專利名稱：除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物降解劑的制備方法，具體地說是一種可以降解除草劑咪唑乙煙酸的生物降解劑的制備方法。
背景技術(shù)：
咪唑乙煙酸(imazethapyr)屬于咪唑啉酮類除草劑，是80年代德國巴斯夫公司開發(fā)的一種高效、低毒、廣譜的大豆田除草劑。自90年代大面積使用以來，由于其殺草譜廣、超高活性、高選擇性、使用方法靈活等特點，一直是大豆田化學除草的主要品種。據(jù)初步統(tǒng)計，2005年黑龍江省大豆種植面積5050萬畝，咪唑乙煙酸的銷售量(制劑)達4000噸以上。咪唑啉酮類除草劑不揮發(fā)，不水解，在土壤中主要通過微生物降解而消失，殘留期比較長，易對后茬敏感作物造成傷害，使用普施特后36個月內(nèi)，不能種植甜菜、油菜、谷子、亞麻、西瓜、蔬菜等作物，嚴重影響了作物輪作換茬及作物結(jié)構(gòu)調(diào)整，也限制了其應(yīng)用。由于土壤殘留，打亂了正常的作物輪作，造成大豆長期連作的局面，北部地區(qū)有的農(nóng)民大豆已經(jīng)重茬8-10年，造成嚴重減產(chǎn)。因此，如何消除咪唑乙煙酸的殘留毒性一直受到各國科學工作者的關(guān)注。尋找有效的農(nóng)藥降解方式，解決農(nóng)藥殘留問題是科學家需要面對、亟待解決的重要課題。
目前，國內(nèi)外學者對解決除草劑殘留藥害問題采取了許多措施，但效果都不明顯。美國等西方國家主要是通過降低此類除草劑使用劑量及限制使用此類除草劑來解決此類問題，但殘留藥害的問題仍然存在。許多學者在實驗室內(nèi)研究化學解毒劑來解決農(nóng)藥的殘留問題，但只保護了作物，而對土壤中殘留的農(nóng)藥沒有起到降解的作用，從根本上解決不了農(nóng)藥的殘留問題。大量研究證明，自然環(huán)境中存在的多種微生物在農(nóng)藥降解方面起著重要的作用，科研工作者通過富集培養(yǎng)、分離篩選等技術(shù)已從土壤、污泥、污水、天然水體、垃圾場和廄肥中分離到降解有機磷類農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物、除草劑中的阿特拉津在國內(nèi)外使用最廣泛，其降解菌的研究報道相對較多，但能夠有效降解咪唑乙煙酸的微生物尚未見報道。農(nóng)藥的微生物降解目前雖已得到了很大的發(fā)展，各種降解農(nóng)藥的微生物的微生物菌株(包括細菌、真菌等)也相繼被分離和鑒定，但是應(yīng)用微生物進行生物修復(fù)的實際應(yīng)用卻往往由于其較低的降解率而受到影響。生物降解是解決農(nóng)藥殘留的發(fā)展方向，雖然該方法綠色環(huán)保，但由于其較低的降解率而影響了該項技術(shù)的發(fā)展。因此篩選出能夠高效降解土壤中殘留的咪唑乙煙酸的微生物具有極其重要的社會價值和經(jīng)濟價值。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種對除草劑咪唑乙煙酸有良好的降解效果的除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的取田間多年施用咪唑乙煙酸的土壤為處理對象，用無菌生理鹽水溶解制成土壤懸濁液；在蛋白胨培養(yǎng)基中添加咪唑乙煙酸的濃度為100mg·L-1，在121℃、20分鐘滅菌冷卻后，接種土壤懸濁液，接種量10％，在30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液按10％接種量接種于咪唑乙煙酸的濃度為200mg·L-1的培養(yǎng)基中，然后在30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，依次類推10次接種，按咪唑乙煙酸100mg·L-1的濃度梯度增長，使最終培養(yǎng)基的咪唑乙煙酸的濃度在接種前達1000mg·L-1，制得富集降解菌株培養(yǎng)物種子；將富集降解菌株培養(yǎng)物種子按照10％的接種量接種到pH＝7.0的馬鈴薯培養(yǎng)基中進行一級擴大培養(yǎng)，再按照10％的接種量接種到pH＝7.0的馬鈴薯培養(yǎng)基中進行二級擴大培養(yǎng)，然后分別接種馬鈴薯培養(yǎng)基或麩皮稻殼培養(yǎng)在28℃-30℃溫度下發(fā)酵30-36小時，包裝制成液體或固體形式的產(chǎn)品。
本發(fā)明還可以包括這樣一些結(jié)構(gòu)特征1、所述的降解菌株培養(yǎng)基為取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1升，煮沸10分鐘，紗布過濾，加20克蔗糖，0.1％ KH2PO4，0.05％MgSO47H2O，再加熱使融化，最后用自來水定容至1升。
2、所述的降解菌株培養(yǎng)基是80％的麩皮和20％的稻殼。
3、所述的降解菌株培養(yǎng)基是80％的麩皮和20％的稻殼，并添加占麩皮和稻殼總重量1％ KH2PO4、0.5％ MgSO4·7H2O和2％的葡萄糖。
4、所述的發(fā)酵時間是30-36小時，所述的包裝制成產(chǎn)品是將發(fā)酵液無菌灌裝。
5、所述的發(fā)酵時間是30-36小時，所述的包裝制成產(chǎn)品是將發(fā)酵物在50℃溫度下進行通風干燥，粉碎后進行包裝。
