專利名稱：突變型p53基因反義表達載體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術，更具體地說是一種突變型p53基因反義表達載體及其制備方法。
背景技術：
研究己證實腫瘤是一種基因病，基因治療是對癌發(fā)生的根本原因的治療。p53屬抑癌基因，與DNA損傷的修復、細胞周期調控、細胞凋亡及抑制腫瘤形成有密切的關系，因而有細胞內“分子警察”之美譽。p53基因突變是人類腫瘤最常見的分子生物學事件，大約50％人類腫瘤具有p53基因的突變，且?guī)缀蹩梢娪诟鞣N類型的腫瘤細胞中。大量研究證實，突變型p53(mt-p53)不僅喪失野生型p53(wt-p53)所具有的抑癌功能，還具有與wt-p53形成異源寡聚體抑制wt-p53的功能，與p53家族成員p63、p73結合干擾它們的抑癌功能，實質上成了一種癌基因。另外還能使腫瘤細胞獲得抵抗各種抗癌藥物誘導凋亡的能力，使許多正在使用的抗癌藥物療效不理想。而且，有p53突變的腫瘤細胞生長旺盛，侵蝕性和轉移率高，患者預后差，是一種不利的預兆因素。因此阻斷mt-p53癌基因的表達成為抗癌研究的新領域。
通過人工方法化學合成或在生物體內合成的反義核酸是與靶基因具有互補序列的DNA或RNA片段，通過堿基互補配對原理與特定靶基因或mRNA形成雜交鏈，從而阻斷靶基因轉錄和翻譯，甚至導致靶基因編碼的功能蛋白被抑制。并且，反義RNA與靶mRNA形成雙鏈分子后，能使靶mRNA對RNA酶H或水解酶的敏感性增加，使其降解加速?？偠灾?。反義基因治療是從基因水平有選擇性地去控制、關閉或阻斷有害基因的表達，從而達到消除病害的目的。
到目前為止，對p53基因治療的研究一方面導入wt-p53進行基因替代治療，并且這方面的研究己進入臨床試驗階段，雖然結果顯示腫瘤細胞增殖減慢并發(fā)生細胞凋亡，但由于mt-p53基因的表達沒有受到阻滯，仍然有源源不斷的p53異常信號產(chǎn)生，而影響wt-p53的療效，2003年的《柳葉刀》雜志(THE LANCET Oncology Vol4 july2003 http//oncology.theiancet.com)已經(jīng)刊登了wt-p53進行基因替代治療卵巢癌失敗的報道。另一方面，有學者利用反義RNA技術將p53全長cDNA轉到含有突變型p53的結腸癌細胞株，用來阻斷mt-p53基因的表達，但正常的wt-p53并沒有得到補充，結果僅顯示癌細胞的增殖速度有所下降。這一方法的特點是導入其編碼基因，而不是反義RNA本身，其重組的反義表達載體分子量大，較難進入細胞，且操作復雜。

發(fā)明內容
本發(fā)明是解決現(xiàn)有技術存在的上述問題，實現(xiàn)能方便的制備個體性的即特異的反義RNA來有選擇地阻斷相對應的突變p53蛋白表達，為開拓新型反義抗癌藥物提供依據(jù)，而提供一種突變型p53基因反義表達載體及其制備方法。
本發(fā)明的任務是通過下述技術方案來實現(xiàn)的一種突變型p53基因反義表達載體，其該載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列GAATTCGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAA AGACCGGCGCACAGAGGAAG GAGGTCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACTGCAGGCATGCAAGGCT；并由此載體能夠轉錄出與此突變點特異性結合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達。
一種突變型p53基因反義表達載體的制備方法，以免疫組化篩選突變型p53細胞系、PCR-SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質粒載體的多克隆位點處，構建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。
所述的制備方法，其反義p53exon8’RNA是用EcoRI限制性內切酶處理重組質粒，使環(huán)狀重組質粒成線狀質粒，在SP6RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的反義RNA，p53第8外顯子的第62位密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有下列優(yōu)點1.通過構建重組反義表達載體，利用所采用的載體所具有的轉錄特性，在體外合成所需(特異性)的反義RNA分子，再將未經(jīng)修飾的反義RNA直接導入研究細胞內。所采用的方法是直接導入反義RNA本身，這樣所導入的RNA分子量小，只有100bp，較易進入細胞內。
2.應用這種體外轉錄系統(tǒng)可直接獲得能與靶mRNA互補的反義RNA分子，并且這種體外轉錄系統(tǒng)能合成較多量的產(chǎn)物，且隨時可重復操作，滿足需要的RNA量。只需注意操作規(guī)范，防止核糖核酸酶(Rnase)的污染導致失敗，便可簡單、方便地在各實驗室開展。


