專利名稱：可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ－“脂聯(lián)素”球部融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，為可溶性腫瘤壞死因子受體II-“脂聯(lián)素”球部融合蛋白，即sTNFR II-gAD。
背景技術(shù)：
“脂聯(lián)素”(Adiponectin)是新近發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)激素，因其由三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室先后獨(dú)立發(fā)現(xiàn)，故又稱GBP-28，apM1，AdipoQ和Acrp30；它是由脂肪細(xì)胞合成并分泌到血液循環(huán)系統(tǒng)的，約占人血漿總蛋白的0.01％(5-30μg/ml)，故其濃度是大多數(shù)激素濃度的103-106倍(Shimada K，Miyazaki T，Daida H.(2004)Adiponectin and atherosclerotic disease.Clin Chim Acta.3441-12.)。它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由兩部分組成氨基端的膠原狀結(jié)構(gòu)和羧基端的補(bǔ)體Clq樣球狀結(jié)構(gòu)。脂聯(lián)素在血中以全長(zhǎng)和蛋白酶裂解后的球狀結(jié)構(gòu)片段(gAD)二種形式存在。脂聯(lián)素通過其球狀結(jié)構(gòu)可形成緊密的同源三聚體，繼而通過其膠原狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步形成更為復(fù)雜的同源多聚體，但gAD僅能形成同源三聚體(Berg AH，Combs TP，Scherer PE.(2002)Acrp30/adiponectinan adipokine regulating glucose and lipid metabolism.TrendsEndocrinol Metab.1384-89.)。脂聯(lián)素有兩種受體AdipoR1和AdipoR2，其中AdipoR1在骨骼肌中大量表達(dá)，而AdipoR2則在肝臟中大量表達(dá)；全長(zhǎng)脂聯(lián)素與AdipoR2有較高的親和性，而gAD則與AdipoR1較高的親和性，盡管兩者均可與AdipoR1和AdipoR2結(jié)合，并通過激活A(yù)MP激酶和PPAR-α途徑，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞和肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取和脂肪酸的氧化(Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et a1.(2003)Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects.Nature.423762-769.)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，它能通過肌肉(約占哺乳動(dòng)物體重的25％)促進(jìn)體內(nèi)脂肪酸的氧化，降低血甘油三酯，并通過提升胰島素敏感性改善葡萄糖代謝；脂聯(lián)素缺失的小鼠呈現(xiàn)為胰島素抵抗(insulin resistance)，最終發(fā)展成II型糖尿病(Maeda N，Shimomura I，Kishida K，et al.(2002)Diet-induced insulin resistance in micelacking adiponectin/ACRP30.Nat Med.8731-737.)。它能通過抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的粘連、遷移和對(duì)修飾低密度脂蛋白的攝取和積累，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。臨床研究顯示，肥胖癥、II型糖尿病和冠心病患者血中的脂聯(lián)素濃度普遍低下(Diez JJ，Iglesias P.(2003)The role of the novel adipocyte-derived hormone adiponectinin human disease.Eur J Endocrinol.148293-300.)。此外，脂聯(lián)素能夠通過循環(huán)進(jìn)入腦脊髓液而作用于神經(jīng)元細(xì)胞。這些中央釋放的脂聯(lián)素能夠使老鼠的體重減輕，脂肪減少；并對(duì)因瘦素(leptin)缺乏而導(dǎo)致葡萄糖水平升高和脂肪積累的老鼠也同樣有效。不同于中央瘦素通過減少食物攝取，中央脂聯(lián)素則是通過提高能量消耗來減肥(Qi Y，Takahashi N，Hileman SM，et al.(2004)Adiponectin acts in the brain todecrease body weight.Nat Med.10524-529.)。脂聯(lián)素還能通過促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)脂肪酸的氧化和抑制肝細(xì)胞脂肪酸合成以及TNFα的產(chǎn)生，從而減緩酒精/非酒精性脂肪肝的發(fā)生(Xu A，Wang Y，Keshaw H，et al.(2003)The fat-derived hormone adiponectinalleviates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in mice.J Clin Invest.11291-100.)。因此，脂聯(lián)素是一個(gè)具有防治II型糖尿病、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝潛力的細(xì)胞因子。