本發(fā)明中所涉及的百分比，除有注明之外均為重量百分比。
將10次富集后的培養(yǎng)物進行平板分離，經(jīng)28℃-30℃培養(yǎng)24小時后，觀察平板菌落生長情況，鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有生長旺盛的菌種微觀形態(tài)一致，系青霉狀真菌；經(jīng)生理生化實驗，結(jié)果相同。由此證明，通過咪唑乙煙酸濃度梯度逐漸增長的富集培養(yǎng)過程，土壤中僅有一種微生物適應(yīng)高濃度咪唑乙煙酸而生存下來，故確定該微生物為本發(fā)明的出發(fā)菌株。
以玉米為指示作物進行生物測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)咪唑乙煙酸的降解半衰期由自然條件的75天降低到30天。
選取水稻為指示作物進一步驗證該菌株的降解功效。
將本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)品，噴灑在含咪唑乙煙酸的土壤中(咪唑乙煙酸濃度50μg·kg-1)，經(jīng)30℃、60天時間的降解后，處理咪唑乙煙酸的降解率為80％，而對照的降解率為45％，90天后處理降解率為98％，此殘留濃度下對大多數(shù)作物的生長無不良影響，而對照降解率為60％，加菌處理在5個月內(nèi)完全清除土壤中殘留的咪唑乙煙酸。充分證明了使用此項生物技術(shù)可以有效解決咪唑乙煙酸對后茬敏感作物的傷害問題。
大豆是我國主要糧食和經(jīng)濟作物之一，種植面積占我國糧食種植面積10-20％，而咪唑乙煙酸的使用面積之大，其殘留藥害嚴重影響后茬作物的輪種，這是幾十年來一直困繞我國乃至世界農(nóng)業(yè)的最棘手的問題之一。本項發(fā)明采用生物技術(shù)，菌種取之于土壤而用之于土壤，適應(yīng)環(huán)境能力極強，在條件適宜情況下，即可大量繁殖而作用于咪唑乙煙酸，從而消除咪唑乙煙酸對后茬作物的影響，為解決大豆田咪唑乙煙酸的殘留藥害問題提供了一條切實可行的途徑。采用綠色降解技術(shù)在保護環(huán)境的同時減少農(nóng)作物損失，可能會有肥料的作用，降低同等功效其它方法的生產(chǎn)成本，減輕農(nóng)民負擔，增加農(nóng)民收入，保護生態(tài)環(huán)境，具有顯著的社會效益。而且，降低土壤中殘留農(nóng)藥對糧食污染，對綠色食品生產(chǎn)有極其重要的意義。
本發(fā)明具有極其重要的學術(shù)價值(1)將微生物技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥降解，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中尚屬首創(chuàng)。(2)通過馴化微生物使其服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，在基礎(chǔ)理論研究范疇中占有重要位置。(3)通過對微生物降解農(nóng)藥機理的研究，明確微生物修復(fù)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位和作用，對研究現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)具有深遠的指導(dǎo)意義。
具體實施方式
下面舉例對本發(fā)明作更詳細的描述1、取田間多年施用咪唑乙煙酸的土壤為處理對象，用無菌生理鹽水溶解后制得土壤懸濁液；在蛋白胨培養(yǎng)基中添加咪唑乙煙酸的濃度為100mg·L-1，該培養(yǎng)基在121℃、20分鐘滅菌冷卻后，接種土壤懸濁液，接種量10％，在30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液按10％接種量接種于咪唑乙煙酸的濃度為200mg·L-1的蛋白胨培養(yǎng)基中，然后在30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，依次類推10次接種，按咪唑乙煙酸100mg·L-1的濃度梯度增長，使最終蛋白胨培養(yǎng)基中的咪唑乙煙酸的濃度在接種前達1000mg·L-1，得到富集降解菌株培養(yǎng)物種子；富集降解菌株培養(yǎng)物種子經(jīng)過斜面培養(yǎng)(馬鈴薯20克，蔗糖2克，0.1％ KH2PO4，0.05％ MgSO4·7H2O，水100毫升和2％的瓊脂斜面28℃培養(yǎng)36小時)、一級擴大培養(yǎng)和二級擴大培養(yǎng)后(擴大培養(yǎng)基均采用馬鈴薯20克，蔗糖2克，0.1％ KH2PO4，0.05％ MgSO4·7H2O，水100毫升，28℃通風培養(yǎng)24小時)，按照10％的接種量加入由馬鈴薯20克，蔗糖2克，0.1％ KH2PO4，0.05％ MgSO4·7H2O，水100毫升組成的降解菌株培養(yǎng)基中，在28℃溫度下通風發(fā)酵36小時，發(fā)酵液無菌罐裝，包裝制成產(chǎn)品。