附圖為本發(fā)明的反義表達載體示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
一種突變型p53基因反義表達載體，其該載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列GAATTCGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAA AGACCGGCGCACAGAGGAAG GAGGTCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACTGCAGGCATGCAAGGCT；并由此載體能夠轉錄出與此突變點特異性結合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達。
一種突變型p53基因反義表達載體的制備方法，以免疫組化篩選突變型p53細胞系、PCR-SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質粒載體的多克隆位點處，構建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。
所述的制備方法，其反義p53exon8’RNA是用EcoRI限制性內切酶處理重組質粒，使環(huán)狀重組質粒成線狀質粒，在SP6RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的反義RNA，p53第8外顯子的第62位密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸。
參照附圖，本發(fā)明采用的pGEM3zf(+/-)質粒載體，在其多克隆位點兩側含有兩個反向的噬菌體啟動子T7RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶，在T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶存在時，識別相應啟動子，轉錄下游DNA序列，合成特異的RNA。這兩種噬菌體聚合酶都對自己的啟動子顯示出相當大的專一性，幾乎不能在其他啟動子的驅動下起始轉錄，同時也不能識別克隆DNA序列中的細菌、質粒或真核啟動子。因此噬菌體聚合酶能合成任何置于適當啟動子控制下的DNA的全長轉錄物。本研究把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質粒載體的多克隆位點處，構建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。然后用EcoRI限制性內切酶處理重組質粒，使環(huán)狀重組質粒成線狀質粒，在SP6RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的RNA，即反義D53exon8’RNA。而用HindIII限制性內切酶處理成的線狀質粒在T7RNA聚合酶作用下，合成與mt-p53exon8 mRNA同序列的RNA，即正義p53exon8’RNA。
一.構建特異性的突變型p53體外反義表達載體1.技術措施1.1細胞株、菌株、質粒載體(1)人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MA-231，天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子生物學實驗室常規(guī)液氮保存。
(2)E.colil JM109感受態(tài)大腸肝菌購自大連寶生物公司(3)質粒載體pGEM3zf(+/-)載體購自美國Promega公司1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基，Invitrogen，美國胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)，Invitrogen，美國0.25％胰蛋白酶，Hyclone，美國二甲基亞砜(DMSO)，Sigma，美國EDTA抗原修復液、山羊血清封閉液、生物素標記二抗工作液(Biotinylatedsecondary Antibody)、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(Streptavidin-HRP)、3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)及小鼠抗人p53單克隆抗體購自北京中山生物公司Taq酶，Promega，美國引物序列1

引物序列2

