專利名稱：一種通過基因表達(dá)圖譜預(yù)測胃癌術(shù)后存活狀況的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測癌癥手術(shù)后存活率的方法，尤其涉及一種通過基因微陣列的分類圖譜，以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)測胃癌術(shù)后存活狀況的方法。
背景技術(shù)：
胃癌是世界上常見的癌癥之一，且居臺灣地區(qū)患癌率的第四位。目前臨床上普遍是以內(nèi)窺鏡進(jìn)行篩檢，以期于癌癥早期階段診斷出，但仍有部分患者在診斷時，其癌癥已處于較嚴(yán)重的癌癥期(stage)。根據(jù)先前的研究報(bào)告指出，癌癥I期(stage I)的患者通常具有較好的預(yù)后(prognosis)，而癌癥IV期(stageIV)的患者則顯示出非常差的預(yù)后。但令人困擾的是，癌癥II期(stage II)與III期(stage III)患者的預(yù)后情形卻有著極大的差異，目前尚無法得知其生物原因。
已有一些研究報(bào)告指出，公知的一些臨床病理因子與多個有趣的分子，包括細(xì)胞周期調(diào)控因子(cell cycle regulation factors)(例如，p27或細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E))、細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules)(例如，細(xì)胞粘附連接分子(E-cadherin)、血管形成因子(angiogenic factors)(例如，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與胎盤生成因子(placenta growthfactor))、致癌因子(oncogenes)(例如，c-erbB2與c-myc)，以及腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes)(例如p53))等，可能與胃癌患者的預(yù)后有關(guān)。然而，這在不同的研究中卻存在著不一致的結(jié)果，并且由于疾病的生物學(xué)十分復(fù)雜，因此在這些先前報(bào)告中的參數(shù)僅能提供有限的個別患者的預(yù)后信息。由于胃癌的細(xì)胞與分子具有異質(zhì)性(heterogeneity)，以及有許多的基因可能參與胃癌病變產(chǎn)生(pathogenesis)的多個步驟，因此這意味著著手研究這些多個基因的變異(alterations)是一件重要的事。
近來，由于能系統(tǒng)化進(jìn)行基因表達(dá)研究的cDNA微陣列(microarray)技術(shù)的改良，使得我們得以看見人類腫瘤基因的表達(dá)圖譜。這些基因表達(dá)圖譜可用以幫助鑒別基因活化圖形，據(jù)此來區(qū)別胃腫瘤的亞綱(subclasses)?；驁D譜的研究也曾被使用于篩選有較高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性的患者，以進(jìn)行輔助治療。最近，Grodon等人揭示一種使用4～6個自微陣列篩選出的基因的簡單的基因表達(dá)量圖形，其在間皮瘤(mesothelioma)的預(yù)測結(jié)果上有很高的準(zhǔn)確度。
但由于前述公知的研究中，很少是從相當(dāng)大量的基因中收集資料，且其大多使用昂貴的數(shù)據(jù)獲取平臺與復(fù)雜的演算及/或軟件，加上該些方法并無法在不參考其它樣本的狀況下分析獨(dú)立的樣本，因此這使得公知方法在臨床應(yīng)用上有其限制。此外，目前仍也無實(shí)際有用的方法，可用以辨別各個患胃癌者，在手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性。

發(fā)明內(nèi)容
為解決前述公知技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種通過基因微陣列的分類圖譜，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以公知統(tǒng)計(jì)方法建立一種D2胃切除術(shù)(D2 gastrectomy)后存活狀況的預(yù)測模式的方法。
根據(jù)本發(fā)明所指出的一種通過基因表達(dá)的微陣列分類圖譜，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，建立胃癌患者術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，包含以下步驟(1)通過多個已知胃癌術(shù)后存活狀況的成對的腫瘤與非腫瘤組織樣本，以其基因表達(dá)的微陣列分類圖譜，在這些組織樣本中篩選出表達(dá)顯著不同的特異性基因；(2)對上述特異性基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并確認(rèn)其結(jié)果與上述微陣列分類圖譜結(jié)果的一致性；以及(3)以公知的統(tǒng)計(jì)模式選取法，從上述特異性基因中選出腫瘤調(diào)節(jié)基因，并通過一訓(xùn)練組樣本以上述腫瘤調(diào)節(jié)基因建立該預(yù)測模式的公式。
