專利名稱：生產(chǎn)改變含油量的植物的制作方法
相關(guān)申請本申請要求2003年12月17日提交的美國臨時專利申請60/530,828的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容全部引入作為參考。
背景技術(shù)：
操縱農(nóng)作物種子的組合物，尤其是種子油類的含量和組成的能力在涉及加工食品油類以及動物飼養(yǎng)油類的農(nóng)業(yè)工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價值。農(nóng)作物的種子含有多種有價值的組分包括油類，蛋白以及淀粉。工業(yè)生產(chǎn)過程可以分離若干或所有這些組分用于專門應(yīng)用的單獨銷售。例如，幾乎60％的美國大豆農(nóng)作物通過大豆加工工業(yè)進行壓榨。大豆加工產(chǎn)生高價銷售的精煉油，而殘余物主要作為低價值的飼料銷售(US Soybean Board，2001 Soy Stats)。加拿大油菜(canola)種子被壓榨產(chǎn)生油類以及副產(chǎn)品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜協(xié)會)。幾乎20％的1999/2000年的美國玉米農(nóng)作物經(jīng)過工業(yè)化精煉，主要用于產(chǎn)生淀粉，乙醇以及油類(玉米精煉業(yè)者協(xié)會)。因此，常常需要使種子的含油量最大化。例如，對于諸如大豆以及加拿大油菜的加工含油種子而言，提高種子的絕對含油量將提高這種谷物的價值。對于加工的玉米而言，可能需要根據(jù)其它主要組分的應(yīng)用提高或者降低含油量。降低油類可以通過降低與油類氧化相關(guān)的不希望的味道改善分離的淀粉的質(zhì)量?；蛘?，在味道不重要的乙醇產(chǎn)生中，提高含油量可以提高總的價值。在許多谷物飼料中，諸如玉米以及小麥，可能希望提高植物含油量，因為油類比諸如碳水化合物的其它種子組分具有較高的能含量。含油種子加工，就像大多數(shù)谷物加工業(yè)一樣是資金密集產(chǎn)業(yè)；因此產(chǎn)品從低值組分到高價值油類組分的產(chǎn)品分布的較小改變可能對于谷物加工者而言具有顯著的經(jīng)濟影響。
油類的生物技術(shù)處理可以提供組成的改變以及油產(chǎn)量的改進。組成的改變尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美國專利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的種子(美國專利5,639,790)等。組成改變的工作主要集中在加工的含油種子但是已經(jīng)可以很容易地延伸至非-含油種子農(nóng)作物包括玉米。雖然對提高含油量具有相當(dāng)?shù)呐d趣，在這一領(lǐng)域目前唯一可行的生物技術(shù)是高油類玉米(HOC)技術(shù)(杜邦，美國專利5,704,160)。HOC利用通過標(biāo)準的選擇育種連同生產(chǎn)系統(tǒng)中稱為頂交(TopCross)的優(yōu)良品種(不孕雄性)雜交雌性得到的高油類授粉者。頂交高油類系統(tǒng)使玉米收獲的谷物含油量從～3.5％提高到～7％，改善了谷物的能含量。
雖然HOC生產(chǎn)系統(tǒng)已經(jīng)卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，擔(dān)負全部的土地的種子栽植的低授粉者百分比的系統(tǒng)含有固有風(fēng)險，尤其是在旱年。第二，當(dāng)前HOC領(lǐng)域含油量已經(jīng)平穩(wěn)在大約9％的油類。最后，高油類玉米主要不是生物化學(xué)變化，而是對于提高含油量產(chǎn)生間接結(jié)果的解剖學(xué)上的突變體(提高胚芽尺寸)。為此，可選擇的高油類策略，尤其是來源于改變生化產(chǎn)量的高油類策略將是非常重要的。
操作油市場最明顯的目標(biāo)農(nóng)作物是大豆以及油菜籽，并且大量商業(yè)工作(例如美國專利5,952,544；PCT申請WO9411516)證明擬南芥是這些農(nóng)作物中油類代謝的優(yōu)良模型。種子油組合物的生物化學(xué)篩選已經(jīng)鑒定了擬南芥的許多關(guān)鍵生物合成酶基因并且導(dǎo)致農(nóng)業(yè)上重要基因的直向同源物被鑒定。例如，利用化學(xué)誘變處理群的篩選已經(jīng)鑒定了其種子顯示脂肪酸成份改變的脂類突變體(Lemieux B等1990，James以及Dooner，1990)。檢測脂肪酸成份改變的T-DNA誘變篩選(Feldmann等1989)鑒定了ω3脫氫酶(FAD3)以及δ-12脫氫酶(FAD2)基因(美國專利5952544；Yadav等，1993；Okuley等，1994)。集中在含油量而非油類質(zhì)量的篩選分析化學(xué)上誘導(dǎo)的皺縮種子或籽粒密度改變的突變體，據(jù)此推斷出改變的植物含油量(Focks以及Benning，1998)。用來鑒定參與非常長鏈脂肪酸產(chǎn)生的酶的另一種篩選鑒定了編碼負責(zé)降低種子中三酰甘油聚集的甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因的突變(Katavic V等，1995)。此外，還顯示DGAT cDNA的種子特異性過表達與提高的植物含油量有關(guān)(Jako等，2001)。
植物中的激活標(biāo)簽法指一種通過插入包含調(diào)節(jié)序列(例如，增強子)的異源核酸構(gòu)建體到植物基因組中而產(chǎn)生隨機突變的方法。調(diào)節(jié)序列可起到增強一個或多個天然植物基因轉(zhuǎn)錄的作用；因此，激活標(biāo)簽法是一種用于產(chǎn)生功能獲得(gain-of-function)，通常是顯性突變體的有效方法(參見，例如，Hayashi等，1992；Weigel D等，2000)。插入的構(gòu)建體提供了一種分子標(biāo)簽，其用于快速鑒定由于其錯表達引起突變表型的天然植物。激活標(biāo)簽法同時可導(dǎo)致功能喪失的表型。插入可導(dǎo)致天然植物基因的破壞，在該情況中表型通常是隱性的。
激活標(biāo)簽法已經(jīng)用于多種物種，包括煙草和擬南芥，以鑒定各種突變表型和與這些表型相關(guān)的基因(Wilson，等，1996，Schaffer等，1998，F(xiàn)ridborg等，1999；Kardailsky等，1999；Christensen S等，1998)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有高油類含量表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物包括含有編碼或互補于編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的HIO30.5多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化載體。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物選自油菜，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻以及花生。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生油類的方法，包括培育轉(zhuǎn)基因植物以及從所述植物回收油類。本發(fā)明進一步提供了產(chǎn)生具有高油表現(xiàn)型植物的方法，所述方法通過鑒定具有HIO30.5基因的等位基因的植物進行，所述HIO30.5基因的等位基因引起與缺少該等位基因且產(chǎn)生所述鑒定的植物的子代的植物相比含油量的增加，其中產(chǎn)生的子代遺傳該等位基因并且為高油表型。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物通過包括向植物的祖細胞導(dǎo)入含有編碼或互補于編碼HIO30.5多肽的序列的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體，以及培育轉(zhuǎn)化的祖細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法產(chǎn)生，其中的HIO30.5多核苷酸序列的表達產(chǎn)生高油類含量表現(xiàn)型。
發(fā)明詳述定義除非另有陳述，這里使用的全部技術(shù)以及科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的相同的含義。專業(yè)人員尤其是參考Sambrook等，1989，以及Ausubel FM等，1993的定義以及術(shù)語。應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法，流程以及試劑，因為這些可以改變。
此處所述的術(shù)語“載體”是指設(shè)計用于在不同宿主細胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_載體”是指可以在異源細胞中整合并表達異源DNA片段的載體。許多原核以及真核生物表達載體是可以市售獲得的。選擇合適的表達載體是本領(lǐng)域述人員所熟知的。
“異源的”核酸構(gòu)建體或序列具有一部分序列不是植物細胞的野生型序列但是在其中表達。異源的控制序列是指不天然調(diào)節(jié)目前正在調(diào)節(jié)的相同基因表達的控制序列(即啟動子或增強子)。通常，異源核酸序列不是它們所存在于的細胞或者基因組的一部分所內(nèi)源產(chǎn)生的，并且已經(jīng)通過傳染，轉(zhuǎn)染，顯微注射，電穿孔法等添加到細胞中?！爱愒吹摹焙怂針?gòu)建體可以含有控制序列/DNA編碼序列組合，其與野生型植物中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合相同或者不同。
