專利名稱：與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物及其用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物，可用于小麥白粉病抗病育種分子標記輔助選擇。
二、技術(shù)背景小麥(Triticum aestivum)作為世界性的重要糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位，但由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的小麥白粉病已成為威脅我國小麥生產(chǎn)的常見病害之一，并且隨著肥水條件的改善，近年有不斷加重的趨勢。把抗性基因引入栽培品種，培育和推廣抗病品種是防治白粉病最經(jīng)濟有效的方法。
提莫菲維小麥(Triticum timopheevii L.)的2G染色體長臂上攜帶抗白粉病基因Pm6(參考文獻Friebe B，Jiang J，Raupp W，McIntosh J，and Gill B S.Characterization ofwheat-alien translocations conferring resistance to disease and pestsCurrent status.Euphytica，1996，9159-87)。在中國部分地區(qū)Pm6單基因喪失了抗性，但是含Pm2+6的品種對白粉病的抗性是有效的，所以Pm6基因在抗病育種中仍具有利用價值。
Bengt和Mac Key利用含Pm6的普通小麥-提莫菲維易位系為供體與不含任何抗白粉病基因的北歐春小麥品種Prins雜交后連續(xù)回交，結(jié)合抗病性鑒定，獲得了一系列抗白粉病的普通小麥—提莫菲維小麥漸滲系，這些漸滲系都含有Pm6基因，但易位片段大小不同。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細胞遺傳研究所1996年自Mac Key博士實驗室引入一套普通小麥—提莫菲維小麥漸滲系，并進行分子遺傳學(xué)鑒定、分子標記篩選和抗白粉病育種研究，確定IGV1-465所含的易位片段最小，并篩選到與Pm6遺傳距離為1.6±1.5cM的分子標記Xbcd135(參考文獻陶文靜，劉金元，劉大鈞，陳佩度.普通小麥-提莫菲維小麥白粉病抗性漸滲系中滲入片段的準確鑒定.植物學(xué)報，1999，41(9)941-946；Wengjing Tao，Dajun Liu.Jinyuan Liu，Yugao Feng，Peidu Chen.Genetic mapping of thepowdery mildew resistance genes Pm6 in wheat by RFLP analysis.TAG，2000，100546-548.)。王心宇用同一套材料篩選RAPD分子標記，發(fā)現(xiàn)OPV20與Pm6連鎖，遺傳距離為3.0±2.2cM(參考文獻Wang Xin-Yu，Qi Zeng-Jun，Identification of RAPDMarkers Tightly Linked to Wheat Powdery Mildew Resistance Gene Pm6.2000，ActaGenetica Sinica，27(12)1072-1079)。另外，河南大學(xué)的許紅星以感病親本豫麥13號和含Pm6基因的抗病親本Timgalen為材料，尋找到RAPD標記S138并且將其轉(zhuǎn)化成SCAR標記，遺傳距離為27.1cM(參考文獻許紅星，劉紅彥，李鎖平.小麥抗白粉病基因Pm6的RAPD標記和SCAR標記。河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，25-28)。
通過分子標記輔助選擇進行抗病育種，可以快速、高效地把Pm6基因轉(zhuǎn)入普通小麥中，加快育種進程。但已篩選的上述3個分子標記不適合在育種中應(yīng)用RFLP標記Xbcd135花費大、操作復(fù)雜；RAPD標記OPV20不穩(wěn)定；SCAR標記與Pm6基因的距離太大。所以篩選簡單易用、連鎖距離更近的分子標記，不但可以用于育種程序中大群體的分子標記輔助選擇，而且可以為抗病基因的分離克隆奠定基礎(chǔ)。本研究就是在上述思想的指導(dǎo)下，進行了開發(fā)與Pm6基因連鎖的分子標記的工作。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于提供與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物及其用法，此標記引物可以提高分子標記輔助選擇效率。
技術(shù)方案本發(fā)明是與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物，該引物是以探針BCD135序列為模板設(shè)計而得到的，其序列為引物NAU/STSBCD135-1SEQ ID NO.1atttggatgaggcaaaggtg，SEQ ID NO.2tctgctggtcctctgatgtg或者引物NAU/STSBCD135-2SEQ ID NO.3gctccgaagcaagagaagaa，SEQ ID NO.2tctgctggtcctctgatgtg。
引物NAU/STSBCD135-1從攜帶Pm6基因的材料中能同時擴增出300bp和350bp的特異條帶，引物NAU/STSBCD135-2從攜帶Pm6基因的材料中能同時擴增出230bp的特異條帶。這兩個分子標記與Pm6的遺傳距離都為1.0CM。
上述標記引物的使用方法(1)以待鑒定材料DNA作為模板，用NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2作為引物進行PCR，
PCR試劑組成為DNA模板2μL，2.5μL10×PCR buffer，1.5μLMgCl2，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H2O；PCR程序為94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，32個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃保存，PCR產(chǎn)物在非變性的聚丙烯酰胺39∶1膠上電泳分離，在用銀染法進行染色；(2)標記引物鑒定Pm6基因的結(jié)果為以NAU/STSBCD135-1為引物進行PCR，攜帶Pm6基因的植株能擴增出約300bp和350bp的條帶；以NAU/STSBCD135-2為引物進行PCR，攜帶Pm6基因的植株能擴增出約230bp的條帶。
