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冷凍過程中酶的穩(wěn)定化的制作方法

文檔序號(hào):593243閱讀:437來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:冷凍過程中酶的穩(wěn)定化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的酶制劑的制備。特別是,本發(fā)明涉及在冷凍過程中穩(wěn)定酶的方法。
如果要制備液體形式的試劑,保持穩(wěn)定性就成為主要問題,原因是通常需要儲(chǔ)存和運(yùn)輸試劑。
液體形式的有市售的試劑實(shí)例是那些包括葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的酶,它們需要用比色方法(已知的Trinder方法(Barham和Trinder,Analyst,1972;97142))測(cè)定葡萄糖。需要穩(wěn)定葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶以保證在其貯存期限內(nèi)酶的功能。典型地,用磷酸酯或Tris(羥甲基)氨基甲烷緩沖液來(lái)配制這些酶以保持試劑在儲(chǔ)存和反應(yīng)期間的pH。遇到的一個(gè)困難是在運(yùn)輸過程中或在儲(chǔ)存時(shí)液體制劑經(jīng)常被冷凍,在這些情況下,酶將失活。
因此,需要提供在儲(chǔ)存時(shí)能有效穩(wěn)定診斷試劑、并且如果發(fā)生冷凍能提供進(jìn)一步的保護(hù)的組合物。
US 607106公開了含有αGST酶和兩性離子緩沖液的組合物,其可以儲(chǔ)存于-20℃下。目的是保留αGST的免疫反應(yīng)性,但其中沒有提及保留酶活性。文中提到了辣根過氧化物酶,但僅在用于免疫測(cè)定的酶標(biāo)記的抗-αGST IgG內(nèi)容中出現(xiàn)。在磷酸緩沖鹽溶液中進(jìn)行該酶在溶解狀態(tài)中的穩(wěn)定化。
US 5910422和US 4465770中都描述了采用多糖或長(zhǎng)鏈低聚糖(例如山梨醇)對(duì)特定的酶(分別為α-淀粉酶和尿酶)在溶解狀態(tài)中的穩(wěn)定化過程。兩性離子緩沖液可用來(lái)幫助酶在溶解狀態(tài)中的穩(wěn)定化。
通常,盡管對(duì)于不同的酶在溶解狀態(tài)中的穩(wěn)定化存在各種不同的方法,仍然需要一種在冷凍過程中或之后穩(wěn)定酶活性、尤其是診斷試劑的酶活性的有用方法。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明,在冷凍中過程中穩(wěn)定酶活性的方法包含在兩性離子緩沖液中提供酶。
兩性離子緩沖液具有有效穩(wěn)定液態(tài)酶的能力,并且如果終溶液因意外或其它原因冷凍其還可以提供保護(hù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,酶為葡萄糖氧化酶或辣根過氧化物酶。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面,酶的冷凍溶液處于兩性離子緩沖液中。
不受理論的限制,兩性離子緩沖液穩(wěn)定酶活性的能力可以是緩沖液防止冷凍過程中pH明顯移動(dòng)能力的結(jié)果。已知磷酸緩沖液可以引起冷凍過程中大的pH移動(dòng)(Rose等人Arch.Biochem.Biophys.,1959;81319-329),并且認(rèn)為這會(huì)引起酶的變性。典型地,在緩沖液組合物中,水會(huì)首先冷凍,然后冰晶會(huì)生長(zhǎng)。當(dāng)溫度接近存在的鹽的低共熔點(diǎn)時(shí),鹽結(jié)晶析出。緩沖液中溶解度較小的鹽將首先從溶液中結(jié)晶出來(lái),在冷凍固體形成之前,這會(huì)引起pH值的大幅度變化。然而,兩性離子緩沖液可以防止這種pH移動(dòng),因此能夠使酶穩(wěn)定。
可以用于本發(fā)明的合適緩沖液包括Mops(3-〔N-嗎啉代〕丙磺酸),Mopso(3-[N-嗎啉代]-2-羥基丙磺酸)和Hepes(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])。這些緩沖液均有市售。其它兩性離子緩沖液對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
制備帶有酶的緩沖液對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很容易的,典型地,制備的緩沖液的濃度為20-250mmol/l。優(yōu)選地,所制備的緩沖液的pH為7。
盡管緩沖液可以防止冷凍時(shí)酶的失活,優(yōu)選的是將溶液儲(chǔ)存在4℃下。
緩沖液可以用來(lái)穩(wěn)定任何酶以抵抗冷凍的作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,酶為葡萄糖氧化酶或辣根過氧化物酶。酶可以是存在于緩沖液中的唯一的活性分子。例如,溶液不含某些時(shí)候存在于一些需要過氧化物酶的診斷試劑盒中的甘油三酯或膽固醇。溶液中也可以不含多糖或低聚糖,即蔗糖。
下列實(shí)施例將說(shuō)明本發(fā)明。
20KU/l葡萄糖氧化酶1.6KU/l過氧化物酶11.0mmol/l苯酚0.05%疊氮化鈉0.03%聚乙烯吡咯烷0.77mmol/l 4-氨基安替比林用氫氧化鈉和/或鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7。配方C50mmol/l Mops緩沖液19.5mmol/l磷酸二氫鈉30.5mmol/l正磷酸氫二鈉19.20KU/l葡萄糖氧化酶1.6KU/l過氧化物酶11.0mmol/l苯酚0.04%疊氮化鈉0.03%聚乙烯吡咯烷0.77mmol/l 4-氨基安替比林用氫氧化鈉和/或鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7。
