專利名稱：生長素釋放肽結(jié)合核酸的制作方法
專利說明生長素釋放肽結(jié)合核酸 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及與生長素釋放肽結(jié)合的核酸和其在制造藥物中的用途以及其在制造診斷劑上的用途。

背景技術(shù)：
生長素釋放肽被鑒定為生長激素促分泌素受體1a(GHSR1a)的天然配體。此受體在腦垂體腺及下丘腦部分中最多，但亦可在其它組織中檢測到低濃度。自70年代后期開始，稱為促分泌素的合成的肽類及其它化合物已顯示出可刺激生長激素釋放。然而，直到1999年發(fā)現(xiàn)生長素釋放肽后才知道負責生長激素釋放的天然配體。生長素釋放肽為一種高度堿性的28個氨基酸的肽激素，其在N-端的第三個氨基酸(絲氨酸3)處具有辛酸側(cè)鏈。此不尋常的修飾對GHS-受體處的相互作用及其活性很重要。然而，在生物樣本中存在著為生物活性生長素釋放肽形式的辛酰基生長素釋放肽與未經(jīng)修飾或去辛?；L素釋放肽二者的混合物。純化的大鼠生長素釋放肽的氨基酸序列經(jīng)測定為GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ.ID.No.2)；該對應(yīng)的人類序列與其僅在二個位置處有所差別，人類序列在氨基酸位置絲氨酸3處攜帶相同的正辛酰基側(cè)鏈且經(jīng)測定為 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ.ID.No.1)。
除了天然正辛?；鶜埢?，引入生長素釋放肽的位置3處的不飽和或分支型辛?；拜^長的脂族鏈也介導(dǎo)受體識別。受體相互作用結(jié)構(gòu)域位于生長素釋放肽的最N端；缺失研究指出最小基序即氨基酸1-5(生長素釋放肽(1-5)[GSSFL])即足夠刺激GHSR1a，但可觀察到對正辛酰基殘基的肽修飾的強烈需求。
生長素釋放肽顯示出介導(dǎo)與合成代謝狀態(tài)相關(guān)的生理功能。其直接刺激垂體腺釋放生長激素(GH)，因此，可為治療肢端肥大病的適合靶標。在嚙齒動物中進行的實驗也顯示出生長素釋放肽通過作用在下丘腦的神經(jīng)元上以GH非依賴性的方式來誘導(dǎo)進食。有趣的是，制造生長素釋放肽的主要部位在胃中的泌酸腺中，表示其是胃、垂體腺及下丘腦間的激素連接。給予大鼠生長素釋放肽后所觀察到的因能量攝取和/或能源利用的改變而造成體重增加的結(jié)果可為生長素釋放肽扮演此角色的支持論點。再者，人類系統(tǒng)性施用生長素釋放肽將引起測試對象的饑餓感而造成過度飲食。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，生長素釋放肽被認為在調(diào)節(jié)食欲及體重中扮演著關(guān)鍵角色，其是作為未飽狀態(tài)的急性及慢性訊號。此假說的其它支持論點來自對胃改道術(shù)后個體的生長素釋放肽水平及食欲降低，因而至少某種程度促成對有效減重程序的效率的觀察。普-韋綜合征患者的臨床數(shù)據(jù)也顯示與該疾病相關(guān)的飲食過量和肥胖是由血中生長素釋放肽極度過多造成。再者，已發(fā)現(xiàn)生長素釋放肽可造成血糖過高并抑制胰島素釋放，此表示其涉及葡萄糖代謝。除了這些能量代謝中的功能外，生長素釋放肽也牽涉多種胃腸道疾病領(lǐng)域中的其它過程，諸如胃部排空及調(diào)節(jié)腸蠕動。再者，也發(fā)現(xiàn)生長素釋放肽表達于多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，且除了刺激垂體腺釋放GH外，還刺激ACTH、PRL及氫化可的松釋放。為健康個體單次注射生長素釋放肽時發(fā)現(xiàn)可增加心臟輸出并降低血壓。因此，生長素釋放肽的作用顯示出涉及多種不同工作。其它涉及此方面的背景資料可在下列文獻中找到M.Kojima，H.Hosoda，Y.Date，M.Nakazato，H.Matsu，K.Kangawa，″Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylatedpeptide from stomach″，Nature 402656-60，1999；M.

D.L.Smiley，M.L.Heiman，″Ghrelin induces adiposity inrodents″，Nature 407908-13，2000；A.M.Wren et al.，″Ghrelin enhances appetite and increa ses food intake in humans″，Journal of Clinical Endocrinology Metabolism 865992-6，2001；M.Nakazato et al.，″A role for ghrelin in the centralregulation of feeding″，Nature 409194-8，2001；N.Nagaya etal.，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2001 May；280(5)R1483-7；Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin inhealthy volunteers；Volante M，et al，J Clin Endocrinol Metab.2002 Mar；87(3)1300-8.Expression of ghrelin and of the GHsecretagogue receptor by pancreatic islet cells and relatedendocrine tumors；Jeffery PL，et al.，J Endocrinol.2002 Mar；172(3)R7-11 Expression and action of the growth hormonereleasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancercell lines；Egido EM et al.，Eur J Endocrinol.2002 Feb；146(2)241-4 Inhibitory effect of ghrelin on insulin andpancreatic somatostatin secretion；Broglio F，et al.，J ClinEndocrinol Metab.2001 Oct；86(10)5083-6，Ghrelin，a naturalGH secretagogue produced by the stomach，induces hyperglycemiaand reduces insulin secretion in humans；Bednarek MA，et al.，J Med Chem.2000 Oct.；434370-6 Structure-function studieson the new growth hormone-releasing peptide，ghrelinminimalsequence of ghrelin necessary for activation of growth hormonesecretagogue receptor 1a。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的基本問題是提供生長素釋放肽的特異拮抗劑。本發(fā)明的基本問題的進一步觀點是提供生長激素促分泌素受體1a(GHSR 1a)的特異拮抗劑。本發(fā)明的基本問題的另一觀點是提供用于分別治療涉及生長素釋放肽及GHSR 1a受體的疾病和病癥的化合物。
本發(fā)明的另一基本問題是提供用于結(jié)合生物活性的生長素釋放肽的手段，更特別的是提供用于治療由生物活性的生長素釋放肽介導(dǎo)的疾病和病癥的方法以及用于特異檢測生物活性的生長素釋放肽的方法。
本發(fā)明的基本問題是在第一方面中通過核酸(優(yōu)選為與生長素釋放肽結(jié)合的核酸)解決，其中該核酸包含 第一片段Box A，及 第二片段Box B， 其中 該第一片段Box A包含約25個連續(xù)核苷酸， 該第二片段Box B包含約6至8個連續(xù)核苷酸， 其中 第一片段Box A的3′-端核苷酸片段與第二片段Box B雜交，其中雜交后形成第一個雙鏈結(jié)構(gòu)，其中此第一個雙鏈結(jié)構(gòu)包含凸起部分(bulge)。
在本發(fā)明的各個及任何方面的實施方案中，該生長素釋放肽為生物活性的生長素釋放肽，更優(yōu)選為辛?；L素釋放肽且最優(yōu)選為正辛?；L素釋放肽。
在一種實施方案中，該雙鏈結(jié)構(gòu)是由第一片段Box A的5個3′-端的連續(xù)核苷酸與第二片段Box B的部分或全部核苷酸(優(yōu)選為第二片段Box B的6至8個連續(xù)核苷酸)所形成。
在一種實施方案中，該凸起部分是由不與該第一片段Box A的5個3′-端的連續(xù)核苷酸堿基配對的第二片段Box B的1至3個核苷酸(優(yōu)選由第二片段Box B的1個核苷酸)所形成。
在一種實施方案中，該凸起部分是由非堿基配對的嘌呤形成，其中該嘌呤優(yōu)選為鳥苷。
在一種較佳的實施方案中，該非堿基配對的嘌呤是由第二片段Box B提供。
在一種實施方案中，該核酸進一步包含第三片段Box C1及第四片段Box C2， 其中該第三片段Box C1包含至少一個核苷酸且 該第四片段Box C2包含至少一個核苷酸，且 其中該第三片段Box C1以其3′-端連接第二片段Box B的5′-端，而第四片段Box C2以其5′-端連接第一片段Box A的3′-端。
在一種較佳的實施方案中，該第三片段Box C1及第四片段Box C2可雜交，其中雜交后形成第二個雙鏈結(jié)構(gòu)。
在一種實施方案中，該第一個雙鏈結(jié)構(gòu)形成第一個螺旋結(jié)構(gòu)。
在一種較佳的實施方案中，該第二個雙鏈結(jié)構(gòu)形成第二個螺旋結(jié)構(gòu)。
在一種更佳的實施方案中，該第二個螺旋結(jié)構(gòu)為螺旋或似螺旋的結(jié)構(gòu)，其包含1至10個堿基對，優(yōu)選為1至3個堿基對，更優(yōu)選為2至3個堿基對。
在一種較佳的實施方案中，該第一個螺旋結(jié)構(gòu)通過第二個螺旋結(jié)構(gòu)延長。
在一種較佳的實施方案中，該第三片段Box C1包含約1至10個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至3個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為2或3個連續(xù)核苷酸。
在一種較佳的實施方案中，該第四片段Box C2包含約1至10個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至3個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為2或3個連續(xù)核苷酸。
在一種較佳的實施方案中，該核酸進一步包含第五片段Box D，其中該第五片段Box D包含至少二個連續(xù)核苷酸。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第五片段Box D包含序列5′-CA。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第五片段Box D包含任何長度的連續(xù)核苷酸，其中該長度選自2、3、4、5和6個連續(xù)核苷酸。
在一種較佳的實施方案中，該第五片段Box D包含序列 5′CA(X)n3′ 其中X為任何核苷酸，其優(yōu)選選自A、G、T、C、U和I， 且其中n為選自0、1、2、3和4的任何整數(shù)。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第五片段Box D是由序列5′CA(X)n3′所組成，其中n＝4。
在一種較佳的實施方案中，該第五片段Box D以其5′-端連接第二片段Box B的3′-端。
在一種較佳的實施方案中，該核酸進一步包含第六片段Box E，其中該第六片段Box E包含至少一個核苷酸。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第六片段Box E包含約1至10個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至4個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為3個連續(xù)核苷酸。
在另一種更優(yōu)選的實施方案中，其中該第六片段Box E的至少一個核苷酸選自U和G。
在一種特別優(yōu)選的實施方案中，其中該U或G核苷酸是直接位于第一片段Box A的5′-端旁。
在一種優(yōu)選的實施方案中，該第六片段Box E以其3′-端連接第一片段Box A的5′-端。
在一種優(yōu)選的實施方案中，該第五片段Box D的3′-端通過第一個間隔子連接第六片段Box E的5′-端。
在一種優(yōu)選的實施方案中，該第四片段Box C2的3′-端通過第二個間隔子連接第三片段Box C1的5′-端。
在一種優(yōu)選的實施方案中，該第一個及第二個間隔子各自分別且獨立地選自親水性間隔子。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該親水性間隔子選自核酸間隔子和非核酸間隔子。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第一個間隔子為核酸間隔子，其包含約1至20個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至5個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為2個連續(xù)核苷酸。
在一種可替換的更優(yōu)選的實施方案中，該第二個間隔子為包含約3至20個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為3至5個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為3個連續(xù)核苷酸的核酸間隔子。在一種甚至更優(yōu)選的實施方案中，該第二個間隔子由ACA或CAA所構(gòu)成。
在另一種可替換的優(yōu)選的實施方案中，該間隔子是非核酸。在其一種特別優(yōu)選的實施方案中，該第一個間隔子和/或第二個間隔子包含至少一個乙二醇部分或數(shù)個這樣的乙二醇部分。
在一種實施方案中，該間隔子的分子量為約172至688Da(優(yōu)選為344Da)。
在一種實施方案中，該核酸為環(huán)狀核酸。
在一種實施方案中，該核酸具有如下的結(jié)構(gòu)
或如下的結(jié)構(gòu)
在一種實施方案中，該第一片段Box A包含下述序列 UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C(SEQ ID No.3)； 其中 X1＝G或A； X2＝A或U； X3＝G或A； X4＝A或C或U；且 X5＝G或A， 優(yōu)選為5′UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC3′(SEQ ID No.4)。
在一種實施方案中，該第二片段Box B包含序列5′GUGAGG 3′。
在一實施方案中，該核酸的序列選自下述的序列 在一種優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列選自下述的序列SEQ ID No.29，SEQ ID No.30，SEQ ID No.33，SEQ ID No.36，SEQ ID No.38，SEQ ID No.39，SEQ ID No.40，SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ IDNo.46，SEQ ID No.47，SEQ ID No.51及SEQ ID No.52。
在一種實施方案中，該核酸可結(jié)合生長素釋放肽，優(yōu)選為人類生長素釋放肽。
在一種優(yōu)選的實施方案中，該生長素釋放肽具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。
在一種實施方案中，該核酸包含修飾。
在一種優(yōu)選的實施方案中，該修飾選自HES部分和PEG部分。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，該修飾為由直鏈或分支PEG所組成的PEG部分，其中該PEG部分的分子量優(yōu)選為約20至120kD，更優(yōu)選為約30至80kD且最優(yōu)選為約40kD。
在一種可替換的更優(yōu)選的實施方案中，該修飾為HES部分，其中該HES部分的分子量優(yōu)選為約10至130kD，更優(yōu)選為約30至80kD且最優(yōu)選為約50kD。
在一種實施方案中，該核酸的核苷酸為L-核苷酸。
在另一種實施方案中，該核酸完全由L-核苷酸所組成。
本發(fā)明的基本問題在第二方面中通過一種藥物組合物解決，其包含如第一方面的核酸且可選擇地包含其它成分，其中該其它成分選自藥學(xué)上可接受的賦形劑及藥學(xué)活性劑。
本發(fā)明的基本問題在第三方面中通過使用根據(jù)第一方面的核酸制造藥物來解決。
本發(fā)明的基本問題在第四種方面中通過使用根據(jù)第一方面的核酸制造診斷工具來解決。
在第三方面的實施方案中，該藥物用于治療和/或預(yù)防選自下列的疾病或病癥肥胖、進食障礙疾患、糖尿病、葡萄糖代謝障礙、腫瘤、血壓失調(diào)、心血管疾病、肢端肥大病、及調(diào)節(jié)能量平衡、食欲、體重及胃腸道疾病。
本發(fā)明的基本問題在第五方面中通過包含生長素釋放肽及根據(jù)第一方面的核酸的復(fù)合物來解決，其中該復(fù)合物優(yōu)選為晶體復(fù)合物。
本發(fā)明的基本問題在第六方面中通過使用根據(jù)第一方面的核酸檢測生長素釋放肽來解決。
本發(fā)明的基本問題在第七方面中通過篩選生長素釋放肽拮抗劑或生長素釋放肽激動劑的方法來解決，該方法包含下列步驟 -提供候選的生長素釋放肽拮抗劑和/或候選的生長素釋放肽激動劑， -提供根據(jù)第一方面的核酸， -提供測試系統(tǒng)，該測試系統(tǒng)在生長素釋放肽拮抗劑和/或生長素釋放肽激動劑的存在下提供信號，及 -測定該候選的生長素釋放肽拮抗劑是否為生長素釋放肽拮抗劑和/或該候選的生長素釋放肽激動劑是否為生長素釋放肽激動劑。
本發(fā)明的基本問題在第八方面中通過篩選生長素釋放肽激動劑和/或生長素釋放肽拮抗劑的方法來解決，該方法包含下列步驟 -提供固定在一種相，優(yōu)選為固相，上的生長素釋放肽， -提供根據(jù)第一方面的核酸，優(yōu)選為經(jīng)標記的根據(jù)第一方面的核酸， -加入候選的生長素釋放肽激動劑和/或候選的生長素釋放肽拮抗劑，及 -測定該候選的生長素釋放肽激動劑是否為生長素釋放肽激動劑和/或該候選的生長素釋放肽拮抗劑是否為生長素釋放肽拮抗劑。
