專利名稱：美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白v和編碼序列及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種新的編碼美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamsela)外膜蛋白V(outer membrane protein V，OmpV)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽，還涉及該多核苷酸和多肽的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
桿菌是目前研究最多的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌因其獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性。革蘭氏陰性細(xì)菌大多數(shù)為條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時可引起多種感染，人類和牲畜中有很多疾病是由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的。主要致病性桿菌有痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、百日咳桿菌等，它們產(chǎn)生內(nèi)毒素，通過內(nèi)毒素使人致病。1996年在日本發(fā)生了一次世界上最大的由O157H7大腸桿菌引起的爆發(fā)流行。大腸桿菌(Escherichia coli)在自然界分布很廣，是人和動物腸道中的正常菌群。正常情況下一般不致病，但它是條件致病菌。近年來，世界范圍的細(xì)菌感染類型和感染細(xì)菌有著明顯變化，原來對人類生命威脅最大的病菌正逐漸被非致病的弱毒菌和條件致病菌所取代。美人魚發(fā)光桿菌就是目前比較重視的這一類細(xì)菌。美人魚發(fā)光桿菌是一種革蘭氏陰性，可以發(fā)光的，兼性厭氧桿菌，它最初是1981年，從在溫暖海水中生長的鯡魚的潰瘍傷口中分離到的，并分類到弧菌屬，稱為美人魚弧菌，因為它能引起的人畜病證與弧菌屬相似，均能引起人類腸胃炎、傷口感染和人畜敗血病(CURRENT MICROBIOLOGY Vol.48(2004)，pp.167-174 Cloning and Characterization of the Gene Encoding for OMP-PDPorinThe Major Photobacterium damsela Outer Membrane Protein)。在1991年基于16sRNA基因序列的比較和染色體DNA-DNA雜交數(shù)據(jù)將其歸類到桿菌屬，稱為美人魚發(fā)光桿菌(Shin JH，Shin MG，Suh SP，Ryang DW，Rew JS，Nolte FS.Primary Vibrio damselasepticemia. Clin Infect Dis 1996；22856-857.)。它是一種具極端破壞性的引起組織壞死傳染病的細(xì)菌，它不僅會引起假結(jié)核病和魚出血性敗血癥，導(dǎo)致漁產(chǎn)養(yǎng)殖損失50％以上；還能通過人的傷口或者是食用未熟海產(chǎn)品而使人致病，在日本就發(fā)生過多起漁民感染了美人魚發(fā)光桿菌而嚴(yán)重致病的事件。更可怕的是，越來越多的報道表明美人魚發(fā)光桿菌具有強(qiáng)致死性，能同時以有免疫缺陷或者是健康人為宿主，并誘發(fā)快速的，爆發(fā)性的傳染(Fraser SL，Purcell BK，Delgado B Jr，Baker AE，Whelen AC.Rapidly fatal infectiondue to Photobacterium (Vibrio) damsela.Clin Infect Dis 1997；25935-936.)。
OmpV是細(xì)菌外膜蛋白中的一個重要蛋白，目前對OmpV蛋白的研究是非常少的。在所有細(xì)菌中，僅獲得Salmonella enterica、霍亂弧菌和副溶血弧菌等3種細(xì)菌的基因序列。對于其結(jié)構(gòu)和功能，僅僅只是認(rèn)為OmpV可能是一個孔蛋白，是一個可以熱誘導(dǎo)的，具高免疫原性的蛋白所以O(shè)mpV是一個非常值得關(guān)注和深入研究的蛋白。
尚未見有任何公開或報道過提及的美人魚發(fā)光桿菌OmpV核苷酸序列。也未見有報道過桿菌OmpV蛋白具有鹽敏感功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V。
本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼具有美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)制備上述新的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的方法。
本發(fā)明還提供了這種美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V和編碼序列的應(yīng)用，即提供了該蛋白的一種新的功能，即鹽敏感功能，在提高生物細(xì)胞鹽敏感性的應(yīng)用。
本發(fā)明所說的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V，其特征在于該多肽含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。
上述美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其相關(guān)信息為(i)序列特征(A)長度258個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述MNKTLIALLT LAAAGTATAG DTYIRNGNIY NNQGGWVAEV GVAQGSDLFK DQKHNTAPIL60NGGYHGEDFN ADLGGTNYRF LGETNDLINM SAYVVGSGII RDGDVAKSLK GTQKRRLAVD120LGLNTDFTLD EHNVISTYLQ HDISGAYKGY LAGATYFHIM NFGSVDFVPF ANLTYQSEDY180VDYYFGIKDR EATANRKAYK GDATVSYGLG YKLVMPINDN WQINQTTQYT RLGSGISDSS240VVDSANQWVV GASVSYNF 258
本發(fā)明所說的分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
上述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的多肽。
