zhì)特異的雙鏈cDNA插入質(zhì)?；虿《据d體，并將其導(dǎo)入宿主細(xì)菌、酵母、或植物細(xì)胞。然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，產(chǎn)生包含(或在許多情況中表達(dá))目的基因的宿主細(xì)胞群。
由自生物體或組織來(lái)源分離mRNA至將cDNA插入質(zhì)?；蜉d體以培養(yǎng)包含分離基因的宿主細(xì)胞群的這整個(gè)過(guò)程稱為“cDNA克隆”。由指定來(lái)源的mRNA制備的一批cDNA稱為“cDNA文庫(kù)”。cDNA文庫(kù)中的cDNA克隆對(duì)應(yīng)于組織來(lái)源中轉(zhuǎn)錄的基因。對(duì)cDNA文庫(kù)的分析可以產(chǎn)生關(guān)于衍生它的生物體或組織中基因表達(dá)模式的許多信息。逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)深入研究了逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶的三種原型形式。莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶包含具有依賴RNA的DNA聚合酶和RNA酶H活性的78kDa單一亞基。已經(jīng)克隆了該酶，并在大腸桿菌中表達(dá)成完全有活性的形式(回顧見(jiàn)V.R.Prasad，《Reverse Transcriptase》即逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第135頁(yè)，1993)。人免疫缺陷病毒(HIV)的逆轉(zhuǎn)錄酶是p66和p51亞基的異二聚體，其中小亞基通過(guò)蛋白水解切割衍生自大亞基。p66亞基具有依賴RNA的DNA聚合酶和RNA酶H結(jié)構(gòu)域二者，而p51亞基只具有DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)克隆了有活性的HIV p66/p51逆轉(zhuǎn)錄酶，并在許多表達(dá)宿主(包括大腸桿菌)中成功表達(dá)(回顧見(jiàn)S.F.J.Le Grice，《ReverseTranscriptase》即逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第163頁(yè)，1993)。在HIV p66/p51異二聚體中，51kD亞基沒(méi)有催化活性，而66kD亞基具有DNA聚合酶和RNA酶H活性二者(S.F.J.Le Grice等人，EMBO Journal，103905，1991；Z.Hostomsky等人，J.Virol.，663179，1992)。禽類肉瘤-白血病病毒(ASLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶，包括但不限于勞氏肉瘤病毒(RSV)的逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)的逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類成紅細(xì)胞增生病毒(AEV)輔助病毒MCAV的逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類髓細(xì)胞增生病毒MC29輔助病毒MCAV的逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒(REV-T)輔助病毒REV-A的逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類肉瘤病毒UR2輔助病毒UR2AV的逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類肉瘤病毒Y73輔助病毒YAV的逆轉(zhuǎn)錄酶、勞氏伴隨病毒(RAV)的逆轉(zhuǎn)錄酶、和成髓細(xì)胞瘤伴隨病毒(MAV)的逆轉(zhuǎn)錄酶，也是兩種亞基即α(大約62kDa)和β(大約94kDa)的異二聚體，其中α通過(guò)蛋白水解切割衍生自β(回顧見(jiàn)V.R.Prasad，《Reverse Transcriptase》即逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第135頁(yè)，1993)。ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶還可以額外存在兩種有催化活性的結(jié)構(gòu)形式，即ββ和α(A.Hi zi和W.K.Joklik，J.Biol.Chem.，2522281，1977)。沉降分析指出，αβ和ββ是二聚體，而且α形式在單體與二聚體形式之間存在平衡(D.P.Grandgenett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，70230，1973；A.Hizi和W.K.Joklik，J.Biol.Chem.，2522281，1977；及D.A.Soltis和A.M.Skalka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，853372，1988)。ASLV的αβ和ββ逆轉(zhuǎn)錄酶是在相同蛋白質(zhì)復(fù)合物中包含三種不同活性即DNA聚合酶、RNA酶H、和DNA內(nèi)切核酸酶(整合酶)活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的唯一已知范例(回顧見(jiàn)A.M.Skalka，《Reverse Transcriptase》即逆轉(zhuǎn)錄酶，冷泉港，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第193頁(yè)，1993)。α形式缺乏整合酶結(jié)構(gòu)域和活性。
已經(jīng)克隆并表達(dá)了ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶各個(gè)亞基的多種形式，包括通常通過(guò)蛋白水解加工成β并由β羧基末端切下4kDa多肽的98kDa前體多肽(F.Alexander等人，J.Virol.，61534，1987；及D.Anderson等人，F(xiàn)OCUS，1753，1995)，和成熟β亞基(J.H.Weis和J.S.Salstrom，美國(guó)專利號(hào)4,663,290，1987；及D.A.Soltis和A.M.Skalka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，853372，1988)。(還可參閱S.Werner和B.M.Wohrl，Eur.J.Biochem.，2674740-4744，2000；S.Werner和B.M.Wohrl，J.Virol.，743245-3252，2000；S.Werner和B.M.Wohrl，J.Bio1.Chem.，27426329-26336，1999)。還已經(jīng)由表達(dá)克隆RSVβ基因的大腸桿菌細(xì)胞純化了異二聚體RSV αβ逆轉(zhuǎn)錄酶(A.P.Chernov等人，Biomed.Sci.，249，1991)。逆轉(zhuǎn)錄效率如上所述，由逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的mRNA至cDNA的轉(zhuǎn)變是研究由克隆基因表達(dá)蛋白質(zhì)的必需步驟。然而，由于許多原因，使用未經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)催化逆轉(zhuǎn)錄是低效的。第一，主要由于逆轉(zhuǎn)錄酶中存在內(nèi)在的RNA酶H活性，在起始或完成第一條鏈反應(yīng)前，逆轉(zhuǎn)錄酶有時(shí)降解RNA模板。另外，mRNA模板分子的錯(cuò)誤引發(fā)能夠?qū)е略赾DNA第一條鏈中摻入錯(cuò)誤，同時(shí)mRNA分子自身的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能使得有些mRNA難以進(jìn)行第一條鏈的合成。
消除逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性能夠排除第一個(gè)問(wèn)題并改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄效率(G.F.Gerard等人，F(xiàn)OCUS，11(4)60，1989；及G.F.Gerard等人，F(xiàn)OCUS，14(3)91，1992)。然而，這些逆轉(zhuǎn)錄酶(“RNA酶H-”形式)沒(méi)有解決錯(cuò)誤引發(fā)和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的額外問(wèn)題。
影響逆轉(zhuǎn)錄效率的另一個(gè)因素是RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力。例如當(dāng)RNA分子的某些區(qū)域具有足夠互補(bǔ)性而發(fā)生雜交并形成雙鏈RNA時(shí)，就能夠形成這些二級(jí)結(jié)構(gòu)。一般而言，可以通過(guò)升高RNA分子所處溶液的溫度來(lái)降低RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。因此，在許多情況中，希望在超過(guò)37℃的溫度來(lái)逆轉(zhuǎn)錄RNA。然而，本領(lǐng)域知道的逆轉(zhuǎn)錄酶于大大超過(guò)37℃(如50℃)的溫度保溫時(shí)通常喪失活性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了逆轉(zhuǎn)錄酶、包含這種酶的組合物、和可用于克服上述逆轉(zhuǎn)錄限制的方法。一般而言，本發(fā)明提供了包含一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、等)具有本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽、用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物。這些組合物還可包含一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、等)核苷酸、合適的緩沖液、和/或一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、等)DNA聚合酶。本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、等)寡核苷酸引物。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選經(jīng)修飾或突變而增加或增強(qiáng)了酶的熱穩(wěn)定性。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可以是單鏈(單一亞基)或多鏈(多個(gè)亞基)，而且RNA酶H活性可能降低或顯著降低。優(yōu)選的是，本發(fā)明的酶是選自下組的酶莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MLV)RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、勞氏肉瘤病毒(RSV)RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、勞氏伴隨病毒(RAV)RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、成髓細(xì)胞瘤伴隨病毒(MAV)RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶或其它ASLV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶和人免疫缺陷病毒(HIV)RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶及其突變體。在優(yōu)選組合物中，逆轉(zhuǎn)錄酶以工作濃度存在。
在某些方面，本發(fā)明包括經(jīng)修飾或突變而增加或增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。這種逆轉(zhuǎn)錄酶的范例包括在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變的酶(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第52位亮氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第64位酪氨酸；(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第152位賴氨酸；(d)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第204位組氨酸；(e)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第289位甲硫氨酸；和(f)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第306位蘇氨酸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第52位亮氨酸被脯氨酸替代、第64位酪氨酸被精氨酸替代、第152位賴氨酸被甲硫氨酸替代、第204位組氨酸被精氨酸替代、第289位甲硫氨酸被亮氨酸替代、和/或第306位蘇氨酸被賴氨酸或精氨酸替代。本發(fā)明的范圍還包括除M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶以外的逆轉(zhuǎn)錄酶，它們包含對(duì)應(yīng)于上文所列的改變。
在其它方面，本發(fā)明還包括熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶，它們?cè)诩訜嶂?0℃達(dá)5分鐘后保留至少大約50％、至少大約60％、至少大約70％、至少大約85％、至少大約95％、至少大約97％、至少大約98％、至少大約99％、或至少大約100％的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
如上所述，本發(fā)明的酶包括在形成多聚體后(如二聚體)或作為單個(gè)蛋白質(zhì)分子(即單體形式)展示逆轉(zhuǎn)錄酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶。在形成多聚體后展示逆轉(zhuǎn)錄酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的范例包括AMV、RSV、和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。作為單獨(dú)的和個(gè)別的蛋白質(zhì)(即單體形式)展示逆轉(zhuǎn)錄酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的一個(gè)范例是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明的多聚體逆轉(zhuǎn)錄酶可以形成同多聚體或異多聚體。換言之，多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物的亞基可以是相同的或不同的。異二聚體逆轉(zhuǎn)錄酶的一個(gè)范例是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，它由一級(jí)氨基酸序列不同的兩種亞基組成。更具體的說(shuō)，如上所述，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶可能由兩種亞基組成，其中一種亞基是通過(guò)另一種亞基的蛋白水解加工生成的。因而，二聚體AMV逆轉(zhuǎn)錄酶可能由共享具有氨基酸序列同一性的區(qū)域、不同大小的亞基組成。
具體而言，本發(fā)明涉及突變型或經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、十個(gè)、十二個(gè)、十五個(gè)、二十個(gè)、等)氨基酸變化，使得與未突變或未修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶相比酶在核酸合成中更加熱穩(wěn)定。表1列出了一些逆轉(zhuǎn)錄酶中用于突變或修飾以生成本發(fā)明的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶和/或展示其它特征(如保真度升高、TdT活性降低、等)的逆轉(zhuǎn)錄酶的位點(diǎn)。表1中描述的修飾優(yōu)選生成本發(fā)明的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶。
可以突變或修飾其它逆轉(zhuǎn)錄酶中的相似或等同位點(diǎn)以生成其它熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶及展示其它特征(如保真度升高、TdT活性降低、等)的逆轉(zhuǎn)錄酶。
表1
表1
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到，不同的病毒分離物可能編碼在上述位置具有不同氨基酸的逆轉(zhuǎn)錄酶。這些分離物經(jīng)修飾可生成本發(fā)明的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶還可具有選自下組的一項(xiàng)或多項(xiàng)特性(a)降低或顯著降低的RNA酶H活性；(b)降低或顯著降低的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性；和/或(c)升高的保真度。
末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性降低或顯著降低的本發(fā)明的酶可能在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第133位酪氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第197位蘇氨酸；和(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第309位苯丙氨酸。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第133位酪氨酸被丙氨酸替代、第197位蘇氨酸被谷氨酸替代、和/和第309位苯丙氨酸被天冬酰胺替代。本發(fā)明的范圍還包括除M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶以外的逆轉(zhuǎn)錄酶，它們包含對(duì)應(yīng)于上文所列的改變。
在某些其它方面，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可能不包括特定的突變組合，諸如組合第204位組氨酸突變成精氨酸(H204R)與第306位蘇氨酸突變成賴氨酸(T306K)的逆轉(zhuǎn)錄酶；組合H204R和T306K與第309位苯丙氨酸突變成天冬酰胺(F309N)的逆轉(zhuǎn)錄酶；及組合H204R、T306K、和F309N與第223位纈氨酸突變成組氨酸(V223H)的逆轉(zhuǎn)錄酶。
另外，展示保真度升高的酶可能在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第64位酪氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第116位精氨酸；(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第190位谷氨酰胺；和(d)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第223位纈氨酸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可能不包括M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、和/或RSV逆轉(zhuǎn)錄酶。因此，例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于熱穩(wěn)定性升高且不是HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于熱穩(wěn)定性升高且不是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶。在還有一些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于熱穩(wěn)定性升高且不是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶。在仍有一些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于熱穩(wěn)定性升高且不是RSV逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明還致力于包含編碼本發(fā)明突變型或經(jīng)修飾逆轉(zhuǎn)錄酶的基因或核酸的核酸分子(如載體)，和包含這種DNA或其它核酸分子的宿主細(xì)胞?？梢允褂萌魏螖?shù)目的宿主來(lái)表達(dá)目的基因或核酸分子，包括原核和真核細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，將原核細(xì)胞用于表達(dá)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶。適用于本發(fā)明的原核宿主的一個(gè)范例是大腸桿菌(Escherichia coli)。適用于本發(fā)明的真核宿主的范例包括真菌細(xì)胞(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞、等)、植物細(xì)胞、和動(dòng)物細(xì)胞(如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)細(xì)胞、草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)sp9和Sf21細(xì)胞、粉夜蛾(Trichoplusa)High-Five細(xì)胞、C.elegans細(xì)胞、光滑爪蟾(Xenopus laevis)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、等)。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的基因或其它核酸分子的宿主細(xì)胞(優(yōu)選的是這種逆轉(zhuǎn)錄酶基因或其它核酸分子包含在宿主細(xì)胞內(nèi)的載體中)；(b)表達(dá)該基因或核酸分子；并(c)由宿主細(xì)胞分離所述逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明還致力于用于生成一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)核酸分子的方法，包括將一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)核酸模板(優(yōu)選一種或多種RNA模板，最優(yōu)選一種或多種信使RNA模板)與一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、等)本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶混合；并在足以生成與一種或多種核酸模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的第一核酸分子的條件下將混合物保溫。在有些實(shí)施方案中，將混合物在升高后的溫度保溫。在具體實(shí)施方案中，升高后的溫度可以是自大約40℃或更高、自大約45℃或更高、自大約50℃或更高、自大約51℃或更高、自大約52℃或更高、自大約53℃或更高、自大約54℃或更高、自大約55℃或更高、自大約56℃或更高、自大約57℃或更高、自大約58℃或更高、自大約59℃或更高、自大約60℃或更高、自大約61℃或更高、自大約62℃或更高、自大約63℃或更高、自大約64℃或更高、自大約65℃或更高、自大約66℃或更高、自大約67℃或更高、自大約68℃或更高、自大約69℃或更高、自大約70℃或更高、自大約71℃或更高、自大約72℃或更高、自大約73℃或更高、自大約74℃或更高、自大約75℃或更高、自大約76℃或更高、自大約77℃或更高、自大約78℃或更高；或大約37℃至大約75℃、大約40℃至大約75℃、大約45℃至大約75℃、大約50℃至大約75℃、大約51℃至大約75℃、大約52℃至大約75℃、大約53℃至大約75℃、大約54℃至大約75℃、大約55℃至大約75℃的溫度范圍。在其它實(shí)施方案中，升高后的溫度在大約50℃至大約70℃、大約51℃至大約70℃、大約52℃至大約70℃、大約53℃至大約70℃、大約54℃至大約70℃、大約55℃至大約70℃、大約55℃至大約65℃、大約56℃至大約65℃、大約56℃至大約64℃、大約56℃至大約62℃的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，升高后的溫度可以在大約45℃至大約60℃、大約46℃至大約60℃、大約47℃至大約60℃、大約48℃至大約60℃、大約49℃至大約60℃、大約50℃至大約60℃、大約51℃至大約60℃、大約52℃至大約60℃、大約53℃至大約60℃、大約54℃至大約60℃的范圍內(nèi)。在其它具體實(shí)施方案中，第一核酸分子是單鏈cDNA。
依照本發(fā)明這一方面適合于逆轉(zhuǎn)錄的核酸模板包括任何核酸分子或核酸分子群(優(yōu)選RNA，最優(yōu)選mRNA)，特別是那些衍生自細(xì)胞或組織的核酸分子。在一個(gè)具體方面，依照本發(fā)明將mRNA分子群(許多不同mRNA分子，通常得自特定細(xì)胞或組織類型)用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。核酸模板的細(xì)胞來(lái)源的范例包括細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明還關(guān)注用于生成一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)雙鏈核酸分子的方法，包括(a)將一種或多種核酸模板(優(yōu)選RNA或mRNA，更優(yōu)選mRNA模板群)與一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、等)本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶混合；(b)在足以生成與所述一種或多種模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的第一核酸分子的條件下將混合物保溫；并(c)在足以生成與第一核酸分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的第二核酸分子的條件下將第一核酸分子保溫，由此形成包含第一和第二核酸分子的一種或多種雙鏈核酸分子。在有些實(shí)施方案中，保溫步驟(b)是在升高后的溫度進(jìn)行的。在具體實(shí)施方案中，升高后的溫度可以是自大約40℃或更高、自大約45℃或更高、自大約50℃或更高、自大約51℃或更高、自大約52℃或更高、自大約53℃或更高、自大約54℃或更高、自大約55℃或更高、自大約56℃或更高、自大約57℃或更高、自大約58℃或更高、自大約59℃或更高、自大約60℃或更高、自大約61℃或更高、自大約62℃或更高、自大約63℃或更高、自大約64℃或更高、自大約65℃或更高、自大約66℃或更高、自大約67℃或更高、自大約68℃或更高、自大約69℃或更高、自大約70℃或更高、自大約71℃或更高、自大約72℃或更高、自大約73℃或更高、自大約74℃或更高、自大約75℃或更高、自大約76℃或更高、自大約77℃或更高、自大約78℃或更高；或大約37℃至大約75℃、大約40℃至大約75℃、大約45℃至大約75℃、大約50℃至大約75℃、大約51℃至大約75℃、大約52℃至大約75℃、大約53℃至大約75℃、大約54℃至大約75℃、大約55℃至大約75℃的溫度范圍。在有些實(shí)施方案中，升高后的溫度在大約50℃至大約70℃、大約51℃至大約70℃、大約52℃至大約70℃、大約53℃至大約70℃、大約54℃至大約70℃、大約55℃至大約70℃、大約55℃至大約65℃、大約56℃至大約65℃、大約56℃至大約64℃、大約56℃至大約62℃的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，升高后的溫度可以在大約45℃至大約60℃、大約46℃至大約60℃、大約47℃至大約60℃、大約48℃至大約60℃、大約49℃至大約60℃、大約50℃至大約60℃、大約51℃至大約60℃、大約52℃至大約60℃、大約53℃至大約60℃、大約54℃至大約60℃的范圍內(nèi)。這種方法可以包括使用一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)DNA聚合酶作為生成該一種或多種雙鏈核酸分子的過(guò)程的一部分。優(yōu)選的是，這種DNA聚合酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶；最優(yōu)選的是，使用這種DNA聚合酶完成的核酸合成是在升高后的溫度(即超過(guò)37℃)進(jìn)行的。本發(fā)明還關(guān)注可用于生成這種雙鏈核酸分子的組合物。這種組合物包含一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、二十種、等)本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶、任選一種或多種DNA聚合酶、合適的緩沖液、一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)引物、和/或一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、等)核苷酸。