有益效果本發(fā)明與已有技術(shù)相比較的優(yōu)點1、本發(fā)明分子標記引物NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2是基于RFLP探針設(shè)計的，可用PCR來鑒定植株中是否含有Pm6，使用起來比RFLP標記Xbcd135更方便。
2、NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2是序列?；缘囊?，所以比已有的RAPD標記OPV20更穩(wěn)定。
3、引物NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2擴增的產(chǎn)物與Pm6基因之間的遺傳距離比SCAR標記S138與Pm6基因之間的遺傳距離近得多，所以用NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2進行PCR鑒定Pm6基因比用SCAR標記S138鑒定時結(jié)果更準確。
4、引物NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2與模板的結(jié)合能力較強，雖然本研究所采用的退火溫度為55度，但退火溫度從50-63度均能較好的擴增出目標片段，實驗要求比較寬松。
5、本研究在進行連鎖分析時候采用的F2分離群體比陶文靜研究時所使用的群體大，所以分析得到的遺傳距離(1.0CM)比陶文靜分析得到的遺傳距離(1.6±1.5cM)更可靠。
三

圖1BCD135的序列及3個SSR位置圖2以NAU/STSBCD135-1為引物在親本及抗、感池中進行的PCR1.Marker 2.Prins 3.感池 4.抗池 5.IGVI465 6.Triticum timopheevi
圖3以NAU/STSBCD135-2為引物在親本及抗、感池中進行的PCR1.Marker 2.Prins 3.感池 4.抗池 5.IGVI465 6.Triticum timopheevi圖4以NAU/STSBCD135-1為引物在F2群體中進行的PCRR抗病單株；S感病單株圖5以NAU/STSBCD135-2為引物在F2群體中進行的PCRR抗病單株；S感病單株五具體實施方式
1、引物的設(shè)計在探針BCD135(參考文獻Nils Rostoks，Yong-Jin Park.Genomic sequencing revealgene content，genomic organization，and recombination relationships in barley.Funct IntegrGenomics，2002，251-59；Yong-Jin Park，Anupan Dixit.Further Evidence ofMicrocolinearity Between Barley and Rice Genomes at Two Orthologous Regions.MolCells，2004，17492-502.)中采用軟件SSR Hunter(參考文獻李強，萬建民等.SSRHunter，一個本地化的SSR位點搜索軟件的開發(fā).遺傳，2005，27(5)808-810)尋找到3個SSR位點，第1個SSR位點(SSR-1)從第257個堿基到第271個堿基、第2個SSR位點(SSR-2)從第970個堿基到第990個堿基、第3個SSR位點(SSR-3)從第1096個堿基到第1110個堿基(圖1)。采用軟件Primer 3.0(http//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，在SSR-2和SSR-3位點的兩側(cè)設(shè)計引物，分別為NAU/STSBCD135-1sEQ ID NO.1atttggatgaggcaaaggtg，SEQ IDNO.2tctgctggtcctctgatgtg和NAU/STSBCD135-2SEQ ID NO.3gctccgaagcaagagaagaa，SEQ ID NO.2tctgctggtcctctgatgtg。(圖1)2、用標記引物NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2在親本間檢測多態(tài)性利用引物NAU/STSBCD135-1進行PCR，在含有Pm6基因的提莫菲維(公知公用，F(xiàn)riebeB，Jiang J，Raupp W，McIntosh J，and Gill B S.Characterization of wheat-alientranslocations conferring resistance to disease and pestsCurrent status.Euphytica，1996，9159-87)、漸滲系IGV1-465(公知公用，Wengjing Tao，Dajun Liu.Jinyuan Liu，Yugao Feng，Peidu Chen.Genetic mapping of the powdery mildew resistance genes Pm6 in wheat byRFLP analysis.TAG，2000，100546-548.)、抗病池(隨機挑選IGV1-465×Prins的F2群體中10株抗病植株的DNA等量混合組成)和不含Pm6基因的感病親本Prins(公知公用品種，Wengjing Tao，Dajun Liu.Jinyuan Liu，Yugao Feng，Peidu Chen.Genetic mappingof the powdery mildew resistance genes Pm6 in wheat by RFLP analysis.TAG，2000，100546-548.)、感病池(隨機挑選IGV1-465×Prins的F2群體中10株感病植株的DNA等量混合組成)中進行多態(tài)性檢測。結(jié)果表明含有Pm6基因的材料中都能檢測到2條特異帶(約300bp和350bp)(圖2)。
