專利名稱：一種提高針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生數(shù)量與質(zhì)量的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生數(shù)量與質(zhì)量的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)包括四個(gè)方面(1)胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)與獲得，這是能否進(jìn)行針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵；(2)胚性培養(yǎng)物穩(wěn)定的規(guī)?；鲋?，這是體細(xì)胞胚胎發(fā)生能否成功的關(guān)鍵；(3)后期原胚的同步成熟及高質(zhì)量體細(xì)胞胚的獲得，這決定于早期原胚階段發(fā)育形態(tài)與增殖的質(zhì)量；(4)體細(xì)胞胚的萌發(fā)、轉(zhuǎn)換和植株再生、移栽，這取決于成熟體細(xì)胞胚的質(zhì)量。
現(xiàn)階段，落葉松胚性愈傷組織的培養(yǎng)基常用的有MS、DCR、SH、LP、GD等針葉樹(shù)離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基，存在的問(wèn)題主要有早期原胚形成的狀態(tài)不好、胚性愈傷組織質(zhì)量不高、早期原胚發(fā)育不完全與子葉發(fā)育不正常、玻璃化問(wèn)題、下胚軸不伸長(zhǎng)、體細(xì)胞胚不生根等。而且，即使培養(yǎng)針葉樹(shù)體細(xì)胞胚較好的體系也存在子葉胚發(fā)生頻率低，每克胚性愈傷組織上可發(fā)生5～25個(gè)子葉胚，畸形胚占到70％以上，且體細(xì)胞胚生根率0～7％等不能規(guī)?；l(fā)生針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基，包括以下組分KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L；
2，4-二氯苯氧乙酸0.1-3.6mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.02-3.2mg/L，蔗糖 5-120g/L。
其中，2，4-二氯苯氧乙酸優(yōu)選濃度為0.2-2.2mg/L，6-芐氨基嘌呤優(yōu)選濃度為0.02-1.1mg/L。
為了能促進(jìn)在培養(yǎng)過(guò)程中體細(xì)胞胚胎的成胚和發(fā)育，培養(yǎng)基中還含有450-550mg/L酸水解酪蛋白，400-500mg/L谷氨酰胺。
本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的各種組分，特別是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、BA(6-芐氨基嘌呤)的濃度比例關(guān)系，使培養(yǎng)基更加有利于針葉樹(shù)種胚性細(xì)胞的保持和快速增殖，將培養(yǎng)得到的胚性細(xì)胞與組織接種于無(wú)激素培養(yǎng)基上過(guò)渡培養(yǎng)，可以促進(jìn)產(chǎn)生大量的子葉胚，并能夠提高正常子葉胚比例的發(fā)生，胚狀體的發(fā)生率可達(dá)到每克胚性愈傷組織320個(gè)高質(zhì)量體細(xì)胞胚，可以廣泛應(yīng)用于落葉松等針葉樹(shù)種的培養(yǎng)、發(fā)育。


圖1為原胚發(fā)育照片；圖2為所獲得體細(xì)胞胚胎照片。
具體實(shí)施例方式
1、實(shí)驗(yàn)材料供試材料為日本落葉松x華北落葉松(Larix leptolepis x L.principis-Rupprechtii)的雜種，采集于遼寧清源大孤家林場(chǎng)落葉松種子園。
2、實(shí)驗(yàn)方法1)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將未成熟種子用0.1％的氯化汞溶液消毒9min，75％酒精消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3～5次，切割種子、剝出幼胚，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基(表1)上，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，挑選其白色、粘性、半透明的轉(zhuǎn)接于上述培養(yǎng)基中，經(jīng)不斷繼代、增殖后，轉(zhuǎn)入2，4-D、BA、KT分別降到1/10的培養(yǎng)基上增殖幾代后，經(jīng)倒置顯微鏡檢查其含有不同發(fā)育時(shí)期的胚性胚柄團(tuán)，確定為胚性愈傷組織，進(jìn)行編號(hào)。
表1.啟動(dòng)培養(yǎng)基組分 (mg/L)

