專利名稱：衍生自吩嗪酮的新型酶底物及其在檢測具有肽酶活性的微生物中作為揭示劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測肽酶活性的新型生色酶底物。這些底物可在包括產(chǎn)生物理化學信號的酶促水解步驟的應用中使用，特別是在微生物學、生物化學、免疫學、分子生物學、組織學等中。與現(xiàn)有的底物(其大多數(shù)只是產(chǎn)生熒光的)相比，本發(fā)明的生色底物可以用于檢測微生物，特別是在凝膠化的介質(zhì)中，因為其產(chǎn)生在反應介質(zhì)中不擴散從而集中在菌落范圍內(nèi)的著色。
本發(fā)明還涉及包含此類底物的反應介質(zhì)，涉及所述底物或介質(zhì)用于檢測表現(xiàn)出肽酶活性的革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和酵母的用途，和涉及使用方法。
通常將能夠通過水解而切割在氨基酸的?；筒分g形成的酰胺基團的酶稱為氨肽酶，和將能夠通過水解而切割在肽的?；鶜埢筒分g形成的酰胺基團的酶稱為肽酶。在本申請中，術(shù)語“肽酶”根據(jù)情況可以指上面定義的肽酶和氨肽酶兩者。
用于檢測肽酶活性的、不擴散的酶生色底物已被描述，并且在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。由此，由本申請人提交的專利申請WO98/04735和WO99/38995涵蓋了這樣的底物。然而，這些底物具有各種缺點其難以合成，純度很低，和產(chǎn)率很低。此外，為了在培養(yǎng)介質(zhì)中使用，必須確定非常精確的介質(zhì)組成以便觀察顏色。
可以在用于檢測混合培養(yǎng)的微生物的固體介質(zhì)中使用的唯一的現(xiàn)有底物是從吖啶衍生的底物，且描述于由本申請人提交的專利申請PCT WO2004/069804中。
衍生自吩嗪酮的分子就其產(chǎn)生熒光的能力來說是已知的。其可以
-用作酸堿指示劑，如例如在Stuzka，V.等人，1963，CollectionCzech.Chem.Commun.，28，1399-1407中所描述的，或-用作熒光標記物，例如用于追蹤蛋白構(gòu)象的改變，如NakanishiJ.等人，2001，Analytical Chemistry，73(13)，2920-2928中所描述的，或例如用于檢測微生物，如專利US5,336,600中描述的。在后一種情況下，所描述的化合物具有缺點，即其只能在液體介質(zhì)中使用，和經(jīng)過證明細菌生長來進行的微生物的檢測通過氧化還原電位的改變來施行。因此，不存在關(guān)于酶活性的特異性，也不存在關(guān)于細菌的屬或種的特異性。
目前描述的氨基吩嗪酮的任何衍生物，特別是résorufamine的任何衍生物，從未被用作可在凝膠化的介質(zhì)中使用的生色酶底物。
根據(jù)本發(fā)明，提出了用于檢測表現(xiàn)出肽酶活性的微生物的新型生色酶底物。本發(fā)明還涉及包含此類底物的反應介質(zhì)，以及涉及所述底物或所述介質(zhì)用于檢測肽酶活性的用途，和涉及使用方法。
由此，本申請人已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，可能通過使用新型生色吩嗪酮衍生物來檢測表現(xiàn)出肽酶活性的微生物，所述吩嗪酮衍生物產(chǎn)生在反應介質(zhì)中不擴散的、從而集中在菌落范圍內(nèi)的著色，通過培養(yǎng)介質(zhì)中菌落著色的改變而證實了肽酶活性。
在用待測試的微生物接種包含本發(fā)明底物的反應介質(zhì)之后，當其不能水解所述底物時觀察到無色至白色的菌落。相反地，當其能夠水解本發(fā)明的底物時，觀察到有色的菌落。
本發(fā)明的吩嗪酮衍生物既是生色的又是生成熒光的，且擁有具有良好的檢測靈敏度的優(yōu)點。此外，熒光的激發(fā)和發(fā)射發(fā)生在可見光譜內(nèi)，這樣可通過肉眼和在正常光照下檢測熒光。
因此，本發(fā)明的目的是式(I)的生色酶底物
其中-R1表示氫原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，-R2表示氫原子、鹵素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，-R3表示氫原子、鹵素原子、C1-C12烷基、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，-R4、R5和R6各自獨立地表示氫原子、鹵素原子、-COOR′或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中至少一個是氫原子，-R′表示氫原子或C1-C6烷基，-R″和R各自獨立地表示C1-C6烷基，或者R″和R與它們所連接的氮原子一起形成包含一個或多個雜原子的雜環(huán)核，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或不存在。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“芳基”特別地意指C6-C12芳族核，特別是苯基、芐基、1-萘基或2-萘基。芳烷基的芳基部分也是如此。因此，C6-C14芳烷基的烷基是C2-C8。
術(shù)語“Cx-Cy烷基”意指具有x至y個碳原子(在本情況下，1至12個碳原子、1至6個碳原子、或1至3個碳原子或2至8個碳原子的)直鏈或支化的烷基。作為實例，可提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。
術(shù)語“鹵素原子”意指氯、溴、碘和氟。
術(shù)語“雜原子”意指除了碳原子以外的原子，例如O、N或S。
R″和R可形成的雜環(huán)核可以具有任意大小，但其優(yōu)選地包含5至7個環(huán)成員。
雜環(huán)核的實例包括嗎啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷和咪唑烷核。
本發(fā)明的封端劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠保護胺的任何封端劑。作為實例，可提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)，9-芴基氧基羰基，增溶劑例如琥珀?；?，或不可代謝的(即非天然的)氨基酸例如哌可酸。
封端劑并非系統(tǒng)性地存在于本發(fā)明的化合物中。在該情況下，即當本發(fā)明的化合物不具有封端劑(X不存在)時，本發(fā)明的化合物以鹽例如氯化物、溴化物或三氟乙酸鹽的形式存在。
由式(I)中的A表示的氨基酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何氨基酸。