roche，瑞典丙烯酰胺、N’，N’-亞甲雙丙烯酰胺、N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)及去離子甲酰胺購自上海生物工程公司聚乙二醇(PEG)，胰化蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeastextract)購于上海生物工程公司EcoRI，PstI，HindIII限制性內切酶、T4DNA連接酶、SP6RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、rNTP Mixture、RNase Inhibitor、DNaseI(RNase free)購于大連寶生物公司焦碳酸二乙酯(DEPC)，Invitrogen，美國RNA純化試劑盒(RNeasy kit)，Qiagen，德國脂質體介導RNA轉染真核細胞試劑盒(TransMessengerTransfection Reagent)Qiagen，德國原位細胞死亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)Roche，瑞典3-(4，5-二甲基噻唑-2?；?-2，5二苯基四氮唑溴鹽(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)Sigma，美國1.3主要儀器CO2細胞培養(yǎng)箱，SANYO，日本。
超凈操作臺，PMV，德國。
PTC-200 PCR儀，MJ，美國。
垂直電泳漕，BioRad，美國。
DNA電泳槽(分鐘i gel electrophoresis system)Labnet，美國。
Labofuge 400R低溫高速離心機，Heraeus，德國。
核酸定量分析儀，GeneQuant，英國。
電泳膠攝影設備及分析軟件，Kodak，日本。
倒置顯微鏡Olympus 1X70及軟件拍攝系統(tǒng)Viewfinder 3.0，Olympus，日本。
酶標儀，Tecan，奧地利。
1.4突變型p53靶基因的確定1)乳腺癌細胞系的培養(yǎng)(1)乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231細胞的復蘇和培養(yǎng)從液氮中取出裝有MCF-7和MDA-MB-231細胞的凍存管，放入37℃水浴中輕搖至完全融化后，70％酒精擦拭管口，無菌吸管轉入15ml離心管；加5ml含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加2ml培養(yǎng)液吹打細胞團懸液，移入50ml培養(yǎng)瓶內并加入培養(yǎng)液至20ml，于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日鏡下觀察細胞，注意換液。
(2)傳代培養(yǎng)瓶中細胞長至匯合度為80％左右，進行細胞傳代；吸棄培養(yǎng)液，加入0.01M PBS 5ml洗滌2次，加入0.25％胰酶2ml，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內孵育2分鐘，鏡下觀察細胞呈懸浮時，加入含10％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液終止消化；吹打懸液后移至離心管內，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入培養(yǎng)液5ml，吹打后分裝入數(shù)個50ml培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液至20ml，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
(3)凍存?zhèn)溆卯敿毎洪L滿培養(yǎng)瓶，且生長狀態(tài)良好時，以0.01M PBS洗滌，0.25％胰酶消化懸液，加培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入含10％DMSO的培養(yǎng)液，將細胞吹打成懸液，分裝入凍存管，每管1ml；依次放入4℃半小時；-20℃1小時；-80℃24小時，最后放入液氮罐中保存，以備后用。
2)免疫組化法檢測突變型p53蛋白的表達(LsAB法)載玻片浸泡濃酸，蒸餾水清洗干凈，高壓滅菌，放入90mm細胞培養(yǎng)皿內；分別接種乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞生長至50％匯合度時取出載玻片，0.01MPBS洗滌2次，95％乙醇固定20分鐘，0.01M