本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增核酸分子的方法，包括(a)將如上所述生成的雙鏈核酸分子與一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)DNA聚合酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶)混合；并(b)在足以擴(kuò)增雙鏈核酸分子的條件下將混合物保溫。在第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)注用于擴(kuò)增核酸分子的方法，包括(a)將一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、二十種、等)核酸模板(優(yōu)選一種或多種RNA或mRNA模板，更優(yōu)選mRNA模板群)與一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶及一種或多種DNA聚合酶混合；并(b)在足以擴(kuò)增與一種或多種模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子的條件下將混合物保溫。在有些實(shí)施方案中，保溫步驟(b)是在升高后的溫度進(jìn)行的。在具體實(shí)施方案中，升高后的溫度可以是自大約40℃或更高、自大約45℃或更高、自大約50℃或更高、自大約51℃或更高、自大約52℃或更高、自大約53℃或更高、自大約54℃或更高、自大約55℃或更高、自大約56℃或更高、自大約57℃或更高、自大約58℃或更高、自大約59℃或更高、自大約60℃或更高、自大約61℃或更高、自大約62℃或更高、自大約63℃或更高、自大約64℃或更高、自大約65℃或更高、自大約66℃或更高、自大約67℃或更高、自大約68℃或更高、自大約69℃或更高、自大約70℃或更高、自大約71℃或更高、自大約72℃或更高、自大約73℃或更高、自大約74℃或更高、自大約75℃或更高、自大約76℃或更高、自大約77℃或更高、自大約78℃或更高；或大約37℃至大約75℃、大約40℃至大約75℃、大約45℃至大約75℃、大約50℃至大約75℃、大約51℃至大約75℃、大約52℃至大約75℃、大約53℃至大約75℃、大約54℃至大約75℃、大約55℃至大約75℃的溫度范圍。在有些實(shí)施方案中，升高后的溫度在大約50℃至大約70℃、大約51℃至大約70℃、大約52℃至大約70℃、大約53℃至大約70℃、大約54℃至大約70℃、大約55℃至大約70℃、大約55℃至大約65℃、大約56℃至大約65℃、大約56℃至大約64℃、大約56℃至大約62℃的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，升高后的溫度可以在大約45℃至大約60℃、大約46℃至大約60℃、大約47℃至大約60℃、大約48℃至大約60℃、大約49℃至大約60℃、大約50℃至大約60℃、大約51℃至大約60℃、大約52℃至大約60℃、大約53℃至大約60℃、大約54℃至大約60℃的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，逆轉(zhuǎn)錄酶的(1)RNA酶H活性降低或顯著降低，(2)TdT活性降低或顯著降低，和/或(3)保真度升高。優(yōu)選的是，DNA聚合酶包括具有3’外切核酸酶活性的第一DNA聚合酶和3’外切核酸酶活性顯著降低的第二DNA聚合酶。
本發(fā)明還關(guān)注包含一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶及一種或多種DNA聚合酶、用于擴(kuò)增反應(yīng)的組合物。這種組合物還可包含一種或多種核苷酸和/或適用于擴(kuò)增的緩沖液。本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種寡核苷酸引物。
本發(fā)明還致力于依照上述方法生成的核酸分子(特別是單鏈或雙鏈cDNA分子)或擴(kuò)增核酸分子，和包含這些核酸分子或擴(kuò)增核酸分子的載體(特別是表達(dá)載體)。
本發(fā)明還致力于包含上述核酸分子、擴(kuò)增核酸分子或載體的重組宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞的范例包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞(包括昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。
本發(fā)明還致力于生成由本發(fā)明方法生成的核酸分子所編碼的多肽的方法，和由這種方法生成的多肽。所述方法包括培養(yǎng)上述重組宿主細(xì)胞，并分離編碼的多肽。
本發(fā)明還關(guān)注使用本發(fā)明的組合物或酶對(duì)一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)核酸分子測(cè)序的方法，包括(a)將一種或多種待測(cè)序核酸分子(如一種或多種RNA或DNA分子)與一種或多種引物、一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸、及一種或多種終止劑(諸如一種或多種雙脫氧核苷三磷酸)混合；(b)在足以合成與一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、二十種、三十種、五十種、一百種、兩百種、等)待測(cè)序核酸分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子群的條件下將混合物保溫；并(c)將核酸分子群分開(kāi)以測(cè)定一種或多種待測(cè)序核酸分子的整個(gè)或部分的核苷酸序列。這種方法還可包括(a)將待測(cè)序核酸分子(如一種或多種RNA或DNA分子)與一種或多種引物、一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸、及一種或多種終止劑(諸如一種或多種雙脫氧核苷三磷酸)混合；(b)在足以合成與待測(cè)序核酸分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子群的條件下將混合物保溫；并(c)將核酸分子群的成員分開(kāi)以測(cè)定待測(cè)序核酸分子的整個(gè)或部分的核苷酸序列。在有些實(shí)施方案中，這種保溫可以在本文所述升高后的溫度進(jìn)行。
本發(fā)明還致力于可用于本發(fā)明方法的試劑盒。這種試劑盒可用于核酸分子(單鏈或雙鏈)的生成、測(cè)序或擴(kuò)增，優(yōu)選在本文所述升高后的溫度進(jìn)行。本發(fā)明的試劑盒包括載體(諸如盒子或硬紙盒)，其中密閉的裝有一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)容器(諸如小瓶、管子、瓶子、諸如此類)。在本發(fā)明的試劑盒中，第一容器裝有一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明的試劑盒還可在相同或不同容器中裝有一種或多種DNA聚合酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)適用于核酸合成的緩沖液、一種或多種核苷酸、及一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、等)寡核苷酸引物?；蛘?，可以將試劑盒的成分分裝到單獨(dú)的容器中(如一種容器用于一種酶和/或成分)。本發(fā)明的試劑盒還可包含用于進(jìn)行本發(fā)明方法的指示或方案。在本發(fā)明的優(yōu)選試劑盒中，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降低或顯著降低，而且最優(yōu)選的是選自下組M-MLV RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶、AMVRNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶。在本發(fā)明的其它優(yōu)選試劑盒中，逆轉(zhuǎn)錄酶的TdT活性降低或顯著降低，和/或保真度升高，正如本文其它部分所述。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選試劑盒中，容器中的酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和/或DNA聚合酶)以工作濃度存在。
因而，本發(fā)明還致力于可用于核酸分子的逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增或測(cè)序的試劑盒，所述試劑盒包含一種或多種熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒的逆轉(zhuǎn)錄酶可能在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第52位亮氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第64位酪氨酸；(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第152位賴氨酸；(d)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第204位精氨酸；(e)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第289位甲硫氨酸；和(f)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第306位蘇氨酸。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶包括熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的任何逆轉(zhuǎn)錄酶。這種逆轉(zhuǎn)錄酶包括逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)菌的逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶(如Ty1和/或Ty3逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶)、和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。本發(fā)明的優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶包括單亞基和多亞基逆轉(zhuǎn)錄酶，且優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶。具體而言，本發(fā)明涉及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶(諸如AMV-RT和RSV-RT)。本發(fā)明的這些逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選具有降低或顯著降低的RNA酶H活性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可能不包括特定的突變組合，諸如組合第204位組氨酸突變成精氨酸(H204R)與第306位蘇氨酸突變成賴氨酸(T306K)的逆轉(zhuǎn)錄酶；組合H204R和T306K與第309位苯丙氨酸突變成天冬酰胺(F309N)的逆轉(zhuǎn)錄酶；及組合H204R、T306K、和F309N與第223位纈氨酸突變成組氨酸(V223H)的逆轉(zhuǎn)錄酶。
根據(jù)下文的圖、發(fā)明描述、和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的。
圖的簡(jiǎn)述

圖1是質(zhì)粒pBAD-6-His-M-MLV H-(F1)的圖譜。
圖2是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列的線性示意圖，所示限制酶切割位點(diǎn)用于生成基因區(qū)段，繼而用于生成突變。
圖3呈現(xiàn)了使用(1)SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和(2)F309N的延伸實(shí)驗(yàn)的掃描磷光圖象。正如在使用所有4種核苷酸的延伸反應(yīng)中所看到的，用相同單位的逆轉(zhuǎn)錄酶將與47聚體DNA模板(5nM)退火的32P標(biāo)記18聚體引物于37℃延伸30分鐘。通過(guò)變性6％凝膠電泳來(lái)分析延伸反應(yīng)。P未延伸的引物。
圖4呈現(xiàn)了SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和突變體F309N、T197E、和Y133A的TdT延伸實(shí)驗(yàn)的掃描磷光圖象。使用所有4種核苷酸，用遞減單位的逆轉(zhuǎn)錄酶(泳道1 646單位，泳道2 200單位，泳道3 50單位，泳道4 20單位)將與47聚體DNA模板(5nM)退火的32P標(biāo)記18聚體引物于37℃延伸30分鐘(見(jiàn)下文實(shí)施例3中的方法部分)。通過(guò)變性6％凝膠電泳來(lái)分析延伸反應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中，認(rèn)為越過(guò)47個(gè)核苷酸模板的延伸是非模板指導(dǎo)的添加或TdT活性。P未延伸的引物。
圖5呈現(xiàn)了(1)SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和(2)突變型蛋白質(zhì)F309N逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA模板錯(cuò)插實(shí)驗(yàn)的掃描磷光圖象。正如在使用所有4種核苷酸的延伸反應(yīng)中所看到的，用相同單位的逆轉(zhuǎn)錄酶將與47聚體DNA模板(5nM)退火的32P標(biāo)記18聚體引物于37℃延伸30分鐘。還在只存在3種互補(bǔ)dNTP(-dCTP、-dATP、-dTTP、和-dGTP)時(shí)進(jìn)行延伸反應(yīng)。通過(guò)變性6％凝膠電泳來(lái)分析延伸反應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中，終止的引物在只存在3種核苷酸時(shí)的延伸效率越高，將反映測(cè)定的SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶的保真度越低。P未延伸的引物。
圖6呈現(xiàn)了(1)SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和(2)突變型蛋白質(zhì)T197A/F309N逆轉(zhuǎn)錄酶和(3)V223H/F309N的DNA模板錯(cuò)插實(shí)驗(yàn)的掃描磷光圖象。正如在使用所有4種核苷酸的延伸反應(yīng)中所看到的，用相同單位的逆轉(zhuǎn)錄酶將與47聚體DNA模板(5nM)退火的32P標(biāo)記18聚體引物于37℃延伸30分鐘。還在只存在3種互補(bǔ)dNTP(-dATP和-dCTP)時(shí)進(jìn)行延伸反應(yīng)。通過(guò)變性6％凝膠電泳來(lái)分析延伸反應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中，終止的引物在只存在3種核苷酸時(shí)的延伸效率越高，將反映測(cè)定的SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶的保真度越低。P未延伸的引物。
發(fā)明詳述在下文描述中，使用了重組DNA、病毒學(xué)和免疫學(xué)的許多術(shù)語(yǔ)。為了更加清楚且一致的理解說(shuō)明書和權(quán)利要求書，包括這些術(shù)語(yǔ)的指定范圍，因而提供下列定義。
克隆載體。在用于本文時(shí)，“克隆載體”指核酸分子，諸如能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制且表征為一個(gè)或少數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬菌?；蚱渌怂岱肿樱梢钥蓻Q定方式在所述位點(diǎn)切割這些DNA序列，并在其中插入DNA以進(jìn)行它的復(fù)制和克隆?？寺≥d體還可包含適用于鑒定經(jīng)克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記。標(biāo)記指例如賦予表達(dá)這種標(biāo)記的宿主細(xì)胞以可識(shí)別表型的基因。常用標(biāo)記包括但不限于抗生素抗性基因，諸如四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。
表達(dá)載體。在用于本文時(shí)，“表達(dá)載體”指與克隆載體相似但可額外包含在轉(zhuǎn)化到宿主中后能夠增強(qiáng)和/或控制克隆于其中的基因或其它核酸分子的表達(dá)的核酸序列的核酸分子。額外核酸序列可以包括啟動(dòng)子序列、遏制子結(jié)合序列、諸如此類。通常將克隆的基因或核酸分子可操作連接一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、等)這種控制序列(諸如啟動(dòng)子序列)。
重組宿主。在用于本文時(shí)，“重組宿主”指例如在表達(dá)載體、克隆載體或任何核酸分子中包含期望的克隆基因或核酸分子的任何原核或真核微生物。術(shù)語(yǔ)“重組載體”還意欲包括那些經(jīng)遺傳工程改造而在宿主染色體或基因組中包含期望的基因或其它核酸分子的宿主細(xì)胞。
宿主。在用于本文時(shí)，“宿主”指作為可復(fù)制的表達(dá)載體、克隆載體或任何核酸分子的受體的任何原核或真核微生物。核酸分子可以包含但不限于結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子和/或復(fù)制起點(diǎn)。
啟動(dòng)子。在用于本文時(shí)，“啟動(dòng)子”指通常描述成基因的5’區(qū)、位置最接近起始密碼子、且能夠指導(dǎo)基因或其它核酸分子的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。相鄰基因或核酸的轉(zhuǎn)錄是在啟動(dòng)子區(qū)起始的。
基因。在用于本文時(shí)，“基因”指包含表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)所必需的信息的核酸序列。它包括啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因，以及參與蛋白質(zhì)表達(dá)的其它序列。
結(jié)構(gòu)基因。在用于本文時(shí)，“結(jié)構(gòu)基因”指轉(zhuǎn)錄成信使RNA、然后翻譯成特定多肽特征性氨基酸序列的DNA或其它核酸分子。
可操作連接。在用于本文時(shí)，“可操作連接”指安置核酸元件使之能夠影響結(jié)構(gòu)基因或其它核酸分子所編碼多肽的表達(dá)的起始。
表達(dá)。在用于本文時(shí)，“表達(dá)”指基因或其它核酸分子生成多肽的過(guò)程。它包括基因或核酸分子轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)和這些mRNA翻譯成多肽。
基本純的。在用于本文時(shí)，“基本純的”指期望物質(zhì)基本上不含在自然界中與期望物質(zhì)相關(guān)的污染性細(xì)胞成分。污染性細(xì)胞成分可以包括但不限于諸如磷酸酶、外切核酸酶、內(nèi)切核酸酶或非期望DNA聚合酶等酶活性。優(yōu)選的是，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶是基本純的。
引物。在用于本文時(shí)，“引物”指在DNA分子的擴(kuò)增或聚合過(guò)程中通過(guò)核苷酸單體的共價(jià)鍵合而延伸的單鏈寡核苷酸。
模板。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“模板”指將要擴(kuò)增、拷貝或測(cè)序的雙鏈或單鏈核酸分子。在雙鏈DNA分子的情況中，可以在對(duì)這些分子擴(kuò)增、拷貝或測(cè)序前進(jìn)行鏈變性以形成第一和第二單鏈。與核酸模板的一部分互補(bǔ)的引物在適當(dāng)條件下發(fā)生雜交，然后核酸聚合酶(諸如本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶)可以向引物添加核苷酸單體，由此合成與所述模板或其部分互補(bǔ)的核酸分子。依照本發(fā)明，新合成的核酸分子的長(zhǎng)度可能等于或小于最初的模板。新合成核酸分子的合成或延伸過(guò)程中的錯(cuò)配摻入可能導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)。因而，合成的核酸分子不必與模板完全互補(bǔ)。
摻入。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“摻入”指成為核酸分子或引物的一部分。
寡核苷酸?！肮押塑账帷敝赴ㄟ^(guò)一個(gè)核苷酸的戊糖的3’位置與相鄰核苷酸的戊糖的5’位置之間的磷酸二酯堿而連接起來(lái)的共價(jià)連接核苷酸序列的合成或天然分子。
核苷酸。在用于本文時(shí)，“核苷酸”指堿基-糖-磷酸組合。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的單體單位，而且脫氧核糖核苷酸通過(guò)DNA聚合酶摻入DNA。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括脫氧核糖核苷三磷酸，諸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。這些衍生物包括例如[αS]dATP、7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”還包括雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。雙脫氧核糖核苷三磷酸的例示性范例包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、和ddTTP。依照本發(fā)明，“核苷酸”可以是未標(biāo)記的，或者通過(guò)眾所周知的技術(shù)進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記包括例如放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)記。
雜交。在用于本文時(shí)，“雜交”指兩種互補(bǔ)單鏈核酸分子(RNA和/或DNA)配對(duì)產(chǎn)生雙鏈分子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，堿基配對(duì)并不完全互補(bǔ)的兩種核酸分子也能夠發(fā)生雜交。因此，假設(shè)使用本領(lǐng)域眾所周知的適當(dāng)條件，錯(cuò)配堿基也不能夠阻止兩種核酸分子的雜交。
熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶。為了本公開(kāi)書的目的，將熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶定義為在相同的加熱處理后比具有野生型熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶保留更大百分比的活性的逆轉(zhuǎn)錄酶。因而，將熱穩(wěn)定性增加/增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶定義為熱穩(wěn)定性具有任意增加的聚合酶，優(yōu)選在足以引起具有野生型熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶活性降低的加熱處理后保留大約1.2至大約10,000倍、大約1.5至大約10,000倍、大約2至大約5,000倍、大約2至大約2000倍(優(yōu)選超過(guò)大約5倍，更優(yōu)選超過(guò)大約10倍，仍更優(yōu)選超過(guò)大約50倍，仍更優(yōu)選超過(guò)大約100倍，仍更優(yōu)選超過(guò)大約500倍，最優(yōu)選超過(guò)大約1000倍)活性。優(yōu)選的是，將本發(fā)明突變型或經(jīng)修飾逆轉(zhuǎn)錄酶與相應(yīng)的未修飾或野生型逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行比較，以測(cè)定熱穩(wěn)定性的相對(duì)增強(qiáng)或增加。例如，52℃、5分鐘加熱處理后，熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可能保留加熱處理前所展示活性的大約90％，而具有野生型熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶可能保留最初活性的10％。同樣，53℃、5分鐘加熱處理后，熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可能保留最初活性的80％，而具有野生型熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶可能沒(méi)有可測(cè)量活性。相似的，50℃、5分鐘加熱處理后，熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可能保留最初活性的大約50％、大約55％、大約60％、大約65％、大約70％、大約75％、大約80％、大約85％、大約90％、或大約95％，而具有野生型熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶可能沒(méi)有可測(cè)量活性或者可能保留最初活性的10％、15％、或20％。在第一種情況(即52℃、5分鐘加熱處理后)中，可以說(shuō)熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性比野生型逆轉(zhuǎn)錄酶高9倍。下文實(shí)施例2列出了可用于測(cè)量逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性的條件的范例。
可以通過(guò)比較逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行加熱處理(即于52℃保溫指定時(shí)間，例如5分鐘)后的樣品與相同逆轉(zhuǎn)錄酶于室溫保溫并加熱處理相同時(shí)間后的對(duì)照樣品的剩余活性來(lái)測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性。通常可以通過(guò)使用互補(bǔ)寡脫氧核糖核苷酸模板將放射性標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸摻入寡脫氧核糖核苷酸引物來(lái)測(cè)量剩余活性。例如，可以測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶使用polyC模板將[α-32P]-dGTP摻入寡dG引物的能力，以測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶的剩余活性。
在其它方面，將本發(fā)明的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶定義為在與相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾逆轉(zhuǎn)錄酶相比更高溫度才失活的任何逆轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選的是，本發(fā)明熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的失活溫度比相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾逆轉(zhuǎn)錄酶的失活溫度高大約2℃至大約50℃(如大約2℃、大約4℃、大約5℃、大約8℃、大約10℃、大約12℃、大約14℃、大約16℃、大約18℃、大約20℃、大約24℃、大約26℃、大約28℃、大約30℃、大約33℃、大約35℃、大約38℃、大約40℃、大約42℃、大約44℃、大約46℃、大約48℃、或大約50℃)。更具體的說(shuō)，在相同條件下進(jìn)行比較時(shí)，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的失活溫度比相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾逆轉(zhuǎn)錄酶的失活溫度高大約5℃至大約50℃、大約5℃至大約40℃、大約5℃至大約30℃、大約5℃至大約25℃。
可以通過(guò)將本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶與相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品于不同溫度處理指定時(shí)間，并在熱處理后測(cè)量樣品的剩余逆轉(zhuǎn)錄酶活性(如果有的話)，由此測(cè)定本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶與相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾逆轉(zhuǎn)錄酶相比失活溫度的差異。測(cè)試逆轉(zhuǎn)錄酶與野生型、未突變、或未修飾對(duì)照之間失活溫度的差異的測(cè)定是通過(guò)比較每種逆轉(zhuǎn)錄酶失活(即在所用具體測(cè)定法中沒(méi)有可測(cè)量的剩余逆轉(zhuǎn)錄酶活性)的溫度的差異而確定的。正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，任何數(shù)目的逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定法都可用于測(cè)定任何測(cè)試逆轉(zhuǎn)錄酶的失活溫度的差異。