作為本發(fā)明前述步驟(1)的例子，例如針對基因微陣列資料，采用三步驟分類方式，建立表達(dá)顯著不同的基因分類圖譜，但并不僅限于此。前述的三步驟包含(i)將位于該微陣列上的上述組織樣本中與腫瘤調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的表達(dá)量的對數(shù)比值(log ratio)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)；(ii)利用折疊改變法(fold-change)濾除上述對數(shù)比值表達(dá)較不顯著的基因；以及
(iii)以多重排列檢定法(multiple permutation test)與交叉驗(yàn)證(crossvalidation，CV)進(jìn)一步篩選出表達(dá)顯著不同的基因。
前述微陣列上基因的表達(dá)量，例如可通過檢測該基因的cDNA表達(dá)量來獲得。
前述步驟(2)中，該特異性基因的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果與其cDNA表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較，來確認(rèn)一致性時，可通過一選定的篩選標(biāo)準(zhǔn)來執(zhí)行，在本發(fā)明中可作為此篩選標(biāo)準(zhǔn)的例子，例如斯皮爾曼等級相關(guān)(Spearmanrank correlation coefficient)檢定法p＜0.05。
前述步驟(3)中，優(yōu)選為進(jìn)一步包含結(jié)合羅吉斯回歸分析(logisticregression)進(jìn)行該腫瘤調(diào)節(jié)基因的選取?？蓱?yīng)用于本發(fā)明中作為前述統(tǒng)計(jì)模式選取法的例子，例如逐步模式法，但并不僅限于此。為避免因樣本數(shù)目不足，所產(chǎn)生的過度擬合(overfitting)問題，前述訓(xùn)練組樣本的樣本數(shù)目，優(yōu)選為不少于預(yù)測模式中腫瘤調(diào)節(jié)基因數(shù)目的5倍。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過基因表達(dá)圖譜預(yù)測胃癌術(shù)后存活狀況的方法，據(jù)此來預(yù)測胃癌患者于D2胃切除術(shù)后的存活率，以供后續(xù)治療以及是否進(jìn)行輔助性治療(adjuvant chemotherapy)的參考。
根據(jù)本發(fā)明所指出的一種預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其包含如下步驟(a)從該胃癌患者獲得腫瘤組織與非腫瘤組織的成對樣本；(b)以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測該成對樣本中腫瘤調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；以及(c)基于步驟(b)中所得的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果，通過前述方法所得的預(yù)測模式計(jì)算該胃癌患者的存活狀況。
本發(fā)明通過基因表達(dá)圖譜所構(gòu)成的預(yù)測模式，較公知技術(shù)能更正確的預(yù)測胃癌患者在治療切除后的存活情況。本發(fā)明方法能成功的避免公知技術(shù)無法將微陣列技術(shù)應(yīng)用在臨床上的缺點(diǎn)。


圖1(A)是表示6個基因與β肌動蛋白內(nèi)參組的逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果；(B)是表示通過逆轉(zhuǎn)錄PCR確認(rèn)6個所選基因的微陣列數(shù)據(jù)；
“N”表示正常組織；“T”表示腫瘤組織；“CD36”表示CD36抗原；“SLAM”表示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子；“TFAP”表示轉(zhuǎn)錄因子AP-2α；“IGF-1”表示類胰島素生長因子；“PIM-1”表示PIM-1致癌基因；“TIMP-4”表示金屬蛋白酶的組織抑制劑-4；“G”表示良好存活；“P”表示不良存活。
圖2是表示4個樣本中每個所選基因的成對逆轉(zhuǎn)錄PCR狀態(tài)；“CD36”表示CD36抗原；“SLAM”表示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子；“TFAP”表示轉(zhuǎn)錄因子AP-2α；“PIM-1”表示PIM-1致癌基因；“β-actin”表示β肌動蛋白；“N”表示正常組織；“T”表示腫瘤組織；“TN”表示腫瘤的表達(dá)量高于非腫瘤的表達(dá)量；“NT”表示非腫瘤的表達(dá)量高于腫瘤的表達(dá)量；圖3是表示被預(yù)測有良好存活與不良存活的患者的存活曲線；(A)全部測試患者的存活率；(B)第三期患者的存活率。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中，對由不良存活與良好存活組所構(gòu)成的18位患者，使用包含有328個已知基因序列的基因，以及具有顯色檢測的自制(in-house)尼龍膜小型微陣列，采用三步驟的分類篩選方式來尋找預(yù)測胃癌患者存活的基因表達(dá)圖譜。