在一種實施方案中，進行該測定法以評估該核酸是否被候選的生長素釋放肽激動劑或候選的生長素釋放肽拮抗劑所置換。
本發(fā)明的基本問題在第九方面中通過一種用于檢測生長素釋放肽的試劑盒來解決，該試劑盒包含根據(jù)第一方面的核酸。
本發(fā)明的基本問題在第十方面中通過利用根據(jù)第八方面的方法獲得的生長素釋放肽拮抗劑來解決。
本發(fā)明的基本問題在第十一方面中通過利用根據(jù)第八方面的方法獲得的生長素釋放肽激動劑來解決。
本發(fā)明基于可產(chǎn)生特異于生長素釋放肽且以高親和力與其結(jié)合的核酸的驚人發(fā)現(xiàn)。更具體地說，令人驚訝地，本發(fā)明人可產(chǎn)生特異結(jié)合生物活性的生長素釋放肽(優(yōu)選為辛?；L素釋放肽，且以正辛?；L素釋放肽為最優(yōu)選)的核酸。
生長素釋放肽為一種具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的堿性肽，且優(yōu)選為經(jīng)脂肪酸側(cè)鏈(優(yōu)選為辛酰基側(cè)鏈，且更優(yōu)選正辛?；鶄?cè)鏈)修飾。人類生長素釋放肽的計算出的生長素釋放肽pI值為11.07，大鼠的生長素釋放肽的pI值為10.56。在一種優(yōu)選的實施方案中，與根據(jù)本發(fā)明的核酸結(jié)合的生長素釋放肽為經(jīng)脂肪酸側(cè)鏈修飾的。在一種可替換的實施方案中，該生長素釋放肽為不具有脂肪酸側(cè)鏈的生長素釋放肽。本文所使用的生長素釋放肽一詞是指任何生長素釋放肽，包括，但不限于哺乳動物生長素釋放肽。優(yōu)選的，該哺乳動物生長素釋放肽選自下列小鼠、大鼠、兔子、倉鼠或人類的生長素釋放肽。最優(yōu)選的，該生長素釋放肽為人類生長素釋放肽。
當發(fā)現(xiàn)可鑒定出對生長素釋放肽具高親和力的核酸時是非常令人驚訝地，因為Eaton等人(Eaton，B.E.；Gold，L.；Hicke，B.J.；Janjic，N.；Jucker，F(xiàn).M.；Sebosta，D.P.；Tarasow，T.M.；Willis，M.C.；Zichi，D.A.；Bioorganic & Medicinal Chemistry，Vol 5，No.6；pp 1087-1096，1997)觀察到一般而言，產(chǎn)生與靶標分子結(jié)合，針對堿性蛋白質(zhì)的適體(aptamer)(即D-核酸)是非常困難的，因為此種靶標會產(chǎn)生高但非特異性的信噪比。此高信噪比來自核酸對堿性靶標(諸如生長素釋放肽)的高非特異性親和力。
甚至更令人驚訝的發(fā)現(xiàn)為盡管生長素釋放肽的總體pI值為強堿性，并且生長素釋放肽的受體結(jié)合基序GSSFL[生長素釋放肽(1-5)]為一種具有pI計算值5.5的相當酸的結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明者利用全長生長素釋放肽鑒定出可特異辨識該肽的酸性受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但不辨識堿性的中央及羧基端結(jié)構(gòu)域的核酸。就靶標分子(即生長素釋放肽)的電荷及核酸的電荷的靜電效果而言，此點頗令人驚訝。帶負電荷的核酸與靶標分子的堿性結(jié)構(gòu)域結(jié)合應(yīng)較核酸與靶標分子的酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合有利得多。因此，必須指出本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員沒有理由期待可成功選擇一個不與生長素釋放肽的堿性部分結(jié)合但與靶標分子的酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核酸配體。
除了具有氨基端受體結(jié)合基序GSSFL外，生物學(xué)上活性的生長素釋放肽(其在此文中也稱為生物活性的生長素釋放肽)的特征優(yōu)選為其在氨基酸絲氨酸3處以正辛酰基?；?。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子(其優(yōu)選為此文所揭示的氨基端基序GSSFL的配體)優(yōu)選能區(qū)分生物學(xué)上活性的生長素釋放肽與生物失活或非生物活性形式的生長素釋放肽。由于結(jié)合完全依賴二種部分(辛酰基及肽)的存在，因此，令人驚訝的是核酸與辛?；L素釋放肽的結(jié)合在1000倍過量的去辛?；L素釋放肽(更優(yōu)選為100倍過量的去辛?；L素釋放肽且最優(yōu)選為10倍過量的去辛?；L素釋放肽)的存在下為特異性結(jié)合。
如此文的優(yōu)選實施方案中所使用的，生物活性的生長素釋放肽為在優(yōu)選的實施方案中基本上顯示出所有天然生長素釋放肽的特征的生長素釋放肽。特別的是，如此文的優(yōu)選實施方案中所使用的生物活性生長素釋放肽為任何促成或可觸發(fā)(更優(yōu)選為經(jīng)由與GHS受體相互作用來促成)生長激素釋放的生長素釋放肽及生長素釋放肽衍生物。相對的，在優(yōu)選的實施方案中，非生物活性的生長素釋放肽為與生物活性的生長素釋放肽不同的生長素釋放肽，更優(yōu)選的為不會觸發(fā)(更優(yōu)選為經(jīng)由與GHS受體相互作用)生長激素釋放。
在一種優(yōu)選的實施方案中，令人驚訝地，本發(fā)明者可產(chǎn)生與生長素釋放肽結(jié)合的核酸，其中該生長素釋放肽為一種生物活性的生長素釋放肽或生物學(xué)上活性的生長素釋放肽，該核酸可區(qū)別在其N端的第三氨基酸(絲氨酸3)處具有辛酰基酸性側(cè)鏈的生長素釋放肽，但其不與缺乏這類辛?；醾?cè)鏈的生長素釋放肽結(jié)合。
此文所描述的根據(jù)本發(fā)明的核酸的特性可在任何使用核酸(不論是單獨使用或在任何組合中使用)的本發(fā)明方面中了解。
不欲受限于任何學(xué)說，本發(fā)明者假定所觀察到的與生長素釋放肽結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的核酸的特異性有一些共有的結(jié)構(gòu)特性(其將于下述內(nèi)容中討論，其中可參考圖20A)。然而，應(yīng)了解的是圖20A具有數(shù)種該結(jié)構(gòu)的特性，該特性不一定實現(xiàn)在本發(fā)明的各個及每一個核酸中。
堿性結(jié)構(gòu)特性為連續(xù)核苷酸的第一個片段(其在此文中也稱為Box A或第一片段Box A)及連續(xù)核苷酸的第二片段(此文中也稱為BoxB或第二片段Box B)。第一片段Box A包含約25個連續(xù)核苷酸，而第二片段Box B包含約6至8個連續(xù)核苷酸。該第一片段Box A的3′端片段與第二片段Box B雜交，其中雜交后形成第一個雙鏈結(jié)構(gòu)，其中此第一個雙鏈結(jié)構(gòu)包含凸起部分。該雙鏈結(jié)構(gòu)是由第一片段Box A的5個3′-端的連續(xù)核苷酸與第二片段Box B的6至8個連續(xù)核苷酸中的一些所形成。該凸起部分是由少至1個，多至3個不與該第一片段BoxA的5個3′-端的連續(xù)核苷酸作堿基配對的核苷酸所形成。因此，該凸起部分可由1、2或3個非堿基配對的核苷酸(優(yōu)選由第二片段Box B提供)所組成。就此凸起部分的大小而言，該第二片段Box B可包含約6至8個連續(xù)核苷酸。更合適的為，該凸起部分是由第二片段Box B內(nèi)、從第二片段Box B的5′-端數(shù)起的非堿基配對的第三個核苷酸所形成，且該第二片段Box B優(yōu)選包含6個連續(xù)核苷酸。
在一種優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸為單一核酸分子。在另一種實施方案中，該單一核酸分子以許多單一核酸分子的形式存在。優(yōu)選的，此文中所使用的核酸及核酸分子二詞可互換使用，如果沒有相反說明。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)意識到本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選由核苷酸所組成，這些核苷酸優(yōu)選通過磷酸二酯鍵彼此共價連接。
另一種重要特性為第二個雙鏈結(jié)構(gòu)。此第二個雙鏈結(jié)構(gòu)是由連續(xù)核苷酸的第三片段(其也稱為Box C1或第三片段Box C1)及連續(xù)核苷酸的第四片段(其也稱為Box C2或第四片段Box C2)所形成。該第三片段Box C1以其3′-端連接第二片段Box B的5′-端，而第四片段BoxC2以其5′-端連接第一片段Box A的3′-端。此第二個雙鏈結(jié)構(gòu)通常形成一種螺旋結(jié)構(gòu)，此文中也稱為第二個螺旋結(jié)構(gòu)。此第二個螺旋結(jié)構(gòu)優(yōu)選為通常由第一個雙鏈結(jié)構(gòu)所形成的螺旋結(jié)構(gòu)的延伸。該第一個雙鏈結(jié)構(gòu)(其優(yōu)選為螺旋結(jié)構(gòu)，此文也稱為第一個螺旋結(jié)構(gòu))的長度是由第一片段Box A及第二片段Box B的長度界定，更精確地說，其是由彼此雜交的該二種Box所界定。由第二個雙鏈結(jié)構(gòu)提供給該第一個螺旋結(jié)構(gòu)的延伸部分為(據(jù)本發(fā)明者目前所知)較穩(wěn)定的種類(但本發(fā)明者并不欲受限于此理論)。第二個螺旋結(jié)構(gòu)是由1至10個堿基對(優(yōu)選為1至3個堿基對且更優(yōu)選為2或3個堿基對)所組成。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員承認如1至3個堿基對這般少的數(shù)目并不一定適合形成螺旋。因此，此文中此種結(jié)構(gòu)也稱為螺旋樣結(jié)構(gòu)(helix-likestructure)，優(yōu)選的，其中這類螺旋樣結(jié)構(gòu)為一種當通過一或數(shù)個堿基對延伸時可產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。
另一種重要的特性為連續(xù)核苷酸的第五片段(此文中也稱為Box D或第五片段Box D)。此額外的片段可改良該核酸的總體結(jié)合。雖然第五片段僅包含至少二個核苷酸，其對生長素釋放肽的結(jié)合的有利影響可通過增加第五片段的長度(優(yōu)選至多6個連續(xù)核苷酸)來進一步改良。再者，若該第五片段在其5′端含有CA二核苷酸且該第五片段具有序列5′CA(X)n3′(其中X為任一種核苷酸且優(yōu)選選自下列A、G、T、C、U和I)時，其將變成特別有效。
根據(jù)本發(fā)明的核酸的另一特色為連續(xù)核苷酸的第六片段，其也稱為Box E或第六片段Box E。優(yōu)選的，該第六片段是由至少一個核苷酸所組成。
從圖20可知不同片段是彼此連接。如其中所描述的，優(yōu)選的，第三片段Box C1及第四片段Box C2各包含1或2個核苷酸(更優(yōu)選為2個核苷酸)，第五片段Box D包含至少2個核苷酸(優(yōu)選為4個核苷酸且最優(yōu)選為6個核苷酸)。
在其中該第三片段Box C1及第四片段Box C2的長度為0的實施方案中，第一片段Box A及第二片段Box B可選擇地通過連接體或間隔子連接，其中這類間隔子可為此文中所揭示的任何間隔子。若未另外指出，此文所使用的″間隔子″及″連接體″一詞可互換使用。
本發(fā)明中，優(yōu)選的，第一片段及第二片段彼此連接(優(yōu)選通過共價鍵)。在一種優(yōu)選的實施方案中，該共價鍵為磷酸二酯鍵。在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第一片段的3′-端連接第二片段的5′-端。
在另一種實施方案中，該第六片段Box E包含1至10個連續(xù)核苷酸(優(yōu)選為1至4個連續(xù)核苷酸且最優(yōu)選為3個連續(xù)核苷酸)。
從這些不同的安排得知，第五片段及第六片段可能彼此連接或不連接，第三及第四片段可能彼此連接或不連接，且第一及第二片段彼此連接或不連接。應(yīng)理解，該連接優(yōu)選通過共價鍵。更優(yōu)選的，該連接是通過親水性間隔子，該親水性間隔子包含至少一個，優(yōu)選為多個乙二醇部分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知多種不同的連接體及間隔子，且可利用如Pils and Micura(Nucleic Acid Research(2000)，28(9)，1859-1863)所描述的下列標準選擇。該連接體不應(yīng)干擾堿基對本身。因此，含有堆疊在末端堿基對上的芳族碳環(huán)的連接體類型并不適合(J.Am.Chem.Soc.(1999)，121，9905-9906；J.Am.Chem.Soc.(1998)，120，11004-11005)。然而，以乙二醇為基礎(chǔ)或從乙二醇衍生的連接體符合此需求，因其具有良好的水溶性及高度的構(gòu)象彈性的優(yōu)點(J.Am.Chem.Soc.(1993)，115，8483-8484；Nucleic AcidsResearch(1993)，21，5600-5603；Biochemistry(1993)，32，1751-1758；Nucleic Acid Research(1990)，18，6353-6359；J.Am.Chem.Soc.(1997)，119，11591-11597)。優(yōu)選的，該間隔子包含一或數(shù)個乙二醇部分或是由其組成，其中氧被CH2、磷酸或硫所替換或取代。
根據(jù)這些連接選擇，可實現(xiàn)下列結(jié)構(gòu)
或
最后，本發(fā)明也包含實現(xiàn)了一種圖20D中所述的根據(jù)本發(fā)明的核酸的完全封閉(即環(huán)形)結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的核酸也可包含與此文所揭示的特定序列基本上同源的核酸?；旧贤匆辉~應(yīng)被理解為至少75％，優(yōu)選為85％，更優(yōu)選為90％，最優(yōu)選為超過95％、96％、97％、98％或99％同源。
本發(fā)明的核酸或根據(jù)本發(fā)明的核酸一詞也應(yīng)包括那些包含此文所揭示的核酸序列或其部分的核酸，優(yōu)選的，該核酸或該部分涉及與生長素釋放肽結(jié)合，更優(yōu)選的該核酸可區(qū)別生物活性的生長素釋放肽與非生物活性的生長素釋放肽，即尤其是區(qū)別辛?；L素釋放肽與去辛?；L素釋放肽。這類核酸可從此文所揭示的核酸衍生，如通過截短衍生。截短可能與此文所揭示的核酸的任一端或兩端有關(guān)。再者，截短可能與核苷酸的內(nèi)部序列有關(guān)，即其可能與介于5′及3′端的核苷酸間的核苷酸有關(guān)。再者，截短應(yīng)包含從此文所揭示的核酸序列刪除少至單一核苷酸。截短也可能與超過一個本發(fā)明核苷酸的片段有關(guān)，其中該片段可為少至一個核苷酸的長度。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可為D-核酸或L-核酸。優(yōu)選的，本發(fā)明的核酸為L-核酸。另外，也可能為核酸的一或數(shù)個部分以D-核酸的形式存在或核酸的至少一或數(shù)個部分為L-核酸。核酸的″部分″一詞應(yīng)指少至一個核苷酸。此文中，這類核酸通常分別指D-及L-核酸。因此，在一種特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸由L-核酸所組成且包含至少一個D-核苷酸。這類D-核苷酸優(yōu)選連接與界定根據(jù)本發(fā)明核酸的片段不同的部分，優(yōu)選的核酸本身的那些涉及與核酸的其它部分相互作用的部分。優(yōu)選的，這類D-核苷酸分別連接任何片段及根據(jù)本發(fā)明的任何核酸的終端。在另一種優(yōu)選的實施方案中，這類D-核苷酸可作為間隔子或連接體，優(yōu)選的，連接修飾部分(諸如PEG和HES)與根據(jù)本發(fā)明的核酸。
本發(fā)明也包括根據(jù)本發(fā)明的核酸為較長核酸的一部分，其中此較長的核酸包含數(shù)個部分，其中至少一部分為根據(jù)本發(fā)明的核酸或其部分。這些較長核酸的其它部分可為D-核酸或L-核酸。任何組合均可用于本發(fā)明中。這些較長核酸的其它部分可顯示與結(jié)合不同的功能，優(yōu)選與生長素釋放肽的結(jié)合無關(guān)。一種可能的功能是容許與其它分子相互作用，其中這類其它分子優(yōu)選與生長素釋放肽不同，諸如用于固定、交聯(lián)、檢測或擴增。
此文所描述的L-核酸由L-核苷酸所組成，優(yōu)選全部由L-核苷酸所組成。
此文所描述的D-核酸由D-核苷酸所組成，優(yōu)選全部由D-核苷酸所組成。
不論本發(fā)明的核酸是否由D-核苷酸、L-核苷酸或此二者的組合(該組合為，如隨機的組合或界定的片段的序列，該片段是由至少一個L-核苷酸及至少一個D-核苷酸所組成)所組成，該核酸可由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其組合所組成。
將本發(fā)明的核酸設(shè)計成L-核酸較為有利的理由有數(shù)種。L-核酸為天然核酸的對映體。然而，由于核酸酶廣泛存在，D-核酸在水溶液中并非很穩(wěn)定，尤其是在生物系統(tǒng)或生物樣本中。天然核酸酶(尤其是來自動物細胞的核酸酶)無法將L-核酸降解。因此，L-核酸的生物半衰期在這類系統(tǒng)(包括動物及人體)中顯著增加。由于缺乏L-核酸的降解力，因而不會產(chǎn)生核酸酶降解產(chǎn)物，因此，不會觀察到由此產(chǎn)生的副作用。此方面確定所有其它確實可用于治療涉及生長素釋放肽的疾病和/或病癥的化合物的L-核酸的范圍。通過與Watson Crick堿基配對不同的機制而特異結(jié)合靶標分子的L-核酸，或那些部分或完全由L-核苷酸所組成的適體(尤其是那些參與適體與靶標分子結(jié)合的適體部分)也稱為spiegelmers。
本發(fā)明也包括本發(fā)明的核酸(不論其是否為D-核酸、L-核酸或D，L-核酸的形式或其是否為DNA或RNA的形式)可以單鏈或雙鏈核酸的形式存在。通常，本發(fā)明的核酸為單鏈核酸(其顯示由一級序列所決定的確定的二級結(jié)構(gòu))，因此也可形成三級結(jié)構(gòu)。然而，本發(fā)明的核酸也可為雙鏈核酸，意指該彼此互補或部分互補的雙鏈彼此雜交。此提供該核酸穩(wěn)定性，若該核酸是以天然D-型而非L-型存在，則此點特別有利。