末端延伸活性。在用于本文時(shí)，“末端延伸活性”指逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)越過(guò)DNA或mRNA模板的5末端向新合成的cDNA鏈的3末端添加額外堿基的能力。末端延伸活性可以特異的(具有核苷酸傾向)或隨機(jī)的添加堿基。
末端延伸活性也稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)活性。將TdT活性降低、顯著降低、或消除的逆轉(zhuǎn)錄酶定義為TdT活性低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的逆轉(zhuǎn)錄酶，具體而言，低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約90％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約85％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約80％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約75％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約50％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約25％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約15％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約10％、低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約5％、或低于相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶的比活的大約1％。將TdT活性消除定義為通過(guò)本文實(shí)施例3中所述測(cè)定法檢測(cè)不到活性水平。
正如下文實(shí)施例3所述，本領(lǐng)域知道能夠越過(guò)模板(如RNA或DNA模板)末端將核酸分子延伸2-3個(gè)核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄酶。另外，在發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄的任何一種反應(yīng)混合物中，可能存在越過(guò)模板末端延伸了不同數(shù)目核苷酸的分子的混合物。本文參考越過(guò)模板末端延伸一個(gè)或多個(gè)核苷酸的分子的數(shù)目或百分比來(lái)測(cè)定TdT活性。例如，若在相同或相似條件下野生型逆轉(zhuǎn)錄酶越過(guò)模板末端向逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中生成的90％分子添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，而經(jīng)修飾逆轉(zhuǎn)錄酶越過(guò)模板末端向45％的分子添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，則說(shuō)經(jīng)修飾逆轉(zhuǎn)錄酶與野生型酶相比展示TdT活性降低50％。另外，在使用DNA作為模板時(shí)，已經(jīng)構(gòu)建的M-MLVSuperScriptTMII的F309N、T306K、H204R突變體展示的TdT活性是SuperScriptTMII的大約0％；而在使用RNA作為模板時(shí)，突變體展示的TdT活性是SuperScriptTMII的大約10-20％。然而，本發(fā)明的某些其它實(shí)施方案明確排除F309N、T306K、H204R突變體。
保真度。保真度指聚合的精確度，或逆轉(zhuǎn)錄酶在合成與模板互補(bǔ)的核酸分子時(shí)區(qū)別正確與錯(cuò)誤底物(如核苷酸)的能力。逆轉(zhuǎn)錄酶的保真度越高，逆轉(zhuǎn)錄酶在核酸合成過(guò)程中向成長(zhǎng)鏈中錯(cuò)摻的核苷酸越少；即保真度的增加或增強(qiáng)導(dǎo)致錯(cuò)誤率降低或錯(cuò)摻率降低的更忠實(shí)的逆轉(zhuǎn)錄酶。
將保真度增加/增強(qiáng)/更高的逆轉(zhuǎn)錄酶定義為保真度具有任意增加的聚合酶，在指定長(zhǎng)度的任何指定核酸分子的合成過(guò)程中與對(duì)照逆轉(zhuǎn)錄酶相比錯(cuò)摻核苷酸數(shù)目降低了優(yōu)選大約1.2至大約10,000倍、大約1.5至大約10,000倍、大約2至大約5,000倍、或大約2至大約2000倍(優(yōu)選超過(guò)大約5倍、更優(yōu)選超過(guò)大約10倍、仍更優(yōu)選超過(guò)大約50倍、仍更優(yōu)選超過(guò)大約100倍、仍更優(yōu)選超過(guò)大約500倍、最優(yōu)選超過(guò)大約1000倍)。優(yōu)選的是，將本發(fā)明的突變型或經(jīng)修飾逆轉(zhuǎn)錄酶與相應(yīng)的未修飾或野生型逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行比較，以測(cè)定保真度的相對(duì)增強(qiáng)或增加。例如，經(jīng)突變逆轉(zhuǎn)錄酶可以在合成1000個(gè)堿基的核酸分子區(qū)段時(shí)錯(cuò)摻1個(gè)核苷酸，比較而言，未突變逆轉(zhuǎn)錄酶在相同大小區(qū)段中錯(cuò)摻10個(gè)核苷酸，則說(shuō)這種突變型逆轉(zhuǎn)錄酶的保真度增加了10倍。
正如下文實(shí)施例5所述，還可以通過(guò)移碼發(fā)生率的降低來(lái)測(cè)量保真度。將保真度升高的逆轉(zhuǎn)錄酶定義為與對(duì)照逆轉(zhuǎn)錄酶(如野生型逆轉(zhuǎn)錄酶)相比在移碼方面保真度增加的聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，例如逆轉(zhuǎn)錄酶在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約1.2倍、在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約1.5倍、在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約5倍、在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約10倍、在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約20倍、在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約30倍、或在移碼方面的保真度增加了超過(guò)大約40倍。
就移碼而言，還可以將保真度增加/增強(qiáng)/更高的逆轉(zhuǎn)錄酶定義為保真度具有任意增加的逆轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶，諸如在移碼方面的保真度增加了大約1.5至大約10,000倍、大約2至大約5000倍、大約2至大約2000倍、大約1.5至大約40倍、大約5至大約40倍、大約10至大約40倍、大約20至大約40倍、大約30至大約40倍、大約5至大約30倍、大約10至大約30倍、大約15至大約30倍、大約20至大約30倍、大約5至大約20倍、大約10至大約20倍、大約15至大約20倍、大約10至大約100倍、大約15至大約100倍、大約20至大約100倍、大約30至大約100倍、或大約50至大約100倍。
本文將錯(cuò)摻減少的逆轉(zhuǎn)錄酶定義為與相應(yīng)的野生型、未突變、或未修飾酶相比相對(duì)錯(cuò)摻為大約或低于90％、大約或低于85％、大約或低于75％、大約或低于70％、大約或低于60％、或優(yōu)選大約或低于50％、優(yōu)選大約或低于25％、更優(yōu)選大約或低于10％、最優(yōu)選大約或低于1％。
可以通過(guò)測(cè)序或本領(lǐng)域知道的其它方法來(lái)測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶的保真度或錯(cuò)摻率(Eckert和Kunkel，1990，Nucl.Acids Res.，183739-3744)。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將由未突變和經(jīng)突變逆轉(zhuǎn)錄酶合成的DNA分子的序列與預(yù)期(已知)序列進(jìn)行比較。由此，可以為每種酶測(cè)定錯(cuò)誤(錯(cuò)摻或移碼)數(shù)目并進(jìn)行比較。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以將未突變和經(jīng)突變逆轉(zhuǎn)錄酶用于具有已知序列的DNA分子的測(cè)序?？梢员容^測(cè)序錯(cuò)誤(錯(cuò)摻或移碼)的數(shù)目，以測(cè)定酶的保真度或錯(cuò)摻率。測(cè)定保真度或錯(cuò)摻率的其它設(shè)置包括使用RNA模板的正向互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)下文和先前J.C.Boyer等人，Methods Enzymol.，275523，1996所述，并敘述于實(shí)施例中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可用于測(cè)定保真度或錯(cuò)摻率的其它方法。
鏈跳躍。在用于本文時(shí)，“鏈跳躍”指由逆轉(zhuǎn)錄酶“跳讀”mRNA模板上超過(guò)一個(gè)(如兩個(gè)、五個(gè)、十個(gè)、五十個(gè)、一百個(gè)、等)核苷酸引起的一類隨機(jī)突變，導(dǎo)致在生成的cDNA中刪除相應(yīng)的核苷酸。
手結(jié)構(gòu)域(Hand domain)。在用于本文時(shí)，“手結(jié)構(gòu)域”指那些位于逆轉(zhuǎn)錄酶中控制模板、引物、或核苷酸相互作用的區(qū)域內(nèi)的氨基酸。該結(jié)構(gòu)域還表征為逆轉(zhuǎn)錄酶中二級(jí)結(jié)構(gòu)的一組三個(gè)區(qū)域，即拇指、指、和掌區(qū)。拇指結(jié)構(gòu)域定義為位于HIV逆轉(zhuǎn)錄酶第240-315位氨基酸之間或M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第280-355位氨基酸之間。指結(jié)構(gòu)域定義為位于HIV逆轉(zhuǎn)錄酶第1-85位和第120-154位氨基酸之間或M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第1-124位和第161-193位氨基酸之間。掌結(jié)構(gòu)域定義為位于HIV逆轉(zhuǎn)錄酶第86-199位和第155-239位氨基酸之間或M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第126-160位和第193-279位氨基酸之間。這些區(qū)域已普遍確定，而且確定N端和C端的氨基酸是近似的。還可以為其它逆轉(zhuǎn)錄酶定義相應(yīng)的區(qū)域。本發(fā)明的優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶在手結(jié)構(gòu)域中具有一處或多種修飾或突變。更具體的說(shuō)，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(包括拇指、指、和掌區(qū))中包含一處或多處突變或修飾。
一般而言，本發(fā)明提供了包含逆轉(zhuǎn)錄酶、用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物，所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十二處、十五處、二十處、三十處、等)突變或修飾，使之更加熱穩(wěn)定。本發(fā)明還提供了包含逆轉(zhuǎn)錄酶、用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子的組合物，所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有一處或多處突變或修飾，使之更有效，即具有更高保真度，和/或更低TdT活性。本發(fā)明還提供了包含逆轉(zhuǎn)錄酶的組合物，所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有一處或多處突變或修飾，使之更加熱穩(wěn)定且更有效。
這些組合物中的酶優(yōu)選以工作濃度存在，同樣優(yōu)選的是RNA酶H活性降低或顯著降低?；蛘?，本發(fā)明組合物中使用的逆轉(zhuǎn)錄酶可以具有RNA酶H活性。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄酶包括逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，諸如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV逆轉(zhuǎn)錄酶、和MAV逆轉(zhuǎn)錄酶或其它ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶或其相應(yīng)的RNA酶H-衍生物?？捎糜谥苽浔景l(fā)明組合物的其它逆轉(zhuǎn)錄酶包括細(xì)菌的逆轉(zhuǎn)錄酶(如大腸桿菌逆轉(zhuǎn)錄酶)(見(jiàn)Mao等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，227489-493，1996)和釀酒酵母逆轉(zhuǎn)錄酶(如Ty1或Ty3逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶)(見(jiàn)Cristofari等人，J.Biol.Chem.，27436643-36648，1999；Mules等人，J.Virol.，726490-6503，1998)。
依照本發(fā)明，可以對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行任何數(shù)目的突變，而且在優(yōu)選方面，可以進(jìn)行多處突變，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性增加。這些突變包括點(diǎn)突變、移碼突變、刪除和插入，優(yōu)選一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十二處、十五處、二十處、三十處、等)點(diǎn)突變?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的任何方法將突變導(dǎo)入本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶?？梢酝ㄟ^(guò)例如在存在錳作為二價(jià)金屬離子輔助因子時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)而隨機(jī)導(dǎo)入突變。或者，可以將由寡核苷酸指導(dǎo)的誘變用于構(gòu)建在沿編碼DNA分子的任何確定位點(diǎn)允許所有可能類型的堿基對(duì)變化的突變型聚合酶。一般而言，這種技術(shù)涉及將與編碼目的逆轉(zhuǎn)錄酶的單鏈核苷酸序列互補(bǔ)但具有一處或多處錯(cuò)配的寡核苷酸進(jìn)行退火。然后用DNA聚合酶延伸錯(cuò)配的寡核苷酸，生成在一條鏈的序列中具有期望變化的雙鏈DNA分子。序列中的變化能夠例如導(dǎo)致氨基酸的刪除、替代、或插入。然后可以將雙鏈多核苷酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，從而可以生成突變型或經(jīng)修飾多肽。上述由寡核苷酸指導(dǎo)的誘變能夠例如通過(guò)PCR來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明還致力于逆轉(zhuǎn)錄一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、二十種、等)核酸分子的方法，包括將一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、二十種、等)核酸模板(優(yōu)選RNA或信使RNA即mRNA，更優(yōu)選mRNA分子群)與一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶混合；并在足以生成與該一種或多種(如一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十二種、十五種、二十種、三十種、等)模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子的條件下將混合物保溫。為了生成與該一種或多種模板互補(bǔ)的核酸分子，優(yōu)選將引物(如寡dT引物)和一種或多種核苷酸用于5’向3’方向的核酸合成。依照本發(fā)明這一方面適用于逆轉(zhuǎn)錄的核酸分子包括任何核酸分子，特別是那些衍生自原核或真核細(xì)胞的核酸分子。這些細(xì)胞可以包括正常細(xì)胞、患病細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、確立細(xì)胞、祖細(xì)胞、前身細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、胚細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞(包括人細(xì)胞)、禽類細(xì)胞、植物細(xì)胞、諸如此類，或由植物或動(dòng)物(如人、牛、豬、小鼠、綿羊、馬、猴、犬、貓、大鼠、兔、鳥(niǎo)、魚、昆蟲(chóng)、等)分離的組織。這些核酸分子還可分離自病毒。
本發(fā)明還提供了用于核酸分子的擴(kuò)增或測(cè)序的方法，包括使核酸分子接觸本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選的是這些方法包括一個(gè)或多個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。逆轉(zhuǎn)錄酶的來(lái)源在本發(fā)明的組合物、方法、和試劑盒中使用的酶包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的任何酶，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶、乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、花椰菜花葉病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)菌的逆轉(zhuǎn)錄酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(R.K.Saiki等人，Science，239487-491，1988；美國(guó)專利號(hào)4,889,818和4,965,188)、Tne DNA聚合酶(PCT發(fā)布號(hào)WO 96/10640)、Tma DNA聚合酶(美國(guó)專利號(hào)5,374,553)及其突變體、片段、變體、或衍生物(參閱例如共同擁有的美國(guó)專利號(hào)5,948,614和6,015,668，將其完整收入本文作為參考)。優(yōu)選的是，在本發(fā)明中使用的逆轉(zhuǎn)錄酶包括逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，諸如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV逆轉(zhuǎn)錄酶、和通常的ASLV逆轉(zhuǎn)錄酶。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)的，可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的且眾所周知的重組或遺傳工程技術(shù)來(lái)獲得經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶。例如，可以通過(guò)定點(diǎn)或隨機(jī)誘變而突變編碼目的逆轉(zhuǎn)錄酶的基因，由此獲得突變型逆轉(zhuǎn)錄酶。這些突變可以包括點(diǎn)突變、刪除突變和插入突變。例如，可以使用一處或多處點(diǎn)突變(如用一個(gè)或多個(gè)不同氨基酸替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸)來(lái)構(gòu)建本發(fā)明的突變型逆轉(zhuǎn)錄酶。
本發(fā)明還包括在氨基酸水平與野生型逆轉(zhuǎn)錄酶(如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、等)70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一并展示升高后的熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明還包括在氨基酸水平與包含下文表3所列氨基酸序列(SEQ ID NO2)的逆轉(zhuǎn)錄酶70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一并展示升高后的熱穩(wěn)定性和/或更加有效(如具有更高保真度和/或具有更低TdT活性)的逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明還包括編碼上述逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸分子。
本發(fā)明還包括包含至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、或700個(gè)氨基酸殘基并保留一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)活性的逆轉(zhuǎn)錄酶片段?？梢酝ㄟ^(guò)刪除突變、本領(lǐng)域常規(guī)的且眾所周知的重組技術(shù)、或使用任意數(shù)目的眾所周知的蛋白水解酶酶促消化目的逆轉(zhuǎn)錄酶，由此獲得這些片段。本發(fā)明還包括編碼上述突變型逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶片段的核酸分子。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶片段還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第1-355位、第1-498位、第1-500位、和第1-550位氨基酸，以及其它逆轉(zhuǎn)錄酶的相應(yīng)片段。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶片段還包含與一種或多種上文所述片段70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一的多肽。
具有與參考氨基酸序列至少例如70％“同一”的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，指蛋白質(zhì)的氨基酸序列與參考序列相同，只是在參考蛋白質(zhì)氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸中，蛋白質(zhì)序列可以包含多達(dá)30個(gè)氨基酸改變。換言之，為了獲得具有與參考氨基酸序列至少70％同一的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，可以刪除或用另一種氨基酸替代參考序列中多達(dá)30％的氨基酸殘基，或者可以在參考序列中插入數(shù)目多達(dá)總氨基酸殘基30％的氨基酸。參考序列的這些改變可以位于參考氨基酸序列的氨基(N-)和/或羧基(C-)末端位置和/或末端位置之間的任何位置，其個(gè)別散布在參考序列的殘基中和/或作為參考序列中的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組。在實(shí)踐中，可以使用已知的計(jì)算機(jī)程序，諸如上文關(guān)于核酸序列特異性測(cè)定所述或CLUSTAL W程序(J.D.Thompson等人，Nucleic Acids Res.，224673-4680，1994)，常規(guī)測(cè)定指定氨基酸序列與參考蛋白質(zhì)的氨基酸序列是否例如至少70％同一。
優(yōu)選在本發(fā)明中使用的酶包括那些RNA酶H活性降低或顯著降低的酶。可以通過(guò)突變例如目的逆轉(zhuǎn)錄酶中的RNA酶H結(jié)構(gòu)域來(lái)獲得RNA酶H活性降低或顯著降低的這些酶，例如通過(guò)如上所述導(dǎo)入一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十二處、十五處、二十處、三十處、等)點(diǎn)突變、一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十二處、十五處、二十處、三十處、等)刪除突變、和/或一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十二處、十五處、二十處、三十處、等)插入突變。
“RNA酶H活性顯著降低的”酶指酶具有相應(yīng)的野生型或RNA酶H+酶(諸如野生型莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MLV)、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)或勞氏肉瘤病毒(RSV)的逆轉(zhuǎn)錄酶)的RNA酶H活性的低于大約30％、低于大約25％、低于大約20％、更優(yōu)選低于大約15％、低于大約10％、低于大約7.5％、或低于大約5％、最優(yōu)選低于大約5％或低于大約2％。
先前已經(jīng)描述了RNA酶H活性降低或顯著降低的逆轉(zhuǎn)錄酶(參閱美國(guó)專利號(hào)5,668,005、美國(guó)專利號(hào)6,063,608、和PCT發(fā)布號(hào)WO98/47912)?？梢酝ㄟ^(guò)多種測(cè)定法來(lái)測(cè)定任何酶的RNA酶H活性，諸如美國(guó)專利號(hào)5,244,797；M.L.Kotewicz等人，Nucl.Acids Res.，16265，1988；和G.F.Gerard等人，F(xiàn)OCUS，14(5)91，1992；和美國(guó)專利號(hào)5,668,005中所述(將它們的公開(kāi)書完整收入本文作為參考)。
特別優(yōu)選在本發(fā)明中使用的酶包括但不限于M-MLV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，在本發(fā)明的組合物、方法、和試劑盒中可以等同的使用RNA酶H活性降低或顯著降低的、能夠由核糖核酸分子生成DNA分子(即具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性)的任何酶。
在本發(fā)明中使用的酶還包括那些末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)活性降低、顯著降低、或消除的酶?？梢酝ㄟ^(guò)突變例如目的逆轉(zhuǎn)錄酶中接近或接觸模板-引物的氨基酸殘基來(lái)獲得末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性降低或顯著降低或TdT活性消除的這種酶，例如通過(guò)導(dǎo)入一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十二處、十五處、二十處、三十處、等)點(diǎn)突變、一處或多處刪除突變、和/或一處或多處插入突變。2001年3月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/808,124(將其完整公開(kāi)書收入本文作為參考)描述了展示TdT活性降低的逆轉(zhuǎn)錄酶，包括在等同或?qū)?yīng)于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶Y64、M289、F309、T197、和/或Y133的氨基酸位置具有一處或多處改變的逆轉(zhuǎn)錄酶。
一方面，在一個(gè)或多個(gè)上文確定位置(即等同或?qū)?yīng)于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶Y64、M289、F309、T197或Y133的氨基酸位置)進(jìn)行氨基酸替代。因而，可以用包括Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、和Val在內(nèi)的任何其它氨基酸替代位于這些位置的氨基酸。展示TdT活性降低或顯著降低的逆轉(zhuǎn)錄酶的具體范例包括M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(如SuperScriptTMII)，其中(1)位于第309位的苯丙氨酸殘基被天冬酰胺替代；(2)位于第197位的蘇氨酸殘基被丙氨酸或谷氨酸替代；和/或(3)位于第133位的酪氨酸殘基被丙氨酸替代。