此處所述的術(shù)語“基因”是指參與多肽鏈產(chǎn)生的DNA片段，其可能包括或者不包括編碼區(qū)之前以及之后的區(qū)域，例如5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或者“前導(dǎo)”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及單獨的編碼片段(外顯子)以及非-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列之間的內(nèi)含子序列(內(nèi)含子)。
這里使用的“重組體”包括已經(jīng)通過導(dǎo)入異源的核酸序列進行修飾的細胞或者載體，或者所述細胞來源于如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非-重組體)形式的細胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)相同形式的基因或者表達在人為干預(yù)下完全表達或者完全不表達的異常表達的天然基因。
此處所述的術(shù)語“基因表達”是指基于基因的核酸序列產(chǎn)生的多肽的方法。所述方法包括轉(zhuǎn)錄以及翻譯；因此“表達”可以是針對多核苷酸或者多肽序列或者兩者。有時，多核苷酸序列的表達不會引起蛋白翻譯?！斑^表達”是指相對于其在野生型(或者其它的參考[例如，非-轉(zhuǎn)基因])植物中的表達，多核苷酸和/或多肽序列表達增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列?！爱愇槐磉_”是指在未-改變或者野生型植物中不自然發(fā)生的，在某時，某地和/或提高水平的表達?！跋抡{(diào)表達”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是內(nèi)源性基因相對于其在野生型植物中表達的降低表達。術(shù)語“錯誤表達”以及“改變表達”包括過表達，下調(diào)表達以及異位表達。
在將核酸序列插入細胞的概念中，術(shù)語“引入的”是指“轉(zhuǎn)染”，或者“轉(zhuǎn)化”或者“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括核酸序列整合到真核或者原核細胞中，其中核酸序列可以整合入細胞的基因組(例如染色體，質(zhì)粒，質(zhì)體或者線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或者瞬間表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
本文使用的“植物細胞”是指來源于植物的任意細胞，包括來自未分化的組織(例如愈傷組織)以及植物種子，花粉，繁殖體(progagules)以及胚的細胞。
此處所述的術(shù)語“天然的”以及“野生型”相對于給定植物性狀或者表現(xiàn)型是指具有在相同種類的植物本身發(fā)現(xiàn)的特征或者表現(xiàn)型的形式。
此處所述的術(shù)語關(guān)于植物特性的“修飾”是指轉(zhuǎn)基因植物相對于類似的非-轉(zhuǎn)基因植物的表現(xiàn)型的改變。對于轉(zhuǎn)基因植物的“目的表型(性狀)”，指通過T1和/或后代植物證明的可觀察到的或可測量的表型，相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物不顯示該表型(也即，在相似條件下培養(yǎng)或分析的基因型類似的植物)。目的表型可表示對植物的改良，或可提供一種在其他植物中產(chǎn)生改良的方法?！案牧肌笔且环N通過給植物提供獨特的和/或新的品質(zhì)，而增強植物物種或品種的實用性的特征?！案淖兒土勘硇汀敝高z傳修飾植物的可測量表型，其中與類似的，但是非修飾的植物相比，該植物顯示統(tǒng)計上顯著增加或減少的總體含油量(即，油類占種子質(zhì)量的百分比)。高油表型指總體含油量增加。
本文使用的“突變體”多核苷酸序列或者基因與相應(yīng)的野生型多核苷酸序列或者基因在序列或者表達上不同，其中的差異導(dǎo)致修飾的植物的表現(xiàn)型或者性狀。相對于植物或植物株系，術(shù)語“突變體”是指植物或者株系具有修飾的植物表型或性狀，其中修飾的表型或性狀與野生型多核苷酸序列或基因的修飾表達有關(guān)。
此處所述的術(shù)語“T1”是指來自T0植物的種子的植物子代。T1子代是可通過應(yīng)用選擇性試劑篩選的第一系列轉(zhuǎn)化的植物，所述的選擇性試劑為例如抗生素或除草劑，由此轉(zhuǎn)基因植物含有相應(yīng)的抗性基因。術(shù)語“T2”是指通過T1植物的花進行自體受精產(chǎn)生的植物子代，所述T1植物之前被篩選作為轉(zhuǎn)基因植物。T3植物是由T2植物等產(chǎn)生的。這里所述的特定植物的“直系子代”來源于所述植物的種子(或者，有時來自其它的組織)且是緊隨的子代；例如，對于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“間接子代”來源于所述植物直系子代的種子(或其它組織)，或來自該家系隨后子代的種子(或其它組織)；例如，T3植物是T1植物的間接子代。
此處所述的術(shù)語“植物部分”包括任意的植物器官或組織，包括，但不限于種子，胚，分生組織區(qū)域，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉和小孢子。植物細胞可獲自任意的植物器官或組織以及由其制備的培養(yǎng)物。可用于本發(fā)明方法的植物種類通常是廣泛的，其可以是可用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物，包括單子葉的和雙子葉的植物。
在這里所述的“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)含有異源多核苷酸的植物。異源的多核苷酸可以穩(wěn)定地整合到基因組中，或可以被插入到染色體外。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組中從而使多核苷酸被連續(xù)傳代。植物細胞，組織，器官或已被導(dǎo)入異源多核苷酸的植物被認為是“轉(zhuǎn)化的”，“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)基因的”植物。也含有該異源多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物或植物細胞的直系和間接子代也被視為是轉(zhuǎn)基因的。
具有改變的含油量表型的植物的鑒定我們使用擬南芥激活標(biāo)簽(ACTTAG)篩選，來鑒定我們命名為“HIO30.5”(At3g52280；GI#184095251-1110)的基因與改變的含油量表型(具體地，高油表型)之間的關(guān)聯(lián)。簡要地，而且如實施例中進一步描述的，用pSKI015載體對許多擬南芥植物進行了突變，所述載體包含來自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA，病毒增強子元件和選擇標(biāo)記基因(Weigel等，2000)。當(dāng)T-DNA插入到轉(zhuǎn)化植物的基因組中時，增強子元件可導(dǎo)致附近基因的上調(diào)，通常在增強子的大約10千堿基(kb)內(nèi)。為了鑒定轉(zhuǎn)基因植物，把T1植物暴露于選擇劑，以便特異性地回收表達選擇標(biāo)記，并具有T-DNA的轉(zhuǎn)化植物。從這些植物收集T2種子。從大約15-20T2種子提取脂類。進行氣相色譜(GC)分析，以測定種子樣本的脂肪酸含量和組成。
對顯示高油表型的擬南芥系進行了鑒定，其中含油量(也即，脂肪酸)與在相同時間培養(yǎng)和分析的其它植物的種子的平均含油量約28.7％相比構(gòu)成種子質(zhì)量的約35％(油增長22％)。通過鑒定T-DNA插入片段的位點發(fā)現(xiàn)了HIO30.5基因與高油表型之間的關(guān)聯(lián)，并且如實施例所示，證實了高油種子表型和T-DNA的存在的遺傳共分離。因此，HIO30.5基因和/或多肽可用于開發(fā)具有修飾的含油量表型(“HIO30.5表型”)的基因修飾的植物。HIO30.5基因可用于產(chǎn)生含油種子作物，其從含油種子加工提供提高的產(chǎn)油量，以及用于生產(chǎn)能提供能量增加的飼料谷物作物用于動物飼養(yǎng)。HIO30.5基因可進一步用于增加特種油料作物的含油量，以便增加所需稀有脂肪酸的產(chǎn)量。已經(jīng)進行遺傳修飾以表達HIO30.5的轉(zhuǎn)基因植物可用于生產(chǎn)油，其中利用標(biāo)準方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，并從植物部分(例如，種子)獲得油。
HIO30.5核酸和多肽擬南芥HIO30.5核酸(基因組DNA)序列提供于SEQ ID NO1以及Genbank登錄號GI#184095251-1110中。對應(yīng)的蛋白序列提供于SEQ ID NO2以及GI#15231174中。擬南芥HIO30.5的直系同源物或旁系同源物的核酸和/或蛋白描述于下面的實施例3中。