本發(fā)明的核酸可加以修飾。這類修飾可能與核酸的單一核苷酸有關(guān)且為本領(lǐng)域所熟知。這類修飾的實例描述于，尤其是下列文獻中Venkatesan N.etal.(2003)Curr Med Chem.Oct；10(19)1973-91；Kusser，W.(2000)J Biotechnol，7427-38；Aurup，H.et al.(1994)Nucleic Acids Res，22，20-4；Cummins，L.L.et al，(1995)NucleicAcids Res，23，2019-24；Eaton，B.E.et al.(1995)Chem Biol，2，633-8；Green，L.S.et al.，(1995)Chem Biol，2，683-95；Kawasaki，A.M.et al.，(1993)J Med Chem，36，831-41；Lesnik，E.A.et al.，(1993)Biochemistry，32，7832-8；Miller，L.E.et al.，(1993)J Physiol，469，213-43。這類修飾可為在組成該核酸的核苷酸個體的2′位置處的H原子、F原子或O-CH3基團或NH2基團。再者，根據(jù)本發(fā)明的核酸可包含至少一個LNA核苷酸。在一種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸由LNA核苷酸所組成。
在一種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸可為多部分核酸(multipartite nuclei acid)。此文所使用的多部分核酸是指由至少二條核酸鏈所組成的核酸。此至少二條核酸鏈形成功能單位，其中該功能單位為靶標分子的配體。該至少二條核酸鏈可通過將核酸裂解以產(chǎn)生二條鏈或可通過合成對應(yīng)于本發(fā)明的第一部分的一個核酸(即總體核酸)及另一對應(yīng)于總體核酸的第二部分的核酸而從任何本發(fā)明的核酸衍生。裂解及合成法二者均可用來產(chǎn)生多部分核酸，此種核酸中具有超過二條如上述例示的鏈。換言之，該至少二條核酸鏈通常與彼此互補且雜交的兩條鏈不同(但不同的核酸部分之間仍可能存在某種程度的互補性)。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的核酸顯示出非常良好的Kd值范圍。更特別地，包含(除了完整Box A及Box B外)各具有最少二個核苷酸的Box C1及Box C2、具有最少六個核苷酸的Box D及具有最少三個核苷酸的Box E的寡核苷酸(例如SOT-E)對生長素釋放肽顯示出較SOT-C好六倍的結(jié)合親和力。
確定結(jié)合常數(shù)的一種可能方法是使用稱為拜爾可(Biocore)的裝置，此也為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知。此文所使用的親和力也通過實施例中所描述的″平衡分析″測量。用來表示根據(jù)本發(fā)明的核酸與靶標(此處為生長素釋放肽)間的結(jié)合強度的合適度量值稱為Kd值，此值與其測量方法為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知。
根據(jù)本發(fā)明的核酸的特征為一定的Kd值。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的核酸所顯示的Kd值低于1μM。約1μM的Kd值為核酸對靶標的非特異結(jié)合的特征。本領(lǐng)域的人士認為一組化合物(諸如根據(jù)本發(fā)明的核酸)的Kd值是在某一范圍內(nèi)。上述約1μM的Kd值為Kd值的優(yōu)選上限。與靶標結(jié)合的核酸的Kd值的優(yōu)選下限為10pM或更高。本發(fā)明包括與生長素釋放肽結(jié)合的核酸個體的Kd值優(yōu)選在此范圍內(nèi)。優(yōu)選的范圍可通過選擇此范圍內(nèi)的任何第一個數(shù)字及此范圍內(nèi)的任何第二個數(shù)字來界定。優(yōu)選的上限值為0.25μM、0.1μM及0.01μM，優(yōu)選的下限值為100nM、10nM、1nM及0.05nM。
根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可具有任何長度，只要其仍可結(jié)合靶標分子并區(qū)分生物活性的生長素釋放肽與非生物活性的生長素釋放肽，即優(yōu)選的，區(qū)分辛?；L素釋放肽與去辛?；L素釋放肽。本領(lǐng)域承認根據(jù)本發(fā)明的核酸具有優(yōu)選的長度。通常，該長度是介于15至120個核苷酸之間。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員承認根據(jù)本發(fā)明的核酸的可能長度是介于15至120個核苷酸間的任何數(shù)目的核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的核酸的長度的更優(yōu)選范圍是介于約20至100個核苷酸之間、約20至80個核苷酸之間、約20至60個核苷酸之間、約20至50個核苷酸之間及約30至50個核苷酸之間。
本發(fā)明也包括此文所揭示的核酸包含部分(moiety)，優(yōu)選為高分子量的部分和/或優(yōu)選的，該部分容許修飾核酸特性，尤其是，在動物體內(nèi)(優(yōu)選為人體)的停留時間。這類修飾的特別優(yōu)選實施方案為將根據(jù)本發(fā)明的核酸PEG化及HES化。此處使用PEG代表聚(乙二醇)，HES代表羥乙基淀粉。此文所使用的PEG化優(yōu)選為修飾根據(jù)本發(fā)明的核酸，其中這類修飾包含連接根據(jù)本發(fā)明的核酸的PEG部分。此文所使用的HES化優(yōu)選為修飾根據(jù)本發(fā)明的核酸，其中這類修飾包含連接根據(jù)本發(fā)明的核酸的HES部分。這些修飾及利用這類修飾來修飾核酸的過程描述于歐洲專利申請案EP 1 306 382號(其公開內(nèi)容全部并入本文作為參考)中。
優(yōu)選的，尤其是在PEG這類高分子量部分的情況中，包含或由高分子量部分組成的修飾部分的分子量是約2000至200,000Da(優(yōu)選為40,000至120,000Da)，尤其是，在HES這類高分子量部分的情況中，修飾部分的分子量是約3000至100,000Da，以5,000至60,000Da更優(yōu)選。HES修飾的方法，如描述于德國專利申請案DE 1 2004 006249.8(其公開內(nèi)容全部并入本文作為參考)中。
不欲受限于任何學(xué)說，以高分子量部分(諸如聚合物，更特別的是此文所揭示的聚合物，且優(yōu)選為生理學(xué)上可接受)修飾根據(jù)本發(fā)明的核酸時似乎改變排出動力學(xué)。更特別的是，似乎由于這類經(jīng)修飾的本發(fā)明核酸的分子量增加且由于核酸不被代謝(尤其是為L型時)因而減少其從動物體內(nèi)(優(yōu)選為從哺乳動物體內(nèi)，更優(yōu)選為從人體內(nèi))排出來。由于排出通常是經(jīng)由腎臟，本發(fā)明者假設(shè)與不具有此種高分子量修飾部分的核酸相較下，此種經(jīng)修飾的核酸的腎小球過濾速率顯著降低(其造成在體內(nèi)的停留時間增加)。因此，尤其值得注意的是盡管具有這類高分子量的修飾部分，根據(jù)本發(fā)明的核酸的特異性不會以有害的方式受到影響。根據(jù)本發(fā)明的核酸具有此令人驚訝的特性(此特性通常無法期待自藥學(xué)化合物取得)，這使得提供持續(xù)釋放時不一定需要可提供持續(xù)釋放的藥物制劑。更確切地說，包含高分子量部分的根據(jù)本發(fā)明的核酸的修飾型可因此直接以持續(xù)釋放的制劑形式使用。
然而，本發(fā)明也包含此文所揭示的核酸不包含任何修飾，尤其是無高分子量修飾，諸如PEG化及HES化。當需要在給藥后令核酸從體內(nèi)快速清除時尤其需要這類實施方案。在使用根據(jù)本發(fā)明的核酸或含此種核酸的藥物的活體內(nèi)造影或暫時性壓抑食欲的情況中可能需要這類快速清除。
本發(fā)明的核酸(此文中稱為根據(jù)本發(fā)明的核酸)和/或根據(jù)本發(fā)明的拮抗劑可用來生產(chǎn)或制造藥物。這類藥物包含至少一種本發(fā)明的核酸，可選擇地加上其它藥學(xué)活性化合物，其中該本發(fā)明的核酸優(yōu)選本身作為藥學(xué)活性化合物。在優(yōu)選的實施方案中，這類藥物包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體。這類載體可為，例如水、緩沖劑、PBS、葡萄糖溶液(優(yōu)選為5％葡萄糖鹽平衡溶液)、淀粉、糖、明膠或任何其它可接受的載體物質(zhì)。這類載體為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員普遍所知。
在另一種實施方案中，該藥物包含另外的藥學(xué)活性劑。這類另外的藥學(xué)活性化合物可為那些已知可降低食欲者，優(yōu)選選自下列PYY3-45、CCK、瘦素及胰島素?；蛘撸蚋郊拥兀@類另外的藥學(xué)活性劑為另一種根據(jù)本發(fā)明的核酸?；蛘撸撍幬镏辽龠€包含一種與生長素釋放肽不同的靶標分子結(jié)合的核酸或顯示出與根據(jù)本發(fā)明的核酸不同的功能的核酸。在一種實施方案中，這類核酸與缺乏辛酸部分的生長素釋放肽結(jié)合。
可使用這類藥物治療和/或預(yù)防的疾病和/或病癥和/或疾病狀態(tài)包括，但不限于肥胖、調(diào)節(jié)能量平衡、食欲及體重、進食障礙疾患、胃腸道疾病、糖尿病、葡萄糖代謝、腫瘤、血壓、心血管疾病、肢端肥大病以及其它GH失衡。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所承認本發(fā)明的核酸可確實用于任何其中可將生長素釋放肽拮抗劑施用給有此需要的患者的疾病中，這類拮抗劑適合用來排除疾病或病癥的原因，或至少減輕該疾病或病癥的作用。這類作用包括，但不限于肥胖、調(diào)節(jié)能量平衡、食欲及體重、進食障礙疾患、胃腸道疾病、糖尿病、葡萄糖代謝、腫瘤治療、血壓、心血管疾病、肢端肥大病以及其它GH失衡。根據(jù)本發(fā)明的核酸在這些及其它疾病或病癥方面的可應(yīng)用性是來自(尤其是)本專利說明書引言部分所概述的生長素釋放肽涉及的事項。為本發(fā)明的目的，能量平衡的調(diào)節(jié)被視為一種疾病。更特別地，該用途是用于治療任何其中調(diào)節(jié)能量平衡受到生長素釋放肽影響(直接或間接)且其中需要降低生長素釋放肽的生物利用度的疾病。同樣地，其可應(yīng)用在葡萄糖代謝、血壓、食欲及體重。其它可利用根據(jù)本發(fā)明的核酸治療的疾病(可能應(yīng)用在系統(tǒng)或局部治療)為選自下列的疾病垂體腫瘤、肢端肥大病、中樞庫興(Cushing)綜合征、腎上腺庫興綜合征、副腫瘤性庫興綜合征、異位性庫興綜合征、腎上腺腫瘤、壓力、皮質(zhì)醇增多癥、心機能不全、心肌梗塞、中風、腎上腺皮質(zhì)機能不全、肌張力減退、主動脈狹窄、高肺壓、縮窄性心包炎、感染性疾病、感染性毒性張力減退、低血容量及低血鈉癥。
如此文所使用者，可利用根據(jù)本發(fā)明的核酸治療的胃腸道疾病包含胃部疾病及病癥、腸疾病及病癥、結(jié)腸病癥及疾病和胃及結(jié)腸運動性的調(diào)節(jié)。在一種優(yōu)選的實施方案中，腸病癥及腸疾病包含炎性腸疾病。更優(yōu)選的炎性腸疾病為潰瘍性結(jié)腸炎及克羅恩病。根據(jù)本發(fā)明的核酸用于治療此種疾病的適合性來自生長素釋放肽參與所述疾病，如下列文獻中所描述Karmiris K et al.(Karmiris K，KoutroubakisIE，Xidakis C，Polychronaki M，Voudouri T，Kouroumalis EA.Circulating levels of leptin，adiponectin，resistin，andghrelin in inflammatory bowel disease.Inflamm Bowel Dis.2006Feb；12(2)100-5)，Tebbe JJ et al.(Tebbe JJ，Mronga S，TebbeCG，Ortmann E，Arnold R，Schafer MK。由生長素釋放肽造成的對結(jié)腸推進的刺激依賴下丘腦神經(jīng)肽Y1釋放因子1受體及促皮質(zhì)素釋放因子1受體的活化。J Neuroendocrinol.2005 Sep；17(9)570-6)and Fukuda H.et al.(Fukuda H，Mizuta Y，Isomoto H，TakeshimaF，Ohnita K，Ohba K，Omagari K，Taniyama K，Kohno S.Ghrelinenhances gastric motility through direct stimulation ofintrinsic neural pathways and capsaicin-sensitive afferentneurones in rats.Scand J Gastroenterol.2004 Dec；39(12)1209-14)。
Kobelt et al.(Kobelt P，Helmling S，Stengel A，Wlotzka B，Andresen V，Klapp BF，Wiedenmann B，Klussmann S，Monnikes H.Anti-ghrelin SPIEGELMER NOX-B11 inhibits neurostimulstory andorexigenic effects of peripheral ghrelin in rats.Gut.2005 Jun30，Epub ahead of print)發(fā)表的刊物報導(dǎo)在施用抗生長素釋放肽Spiegelmer NOX-B11時，由外周生長素釋放肽所引起的劑量依賴性的短期食物攝取量減少。更具體地說，與載體/載體組(1.13±0.59克/公斤-體重，p＜0.0002)相較下，以PBS及3nmol生長素釋放肽(載體/生長素釋放肽組)治療的陽性對照組在腹膜內(nèi)注射(4.94±0.63克/公斤-體重)后的前半小時內(nèi)顯著增加食物攝取(Kobelt，等人(同上)的圖2A)。以30nmol Spiegelmer NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)預(yù)先治療可阻斷生長素釋放肽對攝取食物的刺激(0.58±0.58克/公斤-體重；p＜0.0001)(Kobelt，等人(同上)的圖2A)。相反的，施用由隨機序列組成的對照Spiegelmer并無這類抑制效果，使得由生長素釋放肽引起的攝取食物的刺激仍然完整(4.77±0.66克/公斤-體重；p＞0.864)(Kobelt，等人(同上)的圖2A)。
NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)對攝取食物的抑制作用證明為絕對的劑量依賴性。1nmol劑量的Spiegelmer NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)對由生長素釋放肽引起的食物攝取刺激并無作用(Kobelt，等人(同上)的圖2A)。10nmol NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)的劑量可觀察到中等效果在此劑量水平下，3nmol生長素釋放肽在前30分鐘的刺激作用為適中(3.51±0.66克/公斤-體重對4.94±0.63克/公斤-體重，相對于單獨的生長素釋放肽，p＞0.159)(Kobelt，等人(同上)的圖2A)。
由Shearman et al.(Shearman LP，Wang SP，Helmling S，Stribling DS，Mazur P，Ge L，Wang L，Klussmann S，Macintyre DE，Howard AD，Strack AM.Ghrelin Neutralisation by a RibonucleicAcid-SPM Ame liorates Obesity in Diet-Induced Obese Mic.；Endocrinology.2006Mar；147(3)1517-26.Epub 2005 Dec 8)發(fā)表的刊物報導(dǎo)當給予由飲食引起肥胖(DIO)的小鼠抗生長素釋放肽Spiegelmer NOX-B11-2(SOT-D-109)時，其體重減輕且食物攝取量減少。更具體地說，與對照組相較下，輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)可引起體重減少(見Shearman，等人(同上)的圖4A)。與經(jīng)載體處理的小鼠相較下，輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)可在第1-10天及第12天觀察到顯著的體重減少；與輸注Spiegelmer的對照組(對照組SPM)相較下，可在第1-13天觀察到體重減少(相對于載體組或?qū)φ战MSPM，p＜0.05)。第13天前，輸注NOX-B11-2的小鼠體重平均增加0.32克，而接受對照組Spiegelmer者，體重平均增加1.85克，而那些接受載體者，體重平均增加0.91克。再者，輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)顯著減少食物攝取量(見Shearman，等人(同上)的圖4B)。與載體組相較下，在第1-8天可觀察到對累積的食物攝取量有顯著效果，與對照組Spiegelmer組相較下，在第1-13天可觀察到對累積的食物攝取量有顯著效果(第13天為39.33克對42.61克；p＜0.05)(Shearman，等人(同上)的圖4C)。另外，在第1-5天及6-13天計算喂食效率(每食入千卡所增加的體重)(其為表示用來增加身體質(zhì)量的食物能量的效率如何的指標)(見Shearman，等人(同上)的圖4D)。輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)后第1-5天可觀察到喂食效率降低，但在第6-13天則無法觀察到此作用，這表示暫時減少體重增加并不僅因為減少食物攝取。另外，以NOX-B11-2(SOT-D-109)治療時可改變DIO小鼠的身體組成(Shearman，等人(同上)的圖4E)。與瘦肉含量不變相反，輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)的小鼠的脂肪質(zhì)量含量減少，即使在校正總體重后(Shearman，等人(同上)的圖4F)。輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)不會改變白色脂肪組織儲存重量，而輸注對照Spiegelmer不會改變身體組成或白色脂肪組織重量。
在利用DIO生長素釋放肽缺陷小鼠及野生型小鼠，以NOX-B11-2(SOT-D-109)進行的長期輸注研究中，當將NOX-B11-2(SOT-D-109)輸注給野生型小鼠時可在第1至6天觀察到明顯的體重減輕(見Shearman，等人(同上)的圖5A)。相反的，NOX-B11-2(SOT-D-109)不會改變Ghr1-/-小鼠的體重(見Shearman，等人，同上，圖5B)。另外，輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)會減少野生型小鼠第1天的日食物攝取量(見Shearman，等人(同上)的圖5C)。輸注NOX-B11-2(SOT-D-109)不會改變Ghr1-/-小鼠的食物攝取量(見Shearman，等人(同上)的圖5D)。