在本發(fā)明中使用的酶還包括那些展示保真度升高的酶。2000年3月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/189,454和2001年3月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/808,124(將它們的完整公開(kāi)書收入本文作為參考)描述了展示保真度升高的逆轉(zhuǎn)錄酶，包括在等同或?qū)?yīng)于下文表2所列位置具有一處或多處改變的逆轉(zhuǎn)錄酶。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)上文確定位置進(jìn)行氨基酸替代。因而，可以用包括Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、和Val在內(nèi)的任何其它氨基酸替代位于這些位置的氨基酸。展示保真度升高的逆轉(zhuǎn)錄酶的具體范例包括M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中(1)位于第223位的纈氨酸殘基被組氨酸、苯丙氨酸或異亮氨酸替代；(2)位于第116位的精氨酸殘基被甲硫氨酸替代；(3)位于第152位的賴氨酸殘基被精氨酸替代；(4)位于第190位的谷氨酸殘基被苯丙氨酸替代；(5)位于第197位的蘇氨酸殘基被丙氨酸或谷氨酸替代；(6)位于第309位的苯丙氨酸殘基被天冬酰胺或精氨酸替代；(7)位于第133位的酪氨酸殘基被組氨酸或丙氨酸替代；和/或(8)位于第64位的酪氨酸殘基被色氨酸或精氨酸替代。
因而，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括展示熱穩(wěn)定性升高且任選還展示一項(xiàng)或多項(xiàng)下列特征的逆轉(zhuǎn)錄酶(1)RNA酶H活性降低或顯著降低；(2)TdT活性降低或顯著降低；和/或(3)保真度升高。
本發(fā)明還涉及逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其中在逆轉(zhuǎn)錄酶的公認(rèn)區(qū)域進(jìn)行了突變或替代。這種區(qū)域包括但不限于指、掌和拇指區(qū)。因而，本發(fā)明包括如本文其它部分所述展示熱穩(wěn)定性升高(及其它特性)且在手結(jié)構(gòu)域中(更具體的說(shuō)是在一個(gè)或多個(gè)包括指、掌和/或拇指區(qū)在內(nèi)的區(qū)域中)具有一處或多處(如一處、兩處、三處、四處、五處、十處、十五處、等)突變或修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶。
可以依照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的用于分離并純化天然蛋白的標(biāo)準(zhǔn)流程由它們的天然病毒或細(xì)菌來(lái)源分離在本發(fā)明中使用的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(參閱例如G.E.Houts等人，J.Virol.，29517，1979)。另外，可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的重組DNA技術(shù)來(lái)制備具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(參閱例如M.L.Kotewicz等人，Nucl.Acids Res.，16265，1988；及D.A.Soltis和A.M.Skalka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，853372-3376，1988)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，突變型或經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶是通過(guò)重組技術(shù)生成的?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)獲得許多克隆的逆轉(zhuǎn)錄酶基因(參閱美國(guó)專利號(hào)5,668,005和PCT發(fā)布號(hào)WO 98/47912)。
為了克隆將依照本發(fā)明進(jìn)行修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶的編碼基因，將包含逆轉(zhuǎn)錄酶基因或開(kāi)放讀碼框的分離DNA用于構(gòu)建重組DNA文庫(kù)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的任何載體來(lái)克隆目的逆轉(zhuǎn)錄酶。然而，所用載體必須與將用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主相容。
用于構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)的原核載體包括質(zhì)粒，諸如那些能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒，諸如pBR322、ColE1、pSC101、pUC載體(pUC18、pUC19、等；《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1982；和Sambrook等人，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。芽孢桿菌質(zhì)粒包括pC194、pUB110、pE194、pC221、pC217、等。這些質(zhì)粒是由T.Glyczan公開(kāi)的(《The Molecular Biology of Bacilli》即芽孢桿菌的分子生物學(xué)，Academic出版社，紐約，1982，第307-329頁(yè))。合適的鏈霉菌質(zhì)粒包括pIJ101(Kendall等人，J.Bacteriol.，1694177-4183，1987)。假單胞菌質(zhì)粒的回顧見(jiàn)John等人，Rad.Insec.Dis.，8693-704，1986；和Igaki，Jpn.J.Bacteriol.，33729-742，1978)。還可以將宿主范圍廣泛的質(zhì)?；蛘沉ＶT如pCP13(Darzins和Chakrabarbary，J.Bacteriol.，1599-18，1984)用于本發(fā)明。優(yōu)選用于克隆本發(fā)明基因和核酸分子的載體是原核載體。優(yōu)選的是，將pCP13和pUC載體用于克隆本發(fā)明的基因。
適用于克隆目的逆轉(zhuǎn)錄酶基因和核酸分子的宿主是原核宿主。原核宿主的一個(gè)范例是大腸桿菌。然而，可以在其它原核宿主中克隆本發(fā)明的期望逆轉(zhuǎn)錄酶基因和核酸分子，包括但不限于埃希氏菌屬(Escberichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和變形桿菌屬(Proteus)的宿主。特別感興趣的細(xì)菌宿主包括大腸桿菌DH10B，可以由Invitrogen公司(Carlsbad，加州)獲得。
用于克隆并表達(dá)目的逆轉(zhuǎn)錄酶的真核宿主包括酵母、真菌、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。期望逆轉(zhuǎn)錄酶在這些真核細(xì)胞中的表達(dá)可能需要使用包括真核啟動(dòng)子在內(nèi)的真核調(diào)控區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)眾所周知的技術(shù)使用眾所周知的真核載體系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶基因或核酸分子在真核細(xì)胞中的克隆和表達(dá)。
一旦在特定載體中構(gòu)建了DNA文庫(kù)，則通過(guò)眾所周知的技術(shù)轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。將轉(zhuǎn)化菌落以大約200-300轉(zhuǎn)化菌落/培養(yǎng)皿的密度進(jìn)行涂板。為了選擇逆轉(zhuǎn)錄酶，如下文實(shí)施例所述對(duì)菌落篩選熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，使用經(jīng)標(biāo)記脫氧核苷酸對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)化菌落的過(guò)夜培養(yǎng)物直接測(cè)定熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性，并分析經(jīng)標(biāo)記產(chǎn)物的存在與否。若檢測(cè)到熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性，則將突變體測(cè)序以確定維持逆轉(zhuǎn)錄酶活性的氨基酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的技術(shù)來(lái)克隆編碼本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的基因或核酸分子。聚合酶的修飾或突變依照本發(fā)明，可以在任何逆轉(zhuǎn)錄酶中進(jìn)行一處或多處突變以增加酶的熱穩(wěn)定性或賦予酶以其它特性。這種突變包括點(diǎn)突變、移碼突變、刪除和插入。優(yōu)選的是，將導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代的一處或多處點(diǎn)突變用于生成熱穩(wěn)定性增強(qiáng)或增加的逆轉(zhuǎn)錄酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，可以在其它逆轉(zhuǎn)錄酶中等同或?qū)?yīng)于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶位置H204(如H204R)和/或T306(如T306K或T306R)的位置進(jìn)行一處或多處突變以生成期望結(jié)果。在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可能不包括特定的突變組合，諸如組合第204位組氨酸突變成精氨酸(H204R)與第306位蘇氨酸突變成賴氨酸(T306K)的逆轉(zhuǎn)錄酶；組合H204R和T306K與第309位苯丙氨酸突變成天冬酰胺(F309N)的逆轉(zhuǎn)錄酶；及組合H204R、T306K、和F309N與第223位纈氨酸突變成組氨酸(V223H)的逆轉(zhuǎn)錄酶。
在具體實(shí)施方案中，可以在等同或?qū)?yīng)于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶位置L52、Y64、R116、Y133、K152、Q190、T197、H204、V223、M289、T306和/或F309的位置進(jìn)行一處或多處突變以生成期望結(jié)果(如熱穩(wěn)定性升高、保真度升高、TdT活性降低、等)。因而，在具體實(shí)施方案中，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸位置作為參考讀碼框，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括具有一處或多處如下改變的逆轉(zhuǎn)錄酶(如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、等)L52P、Y64S、Y64W、Y64R、R116M、Y133A、Y133H、K152R、K152M、Q190F、T197R、T197E、T197A、T197K、H204R、V223H、V223F、V223I、M289L、T306K、T306R、F309R、和/或F309N，如本文其它部分所述某些實(shí)施方案中明確排除的那些突變或突變組合除外；以及包含這些蛋白質(zhì)的組合物、編碼這些蛋白質(zhì)的核酸分子、和包含這些核酸分子的宿主細(xì)胞。
逆轉(zhuǎn)錄酶中改變這些蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的突變可能伴隨對(duì)通常與逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)的活性(如RNA酶H活性、逆轉(zhuǎn)錄酶活性、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)活性、等)具有微弱影響或沒(méi)有影響或者顯著改變一種或多種通常與逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)的活性的改變。具有這種突變組合的逆轉(zhuǎn)錄酶的一個(gè)范例是具有如下改變的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶K152M、V223H。
已顯示增強(qiáng)SuperScriptTMII(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，產(chǎn)品目錄編號(hào)18064-022)的保真度的一種突變是V223H(參閱2000年3月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/189,454和2001年3月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/808,124,將它們的完整公開(kāi)書收入本文作為參考)。然而，V223H改變降低了這種酶的熱穩(wěn)定性。經(jīng)鑒定遏制具有V223H突變的酶的去穩(wěn)定效應(yīng)的一種突變體是K152M。因而，本發(fā)明包括在位置K152和V223包含改變且展示保真度升高和熱穩(wěn)定性升高的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。這種逆轉(zhuǎn)錄酶的具體范例是那些K152被甲硫氨酸替代且V223被組氨酸替代的逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明的范圍還包括具有相應(yīng)改變的其它逆轉(zhuǎn)錄酶(如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、等)。
SuperScriptTMII是來(lái)自M-MLV且具有如下替代的RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶D524G、E562Q、和D583N(參閱美國(guó)專利號(hào)5,017,492、5,244,797、5,405,776、5,668,005、和6,063,608，將它們的完整公開(kāi)書收入本文作為參考)。
對(duì)任何目的逆轉(zhuǎn)錄酶，在一處或多處選定位置進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代。因而，可以用包括Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、和Val在內(nèi)的任何其它氨基酸替代位于選定位置的氨基酸。在有些優(yōu)選實(shí)施方案中，選定的氨基酸將是不帶電荷的表面殘基，而且將被帶電荷的殘基替代。在有些優(yōu)選實(shí)施方案中，可以用帶正電荷的氨基酸(如賴氨酸或精氨酸)替代不帶電荷的表面殘基。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的為其它逆轉(zhuǎn)錄酶鑒定出上文標(biāo)識(shí)的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶相應(yīng)位置。因而，考慮到本申請(qǐng)中描述的確定區(qū)域和測(cè)定法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行一處或多處修飾，導(dǎo)致任何目的逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性升高。依照本發(fā)明有待修飾的殘基可能包括上文表1所列。
已經(jīng)知道M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Shinnick等人，Nature，293543，1981；Georgiadis等人，Structure，3879-892，1995)、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Joliot等人，Virology，195812-819，1993)、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶(Schwartz等人，Cell，32853-859，1983)、和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(Wong-Staal等人，Nature，313277-284，1985)的核苷酸序列。
優(yōu)選的是，將由寡核苷酸指導(dǎo)的誘變用于構(gòu)建在沿編碼DNA分子的任何確定位點(diǎn)允許所有可能類型的堿基對(duì)變化的突變型逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的增強(qiáng)為了優(yōu)化本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，可以將眾所周知的誘導(dǎo)性或組成性啟動(dòng)子用于在重組宿主中表達(dá)高水平的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)基因。相似的，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的高拷貝數(shù)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)高水平的表達(dá)。具有誘導(dǎo)性高拷貝數(shù)的載體也可用于增強(qiáng)本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶在重組宿主中的表達(dá)。
為了在原核細(xì)胞(諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌、等)中表達(dá)期望結(jié)構(gòu)基因，必需將期望結(jié)構(gòu)基因可操作連接功能性原核啟動(dòng)子。然而，逆轉(zhuǎn)錄酶基因的天然啟動(dòng)子可能在原核宿主中也有功能，從而能夠表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶基因。因而，可以使用天然啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶基因?？捎糜谠鰪?qiáng)表達(dá)的其它啟動(dòng)子包括組成性或可調(diào)控(即誘導(dǎo)性或去抑制性)啟動(dòng)子。組成性啟動(dòng)子的范例包括噬菌體λ的int啟動(dòng)子和pBR332中β-內(nèi)酰胺酶的bla啟動(dòng)子。誘導(dǎo)性原核啟動(dòng)子的范例包括噬菌體λ的主要右和左啟動(dòng)子(PR和PL)、大腸桿菌的trp、recA、lacZ、lacI、tet、gal、trc、ara BAD(Guzman等人，J.Bacteriol.，177(14)4121-4130，1995)和tac啟動(dòng)子?？莶菅挎邨U菌啟動(dòng)子包括α-淀粉酶啟動(dòng)子(Ulmanen等人，J.Bacteriol.，162176-182，1985)和芽孢桿菌噬菌體啟動(dòng)子(T.Gryczan，《The Molecular Biology of Bacilli》即芽孢桿菌的分子生物學(xué)，Academic出版社，紐約，1982)。鏈霉菌啟動(dòng)子描述于Ward等人，Mol.Gen.Genet.，203468-478，1986。原核啟動(dòng)子的回顧還可以參閱Glick，J.Ind.Microbiol.，1277-282，1987；Y.Cenatiempto，Biochimie，68505-516，1986；和Gottesman，Ann.Rev.Genet.，18415-442，1984。原核細(xì)胞中的表達(dá)還要求在基因編碼序列上游存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)。這種核糖體結(jié)合位點(diǎn)公開(kāi)于例如Gold等人，Ann.Rev.Microbiol.，35365-404，1981。
為了增強(qiáng)本發(fā)明聚合酶在真核細(xì)胞中的表達(dá)，可以使用眾所周知的真核啟動(dòng)子和宿主。有可能在原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)聚合酶表達(dá)的增強(qiáng)。適用于本發(fā)明的原核宿主的一個(gè)范例是大腸桿菌。逆轉(zhuǎn)錄酶的分離和純化優(yōu)選通過(guò)包含并表達(dá)期望逆轉(zhuǎn)錄酶基因的重組宿主在培養(yǎng)中的生長(zhǎng)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的酶。然而，可以由生成本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的任何菌株分離本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明還包括逆轉(zhuǎn)錄酶的片段。這種片段包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白水解片段。
可以向培養(yǎng)基中添加可以被包含克隆逆轉(zhuǎn)錄酶基因的宿主同化的任何營(yíng)養(yǎng)物。應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同情況中使用的菌株和培養(yǎng)基的組成來(lái)選擇最佳培養(yǎng)條件?？梢韵蛏L(zhǎng)培養(yǎng)基中添加抗生素以確保維持包含待表達(dá)期望基因的載體DNA。培養(yǎng)基配方描述于DSM或ATCC目錄和Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989。
可以通過(guò)例如離心將生成本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的重組宿主細(xì)胞與液體培養(yǎng)基分開(kāi)。一般而言，將收集的微生物細(xì)胞散布于合適的緩沖液中，然后通過(guò)超聲處理或其它眾所周知的流程破壞細(xì)胞，從而能夠由緩沖液提取酶。通過(guò)超速離心或離心除去細(xì)胞碎片后，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)來(lái)純化逆轉(zhuǎn)錄酶，諸如抽提、沉淀、層析、親和層析、電泳、諸如此類。在純化過(guò)程中檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的存在與否的測(cè)定法在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可以在傳統(tǒng)的生化純化方法中用于測(cè)定這些酶的存在。
在有些實(shí)施方案中，可以修飾本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶以包含親和標(biāo)簽，從而便于逆轉(zhuǎn)錄酶的純化。合適的親和標(biāo)簽對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的，包括但不限于氨基酸重復(fù)序列諸如六組氨酸、表位諸如血凝素表位和myc表位、和能夠簡(jiǎn)化逆轉(zhuǎn)錄酶純化的其它氨基酸序列。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選具有超過(guò)大約5U/mg，更優(yōu)選超過(guò)大約50U/mg，仍更優(yōu)選超過(guò)大約100U/mg、250U/mg、500U/mg、1000U/mg、5000U/mg或10,000U/mg，最優(yōu)選超過(guò)大約15,000U/mg、超過(guò)大約16,000U/mg、超過(guò)大約17,000U/mg、超過(guò)大約18,000U/mg、超過(guò)大約19,000U/mg和超過(guò)大約20,000U/mg的比活。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可能具有超過(guò)大約50,000U/mg，超過(guò)大約100,000U/mg，超過(guò)大約150,000U/mg，超過(guò)大約200,000U/mg，超過(guò)大約250,000U/mg和超過(guò)大約300,000U/mg的比活。本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶的比活的優(yōu)選范圍包括大約5U/mg至大約350,000U/mg的比活、大約5U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約50U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約100U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約250U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約500U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約1000U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約5000U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約10,000U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約25,000U/mg至大約300,000U/mg的比活、大約100U/mg至大約500U/mg的比活、大約100U/mg至大約400U/mg的比活、和大約200U/mg至大約500U/mg的比活。比活的其它優(yōu)選范圍包括大約200,000U/mg至大約350,000U/mg的比活、大約225,000U/mg至大約300,000U/mg的比活、和大約250,000U/mg至大約300,000U/mg的比活。優(yōu)選的是，比活范圍的下限可以不同于50、100、200、300、400、500、700、900、1,000、5,000、10,000、20,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、和80,000U/mg，而比活范圍的上限可以不同于350,000、300,000、250,000、200,000、150,000、140,000、130,000、120,000、110,000、100,000、和90,000U/mg。在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，依照本發(fā)明制備的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的比活可能高于非熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的比活。在有些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的比活可能比相應(yīng)非熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的比活高5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。在有些優(yōu)選實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的比活可能比相應(yīng)的非熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶的比活高30％或更高。依照本發(fā)明，比活是蛋白質(zhì)或酶的酶活性(U)相對(duì)于反應(yīng)中所用蛋白質(zhì)或酶的總量的度量?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)測(cè)定比活的度量。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可用于由一種或多種模板生成核酸分子。這種方法包括(a)將一種或多種核酸模板(如mRNA，更優(yōu)選mRNA分子群)與一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶混合；并(b)在足以生成與所述一種或多種核酸模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的一種或多種核酸分子的條件下將混合物保溫。
本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增一種或多種核酸分子的方法，包括(a)將一種或多種核酸模板與本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶之一混合；并(b)在足以擴(kuò)增與一種或多種核酸模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的一種或多種核酸分子的條件下將混合物保溫。這種擴(kuò)增方法還可包括使用一種或多種DNA聚合酶，而且可以像在標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR反應(yīng)中那樣獲得采用。