如這里使用的術(shù)語“HIO30.5多肽”指全長HIO30.5蛋白或其“功能活性”的片段，衍生物(變體)或者直系同源物，指該蛋白片段，衍生物或者直系同源物顯示與SEQ ID NO2的多肽相關(guān)的一種或多種功能活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，功能活性HIO30.5多肽，當(dāng)在植物中錯表達時，導(dǎo)致改變的含油量表型。在更進一步優(yōu)選的實施方案中，HIO30.5多肽在植物中的錯表達導(dǎo)致高油表型。在另一個實施方案中，功能活性HIO30.5多肽當(dāng)在植物或植物細胞中表達時，能拯救缺陷的(包括缺失的)內(nèi)源HIO30.5活性；該拯救多肽可來自與具有缺陷活性的植物相同的或不同的物種。在另一個實施方案中，全長HIO30.5多肽的功能活性片段(也即，具有SEQ ID NO2的序列的天然多肽或其天然存在的直系同源物)保留與全長HIO30.5多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性，例如信號活性，結(jié)合活性，催化活性或細胞或者細胞外定位活性。HIO30.5片段優(yōu)選包括HIO30.5結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄起始因子IIF結(jié)構(gòu)域的β亞基，例如C-或N-末端或者催化結(jié)構(gòu)域，尤其，優(yōu)選包括HIO30.5蛋白的至少10個，優(yōu)選至少20個，更優(yōu)選至少25個，最優(yōu)選至少50個的連續(xù)氨基酸。功能域可使用PFAM程序進行鑒定(Bateman A等，1999 Nucleic Acids Res 27260-262)。優(yōu)選的HIO30.5片段包含溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)(Pfam00439)。全長HIO30.5多肽的功能活性變體或其片段，包括具有氨基酸插入，缺失，或者置換，但保留與全長HIO30.5多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性的多肽。有時，產(chǎn)生的變體能改變HIO30.5多肽的翻譯后加工。例如，與天然多肽相比，變體可以具有改變的蛋白轉(zhuǎn)運或者蛋白定位特性，或者改變的蛋白的半衰期。
這里使用的術(shù)語“HIO30.5核酸”包含具有SEQ ID NO1提供的序列，或者與SEQ ID NO1提供的序列互補的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直系同源物。本發(fā)明的HIO30.5核酸可以是來源于基因組DNA或者cDNA的DNA，或者RNA。
在一個實施方案中，功能活性的HIO30.5核酸編碼或者互補于編碼功能活性的HIO30.5多肽的核酸?；蚪MDNA包括在該定義內(nèi)，其用作原始RNA轉(zhuǎn)錄本(也即，mRNA前體)的模板，其在編碼功能活性HIO30.5多肽之前需要加工，例如剪接。HIO30.5核酸可包括其他的非編碼序列，其可以轉(zhuǎn)錄或者不被轉(zhuǎn)錄；這種序列包括5’和3’UTRs，聚腺苷酸化信號和尤其是本領(lǐng)域已知的控制基因表達的調(diào)節(jié)序列。一些多肽需要加工事件，例如蛋白水解剪切，共價修飾，等等，以便完全活化。因此，功能活性核酸可編碼成熟的或者預(yù)先加工的HIO30.5多肽，或者中間體形式。HIO30.5多核苷酸還可以包括異源編碼序列，例如，編碼包括的促進融合多肽純化的標(biāo)記或者轉(zhuǎn)化標(biāo)記的序列。
在另一個實施方案中，功能活性HIO30.5核酸可用于例如，通過反義抑制，共抑制等產(chǎn)生功能喪失的HIO30.5表型。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法的HIO30.5核酸，包括編碼或互補于編碼HIO30.5多肽的序列的核酸序列，該HIO30.5多肽與SEQ ID NO2提供的多肽序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或以上的序列同一性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的HIO30.5多肽包括與SEQ ID NO2的HIO30.5多肽序列具有至少50％或60％同一性的多肽序列，而且與SEQ ID NO2的HIO30.5多肽序列可具有至少70％，80％，85％，，90％或95％或以上的序列同一性。在另一個實施方案中，HIO30.5多肽包括與SEQ ID NO2所示的多肽的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性的多肽序列。在另一個實施方案中，HIO30.5多肽包括與SEQ ID NO2的多肽序列的全長具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同一性的多肽序列并含有溴結(jié)構(gòu)域。
在另一個方面，HIO30.5多核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的HIO30.5核酸序列的全長或是與這種HIO30.5序列互補的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，而且可包含與SEQ ID NO1所示的HIO30.5序列或其功能活性片段，或互補序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。
這里使用的，對于特定的目標(biāo)序列或其特定部分，“百分比(％)序列同一性”被定義為如果必要獲得最大的百分比序列同一性，如通過WU-BLAST-2.0al9程序(Altschul等，J.Mol.Biol.(1990)215403-410所產(chǎn)生的，其中搜索參數(shù)設(shè)為缺省值，在進行序列比對和引入缺口之后，候選的衍生序列中核苷酸或氨基酸與目標(biāo)序列(或其特定部分)中核苷酸或氨基酸相同的百分比。HSP S和HSP S2參數(shù)是機動值，而且是通過程序本身取決于特定序列的組成和在其中對感興趣的序列進行搜索的特定數(shù)據(jù)庫的組成而確定的?！埃ネ恍灾怠蓖ㄟ^把匹配的相同核苷酸或氨基酸的數(shù)目除以報告的百分比同一性的序列的序列長度而確定?！鞍俜直?％)氨基酸序列相似性”通過進行與確定百分比氨基酸序列同一性相同的計算而確定，但是在計算中除了相同的氨基酸之外還包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代，即其中氨基酸被具有相似特性的另一個氨基酸所取代，而對蛋白的折疊或活性沒有顯著的影響。可以互相取代的芳香族氨基酸為苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；可互換的疏水氨基酸為亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸；可互換的極性氨基酸為谷氨酰胺和天門冬酰胺；可互換的堿性氨基酸為精氨酸，賴氨酸和組氨酸；可互換的酸性氨基酸為天冬氨酸和谷氨酸；可互換的小氨基酸為丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。
目標(biāo)核酸分子的衍生核酸分子包括能選擇性地與SEQ ID NO1的核酸序列雜交的序列。雜交的嚴謹度可通過溫度，離子強度，pH，以及雜交和洗滌期間變性劑諸如甲酰胺的存在來進行控制。通常使用的條件是大家所熟知的(參見，例如，Current Protocol in MolecularBiology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor(1989))。在一些實施方案子中，本發(fā)明的核酸分子能在如下的嚴謹雜交條件下與包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子雜交含有核酸的濾紙，在含有6X單倍濃度的檸檬酸鹽(SSC)(1X SSC為0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉；pH 7.0)，5X Denhardt溶液，0.05％焦磷酸鈉和100μg/ml的鯡魚精子DNA的溶液中，65℃預(yù)雜交8小時至過夜；在含有6X SSC，1XDenhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸鈉的溶液中，65℃雜交18-20小時；在含有0.1X SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中，65℃洗滌濾紙1小時。在其他的實施方案中，使用如下的中等嚴謹雜交條件包含核酸的濾紙，在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，1％Ficoll，1％BSA和500μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中，40℃預(yù)處理6小時；在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鮭魚精子DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中，40℃雜交18-20小時；接著，在含有2X SSC和0.1％SDS的溶液中，55℃洗滌兩次1小時。或者，可使用如下的低嚴謹條件在含有20％甲酰胺，5xSSC，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5XDenhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性剪切鮭魚精子DNA的溶液中，37℃孵育8小時到過夜；在相同的緩沖液中雜交18到20小時；在1xSSC中，大約37℃洗滌濾紙1小時。