上述多核苷酸的序列選自SEQ ID NO.3的編碼區(qū)序列或全長序列，其相關(guān)信息為(i)序列特征(A)長度777bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3atgaacaaga cacttatcgc actactaact ttggcagcag ctggcaccgc aacggcaggt60gacacataca tccgtaacgg caacatctac aacaaccaag gtggttgggt tgcggaagtg 120ggcgtagctc aaggtagtga cctatttaaa gatcaaaaac acaatactgc accaatccta 180aacggtggtt accacggtga agacttcaac gcagatttgg gcggcaccaa ctaccgcttc 240ttgggtgaaa ccaacgatct gatcaacatg agcgcatacg tggtaggcag cggcattatt 300cgtgatggcg atgtagcaaa gagcttgaaa ggcacacaaa aacgtcgttt agcggttgat 360ttaggtctaa ataccgattt cactctagat gagcacaacg tcatctcgac atacctacaa 420cacgacatca gcggcgcata caaaggttac ttagcgggcg cgacgtactt ccacatcatg 480aacttcggta gtgttgattt tgttcctttt gctaacctaa cttatcaaag tgaagactac 540gtagattact actttggcat caaagatcgt gaagcgacgg caaaccgcaa agcatacaaa 600ggtgatgcaa cggtaagcta cggtctgggc tacaagctgg ttatgccaat taatgacaac 660tggcaaatca accaaacaac tcaatacact cgcctaggca gtggtatcag tgattcatct 720gttgtagata gcgcaaacca atgggttgtt ggcgcaagcg tgtcttacaa cttctaa 777本發(fā)明所說的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的制備方法，其步驟如下(1)將編碼具有美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞，表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物；(4)分離純化具有美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白活性的多肽。
本發(fā)明與美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體為多克隆抗體。
所說的“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下從位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨的核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中所說的載體可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的美人魚發(fā)光桿菌OmpV多肽時，可以將美人魚發(fā)光桿菌OmpV編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白表達(dá)載體。
所說的“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
所說的“宿主細(xì)胞”為原核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌等，優(yōu)選E.coli DH5α；E.coli BL21和E.coli TOP10等。
還可以用美人魚發(fā)光桿菌OmpV特異抗體的Western印跡分析來分析美人魚發(fā)光桿菌OmpV基因產(chǎn)物的表達(dá)，并證實其在生物樣本中的表達(dá)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的美人魚發(fā)光桿菌OmpV核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選美人魚發(fā)光桿菌OmpV同源基因或同源蛋白。
另外，根據(jù)本發(fā)明的美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的鹽敏感功能及分子量，可以在不同鹽度下篩選美人魚發(fā)光桿菌OmpV同源基因或同源蛋白。
本發(fā)明的美人魚發(fā)光桿菌OmpV核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或文庫篩選法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，并用美人魚發(fā)光桿菌做為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。


圖1為不同鹽度條件下美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白SDS-PAGE圖譜比較。在圖1中，1-4分別表示鹽度為0.5％，1％，4％，M表示mark，KDa表示分子量的大小。
圖2為在不同鹽度條件(0.5％，1％，4％)下，美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白雙向電泳圖譜比較。
圖3為PET-OmpV克隆子在E.coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)。在圖3中，2、3為所克隆的基因的表達(dá)條帶；1為空載體的條帶。
圖4為PLLP-OmpA-OmpW克隆子的PCR鑒定。在圖4中，1為陰性對照，2為陽性對照，3～10為陽性克隆的PCR鑒定，單位為Kb。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1美人魚發(fā)光桿菌OmpV基因的克隆1.細(xì)菌的獲得與培養(yǎng)從海域中獲取的各種細(xì)菌，經(jīng)簡單的分離純化后，用弧菌專用培養(yǎng)基TCBS初步篩選獲得一呈綠色菌落，經(jīng)廈門市疾控中心VITEK32型全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定后定為美人魚發(fā)光桿菌。
挑取美人魚發(fā)光桿菌單菌落于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，加30％甘油-70℃保存。