本發(fā)明還關(guān)注用于對(duì)一種或多種核酸分子測(cè)序的方法，包括(a)將一種或多種待測(cè)序核酸分子與一種或多種引物核酸分子、一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸、及一種或多種終止劑混合；(b)在足以合成與一種或多種待測(cè)序核酸分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子群的條件下將混合物保溫；并(c)將核酸分子群分開(kāi)以測(cè)定一種或多種待測(cè)序核酸分子的整個(gè)或部分的核苷酸序列。
本發(fā)明還關(guān)注通過(guò)這些方法生成的核酸分子(可以是全長(zhǎng)cDNA分子)、包含這些核酸分子的載體(特別是表達(dá)載體)、和包含這些載體和核酸分子的宿主細(xì)胞。DNA聚合酶的來(lái)源依照本發(fā)明，多種DNA聚合酶是有用的。這種聚合酶包括但不限于Thermus thermophilus即嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶、Thermusaquaticus即水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、Thermotoga neapolitana即那不勒斯棲熱袍菌(Tne)DNA聚合酶、Thermotoga maritime即海棲熱袍菌(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis即海濱熱球菌(Tli或VENTTM)DNA聚合酶、Pyrococcus furiosis即激烈熱球菌(Pfu)DNA聚合酶、Pyrococcus species即熱球菌GB-D(DEEPVENTTM)DNA聚合酶、Pyrococcus woosii即沃斯氏熱球菌(Pwo)DNA聚合酶、Bacillussterothermophilus即嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bst)DNA聚合酶、Bacilluscaldophilus即嗜熱芽孢桿菌(Bca)DNA聚合酶、Sulfolobusacidocaldarius即嗜酸熱硫化葉菌(Sac)DNA聚合酶、Thermoplasmaacidophilum即嗜酸熱原體(Tac)DNA聚合酶、Thermus flavus即黃棲熱菌(Tfl/Tub)DNA聚合酶、Thermus ruber即紅棲熱菌(Tru)DNA聚合酶、Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum，Mth)DNA聚合酶、Mycobacterium spp.即分枝桿菌DNA聚合酶(Mtb、Mlep)及其突變體、變體和衍生物。
依照本發(fā)明使用的DNA聚合酶可以是能夠由核酸模板合成DNA分子(通常是5’向3’方向)的任何酶。這種聚合酶可以是嗜溫的或嗜熱的，但是優(yōu)選嗜熱的。嗜溫聚合酶包括T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Klenow片段DNA聚合酶、DNA聚合酶III、諸如此類。優(yōu)選的DNA聚合酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶，諸如Taq、Tne、Tma、Pfu、VENTTMDEEPVENTTM、Tth及其突變體、變體和衍生物(美國(guó)專利號(hào)5,436,149；美國(guó)專利號(hào)5,512,462；PCT發(fā)布號(hào)WO 92/06188；PCT發(fā)布號(hào)WO 92/06200；PCT發(fā)布號(hào)WO 96/10640；W.M.Barnes，Gene，11229-35，1992；F.C.Lawyer等人，PCR Meth.Appl.，2275-287，1993；J.-M.Flaman等人，Nucl.Acids Res.，22(15)3259-3260，1994)。為了擴(kuò)增長(zhǎng)核酸分子(如長(zhǎng)度超過(guò)大約3-5kb的核酸分子)，通常使用至少兩種DNA聚合酶(一種基本缺乏3’外切核酸酶活性，另一種具有3’外切核酸酶活性)。參閱美國(guó)專利號(hào)5,436,149；美國(guó)專利號(hào)5,512,462；W.M.Barnes，Gene，11229-35，1992；PCT發(fā)布號(hào)98/06736；和共同擁有的、共同未決的1997年2月14日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?8/801,720(將它們的公開(kāi)書完整收入本文作為參考)?；救狈?’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的范例包括但不限于Taq、The(exo-)、Tma、Pfu(exo-)、Pwo和Tth DNA聚合酶及其突變體、變體和衍生物。具有3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的非限制性范例包括Pfu、DEEPVENTTM和Tli/VENTTM及其突變體、變體和衍生物。酶組合物的配方為了形成本發(fā)明的組合物，優(yōu)選在緩沖鹽溶液中混合一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶?？梢匀芜x添加一種或多種DNA聚合酶和/或一種或多種核苷酸和/或一種或多種引物以生成本發(fā)明的組合物。更具體的說(shuō)，在穩(wěn)定的緩沖鹽溶液中提供工作濃度的酶。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”和“穩(wěn)定性”通常指將酶或包含酶的組合物于大約4℃保存大約1周后、于大約-20℃保存大約2-6個(gè)月后、和于大約-80℃保存大約6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間后，組合物(諸如酶組合物)保留最初酶活性(U)的至少70％、優(yōu)選至少80％、最優(yōu)選至少90％。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“工作濃度”指酶的濃度處于或接近在溶液中發(fā)揮特定功能(諸如逆轉(zhuǎn)錄核酸)的最佳濃度。
在配制本發(fā)明組合物時(shí)使用的水優(yōu)選經(jīng)過(guò)蒸餾、去離子和無(wú)菌過(guò)濾(通過(guò)0.1-0.2μm濾膜)，而且不含DNA酶和RNA酶污染?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途經(jīng)獲得這種水，例如Sigma化學(xué)公司(圣路易市，密蘇里州)，或者依照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的流程根據(jù)需要進(jìn)行制備。
除了酶成分以外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含合成核酸分子(諸如cDNA分子)所必需的一種或多種緩沖鹽和輔助因子。特別優(yōu)選在配制本發(fā)明組合物時(shí)使用的緩沖鹽是醋酸鹽、硫酸鹽、氫氯化物、磷酸鹽、或Tris-(羥甲基)氨基甲烷(TRISTM)的游離酸形式，但是可以使用與TRISTM具有相同或相似的離子強(qiáng)度和pKa的替換緩沖鹽而獲得等同的結(jié)果。除了緩沖鹽以外，組合物中還包含輔助因子的鹽，諸如鉀鹽(優(yōu)選氯化鉀或醋酸鉀)和鎂鹽(優(yōu)選氯化鎂或醋酸鎂)。為了支持組合物和/或反應(yīng)混合物在保存后穩(wěn)定性增強(qiáng)，向組合物和/或合成反應(yīng)混合物中添加一種或多種碳水化合物和/或糖可能也是有利的。優(yōu)選在本發(fā)明的組合物和/或合成反應(yīng)混合物中包含的這種碳水化合物或糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘油、諸如此類。另外，可以向用于生成本發(fā)明酶組合物和/或試劑盒的酶的保存緩沖液中添加這種碳水化合物和/或糖?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途經(jīng)由許多來(lái)源獲得這種碳水化合物和/或糖，包括Sigma(圣路易市，密蘇里州)。
常常優(yōu)選在加入酶之前首先在水中溶解工作濃度的緩沖鹽、輔助因子的鹽、和碳水化合物或糖并調(diào)整溶液的pH。由此，對(duì)pH敏感的酶將在配制本發(fā)明組合物的過(guò)程中經(jīng)歷較少的由酸或堿介導(dǎo)的失活。
為了配制緩沖鹽溶液，將緩沖鹽(優(yōu)選Tris-(羥甲基)氨基甲烷(TRISTM)的鹽，最優(yōu)選它的氫氯化物鹽)溶于足量的水以生成TRISTM濃度5-150mM、優(yōu)選10-60mM、最優(yōu)選20-60mM的溶液?？梢韵虼巳芤褐屑尤腈V鹽(優(yōu)選它的氯化物或醋酸鹽)以提供它的工作濃度即1-10mM、優(yōu)選1.5-8.0mM、最優(yōu)選大約3-7.5mM。還可以向溶液中加入鉀鹽(優(yōu)選它的氯化物或醋酸鹽)，工作濃度10-100mM、最優(yōu)選大約75mM?？梢韵蛉芤褐屑尤脒€原劑諸如二硫蘇糖醇，優(yōu)選終濃度大約1-100mM、更優(yōu)選大約5-50mM或大約7.5-20mM、最優(yōu)選大約10mM。本發(fā)明組合物中包含碳水化合物和/或糖的優(yōu)選濃度的范圍是大約5％(w/v)至大約30％(w/v)、大約7.5％(w/v)至大約25％(w/v)、大約10％(w/v)至大約25％(w/v)、大約10％(w/v)至大約20％(w/v)、優(yōu)選大約10％(w/v)至大約15％(w/v)。還可以添加少量的乙二胺四乙酸(EDTA)的鹽諸如EDTA二鈉(優(yōu)選大約0.1mM)，盡管EDTA似乎并非本發(fā)明組合物的功能或穩(wěn)定性所必需的。在加入所有緩沖鹽和鹽類后，將該緩沖鹽溶液混勻直至所有鹽類都溶解了，并使用本領(lǐng)域知道的方法將pH調(diào)至7.4至9.2、優(yōu)選8.0至9.0、最優(yōu)選大約8.4。
向這些緩沖鹽溶液中加入酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和/或DNA聚合酶)以生成本發(fā)明的組合物。優(yōu)選向溶液中加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶至工作濃度大約1,000至大約50,000U/ml、大約2,000至大約30,000U/ml、大約2,500至大約25,000U/ml、大約3,000至大約22,500U/ml、大約4,000至大約20,000U/ml、最優(yōu)選工作濃度大約5,000至大約20,000U/ml。優(yōu)選向溶液中加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(包括上文所述的本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶)至工作濃度大約100至大約5000U/ml、大約125至大約4000U/ml、大約150至大約3000U/ml、大約200至大約2500U/ml、大約225至大約2000U/ml、最優(yōu)選工作濃度大約250至大約1000U/ml。優(yōu)選向溶液中加入嗜熱DNA聚合酶組(Taq、The、Tma、Pfu、VENT、DEEPVENT、Tth及其突變體、變體和衍生物)中的酶至工作濃度大約100至大約1000U/ml、大約125至大約750U/ml、大約150至大約700U/ml、大約200至大約650U/ml、大約225至大約550U/ml、最優(yōu)選工作濃度大約250-大約500U/ml。可以任何順序或同時(shí)將酶加到溶液中。
本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種核苷酸，優(yōu)選脫氧核苷三磷酸(dNTP)或雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。本發(fā)明組合物的dNTP成分擔(dān)當(dāng)新合成核酸的“構(gòu)件”，即通過(guò)聚合酶的作用摻入新合成的核酸；而ddNTP可用于依照本發(fā)明的測(cè)序方法。適用于本發(fā)明組合物的核苷酸的范例包括但不限于dUTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dITP、7-脫氮-dGTP、α-硫代-dATP、α-硫代-dTTP、α-硫代-dGTP、α-硫代-dCTP、ddUTP、ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddITP、7-脫氮-ddGTP、α-硫代-ddATP、α-硫代-ddTTP、α-硫代-ddGTP、α-硫代-ddCTP或其衍生物，所有這些都可以通過(guò)商業(yè)途經(jīng)獲得，包括Invitrogen公司(Calsbad，加州)、New England BioLabs(Beverly，馬薩諸塞州)、和Sigma化學(xué)公司(圣路易市，密蘇里州)。核苷酸可以是未標(biāo)記的，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域知道的方法將它們偶聯(lián)放射性同位素(如3H、14C、32P或35S)、維生素(如生物素)、熒光模塊(如熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、或藻紅蛋白)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(如使用PHOTO-GENETM或ACESTM化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，可以由Invitrogen公司(Calsbad，加州)或Sigma化學(xué)公司(圣路易市，密蘇里州)購(gòu)買)、洋地黃毒苷、諸如此類，從而進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途經(jīng)獲得經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，例如Invitrogen公司(Calsbad，加州)或Sigma化學(xué)公司(圣路易市，密蘇里州)。在本發(fā)明中，以工作濃度加入核苷酸，即每種核苷酸大約10-4000μM、大約50-2000μM、大約100-1500μM、或大約200-1200μM、最優(yōu)選大約1000μM。
為了降低成分的變質(zhì)，試劑組合物的保存通常優(yōu)選大于約4℃至多1天，最優(yōu)選-20℃至多1年。
另一方面，可以干燥形式在存在一種或多種碳水化合物、糖或合成聚合物時(shí)制備并保存本發(fā)明的組合物和逆轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選用于制備干燥組合物或逆轉(zhuǎn)錄酶的碳水化合物、糖或聚合物包括但不限于蔗糖、海藻糖、和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其組合。參閱例如美國(guó)專利號(hào)5,098,893、4,891,319、和5,556,771(將它們的公開(kāi)書完整收入本文作為參考)。這種干燥的組合物和酶可于各種溫度保存較長(zhǎng)時(shí)間且本發(fā)明的酶或組合物成分沒(méi)有顯著變質(zhì)。優(yōu)選將干燥的逆轉(zhuǎn)錄酶或組合物保存于4℃或-20℃。cDNA分子的生成/來(lái)源依照本發(fā)明，可以由多種核酸模板分子制備cDNA分子(單鏈或雙鏈)。優(yōu)選用于本發(fā)明的核酸分子包括單鏈或雙鏈DNA和RNA分子，以及雙鏈DNARNA雜種分子。更優(yōu)選的核酸分子包括信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)分子，但是mRNA分子是依照本發(fā)明的優(yōu)選模板。
可以依照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)合成法制備可依照本發(fā)明方法制備的cDNA分子的核酸分子。更優(yōu)選的是，可以由天然來(lái)源獲得核酸分子，諸如多種細(xì)胞、組織、器官或生物體?？捎米骱怂岱肿觼?lái)源的細(xì)胞可以是原核的(細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭菌屬(Clostridium)、衣原體屬(Chlamydia)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、密螺旋體屬(Treponema)、枝原體屬(Mycoplasm)、疏螺旋體屬(Borrelia)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的物種的細(xì)胞)或真核的(包括真菌(尤其是酵母)、植物、原生動(dòng)物和其它寄生蟲(chóng)、和動(dòng)物(包括昆蟲(chóng)，特別是果蠅細(xì)胞；線蟲(chóng)，特別是Caenorhabditis elegans細(xì)胞；和哺乳動(dòng)物，特別是人細(xì)胞))。
可用作核酸分子來(lái)源的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞包括血細(xì)胞(網(wǎng)狀細(xì)胞和白細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞(來(lái)自中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng))、肌肉細(xì)胞(包括來(lái)自骨骼肌、平滑肌或心肌的肌細(xì)胞或成肌細(xì)胞)、結(jié)締組織細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞)和其它基質(zhì)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞)。哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞(精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞)也可作為核酸來(lái)源而用于本發(fā)明，產(chǎn)生上述體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞、前身細(xì)胞和干細(xì)胞也可作為核酸來(lái)源用于本發(fā)明。適合用作核酸來(lái)源的還有哺乳動(dòng)物組織或器官，諸如那些衍生自腦、腎、肝、胰、血液、骨髓、肌肉、神經(jīng)、皮膚、泌尿、循環(huán)、淋巴、胃腸和結(jié)締組織來(lái)源的組織或器官，以及那些衍生自哺乳動(dòng)物(包括人)胚或胎兒的組織或器官。
任何上述原核或真核細(xì)胞、組織和器官可以是正常的、患病的、轉(zhuǎn)化的、確立的、祖細(xì)胞、前身細(xì)胞、胎兒的或胚胎的。患病細(xì)胞可以例如包括那些參與傳染病(由細(xì)菌、真菌或酵母、病毒(包括AIDS、HIV、HTLV、皰疹、肝炎、諸如此類)、或寄生蟲(chóng)引起的)、遺傳或生化病理學(xué)(如囊性纖維化、血友病、阿爾茨海默氏病、肌肉萎縮或多發(fā)性硬化)、或癌癥過(guò)程的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化或已確立的動(dòng)物細(xì)胞系可以包括例如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、293細(xì)胞、L929細(xì)胞、F9細(xì)胞、諸如此類。適合作為核酸來(lái)源而用于本發(fā)明的其它細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官和生物體對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
一旦獲得了起始細(xì)胞、組織、器官或其它樣品，就可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法由其分離核酸分子(諸如mRNA)(參閱例如T.Maniatis等人，Cell，15687-701，1978；H.Okayama和P.Berg，Mol.Cell.Biol.，2161-170，1982；及U.Gubler和B.J.Hoffman，Gene，25263-269，1983)。然后可以將由此分離的核酸分子用于制備依照本發(fā)明的cDNA分子和cDNA文庫(kù)。
在本發(fā)明的實(shí)踐中，cDNA分子或cDNA文庫(kù)是如下生成的在有利于通過(guò)酶或組合物的作用逆轉(zhuǎn)錄核酸分子而形成一種或多種cDNA分子(單鏈或雙鏈)的條件下，將如上所述獲得的一種或多種核酸分子(優(yōu)選一種或多種mRNA分子，諸如mRNA分子群)與具有本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽或者與一種或多種本發(fā)明組合物混合。因而，本發(fā)明的方法包括(a)將一種或多種核酸模板(優(yōu)選一種或多種RNA或mRNA模板，諸如mRNA分子群)與一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶混合；并(b)在足以生成與一種或多種模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的一種或多種核酸分子的條件下將混合物保溫。這種方法可以包括使用一種或多種DNA聚合酶、一種或多種核苷酸、一種或多種引物、一種或多種緩沖液、諸如此類。為了生成cDNA分子或文庫(kù)，可以將本發(fā)明聯(lián)合cDNA合成方法，諸如下文實(shí)施例中描述的那些方法或本領(lǐng)域眾所周知的其它方法(參閱例如U.Gubler和B.J.Hoffman，Gene，25263-269，1983；M.S.Krug和S.L.Berger，Meth.Enzymol.，152316-325，1987；J.Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第8.60-8.63頁(yè)，1989；PCT發(fā)布號(hào)WO 99/15702；PCT發(fā)布號(hào)WO 98/47912；和PCT發(fā)布號(hào)WO 98/51699)。
可有利的用于本發(fā)明的其它c(diǎn)DNA合成方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的。
在獲得了依照本發(fā)明的cDNA分子或文庫(kù)后，可以分離這些cDNA用于進(jìn)一步的分析或操作。GENETRAPPERTM手冊(cè)(Invitrogen公司，Carlsbad，加州；將其完整收入本文作為參考)傳授了用于純化cDNA的詳細(xì)方法，但是也可以使用本領(lǐng)域知道的用于分離cDNA的其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參閱例如J.Sambrook等人，《Molecular CloningA LaboratoryManual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第8.60-8.63頁(yè)，1989)。
在本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明可用于核酸分子的擴(kuò)增和測(cè)序的方法。依照本發(fā)明這一方面的核酸擴(kuò)增方法可以是一步的(如一步RT-PCR)或兩步的(如兩步RT-PCR)反應(yīng)。依照本發(fā)明，可以在一個(gè)管中實(shí)現(xiàn)一步RT-PCR型反應(yīng)，從而降低污染的可能性。這種一步反應(yīng)包括(a)將核酸模板(如mRNA)與一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶和一種或多種DNA聚合酶混合；并(b)在足以擴(kuò)增與模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子的條件下將混合物保溫?？梢詥为?dú)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶活性或者聯(lián)合DNA聚合酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)這種擴(kuò)增。可以兩個(gè)分開(kāi)的步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)兩步RT-PCR反應(yīng)。這種方法包括(a)將核酸模板(如mRNA)與本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶混合；(b)在足以生成與模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子(如DNA分子)的條件下將混合物保溫；(c)將核酸分子與一種或多種DNA聚合酶混合；并(d)在足以擴(kuò)增核酸分子的條件下將步驟(c)的混合物保溫。為了擴(kuò)增長(zhǎng)核酸分子(即長(zhǎng)度超過(guò)3-5kb)，可以使用DNA聚合酶的組合，諸如具有3’外切核酸酶活性的一種DNA聚合酶與3’外切核酸酶活性顯著降低的另一種DNA聚合酶。
依照本發(fā)明這一方面的核酸測(cè)序方法可以包括循環(huán)測(cè)序(測(cè)序聯(lián)合擴(kuò)增)和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序反應(yīng)兩種。本發(fā)明的測(cè)序方法因而包括(a)將待測(cè)序的核酸分子與一種或多種引物、一種或多種本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸、及一種或多種終止劑混合；(b)在足以合成與待測(cè)序分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的核酸分子群的條件下將混合物保溫；并(c)將分子群分開(kāi)以測(cè)定待測(cè)序分子的整個(gè)或部分的核苷酸序列。依照本發(fā)明，可以將一種或多種DNA聚合酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶)與本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)合或分開(kāi)使用。
可依照本發(fā)明使用的擴(kuò)增方法包括PCR(美國(guó)專利號(hào)4,683,195和4,683,202)、鏈取代擴(kuò)增(SDA；美國(guó)專利號(hào)5,455,166；EP 0 684 315)、和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA；美國(guó)專利號(hào)5,409,818；EP 0 329 822)，以及更復(fù)雜的基于PCR的核酸指紋技術(shù)，諸如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)分析(J.G.K.Williams等人，Nucl.Acids Res.，18(22)6531-6535，1990)、任意引發(fā)PCR(AP-PCR；J.Welsh和M.McClelland，Nucl.Acids Res.，18(24)7213-7218，1990)、DNA擴(kuò)增指紋(DAF；Caetano-Anoll és等人，Bio/Technology，9553-557，1991)、微衛(wèi)星PCR或小衛(wèi)星區(qū)DNA的定向擴(kuò)增(DAMD；D.D.Heath等人，Nucl.Acids Res.，21(24)5782-5785，1993)、和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析(EP 0 534 858；P.Vos等人，Nucl.Acids Res.，23(21)4407-4414，1995；J.J.Lin和J.Kuo，F(xiàn)OCUS，17(2)66-70，1995)。可采用本發(fā)明組合物的核酸測(cè)序技術(shù)包括雙脫氧測(cè)序法，諸如美國(guó)專利號(hào)4,962,022和5,498,523中公開(kāi)的那些方法。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明可用于核酸分子的擴(kuò)增或測(cè)序方法，包括一個(gè)或多個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，諸如任何上述基于PCR的方法。試劑盒在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明裝配成用于逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增核酸分子的試劑盒，或者裝配成用于核酸分子測(cè)序的試劑盒。依照本發(fā)明這一方面的試劑盒包括載體設(shè)置(諸如盒子、硬紙盒、管、諸如此類)，其中密封的裝有一種或多種容器設(shè)置(諸如小瓶、管子、安瓿、瓶子、諸如此類)，其中第一容器設(shè)置裝有一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽。當(dāng)使用超過(guò)一種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽時(shí)，可以將它們作為兩種或多種多肽的混合物裝在單一容器中，或者裝在分開(kāi)的容器中。本發(fā)明的試劑盒還可(在相同的或分開(kāi)的容器中)包含一種或多種DNA聚合酶、合適的緩沖液、一種或多種核苷酸、和/或一種或多種引物。