可溶性腫瘤壞死因子受體II(sTNFR II)是TNFα的天然拮抗劑，它是腫瘤壞死因子受體II的細(xì)胞膜外部分(Mohler KM，Torrance DS，Smith CA，et al.(1993)Soluble tumor necrosis factor receptors are effective therapeutic agents in lethalendotoxemia and function simultaneously as both TNF carriers and TNF antagonists.JImmunol.1511548-61.)。sTNFRII與IgG1 Fc(CH2和CH3)形成的融合蛋白質(zhì)二聚體(sTNFRII-Fc，命名為Etanercept)自1999年美國(guó)FDA批準(zhǔn)以來在臨床上用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。研究表明，借助Fc的二聚體化作用，Etanercept拮抗TNFα的能力是相應(yīng)sTNFR II單體的近50倍。最近的眾多研究表明，TNFα也是II型糖尿病、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝等病變中的重要致病因子(Wisse BE.(2004)The inflammatory syndromeThe role of adipose tissue cytokines in metabolic disorderslinked to obesity.J Am Soc Nephrol 152792-2800.)。因此，拮抗TNFα不僅能治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而且有助于II型糖尿病、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝等疾病的防治。
非常重要的是，sTNFR II-gAD融合蛋白借助gAD的三聚體化作用，促使sTNFRII形成同源二或三聚體，會(huì)大大增強(qiáng)該融合蛋白與TNFα的親和力，并因分子量增大可延長(zhǎng)該融合蛋白在血液循環(huán)中的半衰期。此外，借助gAD與其受體AdipoR1和AdipoR2結(jié)合，sTNFR II-gAD與TNFα相互作用形成的復(fù)合物，可導(dǎo)向至骨骼肌和肝臟，最終可將TNFα從血液循環(huán)中加以清除。因此，sTNFR II-gAD融合蛋白不論在功能上，還是在拮抗TNFα的能力上，均優(yōu)于目前臨床使用的sTNFRII-Fc融合蛋白(即只能競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNFα，而不能將其從血液循環(huán)中加以清除，故須長(zhǎng)期和持續(xù)給藥)。

發(fā)明內(nèi)容
sTNFR II-gAD融合蛋白的發(fā)明過程如下為了獲得含有sTNFR II-gAD融合基因的質(zhì)粒，我們對(duì)sTNFR II或gAD cDNA進(jìn)行了克隆和末端改造，構(gòu)建了sTNFR II-gAD-pET24重組質(zhì)粒；將這個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得相應(yīng)的工程菌大腸桿菌sTNFR II-gAD/pET24，并對(duì)sTNFR II-gAD融合基因?qū)崿F(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)效率為15-20％；其表達(dá)產(chǎn)物分別為sTNFR II-gAD融合蛋白，具有雙功能分子活性，即拮抗TNFα和“脂裂素”球部的活性(包括促進(jìn)體內(nèi)脂肪酸的氧化、提高胰島素敏感性、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝)。融合蛋白在細(xì)菌內(nèi)主要以包涵體形式存在；分離純化蛋白并復(fù)性處理后，獲得了sTNFR II-gAD雙功能融合蛋白。將6His引入融合蛋白的C端，從而便于該融合蛋白的分離純化。
本發(fā)明sTNFR II-gAD雙功能融合蛋白，其中有拮抗TNFα的活性(與0.25ng/mL TNFα共孵育，ED50＝1-10ng/mL)，和脂聯(lián)素的生物學(xué)活性(如抑制小鼠髓性白血病細(xì)胞株M1的增殖，半數(shù)有效抑制劑量ED50約為10μg/ml；并對(duì)鏈脲霉素(Streptozotocin)誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠有顯著降血糖效應(yīng)。
sTNFR II借助gAD的三聚體化作用，促使sTNFR II形成同源二或三聚體，從而大大增強(qiáng)了該融合蛋白與TNFα的親和力，并因分子量增大能延長(zhǎng)該融合蛋白在血液循環(huán)中的半衰期。借助gAD與其受體AdipoR1和AdipoR2結(jié)合，sTNFR II-gAD融合蛋白與TNFα相互作用形成的復(fù)合物，可導(dǎo)向至骨骼肌和肝臟，最終可將TNFα從血液循環(huán)中加以清除。
四