根據(jù)一個具體的實施方案，本發(fā)明的目的還是式(I)的生色酶底物 其中-R1表示氫原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，-R2表示氫原子、鹵素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，要理解R1和R2中至少一個是氫原子或鹵素原子，-R3表示氫原子、鹵素原子、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，-R4、R5和R6各自獨立地表示氫原子或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中的至少一個是氫原子，-R′表示氫原子或C1-C6烷基，-R″和R各自獨立地表示C1-C6烷基，或者R″和R與它們所連接的氮原子一起形成包含一個或多個雜原子的雜環(huán)核，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或不存在。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，A表示氨基酸，或具有至多10個氨基酸的肽，其中所述氨基酸是相同或不同的。優(yōu)選地，考慮到底物的成本，A表示氨基酸，或具有至多4個氨基酸的肽，其中所述氨基酸是相同或不同的。
在適合于本發(fā)明目的的氨基酸中，可提及例如α-丙氨酸和β-丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和焦谷氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，其中R1表示烷基并且R2表示氫原子的本發(fā)明化合物是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，R1表示C1-C6烷基，或甚至C3-C6烷基，甲基和戊基是特別優(yōu)選的。
其中R1表示氫原子并且R2表示C1-C6烷基的化合物構(gòu)成了本發(fā)明的另一個實施方案。其中R2表示乙基或己基的化合物是優(yōu)選的。
根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的化合物是其中R3、R4、R5和R6各自表示氫原子的化合物。
根據(jù)另一個實施方案，還優(yōu)選這樣的化合物，其中R1和R2表示烷基或氫原子，并且R4表示氫原子、烷基或-COOR′，其中R′是烷基。作為烷基，優(yōu)選C1-C3烷基，優(yōu)選地是C1烷基。
根據(jù)另一個實施方案，還優(yōu)選其中R1、R2、R3和R4是烷基或氫原子的化合物。作為烷基，優(yōu)選C1-C3烷基，優(yōu)選地是C1烷基。
可按照下面的流程1中所示的操作方案來制備本發(fā)明的化合物流程1
根據(jù)流程1，按照Wi1staetter和Mayer的方案(1904)，在化合物(2)存在的情況下通過經(jīng)適當?shù)厝〈膶Ρ蕉?1)的氧化氯化來制備合適的二氯亞胺(3)。然后，在乙醇溶液中將如此得到的二氯亞胺(3)與經(jīng)適當?shù)厝〈拈g苯二酚(4)縮合，以產(chǎn)生résorufamine(5)。然后，在冷卻至大約-12℃的水浴中將résorufamine(5)與一個或多個任選地受保護的氨基酸(6)反應，產(chǎn)生式(I)的化合物。當然，此處應當指出，當A是單個氨基酸時，化合物(6)中的A′相應于化合物(I)的A，但包含額外的羥基。換句話說，當A是單個氨基酸時，A′以-C(O)OH收尾，而A通過-C(O)-連接至-NH-，丟失了-OH。當A是至少兩個氨基酸的鏈時，A′的最后一個氨基酸是如前面描述的，即，與A的最后一個氨基酸相比較，其包含額外的羥基。
可使用該方法制備本發(fā)明的所有化合物。然而，優(yōu)選地，可按照下面的流程2中描述的方案來制備其中R1或R2是烷基的式(I)化合物。
流程2
在上面的流程2中，在0至-3℃的溫度下，在磷酸或硫酸存在的情況下，通過經(jīng)適當?shù)厝〈?-氨基苯酚(7)與堿金屬的亞硝酸鹽例如亞硝酸鈉的反應來制備亞硝基化合物(8)。然后，在作為酸催化劑的硫酸以及環(huán)化劑存在的情況下，在溶劑例如丙醇或丁醇中將如此獲得的亞硝基乙酰氨基苯酚化合物(8)與經(jīng)適當?shù)厝〈拈g苯二酚(4)反應。使如此獲得的乙酰氨基吩嗪酮脫去乙酰基，方法是于90℃在硫酸存在的情況下進行短暫加熱，在該過程之后進行冷卻和水沉淀。然后，如流程1的操作方案中所示的，將如此獲得的résorufamine(5)與一個或多個任選地經(jīng)保護的氨基酸(6)反應。
也可按照下面的操作方案(如流程3中所示的)來制備所述化合物流程3取代的2，5-二甲氧基苯酚類的合成
取代的2，5-二硝基氟苯類的合成 résorufamine或7-氨基吩嗪-3-酮的合成
肽的基聯(lián) 在上面的流程3中，以4個步驟制備本發(fā)明的化合物。
根據(jù)第1步驟，從也經(jīng)適當?shù)厝〈臍漉衔?9)制備經(jīng)適當?shù)厝〈?，5-二甲氧基苯酚化合物(12)。將該化合物(9)在二甲基甲酰胺(DMF)中與NaH反應，隨后加入碘甲烷，該反應之后在40℃下攪拌，從而產(chǎn)生經(jīng)適當?shù)厝〈?，5-二甲氧基苯基化合物(10)。然后，按照Duff反應(Smith WE，1972，J Org.Chem.，373972)，在回流下將該化合物在三氟乙酸(trifluoroacétate)(TFA)中與烏洛托品反應，從而產(chǎn)生經(jīng)適當?shù)厝〈?，5-二甲氧基苯甲醛(11)。最后，按照Bayer-Villiger反應(Capecchi T.等人，2000，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2681)，在0℃下將化合物(11)在甲醇中與單過氧鄰苯二甲酸鎂反應，然后在DMF中與NaOH反應，從而產(chǎn)生經(jīng)適當?shù)厝〈?，5-二甲氧基苯酚(12)。
根據(jù)第2步驟，從經(jīng)適當?shù)厝〈姆桨?13)制備2，5-二硝基氟苯(17)。在0℃下，將該化合物(13)在三乙胺和二氯甲烷(DCM)中與乙酰氯反應，從而產(chǎn)生經(jīng)適當?shù)厝〈腘-乙酰-氟苯胺(14)。然后，將該化合物在乙酸中與濃硫酸和硝酸的混合物反應，從而產(chǎn)生經(jīng)適當?shù)厝〈南趸桨坊衔?15)。將該化合物(15)和鹽酸一起回流，產(chǎn)生硝基苯胺化合物(16)，所述化合物(16)自身于65℃在乙酸中與過硼酸鈉反應，從而產(chǎn)生化合物(17)。
根據(jù)第3步驟，通過將在第1步驟中獲得的2，5-二甲氧基苯(12)和在第2步驟中獲得的2，5-二硝基氟苯(17)如下所述進行反應而獲得résorufamine(5)將化合物(12)和(17)在環(huán)境溫度下在DMF中與NaH反應，產(chǎn)生經(jīng)適當?shù)厝〈亩蓟?18)。然后，將該化合物(18)在DCM中與BBr3反應，產(chǎn)生二羥基二芳基醚(19)，其在催化劑Pd/C和甲醇存在的情況下自身發(fā)生反應，產(chǎn)生résorufamine(5)。