第一步中，在此使用328個基因，分別分析其在腫瘤與非腫瘤組織中的cDNA表達(dá)量，并計(jì)算出其cDNA表達(dá)量的對數(shù)比值。為避免在每個微陣列樣本上的系統(tǒng)誤差，在此使用非線性的局部加權(quán)回歸法(locally WeightedSactterplot Smoother，LOWESS)，將328個基因的對數(shù)比值(log ratios)標(biāo)準(zhǔn)化至經(jīng)由MA做圖擬合的LOWESS曲線上。對數(shù)比值標(biāo)準(zhǔn)化后，第二步驟再通過折疊改變法(fold-change method)從328個基因中選出141個基因。最后，在第三步驟中使用多重排列檢定法(multiple permutation test)與交叉驗(yàn)證(crossvalidation，CV)進(jìn)一步篩選出6個表達(dá)顯著不同的特異性基因。這些篩選出的特異性基因，包括CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子(SLAM)、轉(zhuǎn)錄因子AP-2α(transcription factor AP-2alpha，TFAP)、類胰島素生長因子(insulin-likegrowth factor 1，IGF-1)、PIM-1致癌基因，以及金屬蛋白酶的組織抑制劑-4(tissue inhibitor of metalloproteinase-4，TIMP-4)。
接著，再通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測前述6個基因在腫瘤和非腫瘤組織中的表達(dá)。將RT-PCR的結(jié)果與前述的微陣列結(jié)果比較。結(jié)果顯示，前述6個基因中有4個(CD36、SLAM、TFAP與PIM-1)，在兩者的結(jié)果中具有高度的一致性(60％以上)，且其斯皮爾曼等級相關(guān)檢定也顯示出具有顯著性，且p＜0.05。
本發(fā)明中，另外隨機(jī)從18位患者中所挑選出的4位患者用以進(jìn)行重復(fù)研究，以測試此自制尼龍膜的微陣列的再現(xiàn)性。這4個患者的總RNAs用兩個不同的微陣列尼龍膜在不同時間進(jìn)行雜交。經(jīng)計(jì)算交叉雜交所得的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficients)都超過0.75(P＜0.05)，這表示本發(fā)明方法具有良好的重復(fù)性。
將每個所選基因在腫瘤組織與非腫瘤組織中的RT-PCR表達(dá)量的狀態(tài)分成四類，分別為(1)腫瘤的表達(dá)量高于非腫瘤的表達(dá)量，以“腫瘤正?！北硎荆?2)非腫瘤的表達(dá)量高于腫瘤的表現(xiàn)量，以“正常腫瘤”表示；(3)腫瘤與非腫瘤均為陽性；以及(4)腫瘤與非腫瘤均為陰性。接著，選用數(shù)個已知存活情形樣本，將其RT-PCR的結(jié)果按照上述四類進(jìn)行分類，據(jù)此分別計(jì)算出每個所選基因在這四種RT-PCR狀態(tài)中的樣本的出現(xiàn)頻率，據(jù)此建立預(yù)測模式。
基于Akaike’s法則(Akaike’s information criterion，AIC)采用羅吉斯回歸分析(logistic regression)模式與逐步模式選擇預(yù)測模式，再從前述4個基因中，獲得由其中3個基因(CD36、SLAM與PIM-1)所組成的最有效的羅吉斯預(yù)測模式。
在前述這3個基因中，公知SLAM是由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞及樹狀細(xì)胞(dendritic cells)所表達(dá)的CD2相關(guān)的表面受體。常在胃癌患者中受損的Th0/Th1免疫反應(yīng)也可為SLAM所誘發(fā)，以此來增強(qiáng)CD8+腫瘤專一性淋巴細(xì)胞的增殖與細(xì)胞殺傷能力。雖然SLAM在胃癌患者的腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)中的真實(shí)角色仍然不清楚，但其似乎在抗腫瘤免疫反應(yīng)上具有潛在性的影響。公知CD36是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(apoptosis)與血管生成(angiogenesis)以結(jié)合其配體凝血因子(ligand thrombospondin-1，TSP-1)的跨膜受體(trans-membranereceptor)。TSP-1位于腫瘤相關(guān)的細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix)中，且CD36表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的表面。腫瘤細(xì)胞中CD36表達(dá)的調(diào)節(jié)可能在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移與血管再生上扮演一個重要的角色。PIM-1是絲氨酸/酪氨酸激酶的產(chǎn)物，其可在胃的上皮細(xì)胞中由幽門螺旋桿菌(H.pylori)誘發(fā)，其可能參與胃的癌變形成。PIM-1在T細(xì)胞的增殖、分化與成熟中也扮演一個重要的角色，其可能與腫瘤的免疫反應(yīng)有關(guān)。PIM-1可由組織缺氧(hypoxia)誘發(fā)，其參與實(shí)體腫瘤細(xì)胞的抗藥性(drug resistance)與腫瘤形成(tumorigenesis)，并且會導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性(genomic instability)。最近的研究顯示，PIM的表達(dá)與前列腺癌(prostate cancer)的臨床檢查結(jié)果有顯著的相關(guān)聯(lián)性。因此，在本發(fā)明預(yù)測模式中所選用的三個基因可能以某種方式參與跟患者存活極為相關(guān)的腫瘤的血管生成與腫瘤免疫反應(yīng)。