圖1是質(zhì)粒sTNFR II-gAD-pET24的示意圖。
圖2是sTNFR II-gAD融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)。
五具體實(shí)施例方式
通過下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征作詳細(xì)描述。
材料與方法一、動(dòng)物、細(xì)胞株、菌株與質(zhì)粒小鼠髓性白血病細(xì)胞株M1，成纖維細(xì)胞株L929，大腸桿菌DH5a和BL21(DE3)；原核表達(dá)質(zhì)粒pET24a(Kanar，Novagen)。
二、主要生化試劑及材料DNeasy組織試劑盒和質(zhì)粒DNA的制備試劑盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)，Trizol，SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶，Platinum Pfx DNA聚合酶和T4 DNA連接酶(Invitrogen)；sTNFR II-Fc(R & D Systems)，瓊脂糖和SDS-PAGE(Biorad)；Ni-NTA(Qiagen)和Sephacryl S-200填料(Pharmacia)。
三、DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等常規(guī)方法均參照文獻(xiàn)(Sambrook J，et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2nd edition，1989)或廠家提供的產(chǎn)品說明書；DNA序列分析在UTSW的DNA測(cè)序服務(wù)中心完成。
四、小鼠I型糖尿病模型的制備參照文獻(xiàn)(Kunjathoor VV，Wilson DL，LeBoeufRC.(1996)Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice.J ClinInvest 971767-1773.)用鏈脲霉素(Streptozotocin，每天40mg/kg體重，連續(xù)5天，腹腔注射)誘導(dǎo)雄性CL57BL/6發(fā)生I型糖尿病(血糖濃度為310-420mg/dl，而正常對(duì)照為160-230mg/dl)。
實(shí)施例1.gAD cDNA的制備。
用Trizol抽提起人皮下脂肪組織的總RNA，并以其作為模板，進(jìn)行RT-PCR制備gAD cDNA。
實(shí)施例2.sTNFR II cDNA的制備。
用Trizol抽提起外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，并以其作為模板，進(jìn)行RT-PCR制備sTNFR II cDNA。
實(shí)施例3.sTNFR II-gAD-pET24重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
用PCR制備sTNFR II-gAD-6His融合基因，并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定；然后將其分別克隆于pET24a，獲得sTNFR II-gAD-pET24重組質(zhì)粒(圖1)，并對(duì)其進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析鑒定。
實(shí)施例4.sTNFR II-gAD融合基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。
將sTNFR II-gAD-pET24重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得相應(yīng)的工程菌sTNFR II-gAD/pET24；并對(duì)sTNFR II-gAD融合基因?qū)崿F(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)效率為20-30％，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在(圖2)。
實(shí)施例5.sTNFR II-gAD-6His融合蛋白的制備。
1.制備包涵體。5克菌體懸于100ml 1xPBS中，冰浴中超聲(電流270mA)，30秒×10次(每次間隔30秒)；裂解液于4℃離心10分鐘(8000g)，將沉淀懸浮于100ml 1xPBS(內(nèi)含4mol/L尿素，0.5％Triton X-100，20mmol/L EDTA)中進(jìn)行漂洗，隨后離心(1000g×10分鐘)收集沉淀；漂洗兩次后，溶于100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，15000g×15分鐘得上清。
2.Ni-NTA柱層析將制備的包涵體溶解液上樣于Ni-NTA柱(2.6×5cm)，用平衡液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH8.0)進(jìn)行沖洗至樣品A280恢復(fù)至基線；然后用洗脫液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH4.5)進(jìn)行洗脫，收集融合蛋白質(zhì)峰(SDS-PAGE鑒定)。