最后，根據(jù)最后一個步驟，然后如流程1的操作方案中所示，將如此獲得的résorufamine(5)與一個或多個任選地經(jīng)保護的氨基酸(6)反應。
在上面的操作方案中，起始反應物(化合物(1)、(2)、(4)、(6)、(7)、(9)和(13))可商購獲得，特別是從Sigma獲得。
本發(fā)明的目的還在于反應介質(zhì)，所述介質(zhì)單獨地或與至少一種其他酶底物相組合地包含至少一種如上定義的式(I)的生色酶底物，所述其他酶底物是與通過本發(fā)明的底物而檢測的酶活性不同的酶活性的特異性酶底物。
由此，當將表現(xiàn)出肽酶活性的微生物接種在包含本發(fā)明的化合物的反應介質(zhì)之中或之上時，在反應介質(zhì)之中或之上產(chǎn)生不擴散的、從而集中在菌落范圍內(nèi)的著色。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“反應介質(zhì)”意指允許至少一種微生物的至少一種酶活性的顯現(xiàn)的介質(zhì)。
可將該反應介質(zhì)只用作揭示的介質(zhì)，或用作培養(yǎng)并揭示的介質(zhì)。在第一種情況下，在接種前進行微生物的培養(yǎng)，而在第二種情況下，反應介質(zhì)也構(gòu)成了培養(yǎng)介質(zhì)，這構(gòu)成了本發(fā)明的一個特定實施方案。
所述反應介質(zhì)可以是固體、半固體或液體。術(shù)語“固體介質(zhì)”意指例如凝膠化的介質(zhì)。
瓊脂是在微生物學中用于培養(yǎng)微生物的常規(guī)固體介質(zhì)，但可以使用明膠、瓊脂糖或另一種膠凝劑?？缮藤彨@得某些制劑，例如Co1umbia瓊脂、Trypcase-soja瓊脂、Mac Conkey瓊脂、Sabouraud瓊脂，或更一般地，在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述的制劑。
優(yōu)選地，當反應介質(zhì)還是培養(yǎng)介質(zhì)時，其是凝膠化形式的。
反應介質(zhì)中的瓊脂的量是2至40g/l。對于固體介質(zhì)，瓊脂的量優(yōu)選地是9至25g/l，更優(yōu)選地12至14g/l，和對于半固體介質(zhì)，瓊脂的量優(yōu)選地是2至6g/l。
本發(fā)明的酶底物可用于廣泛的pH范圍，特別是在pH5.5至10的范圍內(nèi)。
在反應介質(zhì)中本發(fā)明的酶底物的濃度在0.01和1g/l之間，優(yōu)選地在0.025和0.40g/l之間，且有利地其為0.05g/l。這是因為，在該底物濃度上，獲得更好的著色反差。
所述反應介質(zhì)可包含至少一種其他底物，所述其他底物是與通過本發(fā)明的底物而檢測的酶活性不同的酶活性的特異性底物。所述其他底物的酶促水解產(chǎn)生與通過本發(fā)明的底物所檢測的信號不同的可檢測信號，例如不同顏色或熒光的產(chǎn)物，使得能夠證明例如檢測和/或鑒定和/或定量一種或多種微生物。
作為其他的特異性底物，可提及吲哚氧基類型的底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷(BIOSYNTH)或5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷(BIOSYNTH)，或用于檢測微生物的任何其他底物。
其他的特異性酶底物的濃度一般在0.01和2g/l之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)所用的底物而容易地確定該濃度。
所述反應介質(zhì)還可以組合地包含一種或多種成分，例如氨基酸、蛋白胨、糖類、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、抗生素、表面活性劑、緩沖劑、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽、金屬鹽。介質(zhì)的實例描述于本申請人的專利申請EP 656 421和WO99/09 207中。
因此，本發(fā)明的酶底物和反應介質(zhì)可用于具有肽酶活性的微生物的診斷。
因此，本發(fā)明的目的還在于上面定義的式(I)的生色酶底物或反應介質(zhì)用于在體外檢測和/或鑒定和/或定量表現(xiàn)出至少一種肽酶活性的微生物的用途。
本發(fā)明還涉及用于檢測和/或鑒定和/或定量表現(xiàn)出至少一種肽酶活性的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括·提供如上定義的反應介質(zhì)，·用待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，·溫育，和·揭示至少一種肽酶活性單獨地或與至少一種不同于該肽酶活性的其他酶活性相組合地存在。
接種和溫育步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
例如，溫育溫度通常在20和55℃之間，最常見地在25和45℃之間，30、35和37℃的溫度是最常使用的溫育溫度。至于溫育的氣氛，其可以無區(qū)別地是厭氧的或需氧的。
用肉眼通過顯現(xiàn)著色的變化來進行揭示過程，所述著色在反應介質(zhì)中不擴散從而集中在菌落范圍內(nèi)。
作為由于本發(fā)明的酶底物而可以診斷的微生物，可以提及革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和酵母。
作為革蘭氏陰性細菌，可以提及下列屬的細菌假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血菌屬(haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)和軍團菌屬(Legionella)。
作為革蘭氏陽性細菌，可以提及下列屬的細菌腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)和棒桿菌屬(Corynebacteria)。
酵母的實例包括下列屬的酵母假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、糖酵母屬(Saccharomyces)和絲孢酵母屬(Trichosporon)。
本發(fā)明的底物特別適合用于革蘭氏陰性細菌的檢測，因為可同時獲得微生物的生長和菌落的清晰著色。