本發(fā)明預(yù)測模式使用取自RT-PCR狀態(tài)的資料，來建立成對樣本中3個基因的表達(dá)分類。由于本發(fā)明方法是通過獨(dú)立的微陣列平臺來執(zhí)行，因此僅需要少量的RNA(例如，當(dāng)使用RT-PCR時僅需要2μg)即可在一般的實(shí)驗(yàn)室中執(zhí)行。
在本發(fā)明中，微陣列的數(shù)據(jù)經(jīng)以LOWESS法標(biāo)準(zhǔn)化后，可避免在每個微陣列樣本中可能過度標(biāo)準(zhǔn)化的系統(tǒng)化錯誤。在預(yù)測模式的選擇過程中，過度擬合問題是一個重要的關(guān)鍵。在本發(fā)明中使用隨機(jī)產(chǎn)生樣本以克服此潛在的缺陷，并建立較使用1或2個基因的模式靈敏且特異性高的3基因預(yù)測模式。
已有公知報(bào)告指出，輔助性治療對全部已施予D2胃切除術(shù)的胃癌患者皆具有邊緣效應(yīng)(marginal effect)。假如胃癌患者的存活結(jié)果能被合理的預(yù)測，輔助治療將可用以幫助這些不良存活可能性高的患者，而良好存活可能性高的患者則可省去輔助治療的副作用。雖然被預(yù)測為不好結(jié)果可能性高的患者，是否能從輔助治療獲得實(shí)質(zhì)的利益仍無法得知，但是此預(yù)測的結(jié)果可被用于開發(fā)新的醫(yī)藥組合物的臨床實(shí)驗(yàn)中，或是惡化的胃癌患者(特別是第III期患者)的控制上。
實(shí)施例1預(yù)測模式的建立18對腫瘤與非腫瘤的胃組織樣本，獲自臺大醫(yī)院18位患有胃癌，并接受過D2胃切除術(shù)(gastrectomy)且無顯著殘留腫瘤的患者?；颊咚幠[瘤期(tumor stage)的范圍從第I期至第IV期。其中，9名患者于手術(shù)后12個月內(nèi)死于腫瘤復(fù)發(fā)，在此將其定義為“不良存活(poor survival)”，而另外9名患者于手術(shù)后存活超過30個月，在此將其定義為“良好存活(good survival)”。不良存活組中，包含2位第II期的患者、4位第III期的患者，以及3位第IV期的患者。良好存活組中，包含3位第I期的患者、2位第II期的患者，以及4位第III期的患者。在不良存活組中沒有第I期的患者，且在良好存活組中也沒有第IV期的患者。所有的患者都沒有接受手術(shù)后化學(xué)治療及放射線治療。將此18位患者的腫瘤與非腫瘤組織的成對樣本進(jìn)行解剖，并于30分鐘內(nèi)移至液氮桶中冷凍。其中，非腫瘤的粘膜樣本取自位于離腫瘤區(qū)域至少3cm以上，且明顯正常的粘膜區(qū)域。
本發(fā)明在此使用自制尼龍膜cDNA微陣列，其是由包含384個點(diǎn)(spots)的尼龍膜，采用公知cDNA微陣列的制造方法所制備。位于尼龍膜上的384個點(diǎn)是以每列16個點(diǎn)、每行24個點(diǎn)，以及點(diǎn)距為250μm的方式排列。cDNA微陣列包含328個選自被認(rèn)為可能與癌癥有關(guān)的且已知的人類基因的經(jīng)定序確認(rèn)的(sequence verified)cDNA克隆(clone)，用以作為雜交反應(yīng)的靶標(biāo)。這些基因包括致癌基因、腫瘤抑制基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因(apoptosis-relatedgenes)、基質(zhì)蛋白酶基因(matrix proteinase genes)、血管生成相關(guān)的基因(angiogenesis-related genes)、免疫相關(guān)的基因(immune-related genes)等等。在此另以16個植物基因及甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehydes phosphatedehydrogenase，GAPDH)作為微陣列的內(nèi)參基因。
接著，分別從前述18對樣本中抽取其RNAs，以用于進(jìn)行微陣列雜交(hybridizations)。在此使用Trizol試劑(Invitrogen Life Technologies，Inc.Carlsbad，CA)，從每個胃癌腫瘤組織和對應(yīng)的非腫瘤部份的樣本中，分別抽取30μg的總RNAs，并將其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并標(biāo)記生物素。