本發(fā)明也包含替換地或額外地使用藥物，以原則上預(yù)防所揭示的任何與使用該藥物治療的有關(guān)疾病。用于此的各別標記選自下列心血管風險因子(例如膽固醇及低有氧活性)及一般需要管理體重的因子。
原則上，根據(jù)本發(fā)明的藥物可以任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的形式施用。優(yōu)選的施用途徑為系統(tǒng)性施用，以經(jīng)由注射途徑施用更優(yōu)選?；蛘撸蓪⑺幬锞植渴┯?。其它施用途徑包含肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)及皮下、per orum或鼻內(nèi)，優(yōu)選的施用途徑為最不具侵入性但可確保功效的途徑。
本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物。這類藥物組合物包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸及優(yōu)選的，包含藥學(xué)上可接受的結(jié)合劑。這類結(jié)合劑可為任何本領(lǐng)域所使用和/或已知的結(jié)合劑。更特別地，這類結(jié)合劑為任何與制造此文所揭示的藥物有關(guān)的結(jié)合劑。在另一種實施方案中，該藥物組合物包含另外的藥學(xué)活性劑。
本發(fā)明也包含此文所描述的構(gòu)成此文所揭示的藥物組合物的藥物。
本發(fā)明的另一方面涉及用于治療需要此種治療的個體的方法，其中該方法包含施用至少一種藥學(xué)活性量的根據(jù)本發(fā)明的核酸。在一種實施方案中，該個體患有疾病或處于發(fā)展這類疾病的風險中，其中該疾病為任何此文所揭示的疾病，尤其是所揭示的那些與可用來制造藥物的本發(fā)明核酸的用途有關(guān)的任何疾病。
需了解該根據(jù)本發(fā)明的核酸及拮抗劑不僅可作為藥物或用來制造藥物，也可用于美容目的，尤其是與生長素釋放肽在肥胖方面所涉及部分有關(guān)。為了相同的目的和/或相同理由，根據(jù)本發(fā)明的核酸及拮抗劑可作為食品添加劑，控制體重的手段、控制食欲的手段和/或診斷劑。含有根據(jù)本發(fā)明的核酸及拮抗劑的組合物可用于任何上述目的。
優(yōu)選的，此文所使用的診斷或診斷劑或診斷工具適合檢測(直接或間接)生長素釋放肽(優(yōu)選為此文所描述的生長素釋放肽且更優(yōu)選為與此文所描述的不同病癥或疾病相關(guān)的生長素釋放肽)。該診斷劑適合分別用于檢測和/或追蹤此文所描述的任何病癥或疾病。這類檢測可能通過根據(jù)本發(fā)明的核酸與生長素釋放肽結(jié)合。這類結(jié)合可被直接或間接檢測。該相關(guān)方法及手段為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知。尤其是，根據(jù)本發(fā)明的核酸可包含可令根據(jù)本發(fā)明的核酸(優(yōu)選為與生長素釋放肽結(jié)合的核酸)被檢測到的標記。這類標記優(yōu)選選自下列放射活性標記、酶標記及熒光標記。原則上，所有研發(fā)出的用于抗體的已知分析均可用于根據(jù)本發(fā)明的核酸，但應(yīng)將該與靶標結(jié)合的抗體替換成與靶標結(jié)合的核酸。在使用未標記的與靶標結(jié)合的抗體的抗體分析中，優(yōu)選通過二級抗體(其經(jīng)放射活性標記、酶標記及熒光標記修飾)并與該結(jié)合靶標的抗體的Fc片段結(jié)合來完成檢測。在核酸(優(yōu)選為根據(jù)本發(fā)明的核酸)的情況中，該核酸優(yōu)選以選自下列的這類標記修飾生物素、Cy-3及Cy-5，且標記是通過針對這類標記的抗體(如抗-生物素抗體、抗-Cy-3抗體或抗-Cy-5抗體)檢測，或者，在該標記為生物素的情況中，該標記是通過鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白(其天然與生物素結(jié)合)檢測。這類抗體、鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白優(yōu)選以各自的標記(如放射活性標記、酶標記或熒光標記)修飾(如同二級抗體)。
在另一種實施方案中，該根據(jù)本發(fā)明的核酸分子通過第二種檢測手段檢測或分析，其中該檢測手段為分子信標。分子信標的方法學(xué)為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知。簡單地說，核酸探針(也稱為分子信標)與欲檢測的核酸樣本反向互補并因此與欲檢測的核酸樣本的一部分雜交。當與核酸樣本結(jié)合時，該分子信標的熒光基團分開，使熒光信號改變(優(yōu)選為強度改變)。此改變與核酸樣本存在量相關(guān)。
用于區(qū)分根據(jù)本發(fā)明生物活性及非生物活性的生長素釋放肽的分析可利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的標準技術(shù)執(zhí)行。需了解這類分析也可用來檢測生長素釋放肽(優(yōu)選為將在下文中概述的生物活性的生長素釋放肽)。
本領(lǐng)域承認使用根據(jù)本發(fā)明的核酸檢測生長素釋放肽特別容易檢測到如此文所定義的生物活性的生長素釋放肽。另外，生物活性的生長素釋放肽可分開檢測，因此可通過(尤其是)下列程序區(qū)別去辛?；L素釋放肽，其中其它程序?qū)Ρ绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是明白清楚的。
涉及檢測生物活性的生長素釋放肽的優(yōu)選方法包含下列步驟 (a)提供欲檢測是否存有生物活性的生長素釋放肽的樣本， (b)提供根據(jù)本發(fā)明的核酸， (c)將樣本與核酸反應(yīng)，優(yōu)選在反應(yīng)容器中進行 其中步驟(a)可在步驟(b)之前執(zhí)行，或者步驟(b)可在步驟(a)之前執(zhí)行。
在一種優(yōu)選的實施方案中，提供另一步驟(d)，其為檢測該樣本與核酸的反應(yīng)。優(yōu)選的，步驟(b)的核酸固定在表面上。該表面可為反應(yīng)容器(例如反應(yīng)管、板上的孔、或包含在這類反應(yīng)容器中的裝置，諸如小珠)的表面。將核酸固定在表面上可通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何方式完成，包括，但不限于非共價或共價連接。優(yōu)選的，該連接是經(jīng)由介于表面及核酸間的共價化學(xué)鍵建立。然而，本發(fā)明也包含該核酸是間接固定在表面上，其中這類間接固定涉及使用另外的成分或一對相互作用的配偶體。這類另外的成分優(yōu)選為與欲固定的核酸(其也稱為相互作用的配偶體)特異相互作用的化合物，以促成將核酸附著在表面上。該相互作用的配偶體優(yōu)選選自下列核酸、多肽、蛋白質(zhì)及抗體。優(yōu)選的，該相互作用的配偶體為抗體，更優(yōu)選為一種單克隆抗體?；蛘?，該相互作用的配偶體為核酸，優(yōu)選為功能性核酸。更優(yōu)選的，這類功能性核酸選自下列適體、Spiegelmer及與該核酸至少部分互補的核酸。在另一種替換的實施方案中，該核酸與表面的結(jié)合優(yōu)選由多部分的相互作用配偶體介導(dǎo)。這類多部分的相互作用的配偶體優(yōu)選為一對相互作用的配偶體或為由第1員及第2員所組成的相互作用配偶體，其中該第1員包含在該核酸內(nèi)或附著于該核酸，且該第2員附著于或包含在表面內(nèi)。該多部分的相互作用配偶體優(yōu)選選自包含下列的成對的相互作用配偶體生物素及抗生物素蛋白，生物素及鏈霉抗生物素和生物素及中性鏈親和素(neuravidin)。優(yōu)選的，該成對的相互作用配偶體的第1員為生物素。
這類方法的優(yōu)選結(jié)果是形成生物活性的生長素釋放肽與核酸的固定的復(fù)合物，其中更優(yōu)選的檢測該復(fù)合物。在一種實施方案中是從該復(fù)合物檢測生物活性的生長素釋放肽。更優(yōu)選的，該生物活性的生長素釋放肽是通過一種特異于生物活性的生長素釋放肽的檢測手段檢測。在一種特別優(yōu)選的實施方案中，該生物活性的生長素釋放肽是通過檢測生物活性的生長素釋放肽及非生物活性的生長素釋放肽的檢測手段檢測。
順應(yīng)此需求的各種檢測手段為，例如任何特異于生物活性的生長素釋放肽與去辛?；L素釋放肽中的相同部分的檢測手段。優(yōu)選的，這類檢測手段結(jié)合生長素釋放肽的C-端，或至少不與由N-端及正辛酰基側(cè)鏈所形成的結(jié)構(gòu)域結(jié)合。特別優(yōu)選的檢測手段為選自下列的檢測手段核酸、多肽、蛋白質(zhì)及抗體，其制造方法為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知。
用于檢測生長素釋放肽的方法也包含將樣本從反應(yīng)容器(優(yōu)選為曾用來執(zhí)行步驟c的)移除。
另一種實施方案中的方法也包含將生物活性和/或去辛?；L素釋放肽的相互作用配偶體固定在表面上(優(yōu)選為如上述定義的表面)的步驟，其中該相互作用的配偶體為如此文所定義者，優(yōu)選為如上文中涉及該個別方法中所定義者，且更優(yōu)選為在其不同的實施方案中包含核酸、多肽、蛋白質(zhì)及抗體。在此實施方案中，特別優(yōu)選的檢測手段為根據(jù)本發(fā)明的核酸，其中這類核酸優(yōu)選為經(jīng)標記或未經(jīng)標記者。在這類核酸經(jīng)過標記的情況中可直接或間接檢測核酸。這類檢測也可能涉及使用第二種檢測手段，優(yōu)選的，在此文所描述的不同實施方案中其也選自下列核酸、多肽、蛋白質(zhì)及抗體。這類檢測手段優(yōu)選特異于根據(jù)本發(fā)明的核酸。在一種更優(yōu)選的實施方案中，該第二種檢測手段為分子信標。在一種優(yōu)選的實施方案中，該核酸或第二種檢測手段或此二者可包含檢測標記。該檢測標記優(yōu)選選自下列生物素、溴-脫氧尿苷標記、洋地黃毒苷標記、熒光標記、UV-標記、放射標記及螯合劑分子。或者，該第二種檢測手段與該檢測標記相互作用，該檢測標記優(yōu)選包容在、包含在或附著于核酸。特別優(yōu)選的組合如下 該檢測標記為生物素且該第二種檢測手段為針對生物素的抗體，或者，其中 該檢測標記為生物素且該第二種檢測手段為抗生物素蛋白或攜帶抗生物素蛋白的分子，或者，其中 該檢測標記為生物素且該第二種檢測手段為鏈霉抗生物素或攜帶鏈霉抗生物素的分子，或者，其中 該檢測標記為生物素且該第二種檢測手段為中性鏈親和素或攜帶中性鏈親和素的分子，或者 該檢測標記為溴-脫氧尿苷且該第二種檢測手段為針對溴-脫氧尿苷的抗體，或者，其中 該檢測標記為洋地黃毒苷且該第二種檢測手段為針對洋地黃毒苷的抗體，或者， 其中該檢測標記為螯合劑且該第二種檢測手段為放射性核素， 其中優(yōu)選的，該檢測標記附著于核酸。此種組合也可被接受用于其中該核酸附著于表面的實施方案中。在這類實施方案中，優(yōu)選的該檢測標記附著于該相互作用的配偶體。
最后，本發(fā)明也包含利用第三種檢測手段檢測該第二種檢測手段，優(yōu)選的，該第三種檢測手段為一種酶，更優(yōu)選的，其在檢測該第二種檢測手段時顯示出酶促反應(yīng)，或者，該第三種檢測手段為用于檢測放射線(以由放射性核素發(fā)射的放射線更優(yōu)選)的手段。優(yōu)選的，該第三種檢測手段特異檢測和/或與該第二種檢測手段相互作用。
再者，在具有固定在表面上的生物活性和/或去辛酰基生長素釋放肽的相互作用配偶體且，優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子加入由相互作用的配偶體及生長素釋放肽所形成的復(fù)合物的實施方案中，可將樣本從反應(yīng)物(更優(yōu)選為執(zhí)行步驟c)及步驟d)的反應(yīng)容器)移除。
在一種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸包含熒光部分，其中該熒光部分的熒光在形成核酸與生物活性的生長素釋放肽間的復(fù)合物時及游離的生物活性的生長素釋放肽會不相同。
在另一種實施方案中，該核酸為根據(jù)本發(fā)明的核酸的衍生物，其中該核酸的衍生物包含至少一種取代腺苷的腺苷的熒光衍生物。在一種優(yōu)選的實施方案中，該腺苷的熒光衍生物為乙烯腺苷(ethenoadenosine)。
在另一種實施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的核酸的衍生物及生物活性的生長素釋放肽所組成的復(fù)合物是利用熒光檢測。
在該方法的一種實施方案中，在步驟(c)或步驟(d)中產(chǎn)生信號，且優(yōu)選的，該信號與樣本中的生物活性的生長素釋放肽的濃度相關(guān)。
在一種優(yōu)選的實施方案中可在96-孔板中執(zhí)行分析，其中將成分固定在如上述的反應(yīng)容器中，且該孔是作為反應(yīng)容器。
上述的反應(yīng)步驟的順序及隨之描述的不同實施方案原則上是適合用來檢測生物活性的生長素釋放肽(即辛?；L素釋放肽且更優(yōu)選的，正辛?；L素釋放肽)及去辛酰基生長素釋放肽。在下述的前提條件下，此項是可行的在檢測生物活性的生長素釋放肽時，至少一種相互作用的配偶體及根據(jù)本發(fā)明的核酸適合特異檢測該生物活性的生長素釋放肽。原則上，使用特異于生物活性的生長素釋放肽的根據(jù)本發(fā)明的核酸即足夠。此種特異于樣本中所包含的生長素釋放肽量的方法所讀出的數(shù)據(jù)可作為分析生物活性的生長素釋放肽的結(jié)果。然而，此結(jié)果也可能用于測定生長素釋放肽總含量(優(yōu)選為生物活性的生長素釋放肽及去辛?；L素釋放肽)的方法中。為了這類目的，優(yōu)選執(zhí)行一種與上述方法相一致的方法，其是使用特異于去辛?；L素釋放肽或適合檢測生物活性及去辛酰基生長素釋放肽(即總生長素釋放肽的內(nèi)容或其量)的檢測手段或相互作用配偶體。若該相互作用的配偶體或手段適合檢測任何生長素釋放肽，不論其是為生物活性的生長素釋放肽或去辛?；L素釋放肽，該樣本中所包含的生長素釋放肽的總含量可通過可測定樣本中的生物活性生長素釋放肽百分比的讀出方法，將生物活性的生長素釋放肽的值除以生長素釋放肽的總含量值來計算。在另一種實施方案中，該方法用來特異檢測去辛?；L素釋放肽。這類去辛?；L素釋放肽可，例如通過特異于去辛?；L素釋放肽的檢測手段或相互作用配偶體檢測，諸如針對缺乏正辛?；糠值纳L素釋放肽的C-端或N-端。然后，可將由此測定的生長素釋放肽量，即去辛?；L素釋放肽的量加上生物活性的生長素釋放肽的量以產(chǎn)生樣本中的總生長素釋放肽含量。
本發(fā)明的核酸可進一步作為設(shè)計藥物的起始物質(zhì)?；旧嫌卸N可能的方法。一種方法是篩選化合物文庫，然而，這類化合物文庫優(yōu)選為低分子量化合物文庫。在一種實施方案中，該篩選法為高通量篩選法。優(yōu)選的，高通量篩選法在基于靶標的分析中快速、有效、試錯性地評估化合物。在最優(yōu)選的情況中，該分析通過比色(colormatic)測量。隨之使用的化合物文庫為本領(lǐng)域的一般技術(shù)人士所已知。
或者，根據(jù)本發(fā)明的核酸可用來理性設(shè)計(rational design)藥物。優(yōu)選的，理性的藥物設(shè)計為設(shè)計藥物前導(dǎo)結(jié)構(gòu)。從靶標的三維結(jié)構(gòu)(其通常通過諸如X-射線結(jié)晶圖或核磁共振分光譜的方法鑒定)開始，使用計算機程序搜尋含有多種不同化學(xué)化合物的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫。通過計算機完成選擇，該鑒定出的化合物可接著在實驗室中進行測試。
藥物的理性設(shè)計可從任何根據(jù)本發(fā)明的核酸開始且涉及一種結(jié)構(gòu)(優(yōu)選為三維結(jié)構(gòu))，該結(jié)構(gòu)類似于本發(fā)明核酸的結(jié)構(gòu)或與本發(fā)明核酸的結(jié)構(gòu)的介導(dǎo)結(jié)合的部分相同。這類結(jié)構(gòu)在任何情況中仍均顯示出與本發(fā)明核酸相同或類似的結(jié)合特性。在理性的藥物設(shè)計的進一步步驟或替換的步驟中，優(yōu)選的，通過與核苷酸及核酸不同的化學(xué)基團來模擬與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的核酸部分的三維結(jié)構(gòu)。通過此模擬可設(shè)計出與該核酸不同的化合物。這類化合物優(yōu)選為小分子或肽。
在篩選化合物文庫的情況中(諸如使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的競爭性分析)可找出合適的生長素釋放肽類似物、生長素釋放肽激動劑或生長素釋放肽拮抗劑。這類競爭性分析可依下述設(shè)立。將本發(fā)明的核酸(優(yōu)選為Spiegelmer，其為與靶標結(jié)合的L-核酸)與固相偶聯(lián)。為了鑒定生長素釋放肽類似物，可將經(jīng)標記的生長素釋放肽加入分析中?？赡艿念愃莆飳⑴c生長素釋放肽分子競爭與Spiegelmer結(jié)合，這將使得相關(guān)標記的信號減少。激動劑或拮抗劑的篩選可能涉及使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的細胞培養(yǎng)分析。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可包含至少一種或數(shù)種本發(fā)明的核酸。另外，該試劑盒可包含至少一種或數(shù)種陽性或陰性對照。陽性對照可為，如生長素釋放肽，尤其是本發(fā)明核酸所選擇或結(jié)合的生長素釋放肽，優(yōu)選為液態(tài)形式。陰性對照可為，如在生物性質(zhì)上類似于生長素釋放肽，但不被本發(fā)明的核酸識別的肽。再者，該試劑盒可包含一或多種緩沖劑。試劑盒中可包含多種不同成分，這些成分可為干燥或凍干型或溶解在液體中。該試劑盒可包含一或多個容器，該容器可包含試劑盒的一或多種成分。在另一種實施方案中，該試劑盒包含提供使用者如何使用該試劑盒及其不同成分的說明書或說明書頁。
優(yōu)選的，在優(yōu)選的實施方案中，此文中所使用的治療一詞額外或替換地包含預(yù)防和/或追蹤(follow-up)。
優(yōu)選的，此文中所使用的疾病及病癥一詞應(yīng)可互換使用，如果沒有相反的說明。
優(yōu)選的，此文中所使用的包含一詞不欲限制該名詞后所連接的或該名詞所描述的主體。然而，在替換的實施方案中，包含一詞應(yīng)被理解為含有且因此限制該名詞后所連接的或該名詞所描述的主體。
下表中列出根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的多種不同SEQ ID Nos.和化學(xué)性質(zhì)，以及此文中所使用的靶標分子生長素釋放肽，其實際序列及內(nèi)部參考編號。