2.基因的全長克隆(Cloning of full-length DNA)由于美人魚發(fā)光桿菌基因的全序列還未測定，目前也無該菌OmpV的基因序列報道。鑒于副溶血弧菌已完成全序列測定，我們按其的OmpV序列設(shè)計了OmpV基因引物，用于美人魚發(fā)光桿菌OmpV的PCR擴(kuò)增。由此，可根據(jù)副溶血弧菌OmpV序列的5`端和3`端并加上酶切位點(diǎn)和兩個保護(hù)堿基設(shè)計引物，R15’-GGGGATCCATGAACAAGACACT-3’(記為SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸R25’-CCGCTAGCTTAGAAGTTGTAAGACAC-3’(記為SEQ ID NO.2)為反向引物，以美人魚發(fā)光桿菌為模板，對美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白進(jìn)行PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃90秒進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為777bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
上述SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2分別為SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述GGGGATCCATGAACAAGACACTSEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度26bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述CCGCTAGCTTAGAAGTTGTAAGACAC實施例2美人魚發(fā)光桿菌OmpV基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的美人魚發(fā)光桿菌OmpV基因全長為777bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。根據(jù)DNA全長推導(dǎo)出美人魚發(fā)光桿菌OmpV的氨基酸序列，共258個氨基酸殘基，分子量27kD，詳細(xì)序列記為SEQ ID NO.4，其相關(guān)信息為(i)序列特征(A)長度258氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述MNKTLIALLT LAAAGTATAG DTYIRNGNIY NNQGGWVAEV GVAQGSDLFK DQKHNTAPIL60NGGYHGEDFN ADLGGTNYRF LGETNDLINM SAYVVGSGII RDGDVAKSLK GTQKRRLAVD120LGLNTDFTLD EHNVISTYLQ HDISGAYKGY LAGATYFHIM NFGSVDFVPF ANLTYQSEDY180VDYYFGIKDR EATANRKAYK GDATVSYGLG YKLVMPINDN WQINQTTQYT RLGSGISDSS240VVDSANQWVV GASVSYNF 258將OmpV的基因序列全長及基編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與副溶血弧菌OmpV基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，它與副溶血弧菌OmpV基因的全編碼序列(GenBank Accession No.BA000032)中的11-645序列具有99％的相同性(見表1)表1Percent Identoty99％in nt overlap
Query1 atgaacaagacacttatcgcactactaactttggcagcagctggcaccgcaacggcaggt 60||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1 atgaacaagacacttatcgcactactaactttggcagcagctggcaccgcaacggcaggt 60Query61 gacacatacatccgtaacggcaacatctacaacaaccaaggtggttgggttgcggaagtg 120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct61 gacacatacatccgtaacggcaacatctacaacaaccaaggtggttgggttgcggaagtg 120Query121 ggcgtagctcaaggtagtgacctatttaaagatcaaaaacacaatactgcaccaatccta 180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct121 ggcgtagctcaaggtagtgacctatttaaagatcaaaaacacaatactgcaccaattcta 180Query181 aacggtggttaccacggtgaagacttcaacgcagatttgggcggcaccaactaccgcttc 240||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct181 aacggtggttaccacggtgaagacttcaacgcagatttgggcggcatcaactaccgcttc 240Query241 ttgggtgaaaccaacgatctgatcaacatgagcgcatacgtggtaggcagcggcattatt 300||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct241 ttgggtgaaaccaacgatctgatcaacatgagcgcatacgtggtaggcagcggcattatt 300Query301 cgtgatggcgatgtagcaaagagcttgaaaggcacacaaaaacgtcgtttagcggttgat 360||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct301 cgtgatggcgatgtagcaaagagcttgaaaggcacacaaaaacgtcgtttagcagttgat 360Query361 ttaggtctaaataccgatttcactctagatgagcacaacgtcatctcgacatacctacaa 420||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct361 ttaggtctaaataccgatttcactctagatgagcacaacgtcatctcgacatacctacaa 420Query421 cacgacatcagcggcgcatacaaaggttacttagcgggcgcgacgtacttccacatcatg 480||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct421 cacgacatcagcggcgcatacaaaggttacttagcgggcgcgacgtacttccacatcatg 480Query481 aacttcggtagtgttgattttgttccttttgctaacctaacttatcaaagtgaagactac 540||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct481 aacttcggtagtgttgattttgttccttttgctaacctaacttatcaaagtgaagactac 540Query541 gtagattactactttggcatcaaagatcgtgaagcgacggcaaaccgcaaagcatacaaa 600