前述攜帶雙股cDNAs的微陣列先在1ml的雜交緩沖液(5×RNA提取標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(extraction standard saline citrate，SSC)、0.1％十二烷基肌氨酸(N-lauroylsarcosine)、0.1％十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、1％由Roche Molecular Biochemicals公司制造的阻斷試劑(blocking reagent)混合物，以及鮭魚精(salmon-sperm)DNA(50μg/mL))中，在63℃下，預(yù)雜交(prehybridized)1.5小時。將生物素標(biāo)記的cDNA探針與含有人類COT-1DNA的雜交溶液(13μL)和一個微陣列封入于一雜交袋中，并將雜交袋置于63℃下10小時。之后，微陣列的尼龍膜以含有0.1％SDS的2×SSC于室溫下清洗5分鐘，接著以含有0.1％SDS的0.1×SSC于63℃下清洗3次，每次5分鐘。在雜交反應(yīng)后，將前述尼龍膜置于1ml含有堿性磷酸酶連接的鏈霉親和素(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin)、4％聚乙二醇(polyethylene glycol)與0.3％牛血清白蛋白(BSA)在1×磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中進(jìn)行初步顯色反應(yīng)。用于顯色的是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍(lán)四唑(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium，BCIP/NBT)底物。最后，以含有20mMEDTA的1×磷酸鹽緩沖溶液終止顯色反應(yīng)。
顯色后，前述尼龍膜通過使用平臺式掃描儀(UMAX(Fremont，CA)MagicScan at 3,000dpi)進(jìn)行掃描并獲得圖像，并將所得結(jié)果的數(shù)據(jù)庫以標(biāo)記圖像檔案格式(tagged image file format，Tiff)儲存。為定量基因的表達(dá)量，在此利用GenePix Pro軟件程序(Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA)測量數(shù)字化的圖像。
之后，將前述每個點(diǎn)上通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的顏色轉(zhuǎn)換成灰度圖像。該點(diǎn)的每個像素的明亮值范圍，以0至256表示(從黑色經(jīng)由灰影到白色)。接著，將通過Umax 6000掃描所得的圖像，以GenePix Pro 2.0軟件計(jì)算產(chǎn)生每個微陣列點(diǎn)的表達(dá)值，并將這些數(shù)據(jù)收集成excel文檔。將微陣列上每個基因的表達(dá)值以對數(shù)比值(log ratio)(底為2)表示，其定義為腫瘤組織中每個基因的點(diǎn)表達(dá)值對上非腫瘤組織中每個基因的點(diǎn)表達(dá)值。
前述所獲得的18對樣本的微陣列數(shù)據(jù)(包含良好存活組與不良存活組)，接著利用三步驟的管理分類法，在其兩個存活組中挑出最顯著不同的表達(dá)基因。在第一步驟中，為避免在每個微陣列樣本上的系統(tǒng)誤差，在此使用非線性的局部加權(quán)回歸法(locally Weighted Sactterplot Smoother，LOWESS)，據(jù)此將328個基因的對數(shù)比值標(biāo)準(zhǔn)化至經(jīng)由MA做圖擬合的LOWESS曲線上。第二步驟，通過折疊改變法在每個微陣列樣本中定義調(diào)節(jié)基因，看誰的折疊改變(標(biāo)準(zhǔn)化的對數(shù)比值)大于1，據(jù)此從所有18個微陣列樣本中挑出顯著的調(diào)節(jié)基因。在全部18個微陣列樣本中，看誰的折疊改變在18個樣本中至少有兩個大于1，將其挑出作為顯著性調(diào)節(jié)基因。由此，在本發(fā)明中從328個基因中選出141個基因。第三步驟，為了在兩存活組間挑出最顯著不同的表達(dá)基因，在此使用多重排列檢定法同時檢定所有在第二步驟中過濾過的顯著性調(diào)節(jié)基因，并獲得每個基因的調(diào)整p值。多重檢定是一種用以控制產(chǎn)生不正確檢定結(jié)論(假陽性與假陰性)的可能性的方法。為評估18個樣本的內(nèi)部一致性，在此使用留一法(leave-one-out)交叉驗(yàn)證產(chǎn)生18個CV樣本，并挑出不同的表達(dá)基因(調(diào)整p值小于0.05 family-wise錯誤率)。由此從前述141個基因中篩選出6個顯著不同的表達(dá)基因。這6個基因分別為CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子(SLAM)、轉(zhuǎn)錄因子AP-2α(TFAP)、類胰島素生長因子(IGF-1)、PIM-1致癌基因，以及金屬蛋白酶的組織抑制劑-4(TIMP-4)。