利用引物NAU/STSBCD135-2進行PCR，在含有Pm6基因提莫菲維、漸滲系IGV1-465、抗病池(隨機挑選IGV1-465×Prins的F2群體中10株抗病植株的DNA等量混合組成)和不含Pm6基因的感病親本Prins、感病池(隨機挑選IGV1-465×Prins的F2群體中10株感病植株的DNA等量混合組成)中進行多態(tài)性檢測。結(jié)果表明含有Pm6基因的材料中都能檢測到1條特異帶(約270bp)(圖3)。
PCR試劑組成為DNA模板2μL，2.5μL10×PCR buffer，1.5μLMgCl2，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H2O；PCR程序為94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，32個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃保存，PCR產(chǎn)物在非變性的聚丙烯酰胺39∶1膠上電泳分離，在用銀染法進行染色。
3、用標記引物NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2在F2群體中驗證利用引物NAU/STSBCD135-1進行PCR(條件和方法同上)，在[IGV1-465×Prins]的F2群體中進行多態(tài)性檢測。結(jié)果表明在424個F2單株中，抗病單株327株都能擴增出300和350bp的條帶，97株感病單株中有4單株能擴增出兩條特異帶，另93株擴增不出(圖4)。
利用引物NAU/STSBCD135-2進行PCR，在[IGV1-465×Prins]的F2群體中進行多態(tài)性檢測。結(jié)果表明在424個F2單株中，抗病單株327株都能擴增出約230bp的條帶，97株感病單株中有4單株能擴增出這條特異帶，另93株擴增不出(圖5)。
以NAU/STSBCD135-1為引物的擴增結(jié)果與以NAU/STSBCD135-2為引物的擴增結(jié)果是一致的。根據(jù)擴增結(jié)果，利用作圖軟件MAPMAKER 3.0計算出這兩個分子標記與Pm6的遺傳距離為1.0cM。
序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物及其用法<130>000<140>000<141>2006-07-03<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Triticum aestivum x Triticum timopheevi(小麥和提莫菲維的雜交種)<220>
<221>NAU/STSBCD135-1的左引物序列<222>(1)..(20)<223>
<400>1atttggatga ggcaaaggtg20<210>2<211>20<212>DNA<213>Triticum aestivum x Triticum timopheevi(小麥和提莫菲維的雜交種)<220>
<221>NAU/STSBCD135-1和NAU/STSBCD135-2的右端引物序列<222>(1)..(20)<223>
<400>2tctgctggtc ctctgatgtg20<210>3<211>20<212>DNA<213>Triticum aestivum x Triticum timopheevi(小麥和提莫菲維的雜交種)<220>
<221>NAU/STSBCD135-2的左端引物序列<222>(1)..(20)<223>
<400>3gctccgaagc aagagaagaa20
權(quán)利要求
1.與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物，其序列為引物NAU/STSBCD135-1SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或者引物NAU/STSBCD135-2SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述與Pm6連鎖的標記引物，其特征在于用引物NAU/STSBCD135-1從攜帶Pm6基因的抗病植株中擴增出300bp和350bp的特異片段，用引物NAU/STSBCD135-2從攜帶Pm6基因的抗病植株中擴增出230bp的特異片段。
3.權(quán)利要求1-2之一所述與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物的用法(1)以待鑒定材料的DNA作為模板，用NAU/STSBCD135-1或NAU/STSBCD135-2作為引物進行PCR，PCR試劑組成為DNA模板2μL，2.5μL 10xPCR buffer，1.5μLMgCl2，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H2O；PCR程序為94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，50-63℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，32個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃保存；PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物在39∶1非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法進行染色；(2)標記引物鑒定Pm6基因的結(jié)果為用引物NAU/STSBCD135-1進行PCR，能擴增出300bp和350bp特異帶的植株為攜帶Pm6基因的植株；或者用引物NAU/STSBCD135-2進行PCR，能擴增出230bp特異帶的植株為攜帶Pm6基因的植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了與小麥抗白粉病基因Pm6連鎖的標記引物及其用法。根據(jù)與Pm6連鎖的RFLP探針BCD135的序列設(shè)計了兩對STS引物分別為NAU/STS
文檔編號C12Q1/68GK1884296SQ20061008831
公開日2006年12月27日 申請日期2006年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日
發(fā)明者王秀娥, 紀劍輝, 曹愛忠, 王海燕, 陳佩度, 劉大鈞 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)