配方D(不含Mops緩沖液的對(duì)照)39mmol/l磷酸二氫鈉61mmol/l正磷酸氫二鈉20KU/l葡萄糖氧化酶1.6KU/l過氧化物酶11.0mmol/l苯酚0.04%疊氮化鈉0.03%聚乙烯吡咯烷0.77mmol/l 4-氨基安替比林用氫氧化鈉和/或鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7。
所有的制劑均在-20℃下冷凍2周,在融化后測(cè)定每種酶的活性。采用Theorell Acta.Chem.Scand.,1950;4;22的方法測(cè)定過氧化物酶的活性。采用Bergmeyer等人,酶促分析,1974;1457(Academic Press)的方法測(cè)定葡萄糖氧化酶的活性。
將這些結(jié)果與用在4℃下儲(chǔ)存2周的同樣試劑得到的結(jié)果進(jìn)行比較。在500nm下測(cè)定試劑的吸收度,在使試劑與100mmol/l的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行反應(yīng)后,獲得了從吸收度測(cè)定的因子。
使制劑也經(jīng)受冷凍和提高溫度的條件,以模仿在試劑裝運(yùn)過程中可能發(fā)生的條件。
使試劑經(jīng)受兩套試驗(yàn)條件;儲(chǔ)存于-20℃或+37℃下。在-20℃或+37℃下,每個(gè)試驗(yàn)周期均為3天,接著在正常的儲(chǔ)存溫度4℃下保持3天。使試劑在每個(gè)試驗(yàn)條件下經(jīng)過3個(gè)循環(huán)。
完成后,通過評(píng)價(jià)線性度以及獲得一套質(zhì)量控制物質(zhì)的正確值的能力來(lái)測(cè)定每種試劑的穩(wěn)定性。
所有的葡萄糖和酶測(cè)定均采用自動(dòng)分析儀進(jìn)行。結(jié)果1)酶活性2周后,在-20℃下對(duì)葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶在所有試劑中的濃度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果列于表1。不含Mops緩沖液的試劑D未發(fā)現(xiàn)有可檢測(cè)到的葡萄糖氧化酶活性存在,并且在冷凍和融化后過氧化物酶的水平降低。其它3個(gè)或僅含有兩個(gè)不同濃度Mops緩沖液或含有組合的Mops和磷酸緩沖液的試劑在冷凍和融化后保留了它們的葡萄糖氧化酶活性和過氧化物酶活性。
表1
2)線性度(表2,3和4)當(dāng)儲(chǔ)存于+4℃下時(shí),所有的配方對(duì)22mmol/l葡萄糖均顯示出線性度。所有含有Mops緩沖液的配方在-20℃下3個(gè)循環(huán)后均保持了它們的22mmol/l的線性度。不含Mops緩沖液的配方D在3個(gè)循環(huán)后失活,并且無(wú)法測(cè)定葡萄糖的濃度。所有配方在+37℃下3個(gè)循環(huán)后均保持了它們的線性度。
表2(+4℃下3個(gè)周期的運(yùn)輸研究)
表3(-30℃下3個(gè)周期的運(yùn)輸研究)
表4(+37℃下3個(gè)周期的運(yùn)輸研究)
3)質(zhì)量控制血清中葡萄糖的回收(表5,6和7)相對(duì)于對(duì)照血清樣品對(duì)配方進(jìn)行了試驗(yàn)。在表中,Precie-Path以及Precie-Norm可從Roche Diagnostics得到,并且多血清樣品可從Randox Laboratories得到。
當(dāng)儲(chǔ)存于4℃下時(shí),所有的配方給出了可接受的值。-20℃下3個(gè)周期后,所有的含有Mops的配方給出的值均在范圍之內(nèi),與儲(chǔ)存于4℃下的對(duì)照試劑相比有小于3%的偏差。+37℃下3個(gè)周期后,對(duì)于每一個(gè)對(duì)照血清來(lái)說(shuō),所有的配方均給出可接受的值。
表5(+4℃下的穩(wěn)定性)
表6(2周時(shí)-20℃下的穩(wěn)定性)
表7(2周時(shí)+37℃下的穩(wěn)定性)
總之,使用作為單獨(dú)的緩沖液或與磷酸緩沖液結(jié)合的Mops緩沖液在冷凍和融化后可保持酶的活性。
權(quán)利要求
1.在冷凍過程中穩(wěn)定酶活性的方法,其中的酶處于兩性離子緩沖液中。
2.權(quán)利要求1中所述的方法,其中的酶為葡萄糖氧化酶或辣根過氧化物酶。
3.權(quán)利要求1或2中所述的方法,其中的兩性離子緩沖液為Mops、Mopso或Hepes。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法,其中的緩沖液以20-250mmol/l的濃度存在。
5.任意前述權(quán)利要求所述的方法,其中溶液的pH為7。
6.任意前述權(quán)利要求所述的方法,其中的溶液儲(chǔ)存于4℃。
7.任意前述權(quán)利要求所述的方法,其中的溶液處于冷凍狀態(tài)。
8.任意前述權(quán)利要求所述的方法,其中的溶液不含任何其它活性成分。
9.包含葡萄糖氧化酶或辣根過氧化物酶以及兩性離子緩沖液的組合物。
10.處于兩性離子緩沖液中的酶的冷凍溶液。
11.權(quán)利要求10中所述的冷凍溶液,其中的酶為葡萄糖氧化酶或辣根過氧化物酶。
全文摘要
一種在冷凍過程中穩(wěn)定酶的方法,其中的酶處于兩性離子緩沖液中。兩性離子緩沖液可以在冷凍和融化過程中保持酶的活性。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1344794SQ0114067
公開日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2001年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月20日
發(fā)明者S·P·菲茨格拉德, J·坎貝爾, J·V·拉蒙特, M·金 申請(qǐng)人:蘭道克斯實(shí)驗(yàn)有限公司
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