在用以描述存活特性的基因被篩選出后，為確認(rèn)此微陣列結(jié)果及進(jìn)一步明晰前述所選基因表達(dá)上的區(qū)別，在此使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析所選基因，用前述18個樣本中具有足夠RNA的10個樣本的微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明中，使用莫洛尼氏白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Moloney MurineLeukemia Virus Reverse Transcriptase)、隨機(jī)引物，及其它配套試劑(Promega)，通過公知聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)逆轉(zhuǎn)錄出2μg的總RNAs。PCR產(chǎn)物通過公知電泳在1.5％瓊脂膠(agarose gel)上進(jìn)行分離，并用溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)染色后，于紫外光下使其顯現(xiàn)。接著，使用NIH Image 1.62軟件確定平均染色帶密度，并計(jì)算所選基因相對于β肌動蛋白(β-actin)基因的值，由此確定6個所選基因的微陣列表達(dá)比與RT-PCR結(jié)果之間的關(guān)系。
為建立供胃癌患者用的存活預(yù)測模式，在此從這些不同的基因中挑選出微陣列與RT-PCR結(jié)果之間的一致率大于60％或斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)具有顯著性，且p＜0.05者，將其用于預(yù)測模式的訓(xùn)練(參閱圖1)。并從其中挑選出4個基因，分別為CD36、SLAM、TFAP與PIM-1。
將每個所選基因在腫瘤組織與非腫瘤組織中的RT-PCR表達(dá)量的狀態(tài)分成四類，分別為(1)腫瘤的表達(dá)量高于非腫瘤的表達(dá)量，以“腫瘤正常”表示；(2)非腫瘤的表達(dá)量高于腫瘤的表達(dá)量，以“正常腫瘤”表示；(3)腫瘤與非腫瘤均為陽性；以及(4)腫瘤與非腫瘤均為陰性(圖2)。接著，選用20個樣本作為預(yù)測模式訓(xùn)練組，此20個樣本包含前述18個樣本中的10個，及從另外新登記的40個樣本中隨機(jī)選出的10個，其中10個為良好存活，另10個為不良存活。在訓(xùn)練組中，將每個樣本經(jīng)RT-PCR分析所得的結(jié)果分別分配至前述四種RT-PCR狀態(tài)類別中。最后，依據(jù)訓(xùn)練組所得的四類RT-PCT結(jié)果的頻率，建立預(yù)測模式。接著，依據(jù)Akaike’s法則使用羅吉斯回歸模式與逐步模式選擇有效的預(yù)測模式?？蓮那笆?個基因中，獲得由其中3個基因(CD36、SLAM與PIM-1)所組成的最有效的羅吉斯預(yù)測模式，其預(yù)測方程式可推算如下式一所示λ＝0.833CD36-0.762SLAM-0.317PIM-1π＝exp(λ)/(1+exp(λ))(式一)其中，“CD36”、“SLAM”與“PIM-1”分別為前述樣本的CD36、SLAM與PIM1在四種RT-PCR狀態(tài)分類中的出現(xiàn)頻率；“π”為“不良存活狀況”的可能性。當(dāng)“π”小于或等于0.5時，會被預(yù)測為良好存活(定義為存活時間＞30個月)。當(dāng)“π”大于0.5時，則會被預(yù)測為不良存活(定義為存活時間＜12個月)。CD36、SLAM與PIM-1的羅吉斯回歸系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.411、0.436與0.173。
熟知本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，根據(jù)閱讀本發(fā)明說明書所載的內(nèi)容可了解到，前述(式一)中系數(shù)會因所使用的預(yù)測模式訓(xùn)練組的患者樣本的不同或數(shù)量不同而會有些許差異，但其并不影響本發(fā)明的實(shí)施。可以理解的是，當(dāng)預(yù)測模式訓(xùn)練組中所包含的樣本數(shù)量越多，根據(jù)本發(fā)明方法所得的預(yù)測公式將會越準(zhǔn)確。
實(shí)施例2
對于30位患者的獨(dú)立測試組，應(yīng)用本發(fā)明所指出的由CD36、SLAM與PIM-1所組成的預(yù)測模式進(jìn)行存活預(yù)測。將這30位患者的腫瘤與非腫瘤組織樣本，分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，據(jù)此來獲得每位患者組織樣本中CD36、SLAM與PIM-1的RT-PCR表達(dá)狀態(tài)。將每個基因的表達(dá)狀態(tài)對照實(shí)施例1中RT-PCR狀態(tài)分類表，由表中獲得前述由訓(xùn)練組20個基因所計(jì)算出的出現(xiàn)頻率，并將每位患者的每種基因所對應(yīng)的出現(xiàn)頻率數(shù)值帶入(式一)中，由此即可計(jì)算出，該名胃癌患者可能的術(shù)后存活狀況。
經(jīng)分析后所得結(jié)果顯示，其中23位患者被正確的預(yù)測(76.7％)，并產(chǎn)生80％的特異度(specificity)、73.3％的靈敏度(sensitivity)、75％的陽性預(yù)測值，以及78.57％的陰性預(yù)測值。頻率分布如表1A所示。此結(jié)果顯示，本發(fā)明預(yù)測模式在獨(dú)立測試組中表現(xiàn)出高度的預(yù)測能力?；颊叩拇婊盥时活A(yù)測為具有“良好存活”顯著高于被預(yù)測為具有“不良存活”者(p＝0.00531)。(圖3A)7位第I期的患者中有6位通過此模式正確地被預(yù)測。其中1位患者被預(yù)測為“不良存活”，且其于第12個月時死于多重肝臟轉(zhuǎn)移(metastases)。其它6位患者中有5位被正確的預(yù)測，其頻率分布示于表1B。5位第II期患者中有3位被正確的預(yù)測。這3位患者中的2位被預(yù)測為具有“不良存活”，并于12個月內(nèi)死于疾病，其頻率分布示于表1C。2位第IV期的患者通過此模式被正確的預(yù)測，其頻率分布示于表1E。