由于遺傳密碼的簡并性，可產(chǎn)生許多編碼HIO30.5多肽的多核苷酸序列。例如，根據(jù)特定宿主生物顯示的最佳密碼子使用，可選擇密碼子以增加多肽在特定的宿主物種中的表達(參見，例如，Nakamura等，1999)。這種序列變體可用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明的方法可使用擬南芥HIO30.5的直系同源物。鑒定其他植物品種中直系同源物的方法是本領(lǐng)域已知的。一般說來，不同物種中的直系同源物保持相同的功能，由于存在一個或多個蛋白基序和/或三維結(jié)構(gòu)。在進化過程中，當(dāng)物種形成后發(fā)生基因重復(fù)事件時，一個物種，例如擬南芥中的單個基因可能相應(yīng)于另一個物種中的多個基因(旁系同源物)。這里使用的，術(shù)語“直系同源物”包括旁系同源物。當(dāng)序列數(shù)據(jù)可用于特定的植物物種時，通常可通過序列同源性分析，例如BLAST分析，一般使用蛋白餌序列，來鑒定直系同源物。如果來自正向BLAST結(jié)果的最合適序列檢索到了反向BLAST中原始的查詢序列，該序列則為可能的直系同源物(Huynen MA和Bork P，Proc Natl AcadSci(1998)955849-5856；Huynen MA等，Genome Research(2000)101204-1210)。用于多個序列比對的程序，例如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 224673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守區(qū)域和/或殘基，并產(chǎn)生系統(tǒng)樹。在表示來自不同物種的多個同源序列(例如，通過BLAST分析檢索到的)的系統(tǒng)樹中，來自2個物種的直系同源序列，相對于來自2個物種的所有其他的序列，通常在系統(tǒng)樹上顯得最靠近。結(jié)構(gòu)串線(threading)或蛋白折疊的其他分析(例如，使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的軟件)也可鑒定可能的直系同源物。核酸雜交方法也可用于尋找直向同源基因，而且當(dāng)不能獲得序列數(shù)據(jù)是優(yōu)選的。簡并PCR和cDNA或基因組DNA文庫篩選是尋找相關(guān)基因序列的常見方法，而且是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Sambrook，1989；Dieffenbach and Dveksler，1995)。例如，Sambrook等中描述了用于從感興趣的植物物種產(chǎn)生cDNA文庫，和用部分同源基因探針探測文庫的方法。擬南芥HIO30.5編碼序列的高度保守部分可用作探針。HIO30.5直系同源核酸可在高度，中度或低度嚴謹條件下與SEQ ID NO1的核酸雜交。擴增或分離假定的直系同源物的部分之后，可通過標(biāo)準技術(shù)克隆該部分并進行測序，而且用作探針來分離完整的cDNA或基因組克隆。或者，可以啟動EST方案來產(chǎn)生感興趣的植物物種的序列信息數(shù)據(jù)庫。在另一種方法中，能特異性結(jié)合已知的HIO30.5多肽的抗體，用于直系同源物分離(參見，例如，Harlow andLane，1988，1999)。Western印跡分析可確定HIO30.5直系同源物(也即，直系同源蛋白)存在于特定植物物種的粗提取物中。當(dāng)觀察反應(yīng)性時，可通過篩選顯示特定植物物種的表達文庫，來分離編碼候選直系同源物的序列。如Sambrook等1989中所述，可在各種商業(yè)可獲得的載體中構(gòu)建表達文庫，包括λgt11。一旦通過任何這些方法鑒定到了候選的直系同源物，候選的直系同源序列可用作餌(“查詢”)，用于從其中已經(jīng)鑒定到HIO30.5核酸和/或多肽序列的擬南芥或其他的物種中對序列進行反向BLAST。
可使用任何可用的方法來獲得HIO30.5核酸和多肽。例如，通過如前所述的篩選DNA文庫或通過使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，分離感興趣的cDNA或基因組DNA序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的?；蛘撸珊铣珊怂嵝蛄?。任何已知的方法，例如位點定向誘變(Kunkel TA等，1991)，可用于將所需的改變引入到克隆的核酸中。
通常，本發(fā)明的方法包括把所需形式的HIO30.5核酸整合到用于轉(zhuǎn)化植物細胞的植物表達載體中，并在宿主植物中表達HIO30.5多肽。
分離的HIO30.5核酸分子是不同于天然發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置的核酸分子，而且從至少一個雜質(zhì)核酸分子中鑒定和分離，該雜質(zhì)核酸分子通常結(jié)合在HIO30.5核酸的天然來源中。然而，分離的HIO30.5核酸分子包括包含在通常表達HIO30.5的細胞中的HIO30.5核酸分子，例如，該核酸分子位于與天然細胞的核酸分子不同的染色體位置中。
產(chǎn)生具有改變的含油量表型的遺傳修飾的植物HIO30.5核酸和多肽可用于產(chǎn)生具有修飾的含油量表型的遺傳修飾的植物。這里使用的，“修飾的含油量表型”可指植物任何部分中修飾的含油量；經(jīng)常在種子中觀察到修飾的含油量。在一個優(yōu)選的實施方案中，植物中HIO30.5基因的改變表達可用于產(chǎn)生具有高油表型的植物。
這里所述的方法一般適用于所有植物。盡管在擬南芥中進行了激活標(biāo)簽法和基因鑒定，但是HIO30.5基因(或其直系同源物，變體或片段)可在任何植物種類中表達。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)油植物，其在特異性器官，主要是在種子中生產(chǎn)和儲存三酰基甘油。這些物種包括大豆(Glycine max)，油菜籽和canola(包括甘藍型油菜(Brassica napus)，B.campestris)，向日葵(Helianthus annus)，棉花(陸地棉)，玉米(Zea maya)，可可(Theobroma cacao)，紅花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亞麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和花生(Arachis hypogaea)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生果實和蔬菜的植物，產(chǎn)生谷物的植物，產(chǎn)生堅果的植物，快速周期的蕓苔品種，紫花苜蓿(Medicago sativa)，煙草(Nicotiana)，草坪草(Poaceae family)，其他的飼料作物，和可能是稀有脂肪酸來源的野生物種。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解本領(lǐng)域存在的各式各樣的轉(zhuǎn)化技術(shù)，而且新技術(shù)不斷地變成可用的。適于靶宿主植物的任何技術(shù)可用于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可引入各種形式的構(gòu)建體，包括但不限于DNA鏈，到質(zhì)粒，或人工染色體中?？赏ㄟ^各種技術(shù)將構(gòu)建體引入到靶植物細胞中，包括但不限于異源核酸的土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，電穿孔法，顯微注射，微粒轟擊，磷酸鈣-DNA共沉淀或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化優(yōu)選是永久的，也即通過使導(dǎo)入的表達構(gòu)建體整合到宿主植物基因組中，以便該導(dǎo)入的構(gòu)建體傳遞給連續(xù)的植物世代。根據(jù)計劃的用途，包含HIO30.5多核苷酸的異源核酸構(gòu)建體可編碼完整的蛋白或其生物學(xué)活性部分。
在一個實施方案中，雙元基于Ti的載體系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)移多核苷酸。標(biāo)準的土壤農(nóng)桿菌雙元載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且許多是可商業(yè)獲得的(例如，pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。
用土壤農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化植物的最佳方法隨待轉(zhuǎn)化的植物種類而變化。用于土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的示例性方法包括轉(zhuǎn)化來源于無菌籽苗和/或小植株的胚軸，芽，莖或葉組織的外植體。這種轉(zhuǎn)化的植物可有性繁殖，或通過細胞或組織培養(yǎng)繁殖。先前已經(jīng)描述了土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用于許多不同類型的植物，而且可在科學(xué)文獻中找到這種轉(zhuǎn)化方法。其中特別相關(guān)的是轉(zhuǎn)化商業(yè)上重要的作物，例如油菜籽(De Block等，1989)，向日葵(Everett等，1987)和大豆(Christou等，1989；Kline等，1987)的方法。