本發(fā)明通過附圖、實施例及列出的序列進一步說明，從這些附圖、實施例及序列可得知另外的特性、實施方案及優(yōu)點，其中 圖1顯示與人類生長素釋放肽結(jié)合的RNA配體的序列的排列比對； 圖2顯示截短的適體相對于已知序列SOT-C(B11trc)競爭與生長素釋放肽的結(jié)合的競爭分析； 圖3顯示選出的RNA配體序列的比對，其公開于專利申請案WO2004/013274 A2中； 圖4顯示計算出的與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-C的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125167-188)計算出； 圖5顯示計算出的與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-D-000的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)是以程序″RNAfold″(Hofacker etal.，1994，Monatsh Chem 125167-188)計算出； 圖6顯示計算出的與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-D的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125167-188)計算出； 圖7顯示計算出的與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆F-12的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125167-188)計算出； 圖8顯示SOT-D-000衍生物(其為截短與理性設(shè)計實驗的結(jié)果)的比對； 圖9顯示在室溫以Spiegelmer SOT-C、SOT-D-000及其變異體抑制由生長素釋放肽所誘導(dǎo)的Ca++釋放的單點測量；以預(yù)先在室溫下溫育的5nM生長素釋放肽及不同量的Spiegelmer SOT-C、SOT-D-000或D-000的變異體刺激細胞，結(jié)果顯示熒光信號的百分比(其相對于無Spiegelmer時所取得的信號進行標準化)； 圖10顯示與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-D-109的推定的二級結(jié)構(gòu)； 圖11顯示在室溫以Spiegelmer D-109及5′-聚乙二醇化的D-109抑制由生長素釋放肽所誘導(dǎo)的Ca++釋放的劑量-反應(yīng)曲線；以預(yù)先在室溫下溫育的5nM生長素釋放肽及不同量的Spiegelmer D-109及5′-聚乙二醇化的-D-109刺激細胞；結(jié)果顯示熒光信號的百分比(其相對于無Spiegelmer時所取得的信號進行標準化)；據(jù)發(fā)現(xiàn)SpiegelmerD-109及其修飾的變化體可以同樣的IC50抑制由生長素釋放肽所誘導(dǎo)的Ca++釋放； 圖12顯示計算出的與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125167-188)計算出； 圖13顯示以細胞培養(yǎng)實驗測試的Spiegelmer SOT-E的截短變異體的結(jié)合分析； 圖14顯示與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-19的推定的二級結(jié)構(gòu)； 圖15顯示與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-21的推定的二級結(jié)構(gòu)； 圖16顯示與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-33的推定的二級結(jié)構(gòu)； 圖17顯示與生長素釋放肽結(jié)合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-25的推定的二級結(jié)構(gòu)； 圖18顯示指出與D-生長素釋放肽結(jié)合的RNA克隆SOT-C及SOT-E的KD值的Biacore 2000傳感圖(sensorgram)； 圖19顯示在37℃以Spiegelmer SOT-E、SOT-E-19-5′-氨基、SOT-E-19-5′-PEG或SOT-D-109抑制由生長素釋放肽所誘導(dǎo)的Ca++釋放的劑量-反應(yīng)曲線；以預(yù)先在37℃下溫育的2nM人類生長素釋放肽及不同量的Spiegelmer SOT-E、SOT-E-19-5′-氨基、SOT-E-19-5′-PEG或SOT-D-109刺激細胞；結(jié)果顯示熒光信號的百分比(其相對于無Spiegelmer時所取得的信號進行標準化)；據(jù)發(fā)現(xiàn)SpiegelmerSOT-E-19及其修飾的變體可以約4nM的IC50抑制由生長素釋放肽所誘導(dǎo)的Ca++釋放； 圖20A顯示序列Box的定義，其為與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer的特征； 圖20B顯示圖20A的一種變體； 圖20C顯示圖20A的一種變體； 圖20D顯示圖20A的一種變體； 圖21顯示SOT-D-109、SOT-E、SOT-E-19、SOT-E-21、SOT-E-33及SOT-E-25的序列； 圖22顯示施用外源性生長素釋放肽后，抗生長素釋放肽Spiegelmer SOT-E-19-5′-PEG對生長激素釋放的抑制作用； 圖23顯示SOT-E-19的不同衍生物(其包含取代內(nèi)部連接子的額外核苷酸)的概觀，觀察到的IC50值以nM表示； 圖24顯示以辛酰基生長素釋放肽、去辛酰基生長素釋放肽及Spiegelmer SOT-E-19進行的細胞競爭分析的結(jié)果，該成分的組合及濃度概述于黑帶下； 圖25顯示通過EIA型檢測分析記錄的吸收對人類生長素釋放肽(辛?；?濃度的標準曲線，而與生長素釋放肽結(jié)合的SpiegelmerNOX-B11用來固定人類生長素釋放肽(辛?；?，以定量人類生長素釋放肽(辛酰基化)； 圖26A-D顯示用于定量辛酰基生長素釋放肽的方法的多種步驟，此方法是利用與生長素釋放肽結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的核酸進行。

具體實施例方式 實施例1與生長素釋放肽結(jié)合的序列 如果沒有明確的相反說明，這些實施例中所使用的生長素釋放肽為其辛?；L素釋放肽的形式。
利用從DE 10349441.3中所描述的技術(shù)衍生的技術(shù)在活體外選擇針對生物素化的人類D-生長素釋放肽的RNA?？寺「患膁sDNA分子群并將其測序。序列分析的結(jié)果可在圖1中見到。
所有序列包含已知的與生長素釋放肽結(jié)合的序列SOT-C(B11trc；見專利申請案WO 2004/013274 A2號)的生長素釋放肽-結(jié)合基序A(25個核苷酸)。在這些23個克隆中僅有4個的基序A位于序列的3′端。19種序列中的基序A是位于克隆的5′端。另外的稱為基序D的基序是位于基序A的3′端。
序列的結(jié)合特征 選出15個在不同位置處顯示變化的克隆(圖1)，在37℃，利用實施例2中所描述的″競爭分析″進行評級實驗。使用經(jīng)放射標記的適體SOT-C(B11trc)作為參考。數(shù)種候選物與D-生長素釋放肽結(jié)合的結(jié)合力較SOT-C(B11trc)來得強，其顯示出較低的KD或較大量的活性構(gòu)象而無法在″競爭分析″中區(qū)分?？寺S-P2-G2、MS-P2-D2、MS-P2-A2、MS-P2-H3似乎具有較對照組克隆SOT-C(B11trc)為佳的結(jié)合力，克隆MS-P2-E1、MS-P2-B1、MS-P2-F1、MS-P2-C3、MS-P2-C2、MS-P2-A4及MS-P2-B2顯示出更好的結(jié)合力。與SOT-C(B11trc)相較下，克隆MS-P2-E3、MS-P2-A3、MS-P2-H2及MS-P2-D1可測定出與其類似的結(jié)合結(jié)果(圖2；該評估見圖1)。因此，在37℃下，測試具有在平衡分析中作為適體的活性及在細胞培養(yǎng)分析中作為Spiegelmer的活性的最優(yōu)選克隆(實驗計劃見圖2)。結(jié)果概述于圖1中。在37℃下，于平衡分析中測得克隆MS-P2-D2、MS-P2-F1、MS-P2-C2、MS-P2-A4及MS-P2-B2具有22-34nM的KD值(約60％的活性分子)，而在37℃下，于細胞培養(yǎng)實驗中可檢測到3.0-8.0nM的IC50值。相比之下，在37℃檢測到的SOT-C(B11trc)的IC50值為20nM，而在37℃測定出的KD值為100nM(47％的活性分子)(如專利申請案WO 2004/013274 A2號中所描述者，室溫下，SOT-C的IC50值為約5nM)。結(jié)果指出SpiegelmerMS-P2-F1、MS-P2-C2及MS-P2-D2的生物活性在37℃下可能較SOT-C(B11trc)甚至高出約5倍。在后續(xù)的截短實驗中，選擇克隆MS-P2-F1(IC50值為4.0nM)(二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，見圖12)。
需了解圖1中所示的任何序列為根據(jù)本發(fā)明的核酸，包括那些為其截短型，然而仍可與靶標結(jié)合者。
實施例2序列的結(jié)合特征 2.1使用″平衡結(jié)合分析″評估經(jīng)放射標記的適體的等級 就其對生物素化的人類D-生長素釋放肽的結(jié)合行為，使用″平衡結(jié)合分析″將大部分此文所揭示的克隆(尤其是圖1中所列者)以經(jīng)放射標記的適體(D-RNA)形式進行評級。
完成分子對人類D-生長素釋放肽的結(jié)合行為的評級。為此，使用如此處所描述的標準實驗方案，將鑒定出的適體合成為如圖1所描述的截短適體(無引物結(jié)合位點)的形式。
利用下列實驗方案，以γ-P32-ATP將適體序列在5′端做放射標記。
成分[終濃度] 寡核苷酸5μM T4向反應(yīng)緩沖液(Invitrogen) 1x T4多核苷酸激酶(Invitrogen) 10U/10微升反應(yīng)體積 [γ-32P]ATP 1微升/10微升反應(yīng)體積 將反應(yīng)物在37℃溫育1小時。接著，將經(jīng)放射標記的適體進行凝膠純化。
將2-5皮摩爾的經(jīng)放射標記的RNAs在95℃，于不含Ca++及Mg++的選擇緩沖液(根據(jù)人類血液中的生理條件20mM Tris、150mM NaCl、5mM KCl，在37℃調(diào)整為pH7.4)中變性3分鐘，經(jīng)由在37℃下加入這些離子，使最終濃度為1mM，使之折疊，并在37℃下與濃度為0.4至3000nM的生物素化的人類D-生長素釋放肽一起溫育1小時。接著，加入固定量的作為基質(zhì)的中性鏈親和素瓊脂糖，并將RNA肽復(fù)合物在37℃搖動超過30分鐘。然后，將具有結(jié)合的肽的基質(zhì)沉淀，去除上清液，以100微升選擇緩沖液清洗基質(zhì)，利用Beckman Coulter測量放射活性，以測定結(jié)合及未結(jié)合的RNA間的差異。將作為對照組(0nM生物素化的人類D-生長素釋放肽)的背景值從計算出的數(shù)字減去。利用軟件程序″GraFIT″(4.0.10版，Erithacus Software Ltd.，Surrey，UK)計算平衡常數(shù)。
2.2利用競爭分析將適體評級 為了將克隆與已知的與生長素釋放肽結(jié)合的序列SOT-C(Blltrc；見專利申請案WO 2004/013274A2號)相比較，利用如此文所描述的標準實驗方案(實施例4)將SOT-C合成為適體形式(D-RNA)。利用如此文所描述的標準實驗方案，以γ-P32-ATP將適體序列的5′端做放射標記。
按照用于平衡分析的描述制備經(jīng)放射標記的SOT-C及鑒定出的克隆(D-RNA)。在20nM的肽濃度(生物素化的人類D-生長素釋放肽)下進行分析。然后，測試等摩爾量的經(jīng)放射標記的SOT-C與二種不同濃度(40nM及200nM)的適體(結(jié)果描述于圖2中)。依類似平衡分析的方法進行分析。
2.3與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer對由生長素釋放肽所誘導(dǎo)的鈣釋放的抑制作用 在監(jiān)測人類(L-)生長素釋放肽與人類生長激素促分泌素受體(GHS-R)的相互作用的細胞分析系統(tǒng)中確定與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer的功能性特征。通過熒光鈣指示劑目視檢查由受體-配體的相互作用造成的胞內(nèi)鈣釋放。
將表達人類生長素釋放肽受體(GHS-R1a)的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞(從Euroscreen，Gosselies，Belgium取得)以每孔5-7×104細胞的濃度接種在黑色有透明底的96孔板(Greiner)中，在37℃及5％CO2下，于UltraCHO介質(zhì)(Cambrex)(其額外含有100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素、400微克/毫升遺傳霉素及2.5微克/毫升兩性霉素)中培養(yǎng)一整夜。
在加入鈣指示劑染料fluo-4前，以200微升CHO-U+清洗細胞一次。然后，加入50微升指示劑染料溶液(在CHO-U+中的10μMfluo-4(Molecular Probes)、0.08％pluronicl27(Molecular Probes))并將細胞在37℃下培養(yǎng)60分鐘。然后，以180微升CHO-U+清洗細胞三次。最后，在每一孔中加入90微升CHO-U+。
將多種不同量的Spiegelmer在0.2毫升low profile96孔板中，在含5mM西磺舒(probenecid)和20mM HEPES的UltraCHO介質(zhì)(CHO-U+)中與人類(L-)生長素釋放肽(從Bachem購得)在室溫或37℃下培育15至60分鐘。在對照組方面，分析僅含肽的樣本(最大的鈣釋放量)及不含肽的樣本(最少的鈣釋放量)。在這些刺激溶液中，與分析相較下，肽及Spiegelmer(若加入)為10倍濃縮。
為了檢測鈣的釋放量，將刺激溶液加入細胞(10微升/孔)中并監(jiān)測熒光信號的變化。在配備注射泵的Fluostar Optima多重檢測板讀數(shù)計(BMG)中，于485nm的激發(fā)波長及520nm的發(fā)射波長處測量熒光信號。
在并行測量數(shù)種樣本方面，同時記錄96孔板中的一排孔(垂直的)。前三次讀數(shù)有4秒的時間落差以完成基線測定。然后，中斷記錄并將板從儀器移出。利用多道型吸量管(multi-channel pipette)將10微升刺激溶液加入孔中，再將板再次移入儀器中繼續(xù)測量。在全部20次記錄中執(zhí)行4秒的時間間隔。
測定各孔的最大熒光與基線值間的差異，并相對于人類(L-)生長素釋放肽(辛?；?濃度繪圖，或者，在Spiegelmer對鈣釋放的抑制作用的實驗中，相對于Spiegelmer濃度繪圖，以測定50％-最大抑制常數(shù)(IC50)。
2.4表面等離子共振(SPR)測量 依說明，利用BIAcore 2000儀(BIAcore AB，Uppsals Sweden)，通過SPR實時動力分析確定與生物素化的人類D-生長素釋放肽結(jié)合的適體的特征。將100RU(Flowcell 2)和300RU(Flowcell 3)的C-端生物素化的肽固定在與鏈霉抗生物素結(jié)合的傳感芯片(BIAcore AB，F(xiàn)reiburg，Germany)上，并利用Kinject注射濃度0.1μM至1μM的樣本，控制360秒的結(jié)合時間及360秒的解離時間。使用Flowcell 1作為緩沖液及葡聚糖基質(zhì)對照組(BIAcore SA-Chip表面)，然而，將非特異性D-肽固定在Flowcell 4上以測定適體的非特異性結(jié)合。在37℃下反應(yīng)。以BIAevaluation 3.0軟件(BIAcore AB，Uppsals，Sweden)分析數(shù)據(jù)，使用Langmuir 1∶1化學(xué)計量擬合算法。
實施例3與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer基序的界定 3.1 SOT-D-000的截短 3.1.2 預(yù)先選定的Spiegelmer SOT-D-000的末端截短 依專利申請案WO 2004/013274 A2號中所提出的內(nèi)容，預(yù)先取得圖3中所示的與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer。在預(yù)測二級結(jié)構(gòu)(最小自由能構(gòu)象[Hofacker et al.，1994，Monatsh.Chem 125167-188])時，所有Spiegelmer在5′-及3′-端間很可能有典型的分子內(nèi)堿基配對(圖4-7；圖3中的有下劃線的堿基)。Spiegelmer中出現(xiàn)這類結(jié)構(gòu)成分可能為正確折疊該活性三維結(jié)構(gòu)所不可少的，但對經(jīng)濟節(jié)省的Spiegelmer的合成方法而言，該分子的長度應(yīng)盡可能短。選擇Spiegelmer SOT-D-000(不含引物結(jié)合位點的SOT-R04-DR14-F7的截短變體的別名)作為末端截短的基礎(chǔ)，因其為所選擇的具有形成最長末端螺旋的潛力的最短Spiegelmer。
合成具有8個(SOT-D-108)、7個(SOT-D-100)及6個(SOT-D-104)個，而非10個堿基對的螺旋長度的SOT-D-000截短變體并依實施例2中的描述在細胞培養(yǎng)中測試(圖9)。SOT-D-104(39mer)明顯喪失結(jié)合活性，而SOT-D-100(41mer)及SOT-D-108(43mer)則保持全部的生長素釋放肽拮抗效能。變體SOT-D-106(SOT-D-104的另一截短體，其中G4已被移除)幾乎無活性。令人驚訝地，此非匹配的G(其出現(xiàn)在所有選定的生長素釋放肽Spiegelmer的螺旋中)可能不易去除。相反，其顯示出對與生長素釋放肽結(jié)合而言為必須的。
3.1.2 SOT-D-100及-108的內(nèi)部缺失突變體 當考慮圖3中所選出的生長素釋放肽結(jié)合子的比對時，所有比對分子中在直接與5′端的末端螺旋相鄰處似乎均存有高可變區(qū)。為了在生長素釋放肽結(jié)合子的進一步截短中利用此明顯的變化性，使用最短的完全活性SOT-D變異體SOT-D-100及-108作為進一步截短的基礎(chǔ)。在內(nèi)部SOT-D-100變異體的情況中，可單純將相應(yīng)堿基刪去，然而，在SOT-D-108變異體的情況中，其是在合成期間被一有彈性的親水性間隔子所取代。然后，依實施例2的描述，在細胞培養(yǎng)中測試SOT-D-100及其衍生物SOT-D-101和-102，以及SOT-D-108衍生物SOT-D-109、-110和-111(圖9)。如圖8中所呈現(xiàn)，刪除二個，但非三個內(nèi)部核苷酸可能不喪失活性(SOT-D-101；-102)。相反地，當被間隔子取代時(SOT-D-109、-110、-111)，可刪除3個核苷酸。間隔子的理想位置在SOT-D-109中實現(xiàn)(圖10)。