本發(fā)明預(yù)測模式應(yīng)用于16位第III期患者所得的準(zhǔn)確度的頻率分布示于表1D。12位患者被正確的預(yù)測(75％)，其特異度為100％、靈敏度為63.6％、陽性預(yù)測值為100％，以及陰性預(yù)測值為55.6％?；颊叩拇婊盥时活A(yù)測為具有“良好存活”顯著高于被預(yù)測為具有“不良存活”者(p＝0.04467)。(圖3B)表1A 在全部30位測試患者中準(zhǔn)確度的頻率分布

靈敏度＝73.33％特異性＝80.00％陰性預(yù)測值＝78.57％陽性預(yù)測值＝75.00％表1B在7位第I期患者中準(zhǔn)確度的頻率分布

靈敏度＝100.00％特異性＝85.71％陰性預(yù)測值＝100.00％陽性預(yù)測值＝50.00％表1C在5位第II期患者中準(zhǔn)確度的頻率分布

靈敏度＝50.00％特異性＝66.67％陰性預(yù)測值＝66.67％陽性預(yù)測值＝50.00％
表1D在16位第III期患者中準(zhǔn)確度的頻率分布

靈敏度＝63.64％特異性＝100.00％陰性預(yù)測值＝55.56％陽性預(yù)測值＝100.00％表1E在2位第IV期患者中準(zhǔn)確度的頻率分布

靈敏度＝100.00％特異性＝100.00％陰性預(yù)測值＝100.00％陽性預(yù)測值＝100.00％
權(quán)利要求
1.一種通過基因表達(dá)圖譜建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，包含如下步驟(1)以多個已知胃癌術(shù)后存活狀況的成對的腫瘤與非腫瘤組織樣本為媒介，用其基因表達(dá)的微陣列分類圖譜，在該些組織樣本中篩選出表達(dá)顯著不同的特異性基因；(2)對上述特異性基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并確認(rèn)其結(jié)果與該微陣列分類圖譜結(jié)果的一致性；以及(3)采用一種統(tǒng)計(jì)模式選取法，從上述特異性基因中選出腫瘤調(diào)節(jié)基因，并通過一訓(xùn)練組樣本用上述腫瘤調(diào)節(jié)基因建立該預(yù)測模式的公式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中步驟(1)中的所述基因包含致癌基因、腫瘤抑制基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因、基質(zhì)蛋白酶基因、血管生成相關(guān)的基因，或免疫相關(guān)的基因至少其中之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中步驟(1)中進(jìn)一步包含下列步驟(i)將位于所述微陣列上的所述組織樣本中與腫瘤調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的表達(dá)量的對數(shù)比值(log ratio)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)；(ii)利用折疊改變法(fold-change)濾除對數(shù)比值表達(dá)較不顯著的基因；以及(iii)以多重排列檢定法(multiple permutation test)與交叉驗(yàn)證(crossvalidation，CV)進(jìn)一步篩選出表達(dá)顯著不同的特異性基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述基因的表達(dá)量為所述組織樣本中所述基因的cDNA表達(dá)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)化的步驟使用非線性的局部加權(quán)回歸法進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述步驟(2)中的一致性通過一個選定的篩選標(biāo)準(zhǔn)來執(zhí)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述篩選標(biāo)準(zhǔn)為斯皮爾曼等級相關(guān)(Spearman rank correlation)檢定法p＜0.05。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)模式選取法為逐步模式法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中步驟(3)中進(jìn)一步包含結(jié)合羅吉斯回歸分析(logistic regression)，進(jìn)行所述腫瘤調(diào)節(jié)基因的選取。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中步驟(3)中所述訓(xùn)練組樣本為已知胃癌術(shù)后存活狀況的成對的腫瘤與非腫瘤組織樣本。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述訓(xùn)練組樣本的樣本數(shù)目不少于所述預(yù)測模式中所述腫瘤調(diào)節(jié)基因數(shù)目的5倍。