特別地，其中A是L-丙氨酸的本發(fā)明生色底物具有優(yōu)點，即其使得能夠?qū)⒏锾m氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌清晰地區(qū)分開。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于用于區(qū)分細菌屬于革蘭氏陽性微生物還是屬于革蘭氏陰性微生物的方法，其特征在于，所述方法包括·提供如上定義的反應介質(zhì)，其中生色底物的取代基A是L-丙氨酸，·用待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，·溫育，和·揭示至少一種意味著存在革蘭氏陰性微生物的著色變化的存在。
其中A是β-丙氨酸或焦谷氨酸的本發(fā)明的生色底物具有優(yōu)點，即其使得能夠?qū)⒕G膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)與其他屬區(qū)分開，也可將綠膿假單胞菌與假單胞菌屬的其他物種區(qū)分開。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于檢測綠膿假單胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括·提供如上定義的反應介質(zhì)，其中生色底物的取代基A是β-丙氨酸或焦谷氨酸，·用待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，·溫育，和·揭示至少一種意味著存在綠膿假單胞菌微生物的著色變化的存在。
待分析的生物樣品是任何臨床樣品，例如唾液、血液、尿液或糞便樣本，或其分析可幫助臨床醫(yī)師作出診斷的任何其他樣品。所述樣品也可以是來自食品和/或制藥工業(yè)的產(chǎn)物的樣品，或者食品和/或制藥工業(yè)的基礎(chǔ)產(chǎn)物(produit de base)的樣品，在所述產(chǎn)物中必須保證不存在致病微生物，或者計數(shù)污染性菌群，或者檢測特定微生物。
借助于下列以非限性的、舉例說明的方式給出的實施例，將更全面地理解本發(fā)明。
實施例17-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮的合成通過1.76g(10mmol)對苯二胺的氯化來制備1，4-二氯苯醌二亞胺，隨后在無水甲醇(50ml)存在的情況下通過加熱將其溶解，并將9g尿素加入至攪拌的所述溶液中。然后，在40-50℃下向所述溶液中加入1.8g(10mmol)5-戊基間苯二酚，并在完全溶解后，小心地使反應混合物回流以避免過度放熱。加熱持續(xù)1.5小時，在該時間后，緩慢地向充分攪拌的含氨的冰/水混合物中加入該冷卻的反應混合物。通過吸濾收集沉淀并用水洗滌，然后風干，從而獲得2.2g由標題化合物的混合物組成的粗產(chǎn)物，未氯化的產(chǎn)物占大部分。
在攪拌下，將乙酸(30％，200cm3)從2-頸燒瓶中逐滴加入溶液中，所述溶液由溶解在200cm3水中的大約5g硼氫化鈉和200mg氫氧化鈉組成。將氫氣通過3-頸燒瓶，在所述3-頸燒瓶中，將7-氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(0.564g)的混合物溶解在無水二甲基甲酰胺(15cm3，加熱隨后冷卻)中，并用無水四氫呋喃(THF)(15cm3)稀釋該溶液。向所述溶液中加入催化劑Pd/C(5％，200mg)。在所述溶液中溫和地通入氫氣，并在明顯的還原后長時間持續(xù)該過程(大約1小時)。通過溶液從紫紅色轉(zhuǎn)變成灰綠色來證明還原。如此，獲得résorufamine的溶液。
在分開的燒瓶中，將0.756g(4.0mmol)N-t-Boc-L-丙氨酸和0.408g(4.0mmol)N-甲基嗎啉溶解在無水THF(10cm3)中，將溶液冷卻至-20℃并在攪拌的同時加入0.56cm3(4.0mmol)氯甲酸異丁酯。在-20℃下進一步攪拌混合物30分鐘，在該時間后，于-10℃在攪拌下將所述混合物導入résorufamine溶液中，同時通入氫氣。15分鐘后，停止輸入氫氣，密封所述系統(tǒng)并在環(huán)境溫度下攪拌反應混合物過夜。過濾反應混合物并在減壓下蒸發(fā)溶劑，將殘留的固體溶解在二氯甲烷(DCM)中，過濾，并用NaHCO3(5％，2次，50cm3)和水(50cm3)洗滌所述DCM溶液。用MgSO4干燥有機相，過濾，并濃縮，從而獲得由兩種標題產(chǎn)物組成的殘留物。通過使用汽油(essence)和乙酸乙酯(7∶3)混合物進行洗脫的在二氧化硅柱上的色譜法來進行純化。第一個點相應于橙色固體形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮，第二個點相應于棕色固體形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮。
實施例27-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮的合成重復上面實施例1中描述的操作方案，除了用N-t-Boc-β-丙氨酸代替N-t-Boc-L-丙氨酸外。
為了回收標題化合物，進行在二氧化硅柱上的色譜法，用汽油/乙酸乙酯(6∶4)混合物進行洗脫。第一個點相應于橙色固體形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮，第二個點相應于橙色固體形式的7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮。
實施例3胺化衍生物的脫保護為進行該過程，根據(jù)下列比例將在實施例1和2中獲得的化合物溶解在2cm3的TFA(三氟乙酸)中7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮為0.10g(0.21mmol)，和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-1-戊基吩嗪-3-酮、7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1-戊基吩嗪-3-酮各為80mg(0.18mmol)。
將混合物在環(huán)境溫度下保持15分鐘。通過薄層色譜法記錄反應的進程直至顯示沒有額外的起始材料。在真空中蒸發(fā)TFA，并用醚充分洗滌殘留物，進行干燥，從而獲得三氟乙酸鹽(棕色固體)形式的不同化合物，產(chǎn)率如下7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮為0.095g(92％)，和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-1-戊基吩嗪-3-酮、7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1-戊基吩嗪-3-酮各為80mg(97％)。
實施例47-N-(L-焦谷氨?；?氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮和7-N-(L-焦谷氨?；?-氨基-1-戊基吩嗪-3-酮的合成重復上面實施例1中描述的操作方案，除了使用0.516g L-焦谷氨酸代替N-t-Boc-L-丙氨酸外。