根據(jù)表達水平，發(fā)生表達的組織類型和/或表達的發(fā)育階段，可調(diào)節(jié)HIO30.5的表達(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯)。許多異源調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子和增強因子)可用于控制HIO30.5核酸的表達。這些包括組成型，誘導(dǎo)型和可調(diào)節(jié)的啟動子，以及能以組織或瞬時特異性方式調(diào)控表達的啟動子和增強因子。示例性的組成型啟動子包括樹莓E4啟動子(美國專利5,783,393和5,783,394)，35S CaMV(Jones JD等，1992)，CsVMV啟動子(Verdaguer B等，1998)和甜瓜肌動蛋白啟動子(公開的PCT申請WO0056863)。示例性的組織特異性啟動子包括番茄E4和E8啟動子(美國專利5,859,330)和番茄2AII基因啟動子(Van Haaren MJJ等，1993)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，HIO30.5表達在來自其表達與早期種子和/或胚胎發(fā)育相關(guān)的基因的調(diào)節(jié)序列的調(diào)控下。其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關(guān)的豆科植物基因包括V.faba豆球蛋白(Baumlein等，1991，Mol Gen Genet 225121-8；Baumlein等，1992，Plant J 2233-9)，V.faba usp(Fiedler等，1993，Plant Mol Biol 22669-79)，豌豆convicilin(Bown等，1988，Biochem J 251717-26)，豌豆凝集素(dePater等，1993，Plant Cell 5877-86)，P.vulgaris β菜豆蛋白(Bustos等，1991，EMBO J 101469-79)，P.vulgaris DLEC2和PHS[β](Bobb等，1997，Nucleic Acids Res 25641-7)和大豆β-conglycinin，7S貯藏蛋白(Chamberland等，1992，Plant Mol Biol 19937-49)。其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關(guān)的谷類基因包括水稻谷蛋白(″GluA-3，″Yoshiharaand Takaiwa，1996，Plant Cell Physiol 37107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，Plant Mol Biol 301207-21；Washida等，1999，Plant Mol Biol 401-12；″Gt3，”Leisy等，1990，Plant Mol Biol 1441-50)，水稻醇溶谷蛋白(Zhou & Fan，1993，Transgenic Res 2141-6)，小麥醇溶谷蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBO J 12545-54)，玉米醇溶蛋白(Z4，Matzke等，1990，Plant Mol Biol 14323-32)和大麥B-hordein(Entwistle等，1991，Plant Mol Biol 171217-31)。其他的其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，包括油棕GL07A(7S球蛋白，Morcillo等，2001，Physiol Plant 112233-243)，甘藍型油菜napin，2S貯藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，J Biol Chem 26212196-201；Stalberg等，1993，Plant Mol Biol 1993 23671-83；Ellerstrom等，1996，Plant Mol Biol 321019-27)，甘藍型油菜油質(zhì)蛋白(Keddie等，1994，Plant Mol Biol 24327-40)，擬南芥油質(zhì)蛋白(Plant等，1994，Plant Mol Biol 25193-205)，擬南芥FAEl(Rossak等，2001，Plant Mol Biol 46717-25)，刀豆conA(Yamamoto等，1995，Plant Mol Biol 27729-41)和長春花異胡豆苷合成酶(Str，Ouwerkerk and Memelink，1999，Mol Gen Genet 261635-43)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用來自在油生物合成期間表達的基因的調(diào)節(jié)序列(參見，例如，美國專利5,952,544)?？蛇x擇的啟動子來自于植物貯藏蛋白基因(Bevan等，1993，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci342209-15)。
在另一個方面，有時可能需要抑制宿主細胞中內(nèi)源HIO30.5的表達。用于實施本發(fā)明該方面的示例性方法包括，但不限于反義抑制(Smith等，1988；van der Krol等，1988)；共抑制(Napoli，等，1990)；核酶(PCT公開WO 97/10328)；和正義與反義的組合(Waterhouse，等，1998)。抑制宿主細胞中內(nèi)源序列的方法，一般使用待抑制序列的至少一部分的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種序列可以與內(nèi)源序列的編碼以及非編碼區(qū)同源。反義抑制可使用完整的cDNA序列(Sheehy等，1988)，部分cDNA序列包括5’編碼序列(Cannon等，1990)或3’非編碼序列(Ch′ng等，1989)的片段。共抑制技術(shù)可使用完整的cDNA序列(Napoli等，1990；van der Krol等，1990)或部分cDNA序列(Smith等，1990)。
可進行標(biāo)準的分子和遺傳試驗，以更進一步分析基因與觀察到的表型之間的關(guān)聯(lián)。示例性技術(shù)描述如下。
1.DNA/RNA分析例如，通過原位雜交，可通過突變體與野生型系的對比確定階段-與組織特異性基因表達模式?？蛇M行基因，尤其是側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)甲基化狀況的分析。其他的適用技術(shù)包括過表達，異位表達，在其他植物物種中的表達和基因敲除(反向遺傳學(xué)，靶向敲除，病毒誘導(dǎo)的基因沉默[VIGS，參見Baulcombe D，1999])。
在優(yōu)選的應(yīng)用中，通過微陣列分析的表達分布被用于同時測量許多不同基因表達中的差異或誘導(dǎo)的改變。用于微陣列分析的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(Schena M等，Science(1995)270467-470；Baldwin D等，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)253-58；van Hal NL等，JBiotechnol(2000)78271-280；Richmond T and Somerville S，Curr OpinPlant Biol(2000)3108-116)?？梢赃M行單獨標(biāo)簽的株系的表達分布分析。這種分析可鑒定由于感興趣基因的過表達而協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的其它基因，其可有助于把未知基因置于特定的途徑。
2.基因產(chǎn)物的分析基因產(chǎn)物分析可包括重組蛋白表達，抗血清產(chǎn)生，免疫定位，催化或其他的活性的生物化學(xué)分析，磷酸化狀況分析和通過酵母雙雜交分析進行與其他蛋白之間的相互作用分析。
3.途徑分析途徑分析可包括，基于它的錯表達表型或通過與相關(guān)基因的序列同源性，把基因或基因產(chǎn)物置于特定的生物化學(xué)，新陳代謝或信號途徑中?；蛘?，分析可包括與野生型系和其它突變系的遺傳交叉(產(chǎn)生雙突變體)，以把基因指定于途徑中，或確定在途徑中突變對下游“報告”基因表達的作用。
產(chǎn)生具有改變含油量的表型的突變植物本發(fā)明更進一步提供了鑒定在內(nèi)源HIO30.5或者其等位基因中具有能賦予這些植物及其后代HIO30.5表型的突變的非轉(zhuǎn)基因植物的方法。。在一種稱為“TILLING”的方法中(用于在基因組中靶向誘導(dǎo)的局部病變)，例如，使用EMS處理，在感興趣植物的種子中誘導(dǎo)突變。培養(yǎng)得到的植物，并且自體受精，后代用于制備DNA樣品。HIO30.5-特異性PCR被用于鑒定突變的植物是否具有HIO30.5突變。然后測試具有HIO30.5突變的植物含油量的改變，或者，測試植物的含油量的改變，然后使用HIO30.5-特異性PCR確定具有改變含油量的植物是否具有突變的HIO30.5基因。TILLING可鑒定能改變特異性基因的表達或由這些基因編碼的蛋白的活性的突變(參見Colbert等(2001)PlantPhysiol 126480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18455-457)。
在另一種方法中，候選基因/數(shù)量性狀基因座(QTL)方法可用于標(biāo)記輔助的育種項目，以鑒定HIO30.5基因或HIO30.5直系同源物中的等位基因或突變，其能賦予含油量的改變(參見Bert等，Theor ApplGenet.2003 Jun；107(1)181-9；以及Lionneton等，Genome.2002 Dec；45(6)1203-15)。因此，在本發(fā)明更進一步的方面中，HIO30.5核酸被用于鑒定具有改變的含油量的植物是否在內(nèi)源HIO30.5中具有突變，或是否具有能導(dǎo)致含油量改變的特定等位基因。
雖然參考特定的方法和實施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解只要不背離本發(fā)明可以進行各種修飾和改變。這里引用的所有出版物都明確地在這里作為參考引入，用于描述和公開可與本發(fā)明一起使用的組合物和方法的目的。所有引用的專利，專利申請和參考的公共數(shù)據(jù)庫中的序列信息也引入作為參考。