PBS洗滌1次；3％過氧化氫甲醇溶液室溫孵育10分鐘；90％乙醇5分鐘，80％乙醇5分鐘，0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；置于EDTA抗原修復液中于微波爐內進行微波抗原熱修復，溫度達98℃后維持10分鐘，取出置室溫冷卻30分鐘；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；加山羊血清封閉液50ul，置濕盒內，室溫孵育10分鐘；加入小鼠抗人p53單克隆抗體(1∶125)50ul，濕盒內，37℃孵育1小時；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；加入生物素標記大鼠抗小鼠工作液50ul，置濕盒內37℃孵育15分鐘；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，濕盒內37℃孵育15分鐘；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；DAB顯色劑顯色，鏡下觀察到足夠的棕黃色反應出現(xiàn)且背景清晰時，PBS沖洗中止反應；蘇木精細胞核覆染30-60秒鐘；蒸餾水終止反應；入鹽水酒精5秒鐘；氨水5秒鐘；蒸餾水沖洗后，80％、90％、100％乙醇各10分鐘梯度脫水；二甲苯處理20分鐘透明化，中性樹膠封片。
檢測結果乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231在載玻片上培養(yǎng)至匯合度50％時作免疫組化染色，MCF-7細胞核呈淺藍色著色(Fig.2A)，表示結果為陰性。MDA-MB-231細胞核呈棕色著色(Fig.2B)，結果為陽性。
3)PCR-SSCP法檢測p53外顯子突變(1)提取MCF-7和MDA-MB-231細胞的DNA培養(yǎng)瓶中細胞生長至80％匯合度時提取DNA，實驗前更換培養(yǎng)液。0.01M PBS洗滌1次，0.25％胰酶完全消化后轉入15ml離心管，1000rpm離心5分鐘，棄上清；10ml 0.01M PBS吹打細胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入TE 800ul，充分混勻后轉入1.5ml離心管內；加入10％SDS 100ul和10ug/ml蛋白酶K 100ul充分混勻后，50℃水浴3小時，不時混勻；冷卻至室溫，加入等量飽和酚，充分混勻；加入氯仿200ul充分混勻后，12000rpm離心10分鐘；吸出上清并轉移到另一離心管，加入等量異丙醇，充分混勻后室溫靜置10分鐘，12000rpm離心10分鐘；吸棄上清，用75％乙醇洗滌DNA沉淀，12000rpm離心1分鐘收集DNA沉淀；重復75％乙醇洗滌一次，吸棄乙醇，并于室溫下?lián)]發(fā)痕量乙醇；溶于TE 20-100ul，室溫溶解DNA12-24小時，取出5ul用于濃度、純度測定和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余保存于4℃。
(2)PCR擴增目的DNA片段按材料中引物序列1和下列反應體系、反應條件，分別以MCF-7和MDA-MB-231的DNA為模板擴增p53外顯子5、6、7、8。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小。
①PCR反應體系(終體積50ul)在0.6u l薄壁離心管中加入10 X PCR reaction buffer 5ul，4X dNTP(各2.5mM)4ul，Mgcl2(25mM)3ul，上下游引物1ul(約10pmol)，DNA模板2ul(約100ng/ul)，Taq酶0.5ul(2.5U/ul)和滅菌雙蒸水33.5ul。
②PCR反應條件94℃預變性5分鐘后，94℃，20秒鐘；60℃，30秒鐘；72℃，20秒鐘，30個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。4℃保存。
(3)SSCP-銀染法檢測基因突變①單鏈構向多態(tài)性分析(SSCP)制板后制備8％聚丙烯酰胺凝膠的反應液10ml，包括2.66ml 30％丙烯酰胺；2ml 5XTBE；0.073ml 10％過硫酸銨；5.27ml DDH2O。充分混勻加入4.5ul TEMED，充分混勻后迅速灌膠；室溫靜置2h后小心取出梳子，立即用1XTBE電泳緩沖液沖洗加樣孔，將膠置于電泳漕上，加1XTBE電泳緩沖液至浸過加樣孔。PCR產(chǎn)物變性后上樣。取5ul PCR擴增產(chǎn)物，加5ul變性上樣緩沖液于薄壁離心管內，15秒鐘低速離心混勻，置98℃水浴中變性10分鐘，即刻置于冰上10分鐘以上。取變性樣品8ul上樣于加樣孔。于室溫，50伏電壓，6-12mA條件電泳2h。
②銀染配制固定液/終止液30％乙醇和10％冰乙酸；染色液0.15％甲醛的AgNO3溶液(濃度1.0g/L)；顯影液30g/L Na2CO3，0.15％甲醛和200ug/L硫代硫酸鈉。仔細分離玻璃板間的凝膠，放入平皿；去離子水漂洗2次，加入固定液緩慢搖洗至甲苯晴藍顏色消失，棄固定液；去離子水漂洗3次；避光下染色液銀染30分鐘；棄染色液，去離子水漂洗5-10秒鐘；加入4℃預泠的顯影液顯色至條帶清楚；加入終止液終止反應5分鐘，去離子水漂洗2分鐘x2次；最后干膠保存。