為了回收標題化合物，進行在二氧化硅柱上的色譜法，用DCM/MeOH(95∶5)混合物進行洗脫。第一個點相應于棕色固體形式的7-N-(L-焦谷氨?；?氨基-2-氯-1-戊基-吩嗪-3-酮，第二個點相應于棕色固體形式的7-N-(L-焦谷氨?；?-氨基-1-戊基-吩嗪-3-酮。
實施例57-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2-二甲基-吩嗪-3-酮和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2，4-三甲基-吩嗪-3-酮的合成5.1.制備二甲氧基苯的一般過程在配備有冷凝器、磁力攪拌棒和氯化鈣保護管的干燥的圓底2-頸燒瓶中，將氫醌(1摩爾當量)溶解在50ml無水三甲基甲酰胺(DMF)中，并以少量的方式加入2.2摩爾當量的NaH。在加入堿后，當H2停止放出時，在15至20分鐘內(nèi)逐滴加入4摩爾當量的碘甲烷。在添加結(jié)束時，在40℃下攪拌反應混合物2小時。向燒瓶中加入200ml鹽水，并用乙醚(3次，50ml)萃取所得的混合物。用水(2次，50ml)洗滌合并的有機層，并通過MgSO4干燥。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并將殘留物進行柱色譜法。
5.1.1. 1，4-二甲氧基-2，3-二甲基苯如上面的5.1部分中所述，使用1.957g(0.01416mol)2，3-二甲基氫醌進行操作。使用輕質(zhì)松香水(essence minérale lég ère)乙醚的95∶5混合物，分離出白色固體形式的產(chǎn)物(2.27g，80％)。
5.1.2.1，4-二甲氧基-2，3，5-三甲基苯如上面的5.1部分中所描述的，使用2.175g(0.01429mol)2，3，5-三甲基氫醌進行操作。分離出無色油形式的產(chǎn)物(2.367g，92％)。
5.2.通過Duff反應進行的二甲氧基苯的甲?；瘜?當量的二甲氧基苯溶解在20ml TFA中，并向所得的溶液中加入1.05當量的烏洛托品。在無水條件下將反應混合物回流2小時。在減壓下蒸發(fā)TFA，將殘留物溶解在100ml醚中，并用水(3次，50ml)洗滌有機溶液，然后通過MgSO4干燥。蒸發(fā)溶劑，并將殘留物進行柱色譜法，使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的80∶20混合物進行洗脫。
5.2.1. 2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯甲醛如上面的5.2部分中所描述的，使用2.270g(0.01366mol)1，4-二甲氧基-2，3-二甲基苯進行該操作。分離出白色固體形式的標題產(chǎn)物(1.18g，44％)。
5.2.2. 2，5-二甲氧基-3，4，6-三甲基苯甲醛如上面的5.2部分中所描述的，使用2.274g(0.01262mol)1，4-二甲氧基-2，3，5-三甲基苯進行該操作。分離出黃色固體形式的標題產(chǎn)物(1.21g，46％)。
5.3.采用Bayer-Villiger氧化反應來制備酚類的一般過程將0.033mol二甲氧基苯甲醛溶解在50ml甲醇中，并逐滴加入單過氧鄰苯二甲酸鎂(MMPP)(0.018mol)在50ml甲醇中的懸浮液，同時將反應混合物保持在0℃。在添加結(jié)束時，在環(huán)境溫度下將反應混合物攪拌4小時。使用50ml 1M NaOH在堿性條件下水解所得的酯。1小時后，在減壓下除去四分之三的甲醇，用1M HCl中和剩余的堿并將pH調(diào)節(jié)至3。用乙酸乙酯(3次，50ml)萃取酚，通過MgSO4干燥合并的有機層，蒸發(fā)溶劑，并將殘留物進行柱色譜法。
5.3.1. 2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯酚如上面的5.3部分中所描述的，使用1.126g(5.797mmol)2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯甲醛進行該操作。使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的60∶40混合物作為洗脫劑，以黃色油的形式分離出標題產(chǎn)物(0.239g，23％)。
5.3.2. 2，5-二甲氧基-3，4，6-三甲基苯酚如上面的5.3部分中所描述的，使用1.205g(5.786mmol)2，5-二甲氧基-3，4，6-二甲基苯甲醛進行該操作。使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的75∶25混合物作為洗脫劑，以白色固體的形式分離出標題產(chǎn)物(0.856g，75％)。
5.4.制備二芳基醚的一般過程將1摩爾當量的合適的酚溶解在10ml無水DMF中，并以少量的方式加入1.1摩爾當量的NaH。在氣體完全釋放后，在環(huán)境溫度下攪拌所得的酚鈉溶液15分鐘。向燒瓶中逐滴加入1摩爾當量的在5ml無水THF中的2，5-二硝基氟苯溶液，并將反應混合物攪拌2小時。最后，將燒瓶中的內(nèi)容物倒入50ml水中，用醚(3次，50ml)進行萃取，并通過MgSO4干燥合并的有機層。在減壓下除去溶劑，并將殘留物進行柱色譜法。
5.4.1. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4-二甲基苯如上面的5.4部分中所描述的，使用0.293g(1.575mmol)2，5-二硝基氟苯和0.287g(1.575mmol)2，5-二甲氧基-3，4-二甲基苯酚進行該操作。在使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的85∶15混合物作為洗脫劑的柱色譜法后，獲得橙色固體形式的標題產(chǎn)物(0.415g，76％)。
5.4.2. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4，6-三甲基苯如上面的5.4部分中所描述的，使用0.812g(4.362mmol)2，5-二硝基氟苯和0.856g(4.362mmol)2，5-二甲氧基-3，4，6-三甲基苯酚進行該操作。在使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的75∶25混合物作為洗脫劑的柱色譜法后，獲得黃色固體形式的標題產(chǎn)物(1.412g，89％)。
5.5.用于氫醌-甲基-醚的脫保護的一般過程將1摩爾當量的二甲基芳基醚溶解在30ml的無水DCM中，并冷卻至-78℃。向冷卻的醚溶液中逐滴加入2.5摩爾當量的BBr3在己烷中的溶液(1M)，并在-78℃下攪拌反應產(chǎn)物30分鐘。然后，加熱至環(huán)境溫度并進行攪拌直至反應結(jié)束(隨后進行薄層色譜法)。于0℃用10ml甲醇稀釋反應混合物，并倒入50ml水中。分離有機層，并用乙酸乙酯(3次，25ml)洗滌水層。通過MgSO4干燥合并的有機層。除去溶劑，并將殘留物進行柱色譜法。