2)胚性愈傷組織繼代、增殖過(guò)程中的不同激素種類(lèi)和濃度的處理將上述繼代、增殖的胚性愈傷組織選擇同一細(xì)胞系、培養(yǎng)條件相同及增殖正常的愈傷組織作為實(shí)驗(yàn)材料，分別轉(zhuǎn)入m1-m6、m7-m12(表2)等含不同濃度2，4-D、不同濃度BA的培養(yǎng)基上，20d后分別觀察、檢查每個(gè)培養(yǎng)基中各個(gè)不同發(fā)育階段原胚的形態(tài)及發(fā)生數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
表2.誘導(dǎo)雜種落葉松胚性細(xì)胞的培養(yǎng)基(unitmg/L)

*2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸；BA6-芐氨基嘌呤；CH酸水解酪蛋白；Glu谷氨酰胺上述培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基配方如下KNO32803mg/L，NH4NO3331mg/L，KH2PO4103mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 206mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 5.2mg/L，MnSO4.H2O10.2mg/L，Na2MoO4.2H2O0.15mg/L，KI 0.51mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，蔗糖30g/L。
3)鏡檢觀察及統(tǒng)計(jì)取經(jīng)m1～m6、m7～m12，即2，4-D、BA濃度處理的培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d左右的愈傷組織，分別稱取500mg，放在φ90cm直徑的培養(yǎng)皿中，加入5～10ml蒸餾水，用鑷子輕輕離散愈傷組織，然后，在“Olympus”倒置顯微鏡下檢查原胚發(fā)育狀況并照相，統(tǒng)計(jì)其不同發(fā)育階段的原胚數(shù)量，取5～10個(gè)視野的平均數(shù)。
4)子葉胚的分化及統(tǒng)計(jì)將上述m1～m6、m7～m12繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d的愈傷組織繼代接種于成熟培養(yǎng)基m13上，35～45d時(shí)統(tǒng)計(jì)其子葉胚形成數(shù)量。其中，分別正常胚與子葉、胚軸發(fā)育異常胚或愈傷化胚正常胚為胚體較長(zhǎng)、肉眼可見(jiàn)正常的一圈多個(gè)子葉和明顯的胚軸部分；子葉、胚軸異常胚多數(shù)子葉為1～2個(gè)，且呈片狀撕裂，這種畸形胚往往沒(méi)有明顯的胚軸部分；愈傷化胚則是沒(méi)有分化出明顯的子葉，子葉端常常為一個(gè)米黃色的堅(jiān)硬球體，而胚根端常常是愈傷化，嚴(yán)重時(shí)將整個(gè)胚全部愈傷化。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)繼代過(guò)程中不同2，4-D濃度對(duì)落葉松原胚發(fā)育的影響接種于含不同2，4-D濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)20d左右的胚性愈傷組織外觀形態(tài)差異明顯2，4-D濃度為0時(shí)，愈傷組織輕微褐化；2，4-D濃度為0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的培養(yǎng)基上繼代的胚性愈傷組織生長(zhǎng)快，表面產(chǎn)生白色、半透明顆粒；當(dāng)2，4-D濃度增加到4mg/L時(shí)，部分胚性愈傷組織褐化較重，生長(zhǎng)速度很慢。
圖1為在增殖培養(yǎng)基下進(jìn)行培養(yǎng)的原胚發(fā)育照片；圖2為在成熟培養(yǎng)基下培養(yǎng)所獲得體細(xì)胞胚照片。
倒置顯微鏡下觀察在6種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原胚發(fā)育狀況，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明a)在2，4-D、BA濃度全為0的無(wú)激素培養(yǎng)基上增殖的原胚同步化程度較好，顯微鏡下原胚形態(tài)發(fā)育階段較整齊，多為接近III型的大胚頭ESM，且胚柄較順、較長(zhǎng)，少部分為典型的III型ESM，多數(shù)胚頭較緊密，細(xì)胞多，邊緣較光滑，長(zhǎng)型單細(xì)胞很少，剛形成的幾個(gè)細(xì)胞期和幾十個(gè)細(xì)胞期的小ESM也很少，無(wú)多重胚和次生胚，但總的ESM數(shù)量較少，說(shuō)明無(wú)激素培養(yǎng)基利于早期原胚的成熟發(fā)育，形成III型的ESM；b)隨著2，4-D濃度從0提高到4mg/L時(shí)，III型的ESM和接近III型的大胚頭ESM數(shù)量隨著2，4-D濃度的提高而降低，剛形成的幾個(gè)細(xì)胞期的小ESM，則隨2，4-D濃度的提高而增加；c)介于III型和剛形成的幾個(gè)細(xì)胞的小ESM中型胚頭的ESM的變化規(guī)律，則是在2，4-D濃度0～2mg/L的范圍內(nèi)，隨著2，4-D濃度的升高而增加；當(dāng)2，4-D濃度升到4mg/L時(shí)，這個(gè)階段(中頭)原胚數(shù)量降到2，4-D濃度為2mg/L的一半左右，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)較高濃度的2，4-D，可以促進(jìn)中小型原胚的形成，但高濃度的2，4-D阻礙了原胚向中型大胚頭后期原胚的發(fā)育，使繼代的胚性愈傷組織中多數(shù)原胚一直停留在小胚頭幾個(gè)細(xì)胞胚柄的早期階段；d)另外，多重胚的變化也與2，4-D、BA濃度及二者比例的改變呈明顯規(guī)律性的變化當(dāng)2，4-D、BA濃度全為0時(shí)，顯微鏡下幾乎不見(jiàn)多重胚和次生胚；當(dāng)添加0.1mg/L的BA而2，4-D濃度為0時(shí)，顯微鏡下則出現(xiàn)大胚頭和小胚頭的多重胚1.4個(gè)/每個(gè)視野，每個(gè)多重胚為3～4個(gè)，甚至更多的原胚重疊排列；當(dāng)BA不變，隨著2，4-D濃度的增加，多重胚數(shù)量逐漸減少；當(dāng)2，4-D濃度增高為4mg/L時(shí)，多重胚消失，說(shuō)明多重胚的發(fā)生與BA、2，4-D濃度及二者的比例緊密相關(guān)。
表3.不同2，4-D濃度對(duì)原胚發(fā)育的影響