以40kDa部分修飾SOT-D-109的5′端可能不會喪失與生長素釋放肽結(jié)合的活性(圖11)。
3.2 SOT-E的截短 接著，與生長素釋放肽結(jié)合的序列MS-P2-F1(其被選定作為前導(dǎo)序列)稱為SOT-E(圖1及圖12)。
在預(yù)測二級結(jié)構(gòu)(最小自由能構(gòu)象[Hofacker et al.，1994，Monatsh.Chem 125167-188])時，Spiegelmer SOT-E在C30及G50間很可能有典型的分子內(nèi)堿基配對(圖12)。下列實驗中描述將Spiegelmer SOT-E截短的實驗。在細胞培養(yǎng)中測試所有SpiegelmerSOT-E各經(jīng)截短的變異體的活性(見實施例2)。
3.2.1 Spiegelmer SOT-E的末端截短 3′端的六個核苷酸似乎不與分子的其它部分雜交。相反的，5′端的核苷酸可被部分配對。令人驚訝地，在不降低結(jié)合力的情況下，該3′端無法被截短(Spiegelmer SOT-E-012)，而SpiegelmerSOT-E-104(截去5′端的6個核苷酸)可保留完全的生長素釋放肽拮抗活性(圖13)。
3.2.2 Spiegelmer SOT-E的內(nèi)部缺失突變體 當考慮圖1中所示的選定的生長素釋放肽結(jié)合子MS-P2-E3、MS-P2-G2、MS-P2-D2、MS-P2-A3、MS-P2-E1、MS-P2-B1、MS-P2-C3、MS-P2-C2、MS-P2-H2、MS-P2-A4及SOT-E(序列家族I)的比對時，所有比對的分子末端處似乎均存在高可變區(qū)并直接與螺旋相鄰(SOT-E中的G36-C43)。Spiegelmer SOT-E的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示出含4個核苷酸的環(huán)(A38-U41；圖12)。為了在生長素釋放肽結(jié)合子的進一步截短中利用此明顯的可變性，首先，在合成期間以有彈性的親水性間隔子取代Spiegelmer SOT-E的相應(yīng)堿基。刪去6個(U37-A42；SOT-E-011)核苷酸，但非8個(G36-C43；SOT-E-008)核苷酸可能不會喪失活性。在5′端(G1-A6)截短及以有彈性的親水性間隔子取代6個核苷酸(U37-A42)的組合可產(chǎn)生44-核苷酸的Spiegelmer SOT-E-019(圖14)，其在細胞培養(yǎng)中顯示出與56-核苷酸Spiegelmer SOT-E(圖12)相相同的IC50。
3.2.3 SOT-E-019內(nèi)的序列片段的重排 序列MS-P2-A2、MS-P2-H3、MS-P2-D1(圖1)所代表的序列家族II與序列家族I(包括SOT-E)具有相似性。這些序列同源性在圖1中以Box A(UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC)體現(xiàn)。在序列家族II中，Box A位于3′端，而在序列家族I中，Box A接近5′端。鑒于體外選擇的該結(jié)果及Spiegelmer SOT-E的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，可設(shè)計其中Box A是位于5′端的SOT-E-019的變異體。為了達到此目的，將SOT-E-019的原始5′端及3′端以有彈性的親水性間隔子連接并移除環(huán)，以產(chǎn)生新5′及3′端(變異體SOT-E-021；圖15及21)。令人驚訝地，對于SOT-E-021未觀察到活性喪失。基于SOT-E-019及SOT-E-021做進一步截短(SOT-E-33(圖16及21)及SOT-E-25(圖17及21))不可能不降低生長素釋放肽的拮抗功能性(圖13)。
3.3 SOT-C、SOT-D-109及SOT-E的比較 通過表面等離子共振(實施例2)測量Spiegelmer SOT-E，與SOT-C相較下，可測得較優(yōu)6倍的KD值(圖18)。與D-109相較下，在細胞培養(yǎng)實驗(實施例2)中，以Spiegelmer SOT-E可檢測到相同的改良的結(jié)合(好5倍)(圖19)。為了改良在動物體內(nèi)的停留時間，以40kDa-PEG部分修飾Spiegelmer SOT-E-19的5′端(SOT-E19-5′-PEG)。在細胞培養(yǎng)實驗中，與SOT-E相較下，Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG顯示出類似的結(jié)果(圖19)且另外顯示出體內(nèi)活性(實施例5；圖22)。
3.4 與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer基序的界定 所有與生長素釋放肽(尤其是此文所定義的具有辛?；鶄?cè)鏈的生長素釋放肽)結(jié)合的分子主要的特征為存有具25個核苷酸的基序(″Box A″)，其對與生長素釋放肽結(jié)合而言為必要的?！錌ox A″內(nèi)的25個核苷酸中有些似乎可與其它堿基交換(圖20A)。
在與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer內(nèi)的″Box A″的功能性而言，″Box A″3′端處的5個核苷酸(5′-CCUAC)與序列5′-GUGAGG的互補鏈雜交形成具有位于中央的非配對鳥苷(Box B)的螺旋結(jié)構(gòu)為其必須要素。刪除Box B中此中央鳥苷導(dǎo)致明顯喪失結(jié)合力(″由Box A界定的螺旋″，非配對G；圖20A)。3′-鄰接″Box A″，″由Box A界定的螺旋″應(yīng)最少以一個，優(yōu)選為二或多個額外、非限定的堿基對延長(″Box C1″及″Box C2″，圖20A)。
在″Box B″的3′端必須有另外的核苷酸供結(jié)合。至少需要另二個核苷酸(優(yōu)選為5′-CA)供結(jié)合。經(jīng)由在此位置加入另二個(理想上為4個)核苷酸(″Box D″，圖20A)產(chǎn)生包含2、3、4、5或6個核苷酸的BoxD可顯著改良結(jié)合。在″Box A″的5′端必須有另外的核苷酸供結(jié)合。至少需要另一個核苷酸(優(yōu)選為U或G)供結(jié)合。經(jīng)由在此位置加入另二個核苷酸(″Box E″，圖20A)產(chǎn)生包含1、2、3或4個核苷酸的Box E可顯著改良結(jié)合。
若Box D及E經(jīng)由一有彈性的親水性間隔子連接，該間隔子也可插在不同的位置中(見圖8；SOT-D-109、SOT-D-110及SOT-D-111)。
令人驚訝地，當″Box C1″及″Box C2″而不是Box D及E以有彈性的親水性間隔子連接時，該限定的序列元件具功能性。
變異體1
變異體2
本專利說明書、權(quán)利要求和/或附圖中所揭示的本發(fā)明特性可分別地及以其任何組合作為用于實現(xiàn)本發(fā)明的多種不同形式的材料。
實施例4適體及Spiegelmer的化學(xué)合成法 化學(xué)固相合成法 小規(guī)模合成法 以ABI 394合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)，利用2′TBDMS RNA亞磷酰胺化學(xué)(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols foroligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，HumanaPress Inc.1993)通過固相合成法制造適體。從ChemGenes(麻省Wilmington市)購買D-rA(N-Bz)-、D-rC(Ac)-、D-rG(N-ibu)-、D-rU-及六乙二醇亞磷酰胺。通過凝膠電泳法純化適體。
以ABI 394合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)，利用2′TBDMS RNA亞磷酰胺化學(xué)(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols foroligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，HumanaPress Inc.1993)通過固相合成法制造未經(jīng)修飾(無聚乙二醇化)的Spiegelmer。從ChemGenes(麻省Wilmington市)購買L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-、L-rU-及六乙二醇亞磷酰胺。通過凝膠電泳法純化適體。
大規(guī)模合成法加修飾 以

合成儀(Amersham Biosciences；GeneralElectric Healthcare，F(xiàn)reiburg)，利用2′TBDMS RNA亞磷酰胺化學(xué)(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，Humana Press Inc.1993)通過固相合成法制造經(jīng)修飾的Spiegelmer SOT-E-19。從ChemGenes(麻省Wilmington市)購買L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-、L-rU-及六乙二醇亞磷酰胺。在經(jīng)L-riboC修飾的孔徑

的CPG(Link Technology，Glasgow，UK)上開始合成。關(guān)于偶聯(lián)(每一循環(huán)15分鐘)，使用在乙腈中的0.3M芐基硫代四唑(CMS-Chemicals，Abinhfon，UK)及在乙腈中的3.5當量的相應(yīng)0.1M亞磷酰胺溶液。通過與胺己基亞磷酰胺(ChemGenes)偶聯(lián)來連接Spiegelmer的5′端的氨基。使用氧化-加帽循環(huán)。從Biosolve(Valkenswaard，NL)購買另外的合成寡核苷酸的標準溶劑及試劑。以DMT-ON模式合成Spiegelmer；去保護后利用Source 15RPC介質(zhì)(Amersham)，經(jīng)由制備性RP-HPLC純化(Wincott F et al 1995 NucleicAcids Res.232677)。以80％醋酸去除5′DMT-基團(在室溫下30分鐘)。接著，加入2M NaOAc水溶液并利用5K再生的纖維素膜(Millipore，Bedford，MA)，通過切向流過濾將Spiegelmer脫鹽。
聚乙二醇化 為了減少在體內(nèi)的腎臟清除率，將Spiegelmer SOT-E-19與40kDa聚乙二醇(PEG)部分在5′端共價偶聯(lián)。使用具這類增加的分子量的Spiegelmer可顯著延長血漿中的保持時間，因此可延長效果。
關(guān)于聚乙二醇化(見歐洲專利申請案EP 1 306 382)，將純化的5′-氨基經(jīng)修飾的Spiegelmer溶解在H2O(2.5毫升)、DMF(5毫升)及緩沖液A(5毫升，其是經(jīng)由下述方法制備將檸檬酸.H2O[7克]、硼酸[3.54克]、磷酸[2.26毫升]及1M NaOH[343毫升]混合，再加入H2O，使最終體積為1升；以1M HCl將pH調(diào)整為8.4)的混合物中。
以1M NaOH將Spiegelmer溶液的pH調(diào)整為8.4。然后，在37℃下，將40kDa PEG-NHS酯(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)分成四份，每份0.6當量，每隔30分鐘加入其中，直到達到75-85％的最大產(chǎn)量。加入PEG-NHS酯的期間，以1M NaOH將反應(yīng)混合物的pH值保持在8-8.5。
將反應(yīng)混合物與4毫升脲溶液(8M)、4毫升緩沖液A及4毫升緩沖液B(在H2O中的0.1M醋酸三乙銨)混合，并在95℃加熱15分鐘。然后，以Source 15RPC介質(zhì)(Amersham)，利用乙腈梯度(緩沖液B；緩沖液C在乙腈中的0.1M醋酸三乙銨)將聚乙二醇化的Spiegelmer通過RP-HPLC純化。在5％緩沖液C中洗脫過量的PEG，在10-15％緩沖液C中洗脫聚乙二醇化的Spiegelmer。將純度＞95％(通過HPLC評估)的產(chǎn)物級分合并，并與40毫升的3M NaOAc混合。通過切向流過濾將聚乙二醇化的Spiegelmer脫鹽(5K再生的纖維素膜，Millipore，Bedford MA)。
實施例5施用外源性生長素釋放肽后，抗生長素釋放肽-SpiegelmerSOT-E19-5′-PEG對生長激素釋放的抑制作用 已知施用大鼠外源性生長素釋放肽后可觸發(fā)生長激素(GH)釋放。預(yù)先施用與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer可遏制由生長素釋放肽所引起的GH釋放。
讓史普格道利(Sprague Dawley)大鼠適應(yīng)其新環(huán)境7天。實驗包含5組，其中各組包含5只動物一組陽性對照及4組不同劑量的Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG。在實驗期間，以氯胺酮(Ketamine)/甲苯噻嗪(Xylazine)將所有動物麻醉，并接受二次通過尾靜脈的靜脈內(nèi)注射。第一次注射是在第二次注射前30分鐘進行，并包含PBS(陽性對照組)及圖22所指出的Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG的劑量。第二次施用包含給予所有動物3nmol大鼠生長素釋放肽并將其記為實驗的時間0。在第二次施用前先從眶竇抽出第一次血液樣本。在給予大鼠生長素釋放肽后的5、15、30及45分鐘后采取另外的樣本。以市售的酶促免疫分析系統(tǒng)，依照制造者的指示(Growth hormone，Rat，Biotrak Assay Kit，RPN2561，Amersham Biosciences Europe GmbH，F(xiàn)reiburg)，分析所產(chǎn)生的血漿樣本中的生長激素濃度。
如圖22中所見，經(jīng)由注射大鼠生長素釋放肽可強烈刺激生長激素釋放，但其可經(jīng)由預(yù)先施用SOT-E19-5′-PEG受到抑制。在75nmolSOT-E19-5′-PEG/公斤體重時可取得最大抑制效果。進一步增加施用劑量至150nmol SOT-E19-5′-PEG/公斤體重時無法進一步遏制GH釋放。結(jié)果證明了抗生長素釋放肽Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG的體內(nèi)活性。
實施例6無內(nèi)部連接體的SOT-E-19的衍生物 如實施例3中所描述，抗生長素釋放肽Spiegelmer SOT-E-19是由L-核苷酸及內(nèi)部連接體所組成，內(nèi)部連接體被并入原始分子SOT-E中以取代6個核苷酸。6個核苷酸中有4個形成Spiegelmer SOT-E中的環(huán)，剩余的2個核苷酸(來自該6個核苷酸)可彼此雜交(SOT-E，見圖23，第1排，雜交的核苷酸下方劃線)。
為了使得無內(nèi)部連接體的SOT-E-19的衍生物盡可能短，以3個核苷酸的不同模塊取代該連接體。以Spiegelmer的形式合成所有衍生物(實驗方案見實施例4)，并在細胞培養(yǎng)實驗中分析之(實驗方案見實施例2)。下列模塊ACA(SOT-E-19-L3)及CAA(SOT-E-19-L4)顯示出可成功取代SOT-E19的內(nèi)部連接體但不會喪失結(jié)合及抑制效力(IC50)。SOT-E-19的不同衍生物顯示于圖23中。
實施例7通過與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer區(qū)別辛?；L素釋放肽及去辛?；L素釋放肽 根據(jù)實施例2中所描述的方法，在競爭分析中進一步分析Spiegelmer SOT-E19與生長素釋放肽結(jié)合的特征。在這些分析中，在刺激細胞前，將Spiegelmer與不同組合的生長素釋放肽肽類(辛?；L素釋放肽與去辛酰基生長素釋放肽)在刺激溶液中一起培育。
肽組合的方案及以全長辛酰基生長素釋放肽(人類生長素釋放肽＝hu生長素釋放肽)進行的實驗的結(jié)果概述于圖24中(條帶從左至右編號)在無任何辛?；L素釋放肽(人類生長素釋放肽＝hu生長素釋放肽)或最終濃度為300nm的去辛酰基生長素釋放肽時未檢測到對細胞的刺激(第1及2條黑帶)，而濃度13nM的辛?；L素釋放肽(人類生長素釋放肽＝hu生長素釋放肽)則已足夠介導(dǎo)鈣的釋放(第3條黑帶)；進一步加入300nM的去辛?；L素釋放肽(第4條黑帶)不會干擾細胞的刺激，這表示該生物上去活性的去辛?；L素釋放肽不是受體拮抗劑。由3nM辛?；L素釋放肽(人類生長素釋放肽＝hu生長素釋放肽)介導(dǎo)的鈣的釋放可被10倍過量的SOT-E19抑制(第5條黑帶)，即使存在超過辛?；L素釋放肽(人類生長素釋放肽＝hu生長素釋放肽)100倍的去辛?；L素釋放肽也不會競爭抑制(第6條黑帶)。相反地，300nM辛?；L素釋放肽及30nM Spiegelmer的分析濃度顯示出可增加鈣的釋放(第7條黑帶)，證明在分析條件下可取得辛?；L素釋放肽(人類生長素釋放肽＝hu生長素釋放肽)增強的刺激。此實驗證明SOT-E19可特異區(qū)分辛酰基型及去辛?；偷纳L素釋放肽。
Spiegelmer NOX-B11與生長素釋放肽的結(jié)合特征(與辛?；L素釋放肽結(jié)合，但與去辛?；L素釋放肽不結(jié)合或僅微弱地結(jié)合)類似于SOT-E19(先前依WO2005/049828中的描述進行同樣的實驗)。
由于二種分子具有高結(jié)構(gòu)相關(guān)性(見實施例3)(其主要基于BoxA)，結(jié)果支持該基序A對根據(jù)本發(fā)明的核酸分子對于辛酰基化生長素釋放肽(尤其是在包括該辛?；腘端處的5個氨基酸)的高特異性而言為必要的。
實施例8利用與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer NOX-B11定量辛?；L素釋放肽 與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer NOX-B11可用在與用來定量辛?；娜祟惣按笫笊L素釋放肽的非放射活性的酶促免疫分析(EIA)類似的分析模式中。