5.5.1. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4-二甲基-2，5-二羥基苯不分離標題化合物，但形成標題化合物，隨后根據(jù)同一容器中的反應直接進行還原和環(huán)化(參見下面的5.6.1部分)。
5.5.2. 1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4，6-三甲基-2，5-二羥基苯如上面的5.5部分中所描述的，使用0.626g(1.728mmol)1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-2，5-二甲氧基-3，4，6-二甲基苯甲醛進行該操作。使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的70∶30混合物作為洗脫劑，分離出橙色固體形式的標題產(chǎn)物(0.435g，75％)。
5.6.制備7-氨基吩嗪-3-酮的一般過程將1.3mmol的二羥基二芳基醚溶解在5ml甲醇中，并向溶液中加入Pd/C5％催化劑(10％重量/重量)。在環(huán)境溫度下，在氫化裝置中于氫氣氣氛中攪拌反應混合物4小時。向燒瓶中加入二氧化硅(以對于待引入柱色譜法的殘留物的載量來說足夠的量)，并再次劇烈地攪拌混合物4小時，使其自由接觸空氣。在氧化結(jié)束時，除去溶劑，并使用洗脫劑梯度對殘留物進行柱色譜法，所述梯度始于輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的50∶50混合物，然后改變成相同溶劑的25∶75混合物，之后變成0∶100混合物。最后，使用乙酸乙酯∶甲醇的90∶10混合物作為洗脫劑。
5.6.1. 7-氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮如上面的5.6部分中所描述的，根據(jù)同一容器中的反應，從0.266g(0.7636mmol)1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4-二甲基-2，5-二羥基苯開始進行該操作。獲得棕紅色固體形式的標題產(chǎn)物(0.125g，68％)。
5.6.2. 7-氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮如上面的5.6部分中所描述的，從0.435g(1.3013mmol)1-(2′，5′-二硝基苯氧基)-3，4，6-三甲基-2，5-二羥基苯開始進行該操作。獲得棕紅色固體形式的標題產(chǎn)物(0.237g，72％)。
5.7.用于將肽偶聯(lián)至7-氨基吩嗪-3-酮的一般過程將0.4mmol 7-氨基吩嗪-3-酮溶解在位于裝有磁力攪拌棒的小圓底燒瓶中的5ml無水DMF之中，并向溶液中加入0.010g Pd/C5％催化劑。在環(huán)境溫度下將燒瓶置于氫化裝置中并維持氫氣氣氛，同時攪拌反應混合物1小時?？梢酝ㄟ^溶液的顏色從強紫紅色變?yōu)榛揖G色來確認完全還原。在分開的燒瓶中，將0.089g(0.4719mmol)的N-t-Boc-丙氨酸、0.072g(0.4719mmol)的羥基苯并三唑(HOBt)和0.07ml(0.4719mmol)的二異丙基碳二亞胺(DIC)溶解在5ml無水DCM中，并在環(huán)境溫度下攪拌反應混合物1小時。在該時期后，在惰性氣氛下，借助于注射器將第二個燒瓶的內(nèi)容物導入第一個燒瓶(其裝有還原形式的7-氨基吩嗪-3-酮)中。由于反應物的非常快速的氧化的原因，避免了來自空氣中的氧的存在。在環(huán)境溫度下將混合物再攪拌20分鐘。通過C鹽來過濾反應混合物，并蒸發(fā)掉溶劑。將殘留物重新溶解在20ml乙酸乙酯中，用20ml 1M HCl、20ml 10％Na2CO3和20ml水洗滌有機層。通過MgSO4干燥，過濾，并在減壓下進行蒸發(fā)，從而獲得殘留物，所述殘留物通過使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的30∶70混合物作為洗脫劑的柱色譜法進行純化。
5.7.1. 7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮如上面的5.7部分中所描述的，使用0.110g(0.4578mmol)7-氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮進行該操作。獲得棕紅色固體形式的標題產(chǎn)物(0.104g，55％)。
5.7.2. 7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮如上面的5.7部分中所描述的，使用0.100g(0.3933mmol)7-氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮進行該操作。獲得橙色固體形式的標題產(chǎn)物(0.113g，68％)。
5.8.N-叔丁氧基羰基的脫保護將0.2mmol相應的用N-叔丁氧基羰基進行保護的化合物溶解在3ml無水DCM中，并向溶液中加入1ml TFA。在環(huán)境溫度下攪拌反應混合物直至反應結(jié)束(然后進行薄層色譜法)。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑和剩余的TFA，并通過使用洗脫劑梯度的在短柱上的色譜法來純化殘留物，所述梯度始于輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙酸乙酯的50∶50混合物，然后改變成相同溶劑的0∶100混合物。最后，使用乙酸乙酯∶甲醇的90∶10混合物作為洗脫劑。
5.8.1. 7-N-(β-丙氨?；?氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮的三氟乙酸鹽如上面的5.8部分中所示，使用0.047g(0.1138mmol)7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮進行該操作。獲得紅色固體形式的標題產(chǎn)物(0.046g，95％)。
5.8.2. 7-N-(β-丙氨?；?氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮的三氟乙酸鹽如上面的5.8部分中所示，使用0.081g(0.1897mmol)7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮進行該操作。獲得紅色固體形式的標題產(chǎn)物(0.080g，96％)。