在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒可以包含一種或多種成分(混合的或分開(kāi)的)，包括一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽、一種或多種合成核酸分子所必需的核苷酸、和/或一種或多種引物(如用于逆轉(zhuǎn)錄的寡dT)。這種逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒還可包含一種或多種DNA聚合酶。本發(fā)明的測(cè)序試劑盒可包含一種或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽，且任選包含一種或多種DNA聚合酶、一種或多種核酸分子測(cè)序所需要的終止劑(如雙脫氧核苷三磷酸分子)、一種或多種核苷酸、和/或一種或多種引物。適用于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測(cè)序試劑盒的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的優(yōu)選多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物和其它成分包括上文所述。本發(fā)明這一方面涵蓋的試劑盒還可包含進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)核酸逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增或測(cè)序方案所必需的額外試劑和化合物?？梢詫⑦@種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā)明多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物、和額外的試劑、成分或化合物裝在一個(gè)或多個(gè)容器中，而且可以兩種或多種上述化合物的混合物的形式裝在這些容器中，或者在本發(fā)明試劑盒中裝在分開(kāi)的容器中。核酸分子的用途可以進(jìn)一步表征通過(guò)本發(fā)明方法制備的核酸分子或cDNA文庫(kù)，例如通過(guò)克隆和測(cè)序(即測(cè)定核酸分子的核苷酸序列)、通過(guò)本發(fā)明的測(cè)序方法、或通過(guò)本領(lǐng)域其它標(biāo)準(zhǔn)方法(參閱例如致力于DNA測(cè)序方法的美國(guó)專利號(hào)4,962,022和5,498,523)?；蛘?，可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法將這些核酸分子用于在工業(yè)過(guò)程中制造各種材料，諸如雜交探針。例如由cDNA生成雜交探針使得醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)人員能夠?qū)颊叩募?xì)胞或組織檢查特定遺傳標(biāo)記的存在與否，諸如癌癥、傳染病或遺傳病、或胚胎發(fā)育的標(biāo)記。另外，這種雜交探針可用于由自不同細(xì)胞、組織或生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)分離DNA片段，用于進(jìn)一步表征。
本發(fā)明的核酸分子還可用于制備可用于重組DNA方法學(xué)的組合物。因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明cDNA或擴(kuò)增核酸分子的重組載體、通過(guò)遺傳工程用重組載體改造的宿主細(xì)胞、使用這些載體和宿主細(xì)胞生成重組多肽的方法、和使用這些方法生成的重組多肽。
可以依照本發(fā)明這一方面使用本領(lǐng)域眾所周知的方法通過(guò)將依照本發(fā)明制備的一種或多種cDNA分子或擴(kuò)增核酸分子插入載體來(lái)生成重組載體。用于本發(fā)明這一方面的載體可以是例如噬菌體或質(zhì)粒，優(yōu)選質(zhì)粒。優(yōu)選的是包含作用于目的多肽編碼核酸的順式作用控制區(qū)的載體?？梢杂伤拗鳌⒒パa(bǔ)載體或載體自身導(dǎo)入宿主后提供適當(dāng)?shù)姆词阶饔靡蜃印?br> 在這一方面的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，載體提供特異表達(dá)(因而稱為“表達(dá)載體”)，它可以是誘導(dǎo)性的和/或細(xì)胞類型特異的。在這種載體中特別優(yōu)選的是那些可由易于操作的環(huán)境因素(諸如溫度和營(yíng)養(yǎng)添加劑)誘導(dǎo)的載體。
可用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括由染色體、附加體和病毒衍生的載體，如由細(xì)菌質(zhì)?；蚣?xì)菌噬菌體衍生的載體和由其組合衍生的載體，諸如粘粒和噬菌粒，優(yōu)選包含用于培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞的至少一種選擇標(biāo)記，諸如四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。在插入這種表達(dá)載體前，應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明的cDNA或擴(kuò)增核酸分子可操作連接適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，諸如噬菌體λPL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道其它合適的啟動(dòng)子。
優(yōu)選用于本發(fā)明的載體包括pQE70、pQE60和pQE-9(可以由Qiagen獲得)；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(可以由Stratagene獲得)；pcDNA3(可以由Invitrogen獲得)；pGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(可以由Pharmacia獲得)；和pSPORT1、pSPORT2和pSV·SPORT1(可以由Invitrogen獲得)。其它合適的載體對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明還提供了生成包含本發(fā)明cDNA分子、擴(kuò)增核酸分子或重組載體的重組宿主細(xì)胞的方法，以及通過(guò)這種方法生成的宿主細(xì)胞?？梢砸勒毡景l(fā)明生成的代表性宿主細(xì)胞(原核或真核)包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括大腸桿菌細(xì)胞(最特別的是大腸桿菌菌株DH10B和Stb12，可以通過(guò)商業(yè)途經(jīng)獲得(Invitrogen公司，Carlsbad，加州))、枯草芽孢桿菌細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)細(xì)胞、鏈霉菌細(xì)胞、歐文氏菌細(xì)胞、克雷伯氏菌細(xì)胞和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)細(xì)胞。優(yōu)選的動(dòng)物宿主細(xì)胞包括昆蟲(chóng)細(xì)胞(最特別的是草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9和Sf21細(xì)胞和粉夜蛾(Trichoplusa)High-Five細(xì)胞)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(最特別的是CHO、COS、VERO、BHK和人細(xì)胞)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的眾所周知的轉(zhuǎn)化、電傳孔或轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)制備這種宿主細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供了用于生成重組多肽的方法，和通過(guò)這些方法生成的多肽。依照本發(fā)明的這一方面，可以通過(guò)在有利于由其生成多肽的條件下培養(yǎng)任何上述重組宿主細(xì)胞，并分離多肽，由此生成重組多肽。用于培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞和用于由此生成并分離多肽的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是眾所周知的。
對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)本文所述方法和應(yīng)用進(jìn)行其它合適的修改和改動(dòng)(它們也是顯而易見(jiàn)的)而不違背本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的范圍?，F(xiàn)在已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，通過(guò)參照下文實(shí)施例將能夠更清楚的理解本發(fā)明，本文只是為了例示目的而包括這些實(shí)施例，并非意欲限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1制備突變型逆轉(zhuǎn)錄酶由Invitrogen公司獲得質(zhì)粒pBAD，并插入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的編碼序列，而生成質(zhì)粒pBAD-6-His-M-MLVH-(F1)。將質(zhì)粒pBAD-6-His-M-MLVH-(F1)用作克隆載體和PCR誘變的靶子(圖1)。pBAD-6-His-M-MLVH-(F1)在大腸桿菌中復(fù)制，并賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞以氨芐青霉素抗性。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因是由ara BAD啟動(dòng)子表達(dá)的，而后者又是由阿拉伯糖誘導(dǎo)的。該啟動(dòng)子受到araC基因產(chǎn)物的遏制，它也存在于質(zhì)粒上。所用宿主大腸桿菌菌株DH10B是araD突變體，不能代謝阿拉伯糖，使得阿拉伯糖成為經(jīng)pBAD-6-His-M-MLV H-(F1)轉(zhuǎn)化的DH10B細(xì)胞的義務(wù)誘導(dǎo)劑。該質(zhì)粒包含含有六組氨酸標(biāo)簽的前導(dǎo)序列，其與M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因的編碼序列處于相同的讀碼框中。參考表3(SEQ ID NO1和2)提供的該質(zhì)粒的序列，第1-96位核苷酸編碼前導(dǎo)序列，第97-99位核苷酸編碼甲硫氨酸。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是通過(guò)蛋白水解由前體多蛋白衍生的，因而野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶不是由甲硫氨酸開(kāi)始的。因此，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第一個(gè)氨基酸是由第97-99位核苷酸編碼的甲硫氨酸后面的蘇氨酸。
用于這些實(shí)驗(yàn)的pBAD-6-His-M-MLV H-(F1)中的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因的序列衍生自質(zhì)粒pRT601的序列。pRT601描述于美國(guó)專利號(hào)5,668,005和5,017,492(將它們完整收入本文作為參考)。
表31 atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaam g g s h h h h h h g m a s m t g g q q61atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aagcatatga ccctaaatat agaagatgagm g r d l y d d d d k h m t l n i e d e121 tatcggctac atgagacctc aaaagagcca gatgtttctc tagggtccac atggctgtcty r l h e t s k e p d v s l g s t w l s181 gattttcctc aggcctgggc ggaaaccggg ggcatgggac tggcagttcg ccaagctcctd f p q a w a e t g g m g l a v r q a p241 ctgatcatac ttctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca taaaacaata ccccatgtcal i i l l k a t s t p v s i k q y p m s301 caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac tgttggacca gggaatactgq e a r l g i k p h i q r l l d q g i l361 gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg tcaagaaacc cgggactaatv p c q s p w n t p l l p v k k p g t n421 gattacaggc ctgtccaaga tctgagagag gtcaacaaac gcgtagaaga catccaccccd y r p v q d l r e v n k r v e d i h p481 accgtaccca acccctacaa cctcttgagt gggctcccac cgtcccacca gtggtacactt v p n p y n l l s g l p p s h q w y t541 gttctagact taaaagatgc ctttttctgc ctgagactcc acccgacgtc tcagcctctcv l d l k d a f f c l r l h p t s q p l601 ttcgcctttg aatggagaga cccagagatg ggaatctctg gccaactaac ctggaccagaf a f e w r d p e m g i s g q l t w t r661 ctcccacagg gattcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg aggcactgcg cagagacctal p q g f k n s p t l f d e a l r r d l721 gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac agtacgtaga tgacttactga d f r i q h p d l i l l q y v d d l l781 ctggccgcca cttctgagct cgactgccaa caaggtactc gggccctgtt acaaaccctal a a t s e l d c q q g t r a l l q t l表3(續(xù))841 ggagacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa tttgccagaa acaggtcaagg d l g y r a s a k k a q i c q k q v k901 tatctggggt atcttctaaa agagggtcag agatggctga ctgaggccag aaaagagacty l g y l l k e g q r w l t e a r k e t961 gtgatggggc agcctactcc gaagaccccg cggcaactaa gggagttcct agggacggcav m g q p t p k t p r q l r e f l g t a1021 ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt gcagaaatgg cagccccctt gtaccctctcg f c r l w i p g f a e m a a p l y p l1081 accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac aaaaggccta tcaagaaatct k t g t l f n w g p d q q k a y q e i1141 aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag atttgactaa gccctttgaak q a l l t a p a l g l p d l t k p f e1201 ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc taacgcaaaa actgggacctl f v d e k q g y a k g v l t q k l g p1261 tggcgtcggc cggtggccta cctgtccaaa aagctagacc cagtagcagc tgggtggcccw r r p v a y l s k k l d p v a a g w p1321 ccttgcctac ggatggtagc agccattgcc gtactgacaa aggatgcagg caagctaaccp c l r m v a a i a v l t k d a g k l t1381 atgggacagc cactagtcat tctggccccc catgcagtag aggcactagt caaacaacccm g q p l v i l a p h a v e a l v k q p1441 cccgatcgat ggctttccaa cgcccggatg actcactatc aggccttgct tttggacacgp d r w l s n a r m t h y q a l l l d t1501 gaccqggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg ctacactgct cccactgcctd r v q f g p v v a l n p a t l l p l p1561 gaggaagggc tgcagcacaa ctgccttgat atcctggccg aagcccacgg aacccgaccce e g l q h n c l d i l a e a h g t r p1621 gacctaacgg accagccgct cccagacgcc gaccacacct ggtacacggg tggatccagtd l t d q p l p d a d h t w y t g g s s1681 ctcttgcaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga ccaccgagac cgaggtaatcl l q e g q r k a g a a v t t e t e v i1741 tgggctaaag ccctgccagc cgggacatcc gctcagcggg ctcagctgat agcactcaccw a k a l p a g t s a q r a q l i a l t1801 caggccctaa ggatggcaga aggtaagaag ctaaatgttt atacgaattc ccgttatgctq a l r m a e g k k l n v y t n s r y a1861 tttgctactg cccatatcca tggagaaata tacagaaggc gtgggttgct cacatcagaaf a t a h i h g e i y r r r g l l t s e1921 ggcaaagaga tcaaaaataa ggacgagata ttggccctac taaaagccct ctttctgcccg k e i k n k d e i l a l l k a l f l p1981 aaaagactta gcataatcca ttgtccagga catcaaaagg gacacagcgc cgaggctagak r l s i i h c p g h q k g h s a e a r2041 ggcaaccgga tggctgacca agcggcccga aaggcagcca tcacagagaa tccagacaccg n r m a d q a a r k a a i t e n p d t2101 tctaccctcc tcatagaaaa ttcatcaccc aattcccgct taattaatta as t l l i e n s s p n s r l i n -
表4提供了在pRT601的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列中導(dǎo)入的點(diǎn)突變，用于生成所用質(zhì)粒。點(diǎn)突變的編號(hào)對(duì)應(yīng)于表3所示核苷酸序列。
表4表3中的核 變化 表3中的核 變化苷酸編號(hào) 苷酸編號(hào)411 a→c 993 a→g459 g→a 1446c→t462 g→c 1449c→a543 g→t 1670a→g546 t→a 1675a→t585 c→g 1676g→c588 c→g 1783g→c589 a→t 1785a→g590 g→c 1845t→g639 a→t 1846g→a642 a→c 1849a→t710 a→g 1850g→c801 a→c 1950c→a990 t→g為了生成M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H-突變體而導(dǎo)入的突變是D524G、D583N、和E562Q。導(dǎo)入的其余突變是為了插入或消除限制酶位點(diǎn)以便于生成適當(dāng)大小的片段用于隨機(jī)PCR誘變。本文將這種RNA酶H-突變體稱為SuperScriptTMII或SuperScriptTMII基因。
如圖2所示改造M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的序列以導(dǎo)入限制酶切割位點(diǎn)，而不改變由序列編碼的氨基酸。將序列分成五段，并設(shè)計(jì)寡核苷酸用于擴(kuò)增每個(gè)片段。
通過(guò)限制酶消化由pBAD-6-His-M-MLV H-(F1)制備片段，并通過(guò)凝膠純化將片段與載體主鏈分開(kāi)。在存在錳時(shí)通過(guò)PCR將每種片段隨機(jī)誘變。采用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件，只是存在0.25mM MnCl2，并將核苷三磷酸濃度限制在每種dNTP 20μM(50mM Tris HCl pH8.3、50mM KCl、3mM MgCl2、20μM dGTP、20μM dCTP、20μM dATP、20μM dTTP、1U Taq DNA聚合酶/100μl反應(yīng)體系)。將PCR產(chǎn)物酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，并將突變片段克隆到切除了該片段的載體中。對(duì)每種突變片段的轉(zhuǎn)化文庫(kù)篩選熱穩(wěn)定變體。實(shí)施例2篩選熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶此實(shí)施例使用了下列溶液EG(每升)20g細(xì)菌用胰胨、10g細(xì)菌用酵母提取物、2ml甘油、0.54g NaCl、0.194g KClEG-阿拉伯糖150ml EG添加1.5ml 10mg/ml氨芐青霉素和1.5ml 20％(w/v)阿拉伯糖(若平板應(yīng)含有阿拉伯糖)20x PEB-I緩沖液18％(w/v)葡萄糖、500mM Tris-HCl pH8.0、200mMEDTA激酶儲(chǔ)存緩沖液50％(v/v)甘油、20mM Tris-HCl pH8.0、100mM KCl、5mMβME100mg/ml溶菌酶用激酶儲(chǔ)存緩沖液配制，保存于-20℃2x PLD5ml 20x PEB-I、1ml 1M DTT、5ml 10％(v/v)屈立通X-100、1ml 100mg/ml溶菌酶、和38ml水2x PZD0.5ml 20x PEB-I、100μl 1M DTT、0.5ml 10％(v/v)屈立通X-100、10μl酶解酶、和3.9ml水10x多聚C反應(yīng)緩沖液500mM Tris-HCl pH8.4、500mM KCl、100mM MgCl21.25x反應(yīng)混合液-1∶1ml 10x多聚C反應(yīng)緩沖液、100μl 1M DTT、1ml多聚C/寡聚dG(30mM/12mM，以核苷酸計(jì))、10μl 100mM dGTP、5.87ml水、和20μl[α-32P]dGTP(10μCi/μl)將各個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種到96孔培養(yǎng)板的單個(gè)孔中。每個(gè)孔裝有120μl含有0.2％阿拉伯糖的EG-Ap培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素的EG培養(yǎng)基)。優(yōu)選首先接種裝有不含誘導(dǎo)劑的選擇培養(yǎng)基的96孔板，將母板培養(yǎng)過(guò)夜，然后用母板復(fù)制含有誘導(dǎo)劑的96孔板并將后者培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物于37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜(如15-20小時(shí))。將過(guò)夜培養(yǎng)物與等體積的2x PLD于室溫混合。有時(shí)在加熱步驟前對(duì)這些提取物直接測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。將提取物置于溫度范圍50℃至60℃的水浴中達(dá)5或10分鐘進(jìn)行加熱。優(yōu)選的是，將培養(yǎng)物于52℃加熱5分鐘。加熱步驟后，將10μl提取物與40μl 1.25x RT反應(yīng)混合液混合。將該反應(yīng)置于37℃水浴中達(dá)10分鐘。將少量反應(yīng)混合液(5μl)點(diǎn)到帶電尼龍膜(Genescreen+，NEN)上。將膜用10％TCA+1％焦磷酸鈉清洗兩次，用乙醇漂洗，干燥，并貼在磷光屏上?；蛘?，可以將膜用4％焦磷酸鈉(pH8.0)清洗兩次，用乙醇漂洗，干燥，并貼在磷光屏上。使用ImageQuant即圖象量化軟件(Molecular Devices)，通過(guò)在磷光成像儀中分析磷光屏來(lái)檢測(cè)濾膜上捕獲的放射性產(chǎn)物。
選擇在加熱滅活步驟后顯示更多逆轉(zhuǎn)錄酶活性(放射性)的候選者。再次篩選這些候選者以確認(rèn)表型。將在第二次篩選后顯得熱穩(wěn)定的候選者小量培養(yǎng)，并第三次測(cè)定熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。將重復(fù)耐熱的候選者測(cè)序，并測(cè)定每個(gè)克隆中的突變。設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于誘變位點(diǎn)的寡核苷酸，其中將誘變氨基酸的密碼子隨機(jī)化(NNK或NNN)。將這些寡核苷酸用于定點(diǎn)誘變以生成在誘變位點(diǎn)進(jìn)行所有可能替代的文庫(kù)。對(duì)該文庫(kù)篩選熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性，并對(duì)最有希望的克隆測(cè)序。
對(duì)片段2(見(jiàn)圖2)中突變體的篩選導(dǎo)致一個(gè)突變體H204R的鑒定。對(duì)位點(diǎn)H204處誘變的文庫(kù)的篩選得到幾個(gè)突變體，但是其中只有一個(gè)(另一個(gè)H204R突變體)比M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶更加熱穩(wěn)定。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的H204R突變體增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性。對(duì)片段3(見(jiàn)圖2)中突變體的篩選得到一個(gè)突變體T306K。T306位置的隨機(jī)化生成了熱穩(wěn)定突變體，經(jīng)測(cè)序是T306R。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的T306K和T306R突變體的熱穩(wěn)定性都增強(qiáng)了大約1.5倍。實(shí)施例3TdT逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在關(guān)于3種dNTP實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)延而檢查逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的保真度突變體時(shí)，觀察到SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶在存在3種和4種dNTP時(shí)越過(guò)模板末端延伸了2-3個(gè)堿基。這種非模板指導(dǎo)的延伸或TdT活性在許多突變體中降低了，但是在少數(shù)突變體諸如F309N和T197E中，這種活性似乎劇烈降低或消除。根據(jù)這些突變體與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的同源性及其與結(jié)合的模板-引物的晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，可能這些突變體與模板-引物緊密接近或接觸。方法誘變對(duì)于F309N根據(jù)突變體位置F309設(shè)計(jì)引物，且在第310-311位氨基酸處沉默插入NgoMIV限制性位點(diǎn)。引物在該位置編碼隨機(jī)NNK序列，生成F309突變體的隨機(jī)文庫(kù)，其中N是4種堿基之任一，而K是T或G。將引物與位于上游SstI限制性位點(diǎn)和下游SalI限制性位點(diǎn)的內(nèi)部SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶引物一起用于標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)(10ng SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶模板、2μM每種引物、48μl Supermix(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)，20個(gè)循環(huán)94℃ 15sec、55℃15sec、72℃30sec)，生成兩種PCR片段，即240bp SstI-NgoMIV片段和200bp NgoMIV-SalI片段。將片段分離、消化、并連接到一起，然后插入經(jīng)SstI和SalI切割的原始SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶克隆。將生成的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到MaxEfficiency DH10B(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)感受態(tài)細(xì)胞中以生成F309位點(diǎn)的突變體文庫(kù)。然后將該文庫(kù)涂板過(guò)夜用于選擇。