原理 在此分析中，將標準物、對照組及未知的經(jīng)處理的血漿在96-孔微量滴定板中培育，該96-孔微量滴定板已預(yù)先涂覆與生長素釋放肽結(jié)合的Spiegelmer(如Spiegelmer NOX-B11，其可識別辛?；L素釋放肽的N端)。培育及清洗后，以抗生長素釋放肽抗體(第1種抗體)或與生長素釋放肽在生長素釋放肽的C端結(jié)合的核酸處理滴定板的孔。此抗體或核酸可經(jīng)標記或不標記，其中核酸優(yōu)選經(jīng)過標記。若(第1種)抗體為未經(jīng)標記，則培育后，去除該(第1種)抗生長素釋放肽抗體，清洗數(shù)次后加入第二種抗體(該抗體是針對第一種抗體的Fc-片段且經(jīng)標記)。該第二種抗體的標記可為辣根過氧化酶(HRP)。將孔與第二種抗體培育后，去除未結(jié)合的部分，將孔與HRP底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)一起培育。然后，加入酸性終止溶液，并在450nm處通過吸收測量來測定底物的酶促轉(zhuǎn)化程度。測得的吸收與樣本中所存在的辛酰基生長素釋放肽的濃度直接成正比。使用一組生長素釋放肽標準來繪制吸收-生長素釋放肽濃度標準曲線，由此可計算未知樣本中的生長素釋放肽。
實驗方案 首先，以包含0.1％吐溫(Tween)的PBS-Dulbecco(帶有Mg2+及Ca2+，Biochrom AG，Berlin，Germany)清洗經(jīng)鏈霉抗生物素涂覆的96-孔板(Reacti-Bind Streptavidin Coated High Bind Capacity Black96-well Plates，Perbio Science，Bonn，Germany)。將各孔與100微升50μM的生物素化的Spiegelmer NOX-B11(溶解在PBS中；SEQ ID72)在室溫中培育1小時。將生物素化的Spiegelmer NOX-B11固定后，通過單次清洗步驟(100微升PBS)去除未結(jié)合的Spiegelmer。此說明于圖26A中。
在移除清洗緩沖液后，將帶有確定濃度的辛酰基生長素釋放肽的原液加入其中并在室溫中培育1小時。移除上清液并清洗孔一次(100微升PBS)。此說明于圖26B中。
將抗生長素釋放肽抗體(來自Phoenix Peptides，Belmont，CA，USA；1°ab)在封閉溶液(來自Phoenix Peptides，Belmont，CA，USA)中培育1小時，通過5個清洗步驟(各100微升PBS)去除未結(jié)合的抗體。此說明于圖26C中。
為了檢測結(jié)合的抗生長素釋放肽抗體，使用特異識別抗-生長素釋放肽抗體(1°ab)的Fc-片段的第二種抗體(來自Phoenix Peptides，Belmont，CA，USA；2°ab-HRP)，該第二種抗體以辣根過氧化酶修飾。通過5個清洗步驟(100微升PBS)去除未結(jié)合的第二種抗體(2°ab-HRP)。此說明于圖26D中。
為了定量，加入100微升TBS底物(Amersham Biosciences，LittleChalfont，UK)，將板密封并在暗室中培育30分鐘。然后，加入50微升終止溶液。在450nm處通過吸收測量來測定底物的酶促轉(zhuǎn)化程度并記錄吸收單位的差異。
如圖25中所示，使用一組生長素釋放肽標準來繪制吸收-生長素釋放肽濃度標準曲線。
結(jié)果 原則上，實驗數(shù)據(jù)證明可使用Spiegelmer NOX-B11以濃度-依賴方式固定辛?；L素釋放肽，因此，其具有作為EIA型檢測分析中的試劑的潛力。
本專利說明書中所揭示的本發(fā)明特性、權(quán)利要求和/或附圖可分別及以其任何組合作為用來實現(xiàn)本發(fā)明的多種不同形式的材料。
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<213>Rattus norvegicus
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>生長素釋放肽
<400>2
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>3
<211>25
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>3
uaarwccgaa rguahccauu ccurc 25
<210>4
<211>25
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>4
uaagaccgaa gguacccaau ccuac 25
<210>5
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>5
ggguaagcgu aagaccgaaa guaaccaauc cuaccguaua uacggugagg cagcac56
<210>6
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>6
ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacagugagg cagcac56
<210>7
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>7
ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>8
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>8
ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucguauc uauggugagg cagcac56
<210>9
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>9
ggguaugcau aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>10
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>10
ggguaugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>11
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>11
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>12
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>12
ggguguaugu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac56
<210>13
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>13
gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac56
<210>14
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>14
gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucauauc uacggugagg cagcac56
<210>15
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>15
gggugugcgu aagaccgaag guacccaauc cuaccuacua acuggugagg cagcac56
<210>16
<211>55
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>16
gggugacgua agaccgaagg uacccaaucc uaccuuuccu gaggugaggc agcac55
<210>17
<211>51
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>17
gggugcugug aggcaaaaaa guaaguccga agguaaccaa uccuacagca c51
<210>18
<211>50
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>18
gggugcugug aggcaaugcg uaaguccgaa gguauccaau ccugcagcac50
<210>19
<211>50
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>19
ggguguugug aggcaauaag uaaguccgaa gguaaccaau ccugcagcac50
<210>20
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>20
cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47
<210>21
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>21
cgugugaggu aguaaaaaaa aaaaaacgua aauccgaagg uaaccaaucc uacacg 56
<210>22
<211>50
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>22
cgugcgguga ggcaaaaacg uaagaccgaa gguaaccauu ccuacccacg 50
<210>23
<211>48
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>23
cgugcgguga ggcagacgua agaccgaagg uaaccauucc uacccacg48
<210>24
<211>41
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>24
cggugaggca gacguaagac cgaagguaac cauuccuacc g 41
<210>25
<211>39
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>25
cggugaggca gauaagaccg aagguaacca uuccuaccg39
<210>26
<211>38
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>26
cggugaggca auaagaccga agguaaccau uccuaccg 38
<210>27
<211>39
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>27
ggugaggcag acguaagacc gaagguaacc auuccuacc 39
<210>28
<211>38
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>28
gguaggcaga cguaagaccg aagguaacca uuccuacc 38
<210>29
<211>43
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>29
ccggugaggc agacguaaga ccgaagguaa ccauuccuac cgg 43
<210>30
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>30
ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg40
<210>31
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>31
ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg40
<210>32
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>32
ccggugaggc cguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40
<210>33
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>33
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>34
<211>49
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)..(36)
<223>n是S
<400>34
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccnggug aggcagcac49
<210>35
<211>49
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>35
cguaagaccg aagguaacca auccuaccgu aucuacggug aggcagcac49
<210>36
<211>51
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(37)
<223>n是S
<400>36
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccgncgg ugaggcagca c 51
<210>37
<211>54
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>37
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagc54
<210>38
<211>50
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>38
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uaucuacggu gaggcagcac 50
<210>39
<211>45
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>N是S
<400>39
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg ncggugaggc agcac45
<210>40
<211>45
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>n是S
<400>40
cggugaggca gcacngcgua agaccgaagg uaaccaaucc uaccg45
<210>41
<211>43
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n是S
<400>41
cggugaggca gcngcguaag accgaaggua accaauccua ccg 43
<210>42
<211>43
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>n是S
<400>42
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg ncggugaggc agc 43
<210>43
<211>50
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>43
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uaucuacggu gaggcagcac50
<210>44
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>44
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg aaacggugag gcagcac47
<210>45
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>45
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg auacggugag gcagcac47
<210>46
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>46
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg acacggugag gcagcac47
<210>47
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>47
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg caacggugag gcagcac47
<210>48
<211>48
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>48
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg aucucgguga ggcagcac 48
<210>49
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>49
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uuucggugag gcagcac47
<210>50
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>50
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg uaucggugag gcagcac47
<210>51
<211>45
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>連接于5’-端的PEG部分
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>n是S
<400>51
gcguaagacc gaagguaacc aauccuaccg ncggugaggc agcac45
<210>52
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc feature
<223>連接于5’-端的PEG部分
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>連接于5’-端的PEG部分
<400>52
ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40
<210>53
<211>28
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>生物素化的人類D-生長素釋放肽