3.透析復(fù)性將Ni-NTA柱層析純化獲得的sTNFR II-gAD融合蛋白調(diào)至OD280＝0.2，在大于20倍體積的透析液(100mmol/L NaHCO3，1.0mol/L尿素，1mmol/L還原型谷胱苷肽，0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH 9.0)中4℃透析復(fù)性12小時(shí)；然后在50mmol/L NaHCO3，500mmol/L NaCl，pH 11中繼續(xù)透析6小時(shí)；離心除去不溶物，收集上清。
實(shí)施例6.sTNFR II-gAD活性的測(cè)定。
1.拮抗TNFα的功能測(cè)定參照文獻(xiàn)(Mohler KM，Torrance DS，Smith CA，etal.(1993)Soluble tumor necrosis factor receptors are effective therapeutic agents inlethal endotoxemia and function simultaneously as both TNF carriers and TNFantagonists.J Immunol.1511548-61.)，在0.25ng/ml TNFα存在的情況下，用Etanercept作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)得半數(shù)有效保護(hù)劑量ED50約為1-10ng/ml。
2.脂聯(lián)素活性的測(cè)定A)參照文獻(xiàn)(Yokota T，Oritani K，Takahashi I，et al.(2000)Adiponectin，a newmember of the family of soluble defense collagens，negatively regulates the growth ofmyelomonocytic progenitors and the functions of macrophages.Blood 961723-1732.)，測(cè)得半數(shù)有效抑制劑量ED50約為10μg/ml。
B)測(cè)定sTNFR II-gAD(5μg/g體重，腹腔注射)對(duì)進(jìn)食后I型糖尿病C57BL/6小鼠的降血糖效應(yīng)(見下表，n＝5，以鹽酸二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照)，結(jié)果顯示sTNFR II-gAD在注射后4小時(shí)內(nèi)有顯著降血糖效應(yīng)。

注*為P＜0.05，**為P＜0.01。
可溶性腫瘤壞死因子受體II-“脂聯(lián)素”球部融合蛋白<110>高基民<120>可溶性腫瘤壞死因子受體II-“脂聯(lián)素”球部融合蛋白<160>1<210>1<211>1023<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sTNFRII-gAD-6His<222>(1)…(555)<223>該DNA片段為編碼人可溶性腫瘤壞死因子受體II(sTNFRII)的cDNA，其中5’端含有ATG，作為大腸桿菌翻譯sTNFRII-gAD-6His融合蛋白的起始密碼。
<220>
<221>sTNFRII-gAD-6His<222>(556)…(564)<223>為EcoRI和NdeI的酶切位點(diǎn)補(bǔ)平后，平端連接形成。
<220>
<221>sTNFRII-gAD-6His<222>(565…1023)<223>DNA片段(459bp)編碼“脂聯(lián)素”球部(gAD)，其3’端含有編碼一個(gè)XhoI位點(diǎn)，6個(gè)組氨酸和終止碼的序列(997-1023bp)。
<400>11 ATGTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACACCCTACGCCCCGGAGCCCGGGAGCACATGCCGG 60MetLeuProAlaGlnValAlaPheThrProTyrAlaProGluProGlySerThrCysArg61 CTCAGAGAATACTATGACCAGACAGCTCAGATGTGCTGCAGCAAATGCTCGCCGGGCCAA 120LeuArgGluTyrTyrAspGlnThrAlaGlnMetCysCysSerLysCysSerProGlyGln
121 CATGCAAAAGTCTTCTGTACCAAGACCTCGGACACCGTGTGTGACTCCTGTGAGGACAGC 180HisAlaLysValPheCysThrLysThrSerAspThrValCysAspSerCysGluAspSer181 ACATACACCCAGCTCTGGAACTGGGTTCCCGAGTGCTTGAGCTGTGGCTCCCGCTGTAGC 240ThrTyrThrGlnLeuTrpAsnTrpValProGluCysLeuSerCysGlySerArgCysSer241 TCTGACCAGGTGGAAACTCAAGCCTGCACTCGGGAACAGAACCGCATCTGCACCTGCAGG 300SerAspGlnValGluThrGlnAlaCysThrArgGluGlnAsnArgIleCysThrCysArg301 CCCGGCTGGTACTGCGCGCTGAGCAAGCAGGAGGGGTGCCGGCTGTGCGCGCCGCTGCGC 360ProGlyTrpTyrCysAlaLeuSerLysGlnGluGlyCysArgLeuCysAlaProLeuArg361 AAGTGCCGCCCGGGCTTCGGCGTGGCCAGACCAGGAACTGAAACATCAGACGTGGTGTGC 420LysCysArgProGlyPheGlyValAlaArgProGlyThrGluThrSerAspValValCys421 AAGCCCTGTGCCCCGGGGACGTTCTCCAACACGACTTCATCCACGGATATTTGCAGGCCC 