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述特異性基因包含CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子(SLAM)、轉(zhuǎn)錄因子AP-2α(TFAP)、類胰島素生長因子(IGF-1)、PIM-1致癌基因，或金屬蛋白酶的組織抑制劑-4(TIMP-4)至少其中之一。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述腫瘤調(diào)節(jié)基因基因選自CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子、轉(zhuǎn)錄因子AP-2α與PIM-1致癌因子所組成的族群。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法，其中所述腫瘤調(diào)節(jié)基因基因選自CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子(SLAM)與PIM-1致癌因子所組成的族群。
15.一種預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其包含如下步驟(a)從胃癌患者取得腫瘤組織與非腫瘤組織的成對樣本；(b)以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測上述成對樣本中腫瘤調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；以及(c)將步驟(b)中所得的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果，通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立胃癌術(shù)后存活狀況的預(yù)測模式的方法所得的預(yù)測模式的公式，計(jì)算胃癌患者的存活狀況。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其中所述非腫瘤組織相距所述腫瘤組織不少于3cm。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其中所述腫瘤調(diào)節(jié)基因包含CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子、轉(zhuǎn)錄因子AP-2α、類胰島素生長因子、PIM-1致癌因子，或金屬蛋白酶的組織抑制劑-4至少其中之一。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其中所述腫瘤調(diào)節(jié)基因選自CD36抗原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子與PIM-1致癌因子所組成的族群。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其中所述公式具有如下(式一)所示的方程式λ＝0.833CD36-0.762SLAM-0.317PIM-1π＝exp(λ)/(1+exp(λ)) (式一)其中，“CD36”、“SLAM”與“PIM-1”分別為待測組織樣本的該基因在該狀態(tài)分類中所相對應(yīng)的出現(xiàn)頻率；“π”為“不良存活狀況”的可能性；當(dāng)“π”小于或等于0.5時，為良好存活；當(dāng)“π”大于0.5時，為不良存活。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其中所述良好存活是指存活時間不少于30個月。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的預(yù)測胃癌患者胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其中所述不良存活是指存活時間不多于12個月。
全文摘要
一種通過基因表達(dá)圖譜預(yù)測胃癌術(shù)后存活狀況的方法，其依據(jù)胃癌患者(訓(xùn)練組樣本)的腫瘤與非腫瘤組織中基因的表達(dá)，以公知統(tǒng)計(jì)方法建立出D2胃切除術(shù)后存活狀況的表達(dá)顯著不同的特異性基因微陣列分類圖譜。之后，進(jìn)一步將組織樣本中這些表達(dá)顯著不同的特異性基因，以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)進(jìn)行分析，并將其表達(dá)狀況，以公知統(tǒng)計(jì)方法在訓(xùn)練組樣本中，建立出本發(fā)明預(yù)測模式。之后，僅需通過將此預(yù)測模式，應(yīng)用于其它的胃癌患者(獨(dú)立測試組)，即可預(yù)測該胃癌患者的術(shù)后存活狀況，以供后續(xù)治療以及是否進(jìn)行輔助性治療(adjuvant chemotherapy)參考。
文檔編號C12Q1/68GK1924023SQ20051009583
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者陳炯年, 林真真, 謝豐舟, 張金堅(jiān) 申請人:陳炯年, 林真真, 謝豐舟, 張金堅(jiān)