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表2Identities＝256/258(99％)，Positiyes＝257/258(99％)，Gaps＝0/258(0％)Query 1 MNKXXXXXXXXXXXXXXXXXDTYIRNGNIYNNQGGWVAEVGVAQGSDLFKDQKHNTAPIL 60MNKTLIALLTLAAAGTATAGDTYIRNGNIYNNQGGWVAEVGVAQGSDLFKDQKHNTAPILSbjct 1 MNKTLIALLTLAAAGTATAGDTYIRNGNIYNNQGGWVAEVGVAQGSDLFKDQKHNTAPIL 60Query 61 NGGYHGEDFNADLGGTNYRFLGETNDLINMSAYVVGSGIIRDGDVAKSLKGTQKRRLAVD 120NGGYHGEDFNADLGG NYRFLGETNDLINMSAYVVGSGIIRDGDV+KSLKGTQKRRLAVDSbjct 61 NGGYHGEDFNADLGGINYRFLGETNDLINMSAYVVGSGIIRDGDVSKSLKGTQKRRLAVD 120Query 121 LGLNTDFTLDEHNVISTYLQHDISGAYKGYLAGATYFHIMNFGSVDFVPFANLTYQSEDY 180LGLNTDFTLDEHNVISTYLQHDISGAYKGYLAGATYFHIMNFGSVDFVPFANLTYQSEDYSbjct 121 LGLNTDFTLDEHNVISTYLQHDISGAYKGYLAGATYFHIMNFGSVDFVPFANLTYQSEDY 180Query 181 VDYYFGIKDREATANRKAYKGDATVSYGLGYKLVMPINDNWQINQTTQYTRLXXXXXXXX 240
VDYYFGIKDREATANRKAYKGDATVSYGLGYKLVMPINDNWQINQTTQYTRLGSGISDSSSbjct 181 VDYYFGIKDREATANRKAYKGDATVSYGLGYKLVMPINDNWQINQTTQYTRLGSGISDSS 240Query 241 XXXXANQWVVGASVSYNF 258VVDSANQWVVGASVSYNFSbjct 241 VVDSANQWVVGASVSYNF 258上列美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的氨基酸序列下列副溶血弧菌OmpV蛋白的氨基酸序列(GenPeptAccessionNo.BAC61439)由上可見，美人魚發(fā)光桿菌OmpV基因與副溶血弧菌OmpV基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
實施例3美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究以下給出不同鹽濃度條件下美人魚發(fā)光桿菌OmpV的變化在提取了美人魚發(fā)光桿菌在0.5％、1％及4％這三種鹽濃度培養(yǎng)條件下的外膜蛋白以后，首先通過SDS-PAGE對它們外膜蛋白圖譜進(jìn)行比較分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以清楚地看到，隨著鹽度的逐漸上升，有一個蛋白條帶也相應(yīng)表現(xiàn)出在量上的逐漸下漸，這表明這條蛋白條帶與美人魚發(fā)光桿菌的鹽適應(yīng)性具有緊密相關(guān)性。結(jié)合對美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白的鑒定結(jié)果可以知道，這個條帶為OmpV。
美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的克隆及誘導(dǎo)表達(dá)后對菌體鹽敏感性的影響按實施例1中的方法對美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，分別連接到PETHIS及PLLP-OmpA中并最終分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21和Top10中。圖3是對E.coli BL21OmpV轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE圖譜。從圖3中可以清楚地看到OmpV蛋白的表達(dá)。對此經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌株以及同樣經(jīng)過誘導(dǎo)的E.coli Top10+PLLP-OmpA-OmpV進(jìn)行了鹽耐受能力的分析，表3為在各鹽度平板接種24小時后的生長觀察結(jié)果。
表3

注+表示有菌落；-表示不生長從表3中可以看出，E.coli Top10+PLLP-OmpA-Omp比對照株E.coli Top10+PLLP-OmpA鹽的耐受力上降低了一個鹽度，這明顯表明了美人魚發(fā)光桿菌OmpV與鹽敏感的直接相關(guān)性。
同時，可以看到E.coli BL21+PET-OmpV與其對照株E.coli BL21+PET在鹽耐受度上基本相同，沒有表現(xiàn)出OmpV導(dǎo)入后對其耐鹽能力的下降。其原因主要是，OmpV在E.coliBL21+PET-OmpV中表達(dá)后仍然存在于胞內(nèi)，很難到達(dá)外膜部位，從而無法發(fā)揮其在鹽敏感性的作用。而在使用PLLP-OmpA載體后，由于載體上所帶的OmpA信號肽的作用，使誘導(dǎo)表達(dá)的OmpV蛋白可以分泌到胞外，在通過某種方式插入外膜后OmpV蛋白就表現(xiàn)出其在鹽敏感性上的作用。使用這兩種載體得出的不同結(jié)果進(jìn)一步表明了，OmpV表達(dá)導(dǎo)致鹽敏感性的提升是OmpV蛋白自身的作用，而不是其誘導(dǎo)表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞其它變化而產(chǎn)生。
實施例4美人魚發(fā)光桿菌OmpV多肽的制備和提純將全長的美人魚發(fā)光桿菌OmpV編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體之中，以達(dá)到表達(dá)和提純目的蛋白。