2、取田間多年施用咪唑乙煙酸的土壤為處理對象，用無菌生理鹽水溶解后制得土壤懸濁液；在蛋白胨培養(yǎng)基中添加咪唑乙煙酸的濃度為100mg·L-1，該培養(yǎng)基在121℃、20分鐘滅菌冷卻后，接種土壤懸濁液，接種量10％，在28℃-30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液按10％接種量接種于咪唑乙煙酸的濃度為200mg·L-1的蛋白胨培養(yǎng)基中，然后在28℃-30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，依次類推10次接種，按咪唑乙煙酸100mg·L-1的濃度梯度增長，使最終蛋白胨培養(yǎng)基中的咪唑乙煙酸的濃度在接種前達1000mg·L-1，得到富集降解菌株培養(yǎng)物種子；富集降解菌株培養(yǎng)物種子經(jīng)過斜面培養(yǎng)(馬鈴薯20克，蔗糖2克，0.1％ KH2PO4，0.05％ MgSO4·7H2O，水100毫升和2％的瓊脂斜面28℃培養(yǎng)36小時)、一級擴大培養(yǎng)和二級擴大培養(yǎng)后(擴大培養(yǎng)基均采用馬鈴薯20克，蔗糖2克，0.1％ KH2PO4，0.05％ MgSO4·7H2O，水100毫升，28℃通風培養(yǎng)24小時)，按照10％的接種量加入由1％KH2PO4、0.5％ MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、10％水和余量的麩皮組成的降解菌株培養(yǎng)基中，在28℃-30℃溫度下通風發(fā)酵30-36小時，將發(fā)酵物在50℃溫度下進行通風干燥，粉碎后進行包裝，包裝制成產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法，其特征是取田間多年施用咪唑乙煙酸的土壤為處理對象，用無菌生理鹽水溶解制成土壤懸濁液；在蛋白胨培養(yǎng)基中添加咪唑乙煙酸的濃度為100mg·L-1，在121℃、20分鐘滅菌冷卻后，接種土壤懸濁液，接種量10％，在28℃-30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液按10％接種量接種于咪唑乙煙酸的濃度為200mg·L-1的培養(yǎng)基中，然后在28℃-30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)5天，依次類推10次接種，按咪唑乙煙酸100mg·L-1的濃度梯度增長，使最終培養(yǎng)基的咪唑乙煙酸的濃度在接種前達1000mg·L-1，制得富集降解菌株培養(yǎng)物種子；將富集降解菌株培養(yǎng)物種子按照10％的接種量接種到pH＝7.0的馬鈴薯培養(yǎng)基中進行一級擴大培養(yǎng)，再按照10％的接種量接種到pH＝7.0的馬鈴薯培養(yǎng)基中進行二級擴大培養(yǎng)，然后分別接種馬鈴薯培養(yǎng)基或麩皮稻殼培養(yǎng)在28℃-30℃溫度下發(fā)酵30-36小時，包裝制成液體或固體形式的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法，其特征是所述的降解菌株培養(yǎng)基是馬鈴薯培養(yǎng)基，其制取方法為取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1升，煮沸10分鐘，紗布過濾，濾液加20克蔗糖，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，再加熱使融化，最后用自來水定容至1升；生產(chǎn)菌種培養(yǎng)基按此比例擴大。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法，其特征是所述的降解菌株培養(yǎng)基是麩皮稻殼培養(yǎng)，其組成為80％的麩皮和20％的稻殼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法，其特征是添加占麩皮和稻殼總重量1％KH2PO4、0.5％MgSO4·7H2O和2％的葡萄糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法，其特征是所述的發(fā)酵時間是30-36小時，所述的包裝制成產(chǎn)品是將發(fā)酵液無菌罐裝。
6.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法，其特征是所述的發(fā)酵時間是30-36小時，所述的包裝制成產(chǎn)品是將發(fā)酵物在50℃溫度下進行通風干燥，粉碎后進行包裝。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種除草劑咪唑乙煙酸高效降解菌劑的制備方法。取田間多年施用咪唑乙煙酸的土壤為處理對象，制得土壤懸濁液；在蛋白胨培養(yǎng)基中添加咪唑乙煙酸的濃度為100mgL
文檔編號C12N1/00GK1869193SQ20061001004
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日
發(fā)明者陶波, 滕春紅, 欒鳳俠, 劉輝, 金萍 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學