480LysProCysAlaProGlyThrPheSerAsnThrThrSerSerThrAspIleCysArgPro481 CACCAGATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGCAGTCTGCACG 540HisGlnIleCysAsnValValAlaIleProGlyAsnAlaSerMetAspAlaValCysThr541 TCCACGTCCCCCACCGAATTTATGAAAGGAGAACCTGGAGAAGGTGCCTATGTATACCGC 600SerThrSerProThrGlTPheMetLysGlyGlTProGlyGlTGlyAlaTyrValTyrArg601 TCAGCATTCAGTGTGGGATTGGAGACTTACGTTACTATCCCCAACATGCCCATTCGCTTT 660SerAlaPheSerValGlyLeTGlTThrTyrValThrIleProAsnMetProIleArgPhe661 ACCAAGATCTTCTACAATCAGCAAAACCACTATGATGGCTCCACTGGTAAATTCCACTGC 720ThrLysIlePheTyrAsnGlnGlnAsnHisTyrAspGlySerThrGlyLysPheHisCys721 AACATTCCTGGGCTGTACTACTTTGCCTACCACATCACAGTCTATATGAAGGATGTGAAG 780AsnIleProGlyLeTTyrTyrPheAlaTyrHisIleThrValTyrMetLysAspValLys781 GTCAGCCTCTTCAAGAAGGACAAGGCTATGCTCTTCACCTATGATCAGTACCAGGAAAAT 840ValSerLeTPheLysLysAspLysAlaMetLeTPheThrTyrAspGlnTyrGlnGlTAsn841 AATGTGGACCAGGCCTCCGGCTCTGTGCTCCTGCATCTGGAGGTGGGCGACCAAGTCTGG 900AsnValAspGlnAlaSerGlySerValLeTLeTHisLeTGlTValGlyAspGlnValTrp901 CTCCAGGTGTATGGGGAAGGAGAGCGTAATGGACTCTATGCTGATAATGACAATGACTCC 960LeTGlnValTyrGlyGlTGlyGlTArgAsnGlyLeTTyrAlaAspAsnAspAsnAspSer961 ACCTTCACAGGCTTTCTTCTCTACCATGACACCAACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC 1020
ThrPheThrGlyPheLeTLeTTyrHisAspThrAsnLeuGluHisHisHisHisHisHis1021 TGA 1023*
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于將可溶性腫瘤壞死因子受體II(sTNFR II)的基因與“脂聯(lián)素”球部(gAD)基因經(jīng)過基因重組、表達(dá)而產(chǎn)生的融合蛋白，即可溶性腫瘤壞死因子受體II-“脂聯(lián)素”球部融合蛋白(sTNFR II-gAD融合蛋白)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于將融合基因克隆于帶有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體pET24中，構(gòu)建成sTNFR II-gAD-pET24表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；轉(zhuǎn)化后獲得的工程菌為大腸桿菌sTNFR II-gAD/pET24。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于將6His引入融合蛋白的C端。
全文摘要
本發(fā)明為一種基因工程技術(shù)生產(chǎn)的可溶性腫瘤壞死因子受體II－“脂聯(lián)素”球部雙功能融合蛋白(即sTNFR II－gAD融合蛋白)。通過對(duì)sTNFR II和gAD的cDNA進(jìn)行改造，獲得了sTNFR II－gAD融合基因，構(gòu)建了sTNFR II－gAD表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌并得到了原核高效表達(dá)；sTNFR II－gAD融合蛋白經(jīng)純化復(fù)性后具有sTNFR II和gAD雙重生物活性，即拮抗TNFα的活性和“脂裂素”球部的活性(包括促進(jìn)體內(nèi)脂肪酸的氧化、提高胰島素敏感性、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝)。此外，單體sTNFR II因gAD的三聚體化作用而形成二或三聚體，其拮抗TNFα的活性較相應(yīng)單體高達(dá)50－100倍。因此，這個(gè)雙功能融合蛋白質(zhì)分子不僅可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而且有助于II型糖尿病、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝等疾病的防治。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1752108SQ200510100468
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者高基民 申請(qǐng)人:高基民