2)來(lái)自不同濃度2，4-D上的愈傷組織在成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)的子葉胚的影響來(lái)自不同2，4-D濃度下的胚性愈傷組織，在同一成熟培養(yǎng)基上所形成子葉胚的數(shù)量和質(zhì)量各不相同，結(jié)果如表4來(lái)自無(wú)激素培養(yǎng)基上繼代的愈傷組織，在ABA誘導(dǎo)下，形成子葉胚的數(shù)量最多可達(dá)216個(gè)/g愈傷組織；而來(lái)自2，4-D濃度為4mg/L的胚性愈傷組織上發(fā)生的子葉胚最少，約60個(gè)/g愈傷組織，且胚性愈傷組織褐化嚴(yán)重。
對(duì)比表3、表4數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在BA濃度為0.1mg/L時(shí)、2，4-D濃度為0.3mg/L、1mg/L、2mg/L時(shí)，對(duì)子葉胚形成的數(shù)量影響不大；但當(dāng)2，4-D濃度為4mg/L時(shí)，其子葉胚數(shù)量突然下降。
繼代培養(yǎng)基中2，4-D、BA濃度對(duì)子葉胚質(zhì)量的影響也很明顯在無(wú)激素的m1和高2，4-D的m6培養(yǎng)基上正常胚比例較高；隨著2，4-D、BA的加入，愈傷化胚及畸形胚數(shù)量迅速上升，尤其是當(dāng)2，4-D濃度為0、BA為0.1mg/L時(shí)，其畸形胚比例最大；當(dāng)BA不變，仍為0.1mg/L時(shí)，增加2，4-D濃度為0.3mg/L、1mg/L、2mg/L時(shí)沒(méi)有增加愈傷化胚的比例。
表4.不同2，4-D濃度繼代下進(jìn)入成熟培養(yǎng)基后子葉胚形成數(shù)量(/g愈傷組織)