對(duì)于T197E和Y133A如T.A.Kunkel等人，Methods Enzymol.，204125，1991所述通過(guò)由寡聚物指導(dǎo)的誘變來(lái)生成突變體T197E和Y133A。簡(jiǎn)而言之，將SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶基因插入pBADhisA(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)載體，并命名為pBAD-SSII。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH11S細(xì)胞中，并用M13K07輔助噬菌體感染細(xì)胞，由此分離單鏈DNA。設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于每一種突變(T197E和Y133A)的寡聚物。使用T4多核苷酸激酶(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)和正向反應(yīng)緩沖液(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)將100μM每種寡聚物激酶化(即磷酸化)。將寡聚物與單鏈pBAD-SSIIDNA退火。在冰上向退火反應(yīng)中加入天然T7DNA聚合酶(USB)和T4 DNA連接酶(Invitrogen公司，Carlsbad，加州)及合成緩沖液(0.4mM dNTP、17.5mM Tris-HCl pH7.5、5mM MgCl2、2.5mM DTT、和1mM ATP)。將反應(yīng)于37℃保溫30分鐘，然后加入1μl 0.5MEDTA終止反應(yīng)。將反應(yīng)轉(zhuǎn)化到DH10B細(xì)胞中并涂板。挑取菌落，通過(guò)限制酶分析來(lái)測(cè)定突變體，并通過(guò)測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)序使用ABI 377設(shè)備和ABI Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction即大染料終止劑循環(huán)測(cè)序簡(jiǎn)易反應(yīng)試劑盒。
選擇包含有活性逆轉(zhuǎn)錄酶的菌落將各個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種到96孔培養(yǎng)板的單個(gè)孔中。每個(gè)孔裝有120μl含有0.2％阿拉伯糖的培養(yǎng)基(EG-Ap)。優(yōu)選首先接種裝有不含誘導(dǎo)劑的選擇培養(yǎng)基的96孔板，將母板培養(yǎng)過(guò)夜，然后用母板復(fù)制含有誘導(dǎo)劑的96孔板并將后者培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物于37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物與等體積的2x PLD(1.8％葡萄糖、50mM Tris-HClpH8.0、20mM EDTA、20mM DTT、1％屈立通X-100、2mg/ml溶菌酶)于室溫混合。通過(guò)混合10μl提取物與40μl 1.25x RT反應(yīng)混合液(62.5mM Tris-HCl pH8.4、62.5mM KCl、12.5mM MgCl2、12.5mM DTT、1.25mM dGTP、多聚C/寡聚dG(3.75mM/1.5mM，以核苷酸計(jì))、[32P]dGTP)，對(duì)這些提取物直接測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。將該反應(yīng)置于37℃水浴中達(dá)10分鐘。將少量反應(yīng)混合液(5μl)點(diǎn)到帶電尼龍膜(Genescreen+，NEN)上。將膜用10％TCA+1％焦磷酸鈉清洗兩次，用乙醇漂洗，干燥，并貼在磷光屏上。使用ImageQuant即圖象量化軟件(Molecular Devices)通過(guò)在磷光成像儀中分析該磷光屏來(lái)檢測(cè)濾膜捕獲的放射性產(chǎn)物。選擇顯示逆轉(zhuǎn)錄酶活性(放射性)的候選者。再次篩選這些候選者以確認(rèn)表型。然后將確認(rèn)后的候選者測(cè)序以測(cè)定維持可檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性的氨基酸。
逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的純化將包含誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄酶的細(xì)胞沉淀以1g/2ml的比率懸于裂解緩沖液(40mM Tris-HCl pH8.0、0.1M KCl、1mM PMSF)。將懸浮液在冰上超聲處理，然后以27,000xg離心30分鐘。將無(wú)細(xì)胞提取物濾過(guò)0.45μm注射濾器。將無(wú)細(xì)胞提取物以1ml/min的流速應(yīng)用于用5倍體積溶于緩沖液A(40mM Tris-HCl pH8.0、10％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1M KCl)的5mM咪唑預(yù)平衡的5ml Ni2+HI-TRAP柱(Pharmacia)。用10倍體積溶于緩沖液A的5mM咪唑清洗柱子。通過(guò)20倍體積溶于緩沖液A的5mM-1M咪唑梯度的清洗來(lái)洗脫逆轉(zhuǎn)錄酶。將包含逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)的洗脫液以1.0ml/min的流速應(yīng)用于用10倍柱床體積溶于緩沖液B(40mM Tris-HCl pH8.0、10％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1mMEDTA、1mM DTT)的50mM KCl預(yù)平衡的1ml Mono-S柱(Pharmacia)。用10倍體積溶于緩沖液B的50mM KCl清洗柱子。用20倍體積溶于緩沖液B的50mM-1M KCl梯度洗脫逆轉(zhuǎn)錄酶。對(duì)各個(gè)級(jí)分分析RT活性。將包含峰RT活性的級(jí)分在儲(chǔ)存緩沖液(40mM Tris-HCl pH8.0、50％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.1M KCl)中進(jìn)行透析。根據(jù)SDS-PAGE的判斷，純化的逆轉(zhuǎn)錄酶超過(guò)95％純。使用Biorad比色法試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
3種dNTP測(cè)定法對(duì)B.D.Preston等人，Science，2421168，1988的流程進(jìn)行了修改。通過(guò)47聚體模板(5’-GAGTTACAGTGTTTTTGTTCCAGTCTGTAGCAGTGTGTGAATGGAAG-3’)(SEQ IDNO3)與18聚體引物(5’-CTTCCATTCACACACTGC-3’)(SEQ ID NO4)(用T4多核苷酸激酶在5’末端[32P]標(biāo)記)(模板引物為3∶1)的退火來(lái)制備DNA模板-引物。實(shí)驗(yàn)混合液(10μl)含有5nM模板-引物、50-200nM圖例中指定的逆轉(zhuǎn)錄酶、3或4種dNTP(每種250μM)、50mMTris-HCl pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT。將反應(yīng)于37℃保溫30分鐘，然后加入5μl 40mM EDTA、99％甲酰胺終止反應(yīng)。通過(guò)于95℃保溫5分鐘使反應(yīng)產(chǎn)物變性，并通過(guò)尿素6％聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。
為了測(cè)定在3種dNTP實(shí)驗(yàn)的對(duì)照反應(yīng)(使用所有4種dNTP)中是否存在任何TdT活性，重復(fù)對(duì)照反應(yīng)，但改變酶量，由＞600單位至20單位，于37℃保溫30分鐘。對(duì)于SuperScriptTMII、T197E、和Y133A，使用200、100、50、和20單位。對(duì)于F309N，使用646、200、50、和20單位。結(jié)果我們進(jìn)行了F309N(H204R、T306K)SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(以下稱為F309N)的DNA模板錯(cuò)插實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)用于比較突變體與SuperScriptTMII的錯(cuò)摻能力。該實(shí)驗(yàn)就是使用合成DNA模板-引物和只包含4種dNTP之3種的偏倚dNTP集合的引物延伸實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)展示于圖3的凝膠上。在進(jìn)行該流程以篩選具有較低錯(cuò)插/錯(cuò)延率的突變體時(shí)，觀察到SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶越過(guò)模板末端延伸了2-3個(gè)堿基，而且有些突變降低或似乎消除了這種非模板指導(dǎo)的延伸或TdT活性。如圖4所示，在存在所有4種dNTP時(shí)，SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和突變體F309N能夠大致相等的延伸引物，只是SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶越過(guò)模板添加了2個(gè)核苷酸，而F309N越過(guò)模板末端不再添加核苷酸。為了進(jìn)一步評(píng)估這種非模板指導(dǎo)的延伸，用SuperScriptTMII、F309N、T197E、和Y133A逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行3種dNTP錯(cuò)延實(shí)驗(yàn)的對(duì)照反應(yīng)(包含所有4種dTNP)達(dá)30分鐘，但改變酶量。3種突變體在先前篩選中顯示水平降得很低的TdT活性。既然觀察到使用20個(gè)單位的酶時(shí)5分鐘就已經(jīng)超過(guò)足夠完成引物延伸的時(shí)間，那么保溫30分鐘和200-646個(gè)單位的逆轉(zhuǎn)錄酶都大大超過(guò)完成反應(yīng)所必需的量。如圖4所示，使用最低測(cè)試量的所有逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)都具有與使用最高單位濃度的反應(yīng)相似的延伸產(chǎn)物，證明反應(yīng)進(jìn)行完全了。SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶越過(guò)模板末端添加2個(gè)核苷酸，F(xiàn)309N和T197E并不越過(guò)模板末端進(jìn)行延伸，Y133A似乎具有越過(guò)模板1個(gè)核苷酸的少量產(chǎn)物。實(shí)施例4熱穩(wěn)定和TdT雙重突變體M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)中的F309氨基酸位置對(duì)應(yīng)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶中的W266位置。該位置位于拇指結(jié)構(gòu)域的基部，而且被認(rèn)為是與模板-引物小溝相互作用的小溝結(jié)合束的一部分。突變H204R和T306K已顯示增加酶的熱穩(wěn)定性。
與SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶或SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶中的H204R/T306K相比，H204R/T306K克隆中的F309N突變?cè)趯?duì)RNA模板的lacZ正向?qū)嶒?yàn)(表5)中展示低2.3倍的突變頻率，且在3種dNTP延伸實(shí)驗(yàn)中展示較短的延伸產(chǎn)物。這兩項(xiàng)發(fā)現(xiàn)支持具有更高保真度的酶的主張(表6)。
表5M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶高保真突變體的突變頻率構(gòu)建物 總噬斑 突變體噬斑 MF(×10-4)SSII 15689 87 39SSII(H204R、T306K)14410 83 41SSII(H204R、T306K、F309N) 11623 39 17SSII(H204R、T306K、F309N、V223H) 11415 39 14表5SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和點(diǎn)突變體的突變頻率。通過(guò)將突變體噬斑(淺藍(lán)或白色)數(shù)目除以噬斑總數(shù)來(lái)測(cè)定突變頻率(MF)。關(guān)于起始DNA的背景突變體頻率，前3種構(gòu)建物是17×10-4，最后一種構(gòu)建物是20×10-4。
表6M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶高保真突變體的錯(cuò)誤率M-MLV SuperScriptTMII F309N V223H/F309N整體ER(oER)1/17,000 1/15,0001/34,000 1/41,000錯(cuò)配占總ER的％ 46 35 68 72(mER) 1/37,000 1/42,0001/50,000 1/58,000移碼占總ER的％ 46 60 21 22(rER) 1/37,000 1/25,0001/162,000 1/188,000鏈跳躍占總ER的％ 8 5 11 6(jER) 1/213,000 1/297,000 1/324,000 1/690,000方法誘變。如實(shí)施例3所述，使用標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變方案，將包含V223H突變的引物與具有下列突變的SuperScriptTMII的單鏈DNA退火H204R、T306K、F309N。對(duì)菌落測(cè)序以確認(rèn)V223H、H204R、T306K、和F309N的新組合。
選擇包含有活性逆轉(zhuǎn)錄酶的菌落。如實(shí)施例3所述進(jìn)行菌落選擇。
逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的純化。如實(shí)施例3所述進(jìn)行純化。
噬斑測(cè)序。將來(lái)自lacZ正向?qū)嶒?yàn)的噬斑由軟瓊脂平板轉(zhuǎn)移至Whatmann 3MM紙，隨后干燥至少1小時(shí)。然后打孔取出噬斑，并將噬斑/紙片直接加到含有4-8μl ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction(Perkin Elmer)、1μl引物(GAAGATCGCACTCCAGCCAGC)(SEQ ID NO5)、和蒸餾水(總體積20μl)的測(cè)序反應(yīng)混合液中。使用ABI循環(huán)測(cè)序方案96℃10sec、50℃5sec、60℃4min，25個(gè)循環(huán)。除去紙片，并將反應(yīng)物沉淀，然后重懸于上樣染料，并在ABI 377測(cè)序儀上運(yùn)行。
將序列與野生型lacZα序列進(jìn)行比較，然后歸類為移碼(插入或刪除1個(gè)核苷酸)、錯(cuò)配、或鏈跳躍(重復(fù)序列之間的插入或刪除)。通過(guò)將突變頻率除以可檢測(cè)位點(diǎn)(即其改變導(dǎo)致表型變化的位點(diǎn))的數(shù)目(116)乘以0.5(以排除最初單鏈的貢獻(xiàn))、然后乘以觀察到的每一類突變體的百分比來(lái)測(cè)定每一類的整體錯(cuò)誤率。ER＝MF/(可檢測(cè)位點(diǎn)×0.5)×(每一類的％)。
3種dNTP測(cè)定法。如實(shí)施例3所述進(jìn)行3種dNTP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果我們進(jìn)行了F309N(H204R、T306K)SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(以下稱為F309N)和V223H F309N(H204R T306K)(以下稱為V223H/F309N)的DNA模板錯(cuò)插實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)用于比較突變體與SuperScriptTMII的錯(cuò)摻能力。該實(shí)驗(yàn)就是使用合成DNA模板-引物且只含有4種dNTP之3種的偏倚dNTP集合的引物延伸實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)展示于圖5和圖6的凝膠上。在該實(shí)驗(yàn)中，引物延伸效率越高指示保真度越低。如圖5和圖6所示，在存在所有4種dNTP時(shí)，SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和突變體F309N和V223H/F309N能夠大致相等的延伸引物，只是在向引物末端添加非模板指導(dǎo)的核苷酸時(shí)有些不一致。然而，在與核苷酸的偏倚集合一起保溫時(shí)，SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶能夠催化越過(guò)缺乏互補(bǔ)核苷酸的模板核苷酸進(jìn)行顯著延伸，指示使用了錯(cuò)誤核苷酸和保真度降低。在圖5中，F(xiàn)309N突變體(泳道2)在每一種3dNTP偏倚集合中顯示比SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶短的延伸產(chǎn)物，指示摻入錯(cuò)誤核苷酸的能力較低，因而保真度較高。在圖6中，V223H/F309N突變體只在dATP和dCTP集合中延伸。在每種情況中，V223H/F309N也具有比SuperScriptTMII短的延伸產(chǎn)物。這符合lacZα實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中F309N和V223H/F309N突變體具有比SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶低的突變頻率(17×10-4和14×10-4對(duì)39×10-4)。只包含H204R T306K突變但不含F(xiàn)309N突變的逆轉(zhuǎn)錄酶具有與SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶相似的突變頻率(41×10-4對(duì)39×10-4)，說(shuō)明這些突變不影響保真度。這些數(shù)據(jù)顯示了在DNA上進(jìn)行的錯(cuò)插實(shí)驗(yàn)與在RNA上進(jìn)行的lacZα實(shí)驗(yàn)之間的相關(guān)性，其中具有較高保真度的突變體在偏倚dNTP集合中具有較短延伸產(chǎn)物，且在lacZα實(shí)驗(yàn)中具有較低突變頻率。
并非lacZ正向?qū)嶒?yàn)中的所有堿基突變都導(dǎo)致可檢測(cè)的表型變化。為了測(cè)定錯(cuò)配、移碼和跳躍的具體錯(cuò)誤率，需要校正突變頻率，即乘以每一類突變體的總百分比，然后用于測(cè)定具體錯(cuò)誤率。下面是來(lái)自SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真SuperScriptTMII H203R T306KF309N逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)的M13mp19中l(wèi)acZα肽的序列圖譜。下劃線指示刪除；“∧”指示插入上面所示堿基A、T、C、或G；完整序列上面所示A、T、C、或G指示錯(cuò)配。由SuperScriptTMII導(dǎo)入的突變的圖譜T CT T TC CAGCGCAACGC AATTAATGTG AGTTAGCTCA CTCATTAGGC ACCCCAGGCT TTACACTTTA1 1 4CG C CCTGCTTCCGGC TCGTATGTTG TGTGGAATTG TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA1CCCCG CGCTATG ACC ATG ATT ACG^CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG1TAAAAT A AAAT T A AT T T A T ACGTA CCG AGC TCG AAT TCA CTG GCC GTC GTT^TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC CCT GGC7 1 1 1TTTTTTTTTTC TTTTTC TTTA T TTC C C T TC T C T T CG TGTT ACC CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CAT CCC^CCT^TTC^GCC AGC TGG CGT1 4AAT AGCG(SEQ ID NO6)
本說(shuō)明書中提及的所有發(fā)表物、專利和專利申請(qǐng)指示了適合于進(jìn)行本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，并將它們收入本文作為參考，就像明確的且個(gè)別的指示收入每一項(xiàng)個(gè)別發(fā)表物、專利或?qū)＠暾?qǐng)作為參考。
序列表<110>Invitrogen公司法拉第大街1600號(hào)美國(guó)加利福尼亞州Carlsbad市92008<120>熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶及其用途<130>0942.504PC01<140>To Be Assigned<141>Herewith<150>US 09/845,157<151>2001-05-01<150>US 09/808,124<151>2001-03-15<150>US 60/207,196<151>2000-05-26<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2151<212>DNA<213>M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因<220><221>CDS<222>(1)..(2151)<400>1atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act 48Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr1 5 10 15ggt gga cag caa atg ggt cgg gat ctg tac gac gat gac gat aag cat 96Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys His20 25 30atg acc cta aat ata gaa gat gag tat cgg cta cat gag acc tca aaa144Met Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu Tyr Arg Leu His Glu Thr Ser Lys35 40 45gag cca gat gtt tct cta ggg tcc aca tgg ctg tct gat ttt cct cag192Glu Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln50 55 60gcc tgg gcg gaa acc ggg ggc atg gga ctg gca gtt cgc caa gct cct240Ala Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro65 70 75 80ctg atc ata ctt ctg aaa gca acc tct acc ccc gtg tcc ata aaa caa288Leu Ile Ile Leu Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln85 90 95tac ccc atg tca caa gaa gcc aga ctg ggg atc aag ccc cac ata cag336Tyr Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln100 105 110aga ctg ttg gac cag gga ata ctg gta ccc tgc cag tcc ccc tgg aac384Arg Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn115 120 125acg ccc ctg cta ccc gtc aag aaa ccc ggg act aat gat tac agg cct432Thr Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro130 135 140gtc caa gat ctg aga gag gtc aac aaa cgc gta gaa gac atc cac ccc480Val Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro145 150 155 160acc gta ccc aac ccc tac aac ctc ttg agt ggg ctc cca ccg tcc cac528Thr Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His165 170 175cag tgg tac act gtt cta gac tta aaa gat gcc ttt ttc tgc ctg aga576Gln Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg180 185 190ctc cac ccg acg tct cag cct ctc ttc gcc ttt gaa tgg aga gac cca624Leu His Pro Thr Set Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro195 200 205gag atg gga atc tct ggc caa cta acc tgg acc aga ctc cca cag gga672Glu Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly210 215 220ttc aaa aac agt ccc acc ctg ttt gat gag gca ctg cgc aga gac cta720Phe Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu Arg Arg Asp Leu225 230 235 240gca gac ttc cgg atc cag cac cca gac ttg atc ctg cta cag tac gta 768Ala Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val245 250 255gat gac tta ctg ctg gcc gcc act tct gag ctc gac tgc caa caa ggt 816Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly260 265 270act cgg gcc ctg tta caa acc cta gga gac ctc ggg tat cgg gcc tcg 864Thr Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asp Leu Gly Tyr Arg Ala Ser275 280 285gcc aag aaa gcc caa att tgc cag aaa cag gtc aag tat ctg ggg tat 912Ala Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr290 295 300ctt cta aaa gag ggt cag aga tgg ctg act gag gcc aga aaa gag act 960Leu Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr305 310 315 320gtg atg ggg cag cct act ccg aag acc ccg cgg caa cta agg gag ttc 1008Val Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe325 330 335cta ggg acg gca ggc ttc tgt cgc