<400>53
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>54
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>54
ggguaagcgu aagaccgaaa guaaccaauc cuaccguaua uacggugagg cagcac56
<210>55
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>55
ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacagugagg cagcac56
<210>56
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>56
ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>57
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>57
ggguaagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucguauc uauggugagg cagcac56
<210>58
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>58
ggguaugcau aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>59
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>59
ggguaugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>60
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>60
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>61
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>61
ggguguaugu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac56
<210>62
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>62
gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccauauc uacggugagg cagcac56
<210>63
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>63
gggugugcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaucauauc uacggugagg cagcac56
<210>64
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>64
gggugugcgu aagaccgaag guacccaauc cuaccuacua acuggugagg cagcac56
<210>65
<211>55
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>65
gggugacgua agaccgaagg uacccaaucc uaccuuuccu gaggugaggc agcac 55
<210>66
<211>51
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>66
gggugcugug aggcaaaaaa guaaguccga agguaaccaa uccuacagca c 51
<210>67
<211>50
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>67
gggugcugug aggcaaugcg uaaguccgaa gguauccaau ccugcagcac50
<210>68
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>68
cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg 47
<210>69
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>69
ccggugaggc aguaagaccg aagguaacca uuccuaccgg 40
<210>70
<211>56
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>70
gggugagcgu aagaccgaag guaaccaauc cuaccguauc uacggugagg cagcac56
<210>71
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>71
uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu40
<210>72
<211>47
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的
<400>72
cgugugaggc aauaaaacuu aaguccgaag guaaccaauc cuacacg4權(quán)利要求
1.一種核酸，優(yōu)選與生長素釋放肽結(jié)合的核酸，其中該核酸包含
第一片段Box A，和
第二片段Box B，
其中
該第一片段Box A包含約25個連續(xù)核苷酸，
該第二片段Box B包含約6至8個連續(xù)核苷酸，
其中
第一片段Box A的3′-端核苷酸片段與第二片段Box B雜交，其中雜交后形成第一個雙鏈結(jié)構(gòu)，其中此第一個雙鏈結(jié)構(gòu)包含凸起部分。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中該雙鏈結(jié)構(gòu)是由第一片段Box A的5個3′-端的連續(xù)核苷酸與第二片段Box B的部分或全部核苷酸優(yōu)選第二片段Box B的6至8個連續(xù)核苷酸所形成。
3.權(quán)利要求1或2的核酸，其中該凸起部分是由不與該第一片段Box A的5個3′-端的連續(xù)核苷酸堿基配對的第二片段Box B的1至3個核苷酸，優(yōu)選由第二片段Box B的1個核苷酸，所形成。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的核酸，其中該凸起部分是由非堿基配對的嘌呤形成，其中該嘌呤優(yōu)選為鳥苷。
5.權(quán)利要求4的核酸，其中該非堿基配對的嘌呤由第二片段Box B提供。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的核酸，其中該核酸進一步包含第三片段Box C1及第四片段Box C2，
其中該第三片段Box C1包含至少一個核苷酸且
該第四片段Box C2包含至少一個核苷酸，且
其中該第三片段Box C1以其3′-端連接第二片段Box B的5′-端，而第四片段Box C2以其5′-端連接第一片段Box A的3′-端。
7.權(quán)利要求6的核酸，其中該第三片段Box C1和第四片段Box C2能雜交，其中雜交后形成第二個雙鏈結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的核酸，其中該第一個雙鏈結(jié)構(gòu)形成第一個螺旋結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求7的核酸，其中該第二個雙鏈結(jié)構(gòu)形成第二個螺旋結(jié)構(gòu)。
10.權(quán)利要求9的核酸，其中該第二個螺旋結(jié)構(gòu)為螺旋或螺旋樣結(jié)構(gòu)，其包含1至10個堿基對，優(yōu)選為1至3個堿基對，更優(yōu)選為2至3個堿基對。
11.權(quán)利要求9或10的核酸，其中該第一個螺旋結(jié)構(gòu)通過第二個螺旋結(jié)構(gòu)延長。
12.權(quán)利要求6-11中任一項的核酸，其中該第三片段Box C1包含約1至10個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至3個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為2或3個連續(xù)核苷酸。
13.權(quán)利要求6-12中任一項的核酸，其中該第四片段Box C2包含約1至10個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至3個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為2或3個連續(xù)核苷酸。
14.權(quán)利要求6-13中任一項的核酸，其中該核酸進一步包含第五片段Box D，其中該第五片段Box D包含至少二個連續(xù)核苷酸。
15.權(quán)利要求14的核酸，其中該第五片段Box D包含序列5′-CA。
16.權(quán)利要求14或15的核酸，其中該第五片段Box D包含任何長度的連續(xù)核苷酸，其中該長度選自2、3、4、5和6個連續(xù)核苷酸。
17.權(quán)利要求13-16中任一項的核酸，其中該第五片段Box D包含序列
5′CA(X)n3′
其中X為任意核苷酸，其優(yōu)選選自A、G、T、C、U和I，
且其中n為選自0、1、2、3和4的任何整數(shù)。
18.權(quán)利要求17的核酸，其中該第五片段Box D由序列5′CA(X)n3′所組成，其中n＝4。
19.權(quán)利要求14-18中任一項的核酸，其中該第五片段Box D以其5′-端連接第二片段Box B的3′-端。
20.權(quán)利要求14-19中任一項的核酸，其中該核酸進一步包含第六片段Box E，其中該第六片段Box E包含至少一個核苷酸。
21.權(quán)利要求20的核酸，其中該第六片段Box E包含約1至10個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至4個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為3個連續(xù)核苷酸。
22.權(quán)利要求20或21的核酸，其中該第六片段Box E的至少一個核苷酸選自U和G。
23.權(quán)利要求22的核酸，其中該U或G核苷酸直接位于第一片段Box A的5′-端旁。
24.權(quán)利要求20-23中任一項的核酸，其中該第六片段Box E以其3′-端連接第一片段Box A的5′-端。
25.權(quán)利要求20-24中任一項的核酸，其中該第五片段Box D的3′-端通過第一個間隔子連接第六片段Box E的5′-端。
26.權(quán)利要求20-25中任一項的核酸，其中該第四片段Box C2的3′-端通過第二個間隔子連接第三片段Box C1的5′-端。
27.權(quán)利要求25或26的核酸，其中該第一個及第二個間隔子分別獨立地選自親水性間隔子。
28.權(quán)利要求27的核酸，其中該親水性間隔子選自核酸間隔子和非核酸間隔子。
29.權(quán)利要求28的核酸，其中該第一個間隔子為核酸間隔子，其包含約1至20個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為1至5個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為2個連續(xù)核苷酸。
30.權(quán)利要求28的核酸，其中該第二個間隔子為核酸間隔子，其包含約3至20個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選為3至5個連續(xù)核苷酸且更優(yōu)選為3個連續(xù)核苷酸。
31.權(quán)利要求30的核酸，其中該第二個間隔子由ACA或CAA所構(gòu)成。
32.權(quán)利要求28的核酸，其中該間隔子是非核酸。
33.權(quán)利要求32的核酸，其中該第一個間隔子和/或第二個間隔子包含至少一個乙二醇部分或數(shù)個此類乙二醇部分。
34.權(quán)利要求33的核酸，其中該間隔子的分子量為約172至688Da，優(yōu)選為344Da。
35.權(quán)利要求1-34任一項的核酸，其中該核酸為環(huán)狀核酸。
36.權(quán)利要求1-35中任一項的核酸，其具有如下的結(jié)構(gòu)
5′-
-間隔子-
或如下的結(jié)構(gòu)
5′-
-間隔子-
37.權(quán)利要求1-36中任一項的核酸，其中該第一片段Box A包含下述序列
UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C(SEQ ID No.3)；
其中
X1＝G或A；
X2＝A或U；
X3＝G或A；
X4＝A或C或U；和
X5＝G或A，
優(yōu)選5′UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC3′(SEQ ID No.4)。
38.權(quán)利要求1-37任一項尤其是權(quán)利要求37的核酸，其中該第二片段Box B包含序列5′GUGAGG 3′。
39.權(quán)利要求1-38任一項的核酸，其中該核酸的序列選自下述的序列
40.權(quán)利要求1-38任一項的核酸，其中該核酸選自下述的序列
41.權(quán)利要求39的核酸，其中該核酸序列選自下述的序列SEQ IDNo.29、SEQ ID No.32、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40和SEQ ID No.41。
42.權(quán)利要求39或40的核酸，其中該核酸序列選自下述的序列SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.51和SEQ ID No.52。
43.權(quán)利要求1-42任一項的核酸，其中該核酸能結(jié)合生長素釋放肽優(yōu)選人類生長素釋放肽。
44.權(quán)利要求43的核酸，其中該生長素釋放肽具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。
45.權(quán)利要求1-44任一項的核酸，其中該核酸包含修飾。
46.權(quán)利要求45的核酸，其中該修飾選自HES部分和PEG部分。
47.權(quán)利要求46的核酸，其中該修飾為由直鏈型或支鏈型PEG所組成的PEG部分，其中該PEG部分的分子量優(yōu)選為約20至120kD，更優(yōu)選為約30至80kD且最優(yōu)選為約40kD。
48.權(quán)利要求46的核酸，其中該修飾為HES部分，其中該HES部分的分子量優(yōu)選為約10至130kD，更優(yōu)選為約30至80kD且最優(yōu)選為約50kD。
49.權(quán)利要求1-48任一項的核酸，其中該核酸的核苷酸為L-核苷酸。
50.權(quán)利要求1-48任一項的核酸，其中該核酸完全由L-核苷酸所組成。
51.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-50中任一項的核酸和可選擇其它成分，其中該其它成分選自藥學(xué)上可接受的賦形劑及藥學(xué)活性劑。
52.權(quán)利要求1-50中任一項的核酸在制備藥物中的用途。
53.權(quán)利要求1-50中任一項的核酸在制備診斷工具中的用途。
54.權(quán)利要求52的用途，其中該藥物用于治療和/或預(yù)防選自下列的疾病或病癥肥胖、進食障礙疾患、糖尿病、葡萄糖代謝障礙、腫瘤、血壓失調(diào)、心血管疾病、肢端肥大病，及調(diào)節(jié)能量平衡、食欲及體重。
55.權(quán)利要求52的用途，其中該藥物用于治療和/或預(yù)防選自胃腸道疾病的疾病或病癥。
56.一種復(fù)合物，其包含生長素釋放肽和權(quán)利要求1-50中任一項的核酸，其中該復(fù)合物優(yōu)選為晶體復(fù)合物。
57.權(quán)利要求1-50中任一項的核酸在檢測生長素釋放肽中的用途。
58.一種用于篩選生長素釋放肽拮抗劑或生長素釋放肽激動劑的方法，其包含下列步驟
-提供候選的生長素釋放肽拮抗劑和/或候選的生長素釋放肽激動劑，
-提供權(quán)利要求1-50中任一項的核酸，
-提供測試系統(tǒng)，該測試系統(tǒng)在生長素釋放肽拮抗劑和/或生長素釋放肽激動劑的存在下提供信號，及
-測定該候選的生長素釋放肽拮抗劑是否為生長素釋放肽拮抗劑和/或該候選的生長素釋放肽激動劑是否為生長素釋放肽激動劑。
59.一種用于篩選生長素釋放肽激動劑和/或生長素釋放肽拮抗劑的方法，其包含下列步驟
-提供固定在一種相優(yōu)選為固相上的生長素釋放肽，
-提供權(quán)利要求1-50中任一項的核酸，優(yōu)選為經(jīng)標記的權(quán)利要求1-50中任一項的核酸，
-加入候選的生長素釋放肽激動劑和/或候選的生長素釋放肽拮抗劑，及
-測定該候選的生長素釋放肽激動劑是否為生長素釋放肽激動劑和/或該候選的生長素釋放肽拮抗劑是否為生長素釋放肽拮抗劑。
60.權(quán)利要求59的方法，其特征在于進行所述測定，從而評估該核酸是否被候選的生長素釋放肽激動劑或候選的生長素釋放肽拮抗劑所置換。
61.一種用于檢測生長素釋放肽的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-50中任一項的核酸。
62.一種生長素釋放肽拮抗劑，其可通過權(quán)利要求59或60的方法獲得。
63.一種生長素釋放肽激動劑，其可通過權(quán)利要求59或60的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸，優(yōu)選的與生長素釋放肽結(jié)合的核酸，其中該核酸包含第一片段Box A和第二片段Box B，其中該第一片段Box A包含約25個連續(xù)核苷酸，該第二片段Box B包含約6至8個連續(xù)核苷酸，其中第一片段Box A的3′-端核苷酸片段與第二片段Box B雜交，其中雜交后形成第一個雙鏈結(jié)構(gòu)，其中此第一個雙鏈結(jié)構(gòu)包含凸起部分。
文檔編號C12Q1/68GK101189337SQ200680019954
公開日2008年5月28日 申請日期2006年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日
發(fā)明者F·雅羅施, D·尤爾伯格, C·馬奇, S·黑爾姆林, S·克魯斯曼 申請人:諾松制藥股份公司