實施例實施例1利用激活標(biāo)簽構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有HIO30.5表型的植物使用激活標(biāo)簽“ACTTAG”載體，pSKI015產(chǎn)生突變體(GI#6537289；Weigel D等，2000)。使用標(biāo)準方法產(chǎn)生擬南芥轉(zhuǎn)基因植物，基本上如公開的申請PCT WO0183697中所述。簡要地，T0擬南芥(Col-0)植物用攜帶有pSKI015載體的土壤農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，該載體包括來源于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA，除草劑抗性選擇性標(biāo)記基因和4X CaMV35S增強子元件。根據(jù)除草劑抗性，在T1世代選擇轉(zhuǎn)基因植物。由T1植物選擇T2種子并以加索引的集合進行保藏，并評價T2種子的一部分用于篩選。
利用下列方法進行種子脂肪酸含量的定量測定。通常以標(biāo)準1∶1∶2比率含有純合插入物，純合野生型以及雜合基因型的測試的各個品系的15到20個T2種子樣品在UMT-2超微量天平(Mettler-Toledo Co.，Ohio，USA)上稱重然后轉(zhuǎn)入玻璃提取瓶。從種子提取脂類，并根據(jù)Browse等人(Biochem J 23525-31，1986)方法的修改方法將所有種子在80℃在500ul的2.5％H2SO4的MeOH溶液中轉(zhuǎn)酯化3小時。已知量的十七烷酸加入反應(yīng)中作為內(nèi)標(biāo)物。向每個瓶中加入750μl的水以及400μl的己烷然后用力搖動并進行相分離。反應(yīng)瓶直接加載到GC上進行分析并通過自動取樣器取上層己烷相。具有火焰電離檢測的氣相色譜法用于脂肪酸甲酯的分離和測定。Agilent 6890Plus GC′s用于用Agilent Innowax柱(30m×0.25mm ID，250um膜厚度)進行分離。載氣是以2.5ml/分鐘恒定流動的氫氣。以不分流的方式注射1μl的樣品(進入溫度220℃，清洗氣流15ml/min 1分鐘)。烘箱設(shè)置為105℃的起始溫度，起始時間0.5分鐘，然后以每分鐘60℃的斜度升至175℃，40℃/分鐘升至260℃，最終保持時間2分鐘。通過火焰電離進行檢測(溫度275℃，燃油流30.0ml/分鐘，氧化劑400.0ml/min)。利用Millennium色譜管理系統(tǒng)監(jiān)控儀器控制和數(shù)據(jù)收集與分析(版本3.2，WatersCorporation，Milford，MA)。自動進行整合和定量分析，但是所有的分析隨后都進行人工檢驗以在得到研究中獲得的結(jié)果匯總之前證實正確的峰鑒別和可接受的信噪比。
命名為WO00086431的ACTTAG品系被鑒定為高油表型。具體地，與其它生長的ACTTAG品系并在相同條件下分析(即基準線)的平均28.7％的平均含油量相比，油構(gòu)成種子質(zhì)量的34.8％(w/w)。一式三份進行同樣種子的重新分析。油構(gòu)成種子質(zhì)量的32.1％，證實相對于基準含油量的增加。
實施例2顯示改變的含油量表型的植物中T-DNA插入序列的表征我們進行了基本上如專利申請PCT WO0183697中所示的標(biāo)準分子分析，以確定與改變的含油量表型相關(guān)的T-DNA插入位點。簡而言之，從顯示改變的含油量表型的植物提取基因組DNA。使用pSKI015載體的特異性引物進行的PCR，確認了來自WO00086431系的植物中存在35S增強子，Southern印跡分析證實了ACTTAG T-DNA的基因組整合。
質(zhì)粒拯救和反向PCR被用于回收T-DNA插入序列側(cè)翼的基因組DNA，然后使用基礎(chǔ)的BLASTN搜索擬南芥基因組DNA TAIR數(shù)據(jù)庫(可以在公眾可以進入的擬南芥信息資源網(wǎng)站獲得)進行序列分析。WO00086431系在三個不同的位點具有插入的T-DNA。
為了確定哪一插入序列引起高種子油表型，檢驗高種子油表型以及T-DNA的存在的共分離。將18個T2植物培養(yǎng)成熟并由這些植物收集的種子確定種子油表型。如實施例1所述確定這些植物的種子油含量。通過使用對相應(yīng)的基因組區(qū)域以及T-DNA特異性的引物的PCR，分析T3種子中T-DNA在插入位點的存在或者不存在，推斷T2種子的遺傳型。結(jié)果顯示位點2以及3緊密連接。此外，在位點2和3包含T-DNA插入序列的T3種子的平均含油量比在這些位點缺乏插入序列的那些家族的平均含油量更高。位點2和3的T2個體同型接合子產(chǎn)生與參比相比115.4％含油量的種子，這些位點T2個體半合子產(chǎn)生與參比相比118.4％含油量的種子，而在這些位點缺乏T-DNA的T2個體具有野生型Col-0植物的種子的參比樣品的105％的平均含油量。因為高油位點的純合子和半合子顯示含油量類似的增加，我們推斷位點2和3與高油表型相關(guān)并且表型由顯性突變引起。相反，在位點1包含T-DNA插入序列的T3家族的平均含油量比在相應(yīng)位點缺乏插入序列的情況相比更低或者幾乎相同。我們推斷位點1與高油表型不相關(guān)。
序列分析揭示顯示為SEQ NO1的核苷酸序列的起始密碼子，我們命名為HIO30.5，是位點3的約1kb的5′的T-DNA的上游邊界。
實施例3擬南芥HIO32.2序列的分析利用BLAST(Altschul等，1997，J.Mol.Biol.215403-410)，PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27260-262)，PSORT(Nakai K和Horton P，1999，Trends Biochem Sci 2434-6)和/或CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 224673-4680)進行序列分析。
SEQ ID NO1與GenBank序列的BLASTN恢復(fù)了候選基因本身(外加其基因組DNA登錄號)以及假定的擬南芥平行進化同源基因，At2g34900(2個登錄號)。At3g52280候選基因沒有表示為cDNA克隆也沒有任何與該基因有關(guān)的擬南芥ESTs存在產(chǎn)生高-記分片段對的序列記分P(N)Ngi|18409525|ref|NM_115088.1|Arabidopsjs thaliana chromos...5550 5.6e-244gi|6434227|emb|AL132972.1|ATT25B15 Arabidopsis thaliana D...1155 1.0e-175gi|18403687|ref|NM_129043.1|Arabidopsis thaliana chromos...609 9.0e-191gi|20197115|gb|Ac004238.3|Arabidopsis thaliana chromosom...341 1.7e-052針對GenBank中的氨基酸的BLASTP重現(xiàn)了類似的結(jié)果，并鑒定了另外3個由基因At2g34900At5g10550 & At5g65630編碼的推斷的擬南芥同系物，與SEQ ID NO2分別具有39％，13％和14％的序列同一性。同樣鑒定了來自水稻的預(yù)測的蛋白(GI#7523514)，與SEQ ID NO2具有15％的序列同一性。最好的10個結(jié)果列于如下并包括編碼與發(fā)育模式相關(guān)的控制基因表達有關(guān)的人和蒼蠅的基因。
產(chǎn)生高-記分片段對的序列記分p(N)Ngi|15231174|ref|NP_190796.1|unknown protein；protein id...1570 1.1e-160gi|15226857|ref|NP_181036.1|putative RING3 protein；prot...606 1.5e-581gi|15238195|ref|NP_196617.1|bromodomain protein-like；...239 1.0e-262gi|7523514|dbj|BAA94242.1|Similar to Arabidopsis thalian...278 3.4e-231gi|15239091|ref|NP_201366.1|putative protein；protein id...212 1.2e-212gi|7657218|ref|NP_055114.1|bromodomain-containing protei...215 7.9e-212gi|3184498|gb|AAC27978.1|R31546_1[Homo sapiens]215 8.2e-212gi|120558|sp|P13709|FSH_DROME FEMALE STERILE HOMEOTIC PRO...216 1.0e-202gi|24640482|ref|NP_511078.2|CG2252-PB [Drosophila melano...216 1.0e-202gi|1588281|prf||2208296A RING3 protein 255 1.2e-201SEQ ID NO1與GenBank序列的BLASTN鑒定了下列擬南芥序列，與SEQ ID NO1的％同一性顯示在括號中At2g34900GI#15226857(39％)；At5g10550 GI#15238195(13％)以及At5g65630GI#15239091(14％)。
針對ESTs的BLASTN重現(xiàn)的來自非-擬南芥植物品種的下列ESTs，與SEQ ID NO2的％同一性顯示在括號中土豆(馬鈴薯)GI#s13608255(58％)以及21921887(30％)；棉花(棉屬)GI#5050723(61％)；大豆(毛豆)GI#9835128(30％)蕪菁GI#1019482(51％)；和谷物(玉米)GI#24765979(34％)。