實施例67-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1-甲基-2-氯吩嗪-3-酮-4-羧酸甲酯的制備將1.76g(10mmol)1，4-二氯苯醌亞胺溶解在50ml無水乙醇中，并輕輕攪拌。向該攪拌的溶液中加入1.82g(10mmol)4-甲基-2，6-二羥基苯甲酸甲酯。溫和地加熱回流該攪拌的溶液直至出現(xiàn)大量放熱，從而需要將燒瓶從熱源移開。在放熱減少后，再使反應混合物回流30分鐘，然后使之冷卻至環(huán)境溫度。在環(huán)境溫度下進一步放置3小時后，通過吸濾收集固體產(chǎn)物，用少量熱水洗滌，然后進行抽吸，從而在真空條件下的干燥器中進行干燥前，以盡可能干燥的狀態(tài)獲得產(chǎn)物。使用乙酸乙酯作為流動相對殘留物進行硅膠薄層色譜法。觀察到大量的深色基礎(chǔ)產(chǎn)物，以及觀察到粉紅色熒光組分。將固體產(chǎn)物溶解在乙酸乙酯中，過濾，并將其通過硅膠錐體。濾液基本上沒有基礎(chǔ)產(chǎn)物。在減壓下除去溶劑，并分離出固體產(chǎn)物。
如上所述，使用t-BOCβ-丙氨酸對固體產(chǎn)物進行氨基?；?，從而獲得標題化合物。
實施例77-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-6-甲基-吩嗪-3-酮的合成7.1.N-乙?；?2-甲基-3-氟苯胺的合成在攪拌下，向處于0℃的由3.161g(25.26mmol)2-甲基-3-氟苯胺和3.87ml(27.78mmol)的三乙胺在50ml DCM中形成的溶液之中加入1.98ml(27.78mmol)乙酰氯。使溶液重新升溫至環(huán)境溫度并攪拌1小時。用水(3次，50ml)洗滌溶液，用MgSO4干燥，并在減壓下除去溶劑。在礦物油/乙酸乙酯(EtOac)混合物中重結(jié)晶后，獲得3.844g(91％)白色晶體形式的標題化合物。
7.2.N-乙酰基-2-甲基-3-氟-4-硝基苯胺的合成在18℃下，在10ml乙酸中，將在上面7.1部分中獲得的化合物與5ml濃硫酸和5ml硝酸的混合物反應1小時。然后在100ml水中稀釋反應溶液，并在乙酸乙酯(EtOAc)(3次，50ml)中進行萃取，通過MgSO4進行干燥，在真空條件下除去溶劑。分離出白色固體形式的標題化合物(1.96g，71％)。
7.3.2-甲基-3-氟-4-硝基苯胺的合成將1.311g(6.18mmol)在上面7.2部分中獲得的化合物在5M鹽酸中回流2小時。用碳酸鈉中和溶液，然后用乙醚(3次，50ml)進行萃取，通過MgSO4進行干燥，并在真空條件下除去溶劑。通過使用松香水(essence minérale)∶EtOAc的70∶30混合物作為洗脫劑的柱色譜法來純化殘留物。分離出黃色固體形式的標題產(chǎn)物(0.589g，94％)。
7.4.2-氟-3，6-二硝基甲苯的合成在65℃下，向由1.61g(10.46mmol)過硼酸鈉四水合物在11mlEtOAc中形成的溶液之中，逐滴加入由0.357g(2.10mmol)在上面7.3部分中獲得的化合物在4ml乙酸中形成的溶液，并攪拌所述混合物6小時。在50ml的水中稀釋反應溶液，在乙醚(3次，20ml)中進行萃取，通過MgSO4進行干燥，并在真空下除去溶劑。通過使用松香水∶三氯甲烷的70∶30混合物作為洗脫劑的柱色譜法來純化殘留物，從而獲得黃色液體形式的標題產(chǎn)物(0.274g，65％)。
7.5. 2，5-二甲氧基苯酚的合成如上面的5.3部分中所示，使用5.53g(0.0333mol)2，5-二甲氧基苯甲醛進行該操作。使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的80∶20混合物作為洗脫劑而分離出黃色油形式的標題產(chǎn)物(4.27g，83％)。
7.6. 1-(3′，6′-二硝基-2′-甲基苯氧基)-2，5-二甲氧基苯的合成如上面的5.4部分中所示，使用0.366g(1.83mmol)在上面7.4部分中制備的2-氟-3，6-二硝基甲苯和0.282g(1.83mmol)在上面7.5部分中制備的2，5-二甲氧基苯酚來進行該操作。使用輕質(zhì)松香水(60-80℃)∶乙醚的70∶30混合物作為洗脫劑而分離出黃色固體形式的標題產(chǎn)物(0.400g，65.5％)。
7.7.標題化合物的合成可如上面的5.5至5.7部分中所示，獲得標題化合物。
實施例8革蘭氏陰性細菌的L-丙氨酸肽酶活性的檢測使用實施例1中制備的氯化或未氯化的化合物，即7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮(氯化的L-丙氨酰基化合物)和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-L-丙氨?；?氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(未氯化的L-丙氨?；衔?，所述化合物根據(jù)實施例3中描述的操作方案進行脫保護。
將10mg每種L-丙氨?；衔锶芙庠?ml二甲亞砜中，并向200ml 50℃的熔化的Columbia瓊脂中加入所述混合物。將如此形成的介質(zhì)分配入培養(yǎng)皿中(每種底物的終濃度50mg/l)。
然后，使用標定為10μl的接種環(huán)(oese)，用標定為0.5McFarland的懸浮液，將來自國際保藏或來源于申請人保藏的菌株接種在各介質(zhì)上。還將所有菌株接種在沒有生色底物的Columbia瓊脂介質(zhì)上，作為生長對照。將所有培養(yǎng)物在37℃下溫育24至48小時。
表1中給出了在溫育24和48小時之間獲得的生長和著色的結(jié)果，其中G表示生長，C表示顏色，I表示無色，符號++表示非常好的生長，符號+表示菌株的良好生長，符號+/-表示菌株的中等生長，符號-表示不存在菌株的生長。
表1
上面表1中的結(jié)果顯示，本發(fā)明的酶底物使得能夠檢測所有細菌菌株，因為它們都生長，但只能觀察到革蘭氏陰性菌株(菌株1至4和6至7)的著色的改變，這還使得能夠區(qū)別革蘭氏陰性菌株和革蘭氏陽性菌株。
實施例9綠膿假單胞菌類別的細菌的β-丙氨酸肽酶活性的檢測為進行該檢測，使用在實施例2中制備的氯化或未氯化的β-丙氨酸化合物，即7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮(氯化的β-丙氨?；衔?和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(未氯化的β-丙氨?；衔?，所述化合物根據(jù)實施例5中描述的操作方案進行脫保護。
還根據(jù)實施例5中描述的方案來準備培養(yǎng)皿和接種菌株。
溫育24和48小時之間的著色結(jié)果顯示于下面的表2中。
表2
上面表2中的結(jié)果證明，本發(fā)明的化合物使得能夠優(yōu)先地檢測綠膿假單胞菌細菌(顯現(xiàn)出淡紫紅色至紫紅色的著色)。