3)不同濃度BA對(duì)原胚發(fā)育與同步化的影響接種于2，4-D濃度同為0.2mg/L、BA濃度不同的繼代培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20d左右的胚性愈傷組織，其原胚發(fā)育狀態(tài)不同，結(jié)果如表5當(dāng)只有2，4-D(0.2mg/L)而無(wú)BA存在時(shí)，顯微鏡下以大胚頭、長(zhǎng)柄較成熟的ESM較多，剛形成的ESM較少，也無(wú)多重胚和次生胚，胚頭較光滑；當(dāng)加入0.5mg/L的BA時(shí)，明顯特征是出現(xiàn)多重胚，且胚頭變得不整齊，密集突起；隨著B(niǎo)A濃度增加到1.5mg/L時(shí)，多重胚的數(shù)量增加到最高值，且每個(gè)多重胚都有幾個(gè)原胚重疊在一起；當(dāng)BA濃度繼續(xù)增加時(shí)，多重胚數(shù)量又有所下降，說(shuō)明過(guò)大濃度BA也不利于多重胚的形成；在BA0～2mg/L的范圍內(nèi)，隨著B(niǎo)A濃度的增加，其不同發(fā)育時(shí)期原胚的總和也增加，包括單細(xì)胞數(shù)量也隨著增加；當(dāng)BA濃度增加到2.5mg/L時(shí)，總ESM又開(kāi)始下降，可能與BA過(guò)大反而抑制其形成ESM有關(guān)。此外，隨著B(niǎo)A濃度的提高，原胚形態(tài)逐漸變得結(jié)構(gòu)紊亂，不僅多重胚、次生胚多，而且胚頭很不光滑，大小突起很明顯，胚頭一般發(fā)育的快、細(xì)胞多，胚頭較大且長(zhǎng)，但胚柄較亂、較散，尤其是小ESM的胚柄細(xì)胞常只有1～2個(gè)長(zhǎng)細(xì)胞?？梢?jiàn)，較高濃度的BA有利于促進(jìn)細(xì)胞分裂，但如果與2，4-D配合比例不當(dāng)，則往往會(huì)使胚性細(xì)胞無(wú)序分裂，導(dǎo)致ESM結(jié)構(gòu)紊亂，并形成較多的多重胚和次生胚。
表5.不同BA濃度對(duì)原胚發(fā)育的影響

4)不同濃度的BA對(duì)子葉胚的影響來(lái)自于不同BA濃度下的原胚組織培養(yǎng)物在成熟培養(yǎng)基上產(chǎn)生的子葉胚數(shù)量，不論多大濃度的BA，其子葉胚數(shù)量均較少，結(jié)果如表6在培養(yǎng)基m10中，BA濃度為1.5mg/L，子葉胚數(shù)量最高；而B(niǎo)A濃度為0，2，4-D濃度為0.2mg/L時(shí)，子葉胚數(shù)量最低；可見(jiàn)，高濃度的BA會(huì)抑制子葉胚的發(fā)育與形成。但無(wú)BA存在，只有低濃度的2，4-D時(shí)，同樣也不利于子葉胚的形成。
同時(shí)，BA濃度也影響體細(xì)胞胚的質(zhì)量培養(yǎng)基m7～m12中，隨著B(niǎo)A濃度的不斷增加，愈傷化胚、畸形胚的比例逐漸上升，體細(xì)胞胚質(zhì)量明顯下降，即使表型是正常的胚，在m7中BA濃度為0、2，4-D濃度為0.2mg/L時(shí)，其胚體較長(zhǎng)，有明顯的胚軸，子葉正常，整個(gè)胚體不腫脹；當(dāng)添加BA后，則胚體變短，尤其是胚軸明顯短，且整體肥大，基部易產(chǎn)生愈傷組織。
表6.不同BA濃度繼代下進(jìn)入成熟培養(yǎng)基后子葉胚形成數(shù)量(/g愈傷組織)

綜上所述，采用本發(fā)明培養(yǎng)基(2，4-D濃度為0.2-2.2mg/L，BA濃度為0.02-1.1mg/L)作為針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎原胚發(fā)育的培養(yǎng)基，有利于胚性細(xì)胞的保持和快速增殖，能提高胚性愈傷組織在成熟培養(yǎng)基上所形成的子葉胚的數(shù)量和質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.一種針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基，包括以下組分KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O300-450mg/L，MgSO4.7H2O130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.1-3.6mg/L，6-芐氨基嘌呤0.02-3.2mg/L，蔗糖5-120g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.2-2.2mg/L，所述6-芐氨基嘌呤濃度為0.02-1.1mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中還含有450-550mg/L酸水解酪蛋白，400-500mg/L谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的針葉樹(shù)種體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基，包括如下組分KNO
文檔編號(hào)C12N5/04GK1733906SQ20051009028
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者張守攻, 韓素英, 齊力旺, 王建華 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所