SEQ ID NOs 3和4是分別來自番茄以及小麥的序列，其代表被編成最小編號的重疊群的重現(xiàn)的ESTs。其中重疊群代表部分編碼區(qū)，可通過分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域是技術(shù)人員確定全cDNA序列。
SEQ ID NO3來自番茄(Lycoprsicon esculentum)，并且是下列序列的重疊群(contig)GI#s 13778307，10804738，9504093，6985312，4381395。與SEQ ID NO1具有58％的同一性。
SEQ ID NO4來自小麥(Triticum aestivum)，并且是GI#s21837181，19950212，20123686，20547632，19957908以及20299669的重疊群。與SEQ ID NO1具有22％的同一性。
PFam分析檢測到來自SEQ ID NO2的殘基87到200的溴結(jié)構(gòu)域(PF00439)。與預(yù)測的起轉(zhuǎn)錄因子的作用相符，PSORT2分析預(yù)言At3g52280基因產(chǎn)物是核來源的(60％)。這個基因可能扮演調(diào)節(jié)參與脂肪酸代謝或有關(guān)途徑的基因表達的角色。
實施例4證實表型/基因型的關(guān)聯(lián)RT-PCR分析表明HIO30.5基因在來自顯示HIO30.5表型的植物中過表達。具體地，從在多種發(fā)育階段以及庫收集的顯示HIO30.5表型的植物的簇生葉子和/或角果提取RNA。利用特異于SEQ ID NO1所示序列，特異于T-DNA插入物鄰近的其它的預(yù)測基因以及特異于組成型表達的肌動蛋白基因(陽性對照)的引物進行RT-PCR。結(jié)果表明顯示HIO30.5表現(xiàn)型的植物過表達HIO30.5基因的mRNA，表明HIO30.5基因的增強表達與HIO30.5表型有關(guān)。
HIO30.5表現(xiàn)型的顯性遺傳模式通過遺傳分析證實。通常，遺傳分析涉及雜交第一代F1的產(chǎn)生以及分析。一般地，通過由T2植物收集花粉進行F1雜交，所述T2植物用于對野生型植物授粉。這樣的雜交通過采取來自各個選擇的個體植物的4朵花以及利用T2花作為雄性花粉供體以及野生型植物的花作為雌性進行。4-5雜交用于單獨的目的。將由同樣個體雜交形成的種子進行聚集，種植以及培育成成熟的雜交第一代F1。
實施例5高油表型的扼要重述為了證實At3g52280的過表達是否導(dǎo)致高含油種子表型，將來自過表達該基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子的油含量與來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏姆N子的油含量進行比較。為了進行這種比較，將At3g52280克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中，At3g52280位于種子特異性PRU啟動子后面，并利用floral dip法轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中。該轉(zhuǎn)化載體含有能提供對卡那霉素抗性的nptII基因，作為選擇標(biāo)記。將來自轉(zhuǎn)化植物的種子在含有卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基中培育。7天后，鑒定轉(zhuǎn)基因植物的健康綠色植物并移植到土壤。非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镌诃傊囵B(yǎng)基上發(fā)芽，生長7天然后轉(zhuǎn)移到土壤上。將22個轉(zhuǎn)基因的幼苗和10個非轉(zhuǎn)基因的對照植物轉(zhuǎn)移到相同的32格平地的隨機位置。植物生長至成熟并自花授精并結(jié)子。從每一植物收獲種子，通過如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波譜學(xué)評估種子的含油量。
使用Bruker 22N/F近紅外光譜法捕獲NIR紅外光譜。使用來自樣品和參比方法的NIR數(shù)據(jù)，根據(jù)制造商的說明書將Bruker軟件用于評估總的種子油和總的種子蛋白含量。根據(jù)AOCS程序Aml-92的一般方法開發(fā)了油含量預(yù)測校準，AOCS程序Aml-92是美國石油化學(xué)家學(xué)會的正式方法和美國石油學(xué)會推薦作法(Ofiicial Methods andRecommended Practices of the American Oil Chemists Society，第5版，AOCS，Champaign I11)。開發(fā)了用于NIR預(yù)測原油ASE(Ren Oil，Accelerated Solvent Extraction)的校準。
已經(jīng)在兩個實驗中檢驗了At3g52280的過表達對種子油的影響。在兩個實驗中，過表達At3g52280的植物具有比生長在相同的平地的對照植物高的種子油含量。整個實驗中，過表達At3g52280的植物的平均種子油含量比未轉(zhuǎn)化的對照高4％。過表達At3g52280的植物的種子油含量顯著高于非-轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?雙向方差分析；P＝0.0208)，參見表l。
表1
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gttagtattg agatggacat actggacgaa ccaacactat ggaggctaaa gttctttgtg960aaggatgcgt tggataatgc aatgaagaag aagaaagaag aggagacaaa gactagagaa1020ttgagtggag cacaaaagaa agaggtttcg aagaaacgaa atgcgactac aaagttagct1080gagaggaaaa cgaagcggtc acgcatatga 1110<210>2<211>369<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>2Met Ala Asp Ser Val Pro Gly His Val Ala Gly Gly Gly Leu Gln Gly1 5 10 15Phe Ser Val Asp Ala Glu Cys Ile Lys Gln Arg Val Asp Glu Val Leu20 25 30Gln Trp Val Asp Ser Leu Glu His Lys Leu Lys Glu Val Glu Glu Phe35 40 45Tyr Ser Ser Ile Gly Val Ser Asn Ser Gly Ser Ile Gly Lys Asp Thr50 55 60Glu Lys Gly Arg His Val Val Gly Ile Arg Lys Ile Gln Gln Glu Ala65 70 75 80Ala Arg Arg Glu Ala Val Ala Ala Lys Arg Met Gln Asp Leu Met Arg85 90 95Gln Phe Gly Thr Ile Phe Arg Gln Ile Thr Gln His Lys Cys Ala Trp100 105 110Pro Phe Met His Pro Val Asn Val Glu Gly Leu Gly Leu His Asp Tyr115 120 125Phe Glu Val Ile Asp Lys Pro Met Asp Phe Ser Thr Ile Lys Asn Gln130 135 140
Met Glu Ala Lys Asp Gly Thr Gly Tyr Lys His Val Met Gln Ile Tyr145 150 155 160Ala Asp Met Arg Leu Val Phe Glu Asn Ala Met Asn Tyr Asn Glu Glu165 170 175Thr Ser Asp Val Tyr Ser Met Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys Phe Glu180 185 190Glu Lys Trp Ala His Phe Leu Pro Lys Val Gln Glu Glu Glu Lys Ile195 200 205Arg Glu Glu Glu Glu Lys Gln Ala Ala Lys Glu Ala Leu Leu Ala Lys210 215 220Glu Ala Ser His Ile Lys Thr Thr Arg Glu Leu Gly Asn Glu Ile Cys225 230 235 240His Ala Asn Asp Glu Leu Glu Lys Leu Met Arg Lys Val Val Glu Arg245 250 255Cys Arg Lys Ile Thr Ile Glu Glu Lys Arg Asn Ile Gly Leu Ala Leu260 265 270Leu Lys Leu Ser Pro Asp Asp Leu Gln Lys Val Leu Gly Ile Val Ala275 280 285Gln Ala Asn Pro Ser Phe Gln Pro Arg Ala Glu Glu Val Ser Ile Glu290 295 300Met Asp Ile Leu Asp Glu Pro Thr Leu Trp Arg Leu Lys Phe Phe Val305 310 315 320Lys Asp Ala Leu Asp Asn Ala Met Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Thr325 330 335Lys Thr Arg Glu Leu Ser Gly Ala Gln Lys Lys Glu Val Ser Lys Lys340 345 350