實施例10焦谷氨?；拿富钚缘臋z測為進行該檢測，使用在實施例4中制備的氯化或未氯化的焦谷氨?；衔铮?-N-(L-焦谷氨?；?氨基-2-氯-1-戊基吩嗪-3-酮(氯化的L-焦谷氨酰基化合物)和7-N-(L-焦谷氨?；?氨基-1-戊基吩嗪-3-酮(未氯化的L-焦谷氨酰基化合物)，所述化合物根據(jù)實施例5中描述的操作方案進行脫保護。
還根據(jù)實施例5中描述的方案來準備培養(yǎng)皿和接種菌株。
溫育24和48小時之間的著色結(jié)果顯示于下面的表3中。
表3
上面表3中的結(jié)果證明，本發(fā)明的化合物使得能夠優(yōu)先地檢測綠膿假單胞菌細菌。
實施例11綠膿假單胞菌類別的細菌的β-丙氨酸肽酶活性的檢測為進行該檢測，使用在實施例5和6中制備的β-丙氨酸化合物，即7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2-二甲基吩嗪-3-酮(b-ala-DMP)、7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2，4-三甲基吩嗪-3-酮(b-ala-TMP)和7-N-(N′-叔丁氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1-甲基-2-氯-4-(氧代-1-甲基)吩嗪-3-酮(b-ala-MCMP)，所述化合物如前面的實施例中所述進行脫保護。
還根據(jù)實施例7中描述的方案來準備培養(yǎng)皿和接種菌株。溫育24和48小時之間的著色結(jié)果顯示于下面的表4中。
表4
*申請人的保藏上面表4中的結(jié)果證明，本發(fā)明的化合物使得能夠優(yōu)先地檢測綠膿假單胞菌細菌(顯現(xiàn)出粉紅色至紫色的著色)。還可指出，根據(jù)所用的取代基和其在主核上的位置，所述結(jié)果在顏色和顏色強度方面可以發(fā)生變化，以及在對于綠膿假單胞菌的靈敏度和特異性方面同樣可以發(fā)生變化，因此依賴于想要的目的就可以考慮將這些不同的底物用于不同的具體應用中。
權(quán)利要求
1.生色酶底物，其特征在于，其相應于下面的式(I) 其中-R1表示氫原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，-R2表示氫原子、鹵素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，-R3表示氫原子、鹵素原子、C1-C12烷基、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，-R4、R5和R6各自獨立地表示氫原子、鹵素原子、-COOR′或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中至少一個是氫原子，-R′表示氫原子或C1-C6烷基，-R″和R各自獨立地表示C1-C6烷基，或者R″和R與它們所連接的氮原子一起形成包含一個或多個雜原子的雜環(huán)核，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或不存在。
2.權(quán)利要求1的生色酶底物，其特征在于-R1表示氫原子、C1-C12烷基、C6-C14芳烷基、芳基、-COOH、-COOR′或-NR″R，-R2表示氫原子、鹵素原子、C1-C12烷基、-COOH或-COOR′，要理解R1和R2中至少一個是氫原子或鹵素原子，-R3表示氫原子、鹵素原子、-CN、-CONH2、-COOR′或-COR′，-R4、R5和R6各自獨立地表示氫原子或C1-C3烷基，要理解R4、R5和R6中的至少一個是氫原子，-R′表示氫原子或C1-C6烷基，-R″和R各自獨立地表示C1-C6烷基，或者R″和R與它們所連接的氮原子一起形成包含一個或多個雜原子的雜環(huán)核，-A表示至少一個氨基酸，和-X表示封端劑或不存在。
3.權(quán)利要求1或2的生色酶底物，其特征在于，R1表示烷基，優(yōu)選地C1-C6烷基，和R2表示氫原子。
4.權(quán)利要求1或2的生色酶底物，其特征在于，R1表示氫原子，和R2表示烷基，優(yōu)選地乙基或己基。
5.權(quán)利要求1的生色酶底物，其特征在于，R1和R2表示烷基或鹵素原子，和R4表示烷基、-COOR′或氫原子。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的生色酶底物，其特征在于，R3、R4、R5和R6表示氫原子。
7.反應介質(zhì)，所述介質(zhì)單獨地或與至少一種其他酶底物相組合地包含至少一種權(quán)利要求1至6中任一項所定義的生色酶底物，所述其他酶底物是與通過權(quán)利要求1至6中任一項所定義的所述底物而檢測的酶活性不同的酶活性的特異性酶底物。
8.權(quán)利要求7的介質(zhì)，其特征在于，所述介質(zhì)是培養(yǎng)介質(zhì)。
9.權(quán)利要求7或8的介質(zhì)，其特征在于，所述介質(zhì)是以凝膠化形式存在的。
10.權(quán)利要求1至6中任一項所定義的生色酶底物或者權(quán)利要求7至9中任一項所定義的反應介質(zhì)的用途，所述用途為用于體外檢測和/或鑒定和/或定量表現(xiàn)出至少一種肽酶活性的微生物。
11.用于檢測和/或鑒定和/或定量表現(xiàn)出至少一種肽酶活性的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括·提供權(quán)利要求7至9中任一項所定義的反應介質(zhì)，·用待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，·溫育，和·揭示至少一種肽酶活性單獨地或與至少一種不同于該肽酶活性的其他酶活性相組合地存在。
12.用于區(qū)分細菌屬于革蘭氏陽性微生物還是屬于革蘭氏陰性微生物的方法，其特征在于，所述方法包括·提供權(quán)利要求7至9中任一項所定義的反應介質(zhì)，其中生色底物的取代基A是L-丙氨酸，·用待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，·溫育，和·揭示至少一種意味著存在革蘭氏陰性微生物的著色變化的存在。
13.用于檢測綠膿假單胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括·提供權(quán)利要求7至9中任一項所定義的反應介質(zhì)，其中生色底物的取代基A是β-丙氨酸或焦谷氨酸，·用待測試的生物樣品接種所述介質(zhì)，·溫育，和·揭示至少一種意味著存在綠膿假單胞菌微生物的著色變化的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及下式(I)的新型酶底物其中，R
文檔編號C12Q1/04GK101044156SQ200580035603
公開日2007年9月26日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者R·J·安德森, P·W·格朗德沃特, A·詹姆斯, D·蒙熱, A·V·扎伊耶夫 申請人:拜奧默里克斯公司