ctc tgg atc cct ggg ttt gca gaa 1056Leu Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu340 345 350atg gca gcc ccc ttg tac cct ctc acc aaa acg ggg act ctg ttt aat 1104Met Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn355 360 365tgg ggc cca gac caa caa aag gcc tat caa gaa atc aag caa gct ctt 1152Trp Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu370 375 380cta act gcc cca gcc ctg ggg ttg cca gat ttg act aag ccc ttt gaa 1200Leu Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu385 390 395 400ctc ttt gtc gac gag aag cag ggc tac gcc aaa ggt gtc cta acg caa 1248Leu Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln405 410 415aaa ctg gga cct tgg cgt cgg ccg gtg gcc tac ctg tcc aaa aag cta 1296Lys Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu420 425 430gac cca gta gca gct ggg tgg ccc cct tgc cta cgg atg gta gca gcc 1344Asp Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala435 440 445att gcc gta ctg aca aag gat gca ggc aag cta acc atg gga cag cca 1392Ile Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro450 455 460cta gtc att ctg gcc ccc cat gca gta gag gca cta gtc aaa caa ccc 1440Leu Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro465 470 475 480ccc gat cga tgg ctt tcc aac gcc cgg atg act cac tat cag gcc ttg 1488Pro Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu485 490 495ctt ttg gac acg gac cgg gtc cag ttc gga ccg gtg gta gcc ctg aac 1536Leu Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn500 505 510ccg gct aca ctg ctc cca ctg cct gag gaa ggg ctg cag cac aac tgc 1584Pro Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys515 520 525ctt gat atc ctg gcc gaa gcc cac gga acc cga ccc gac cta acg gac 1632Leu Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp530 535 540cag ccg ctc cca gac gcc gac cac acc tgg tac acg ggt gga tcc agt 1680Gln Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Gly Gly Ser Ser545 550 555 560ctc ttg caa gag gga cag cgt aag gcg gga gct gcg gtg acc acc gag 1728Leu Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu565 570 575acc gag gta atc tgg gct aaa gcc ctg cca gcc ggg aca tcc gct cag 1776Thr Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln580 585 590cgg gct cag ctg ata gca ctc acc cag gcc cta agg atg gca gaa ggt 1824Arg Ala Gln Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Met Ala Glu Gly595 600 605aag aag cta aat gtt tat acg aat tcc cgt tat gct ttt gct act gcc 1872Lys Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala610 615 620cat atc cat gga gaa ata tac aga agg cgt ggg ttg ctc aca tca gaa 1920His Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu625 630 635 640ggc aaa gag atc aaa aat aag gac gag ata ttg gcc cta cta aaa gcc 1968Gly Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala645 650 655ctc ttt ctg ccc aaa aga ctt agc ata atc cat tgt cca gga cat caa 2016Leu Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln660 665 670aag gga cac agc gcc gag gct aga ggc aac cgg atg gct gac caa gcg 2064Lys Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala675 680 685gcc cga aag gca gcc atc aca gag aat cca gac acc tct acc ctc ctc 2112Ala Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Asn Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu690 695 700ata gaa aat tca tca ccc aat tcc cgc tta att aat taa 2151Ile Glu Asn Ser Ser Pro Asn Ser Arg Leu Ile Asn705 710 715<210>2<211>716<212>PRT<213>M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因<400>2Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr1 5 10 15Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys His20 25 30Met Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu Tyr Arg Leu His Glu Thr Ser Lys35 40 45Glu Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln50 55 60Ala Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro65 70 75 80Leu Ile Ile Leu Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln85 90 95Tyr Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln100 105 110Arg Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn115 120 125Thr Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro130 135 140Val Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro145 150 155160Thr Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His165 170 175Gln Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg180 185 190Leu His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro195 200 205Glu Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly210 215 220Phe Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu Arg Arg Asp Leu225 230 235 240Ala Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val245 250 255Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly260 265 270Thr Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asp Leu Gly Tyr Arg Ala Ser275 280 285Ala Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr290 295 300Leu Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr305 310 315 320Val Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe325 330 335Leu Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu340 345 350Met Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn355 360 365Trp Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu370 375 380Leu Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu385 390 395 400Leu Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln405 410 415Lys Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu420 425 430Asp Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala435 440 445Ile Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro450 455 460Leu Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro465 470 475 480Pro Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu485 490 495Leu Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn500 505 510Pro Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys515 520 525Leu Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp530 535 540Gln Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Gly Gly Ser Ser545 550 555 560Leu Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu565 570 575Thr Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln580 585 590Arg Ala Gln Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Met Ala Glu Gly595 600 605Lys Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala610 615 620His Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu625 630 635 640Gly Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala645 650 655Leu Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln660 665 670Lys Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala675 680 685Ala Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Asn Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu690 695 700Ile Glu Asn Ser Ser Pro Asn Ser Arg Leu Ile Asn705 710 715<210>3<211>47<212>DNA<213>合成構(gòu)建物<400>3gagttacagt gtttttgttc cagtctgtag cagtgtgtga atggaag 47<210>4<211>18<212>DNA<213>合成構(gòu)建物<400>4cttccattca cacactgc 18<210>5<211>21<212>DNA<213>合成構(gòu)建物<400>5gaagatcgca ctccagccag c 21<210>6<211>298<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>6agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta 60tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca120gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg180gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc240gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcg 298
權(quán)利要求
1.經(jīng)修飾或突變而增加或增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。
2.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第52位亮氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第64位酪氨酸；(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第152位賴氨酸；(d)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第204位組氨酸；(e)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第289位甲硫氨酸；和(f)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第306位蘇氨酸。
3.權(quán)利要求2的逆轉(zhuǎn)錄酶，其是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
4.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第52位亮氨酸被脯氨酸替代。
5.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第64位酪氨酸被精氨酸替代。
6.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第152位賴氨酸被甲硫氨酸替代。
7.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第204位組氨酸被精氨酸替代。
8.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第289位甲硫氨酸被亮氨酸替代。
9.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第306位蘇氨酸被賴氨酸或精氨酸替代。
10.權(quán)利要求3的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶在第204位組氨酸和第306位蘇氨酸處具有突變或修飾。
11.權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第204位組氨素被精氨酸替代且第306位蘇氨酸被賴氨酸或精氨酸替代。
12.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其在加熱至50℃達(dá)5分鐘后保留至少50％的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
13.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其在加熱至50℃達(dá)5分鐘后保留至少70％的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
14.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其在加熱至50℃達(dá)5分鐘后保留至少85％的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
15.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其在加熱至50℃達(dá)5分鐘后保留至少95％的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
16.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有選自下組的一項(xiàng)或多項(xiàng)特性(a)降低或顯著降低的RNA酶H活性；(b)降低或顯著降低的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性；和(c)升高的保真度。
17.權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有降低或顯著降低的RNA酶H活性。
18.權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有降低或顯著降低的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性。
19.權(quán)利要求18的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第133位酪氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第197位蘇氨酸；和(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第309位苯丙氨酸。
20.權(quán)利要求19的逆轉(zhuǎn)錄酶，其是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
21.權(quán)利要求20的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第133位酪氨酸被丙氨酸替代。
22.權(quán)利要求20的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第197位蘇氨酸被谷氨酸替代。
23.權(quán)利要求20的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第309位苯丙氨酸被天冬酰胺替代。
24.權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶具有升高的保真度。
25.權(quán)利要求24的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第64位酪氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第116位精氨酸；(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第190位谷氨酰胺；和(d)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第223位纈氨酸。
26.權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶選自下組M-MLV、RSV、AMV、和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。
27.權(quán)利要求26的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶選自下組M-MLVRNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RAVRNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶、和HIV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶。
28.權(quán)利要求26的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
29.權(quán)利要求28的逆轉(zhuǎn)錄酶，其中第524位天冬氨酸被甘氨酸替代，第562位谷氨酸被谷氨酰胺替代，且第583位天冬氨酸被天冬酰胺替代。
30.包含編碼權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸的載體。
31.權(quán)利要求30的載體，其中所述核酸可操作連接啟動(dòng)子。
32.權(quán)利要求31的載體，其中所述啟動(dòng)子選自下組λ-PL啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、ara BAD啟動(dòng)子和trc啟動(dòng)子。
33.包含權(quán)利要求30的載體的宿主細(xì)胞。
34.生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞；(b)表達(dá)所述核酸；并(c)由宿主細(xì)胞分離逆轉(zhuǎn)錄酶。
35.權(quán)利要求34的方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
36.用于逆轉(zhuǎn)錄一種或多種核酸分子的方法，包括(a)將一種或多種核酸模板與一種或多種權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶混合；并(b)在足以生成與所述一種或多種模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的一種或多種第一核酸分子的條件下將(a)的混合物保溫。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述核酸模板是mRNA分子或mRNA分子群。
38.權(quán)利要求37的方法，還包括在足以生成與所述一種或多種第一核酸分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的一種或多種第二核酸分子的條件下將該一種或多種第一核酸分子保溫。
39.依照權(quán)利要求36的方法生成的cDNA分子。
40.依照權(quán)利要求38的方法生成的cDNA分子。
41.用于擴(kuò)增一種或多種核酸分子的方法，包括(a)將一種或多種核酸模板與一種或多種權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶及一種或多種DNA聚合酶混合；并(b)在足以擴(kuò)增與所述一種或多種模板的整個(gè)或部分互補(bǔ)的一種或多種核酸分子的條件下將(a)的混合物保溫。
42.用于將一種或多種核酸分子測(cè)序的方法，包括(a)將一種或多種待測(cè)序核酸分子與一種或多種引物、一種或多種權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸、及一種或多種終止劑混合；(b)在足以合成與所述一種或多種待測(cè)序分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的分子群的條件下將(a)的混合物保溫；并(c)將分子群分開(kāi)以測(cè)定該一種或多種待測(cè)序分子的整個(gè)或部分的核苷酸序列。
43.用于核酸分子的測(cè)序的方法，包括(a)將待測(cè)序核酸分子與一種或多種引物、一種或多種權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種核苷酸、及一種或多種終止劑混合；(b)在足以合成與待測(cè)序分子的整個(gè)或部分互補(bǔ)的分子群的條件下將(a)的混合物保溫；并(c)將分子群的成員分開(kāi)以測(cè)定待測(cè)序分子的整個(gè)或部分的核苷酸序列。
44.用于核酸分子的逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、或測(cè)序的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1的一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶。
45.權(quán)利要求44的試劑盒，還包含選自下組的一種或多種成分一種或多種核苷酸、一種或多種DNA聚合酶、合適的緩沖液、一種或多種引物、及一種或多種終止劑。
46.權(quán)利要求45的試劑盒，其中所述終止劑是雙脫氧核苷酸。
47.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶在對(duì)應(yīng)于選自下組的氨基酸的位置具有一處或多處修飾或突變(a)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第52位亮氨酸；(b)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第64位酪氨酸；(c)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第152位賴氨酸；(d)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第204位精氨酸；(e)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第289位甲硫氨酸；和(f)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的第306位蘇氨酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。一般而言，本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄酶，和用于逆轉(zhuǎn)錄核酸分子(尤其是信使RNA分子)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)突變或經(jīng)修飾增加了熱穩(wěn)定性、降低了末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、和/或增加了保真度的逆轉(zhuǎn)錄酶，和使用這些逆轉(zhuǎn)錄酶或組合物來(lái)進(jìn)行核酸分子(特別是cDNA分子)的生成、擴(kuò)增、或測(cè)序的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)這些方法生成的核酸分子，和這些核酸分子用于生成期望多肽的用途。本發(fā)明還關(guān)注包含這些酶或組合物的試劑盒。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1430670SQ01810163
公開(kāi)日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2001年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月26日
發(fā)明者M·D·史密斯, R·J·波特, G·德哈列沃, G·F·格拉德, K·羅森斯奧 申請(qǐng)人:茵維特羅根公司