Arg Asn Ala Thr Thr Lys Leu Ala Glu Arg Lys Thr Lys Arg Ser Arg355 360 365Ile<210>3<211>965<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>3gccttcatcg gcggcacaac ctgttgctta tctccgatct actccggcga acggcgaaat60tcgagctatg gagaatctaa acggcttagt tcctgacatc cctatacaag agcagaaaga120caatgctact gcttctgaaa atttcggtcg aagtgttgat gaaatggttg ggaaggttga180tcagattgag cagagactga atgaggttga gcatttctat tccaatacta gtaaaaaaca240atcaaacacg ccaagaggtg gctctattct gaaagacaaa gagaaacaga tgtctagctt300tagaaggcgg cagcaggatg catcacgtag agaagcagct ggttccagga gaatgcaaga360acttatgcgc caatttggta ctatattacg tcagatcact cagcacaagt gggcagaacc420ttttatggaa cctgtggatg tcaagggtct tggattacac gattattttg aggttattga480gaagcctatg gacttcagta ctatcaaaaa caagatggaa gcaaaggatg gttctggcta540taagcatgtc cgagagatat gtgctgacgt gaggctaata tttaagaatg cgatgaaata600caacgaggaa agggatgacg ttcatgtaat ggcgaaaacc ttgttgggaa aattcgagga660gaaatggttg cagcttttgc ccaaagttga tgaagaggaa aaacggcgaa aggaagagga720agcagaagcc caacaggata tgcagctcgc tcaagaggct gctcatgcaa aaatggcaaa780agatttaact attgagcttg atgaggtgga catgcaactg gaagaactca gggacttggt840gcttcagaaa tgcagaaaga tttcaacgga agacaggaaa caacttggga atgcgctcac900taagctgtct cctgacgatc ttaataaagc actattgatt gtggcacaga atgatcctac960ttttc965
<210>4<211>1290<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>4cgaggggcgg caatggaggg agcgtggccc catccggcgc cgatggagcc gaccaccgcc60gcggatgggc ctcaagtgtc ggaggtgaac tcgttccggc gccaggtcga cgacctcctc120tccaagaccg acgtgctgga gaagagggtg aacgaggtgg tagggttcta caattccaag180aagcacagca gtggaggccg caaggctggc ggcaggtacg cggaaaacgg tgccagggac240agccacggca atgggatgcc cgacctcatg cgccagtttg ccggtatcat tcgccagatt300acatctcatg aatgggcaca gccgtttttg caaccggtag acgtcgtagg tcttcaactt360gatgactatc accagattat aacaaaacct atggatttct cgaccatccg aaacaaaatg420gaagggaagg aaagtaccac atataacagt gtccgagaaa tatattctga tgttagatta480gtttttacca atgcaatgaa gtacaatgtt gaaggtcacc ctgttaacat aatggccaag540ttcctactcg agagatttga ggagaaatgg cttcaccttc tccctgaagt tgagaacgag600gaaagggaac gggaggaacc aaatgatgct ccaaccataa gcatttctcc ggaagctgca660attgcaaaat tagctgaaga tactggtaat gagctgaatg agattaataa gcagctggag720gagctccaga aaatggtggt tcagagatgc aggaaaatga cgacggacga gaagagaaaa780ctcggcgcag gtctttgcca attgtctcca gaagatctta acaaggcgct agagttggtc840gcgcaagaca atcctagctt ccaaactaca gctgaagaag tggaccttga catggatgct900cagagcgaga cgaccctctg gaggctgaag ttctttgtga gggaagcatt ggaacaacag960gcgaatgtag gcgtagtggc ctgtggcaag atcgatgaaa acacgaagag gagccgcgac1020atgtacaatg ctctagccaa gaccgtttcg aaacggatta agagataacc ttagcggctc1080ggcctttctg atggttcatg gtatttctgt agaaaatagg gccatgttct cccttgtgtg1140aagacatgtt gtatatatac gaagatgaat ctgcactaag atatgcttgg tcgcacccgg1200tctcatgtgg catgggtagc atgctattgg tagctatgta aaataaagag caatgttgaa1260cacctctgag aaacaagaat tattccttga 1290
權(quán)利要求
1.包括植物轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物，該植物轉(zhuǎn)化載體含有編碼或互補于編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的HIO30.5多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列，因此相對于對照植物，該轉(zhuǎn)基因植物具有高油表型。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其選自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻和花生。
3.從權(quán)利要求1的植物獲得的植物部分。
4.權(quán)利要求3的植物部分，其是種子。
5.一種生產(chǎn)油的方法，其包括培育權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，以及從所述植物回收油。
6.產(chǎn)生高油表現(xiàn)型植物的方法，所述方法包括a)把植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入到植物的祖細胞中，該植物轉(zhuǎn)化載體含有編碼或互補于編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的HIO30.5多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列，和b)培育該轉(zhuǎn)化的祖細胞以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其中表達所述的多核苷酸序列，而且相對于對照植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物顯示改變的含油量表型。
7.通過權(quán)利要求6的方法獲得的植物。
8.權(quán)利要求7的植物，其選自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻和花生。
9.權(quán)利要求7的植物，其中的植物選自從所述組細胞生長而來的植物，從所述組細胞生長而來的植物的直接后代的植物以及從所述組細胞生長而來的植物的間接后代的植物。
10.產(chǎn)生具有高油表現(xiàn)型植物的方法，包括鑒定具有HIO30.5基因的等位基因的植物，所述HIO30.5基因的等位基因引起與缺少該等位基因且產(chǎn)生所述鑒定的植物的子代的植物相比含油量的增加，其中產(chǎn)生的子代遺傳該等位基因并且為高油表型。
11.權(quán)利要求10的方法，其使用候選基因/QTL法。
12.權(quán)利要求10的方法，其使用TILLING法。
全文摘要
本發(fā)明涉及由于HIO30.5核酸的改變的表達，而顯示改變的含油量表型的植物。本發(fā)明更進一步涉及生產(chǎn)具有改變的含油量表型的植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1893817SQ200480037898
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者喬納森·萊特納, 斯特凡妮·K·克倫德寧, 約翰·P·戴維斯 申請人:農(nóng)業(yè)經(jīng)濟有限責(zé)任公司