大腸桿菌DH5α克隆載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞根據(jù)以上設(shè)計好的引物，分別對應(yīng)于編碼序列5′和3′端的約20個核苷酸，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒PET-HIS而定)，以便構(gòu)建克隆和表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將美人魚發(fā)光桿菌OmpV基因克隆至E.coli表達(dá)質(zhì)粒PET-HIS.用合適的內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化。用瓊脂糖膠電泳來確定質(zhì)粒的純度和濃度。將線性化的克隆質(zhì)粒，用化學(xué)熱激法轉(zhuǎn)化到克隆載體E.coli DH5α感受態(tài)中。全部涂于LB+Amp平板上，37℃培養(yǎng)12～16小時。
克隆進(jìn)美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白的DH5α陽性克隆的篩選、鑒定隨機(jī)挑取LB+Amp平板上的大腸桿菌菌落，接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基上，同時接種含有空PET-HIS質(zhì)粒的DH5α，過夜培養(yǎng)，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒，并對所提取出的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR驗證，得到PCR驗證圖譜如圖4所示。
大腸桿菌BL21表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞將以上檢測出含有美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白基因的質(zhì)粒用同樣的化學(xué)熱激法轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21感受態(tài)。全部涂于LB+Amp平板上，37℃培養(yǎng)10-16小時。
表達(dá)美人魚發(fā)光桿菌OMPV蛋白的BL21陽性克隆的篩選、鑒定隨機(jī)挑取LB+Amp平板上的大腸桿菌BL21菌落，接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基上，同時接種未轉(zhuǎn)化的BL21和含有PET-HIS空質(zhì)粒的BL21，于30℃中度輕搖至OD值為0.6，加入IPTG100ug/ml 35℃誘導(dǎo)兩個小時，離心收集菌體，SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示。
利用Western blot檢測OmpV蛋白在轉(zhuǎn)基因E.coli中的表達(dá)1、蛋白的獲取按上述方法表達(dá)美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白。
2、SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE 的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，2001)；a)加樣前，將樣品置于LSB加樣緩沖液(2*加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸3～5分鐘；b)4℃80V電壓下聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。
3、蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移a)轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmolTris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)4℃下用DYY-7B電轉(zhuǎn)儀50V轉(zhuǎn)移2小時，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙。
4、膜上蛋白的檢測a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，室溫緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml TNT；b)再將膜浸泡在洗滌緩沖液中，室溫洗滌三次，每次10分鐘；c)加入第一抗體(抗美人魚發(fā)光桿菌OmpV的抗體)，室溫反應(yīng)60分鐘；同步驟b)，洗滌三次；d)加入第二抗體(辣根過氧化酶兔抗鼠二抗)，室溫反應(yīng)60分鐘；同步驟b)，洗滌三次；e)加入底物DAB顯色觀察蛋白條帶。
權(quán)利要求
1.美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V，其特征在于該多肽含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V，其特征在于該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于該多核苷酸的序列選自SEQ ID NO.3的編碼區(qū)序列或全長序列。
6.美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)將編碼具有美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞，表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物；(4)分離純化具有美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V蛋白活性的多肽；
7.如權(quán)利要求1所述的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V在提高生物細(xì)胞鹽敏感性的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸在提高生物細(xì)胞鹽敏感性的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V，編碼具有美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列和美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的氨基酸序列及其利用重組技術(shù)制備美人魚發(fā)光桿菌外膜蛋白V的方法。本發(fā)明還提供了美人魚發(fā)光桿菌OmpV蛋白和編碼序列的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK1786022SQ20051010021
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者彭宣憲, 吳麗娜 申請人:中山大學(xué)