4)p53第8外顯子PCR擴增產(chǎn)物測序PCR大量擴增MDA-MB-231細胞p53外顯子8300ul，條件同上。1.5％瓊脂糖凝膠100V電泳25分鐘，PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，送醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院測序驗證序列。結果與p53外顯子8 Gene bank參考序列[gi4731629]進行同源性比較。
1.5突變型p53 exon8反義表達載體的構建1)PCR擴增p53 exon8及產(chǎn)物的純化(1)PCR擴增p53 exon8按引物序列2、下列反應體系和反應條件，分別以MDA-MB-231的DNA為模板擴增p53外顯子8。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小。
①PCR反應體系(終體積50ul)在0.6ul薄壁離心管中加入10XPCR reaction buffer 5ul，4XdNTP(各2.5mM)4ul，Mgcl2(25mM)3ul，引物1ul(約10pmol)，DNA模板2ul(約100ng/ul)，Taq酶0.5ul(2.5U/ul)和滅菌雙蒸水33.5ul。
②PCR反應條件94℃預變性5分鐘后，94℃，20秒鐘；62℃，30秒鐘；72℃，20秒鐘，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。4℃保存。
(2)PCR擴增產(chǎn)物的純化PCR擴增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠，電壓100伏下電泳20分鐘。切下含有目的條帶的凝膠。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。切下含有目的條帶的凝膠置于1.5ml離心管內，夾碎。每100mg凝膠加入300ul凝膠溶解液，50℃孵育至凝膠溶解；加300ul異丙醇，混勻后室溫靜置15分鐘。吸附管套入收集管，并把溶膠混合物移入吸附管內，12000rpm離心1分鐘；棄流出液，加700ul洗滌液，12000rpm離心1分鐘；棄流出液，加200ul洗滌液，12000rpm離心1分鐘；吸附管套入1.5ml離心管，加TE 50ul，12000rpm離心1分鐘，收集洗出液；取5ul于1.5％瓊脂糖凝膠上鑒定特異性。
2)pGEM3zf(+/-)質粒的轉化提取(1)質粒轉化大腸肝菌存于-80℃的E.coli JM109感受態(tài)細胞置于冰中融化；將50ul的菌液移至滅菌預冷的1.5ml離心管內；加入pGEM3zf(+/-)質粒溶液20ul(濃度約10ng)；冰中放置1h；42℃水浴中放置45秒鐘；冰中放置5分鐘；加入37℃預溫好的SOC培養(yǎng)液，使終體積為1ml；空氣搖床37℃160rpm振蕩培養(yǎng)1h；取100ul菌液涂布于IPTG +xgel、Amp+LB平板；37℃ 300rpm振菌培養(yǎng)過夜。
(2)擴增質粒挑取孤立、飽滿、半徑約2mm的藍色菌落5個，放于5ml Amp+LB培養(yǎng)基中，空氣搖床37℃ 300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(3)SDS堿裂解法提取質粒取1.5ml培養(yǎng)物于1.5ml離心管內，4℃、12000rpm離心30秒鐘；吸干培養(yǎng)液，細菌沉淀重懸于500ul冰冷STE中，4℃、12000rpm離心30秒鐘；吸棄STE，細菌沉淀重懸于100ul冰預冷的堿裂解液I中，劇烈振蕩；加入200ul新配制的堿裂解液II，快速顛倒離心管5次，置于冰上；加入150ul冰預冷的堿裂解液III，反復顛倒數(shù)次，于冰上5分鐘；4℃、12000rpm離心5分鐘；上清轉移到新離心管中；加入等體積的酚∶氯仿(1∶1)，振蕩混合，4℃、12000rpm離心2分鐘，上清轉移到新離心管中；加2倍體積的異丙醇，振蕩混合，室溫放置10分鐘；4℃、12000rpm離心5分鐘；小心吸棄上清液，離心管倒置于紙巾上；加入1ml 70％乙醇，顛倒離心管數(shù)次洗滌核酸沉淀；4℃、12000rpm離心2分鐘；吸凈乙醇，重復70％乙醇洗滌，吸棄所有上清，室溫下使殘存的痕量乙醇揮發(fā)；加50ul含有RNA酶的無菌TE溶解沉淀；取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
(4)聚乙二醇(PEG)沉淀法純化質粒在50ul提取的pGEM3zf(+/-)質粒DNA中加入8ul 4mol/L Nacl和40ul 13％PEG 8000，置于冰上30分鐘；4℃、12000rpm離心15分鐘；吸去上清(小心，DNA呈透明狀，極易掉失)；用500ul 70％乙醇洗滌沉淀DNA；吸去乙醇，重復洗滌1次，吸干乙醇，并于室溫下放置使殘存的痕量乙醇揮發(fā)；用20-30ul無菌水溶解質粒DNA。
(5)提取純化的質粒用EcoRI，PstI內切酶酶切后電泳鑒定在滅菌的離心管中加入EcoRI內切酶1ul，10xH buffer2ul，質粒DNA 10ul(約2ug/ul)和滅菌雙蒸水7ul。于另一管中加入PstI內切酶1ul，10xH buffer 2ul，質粒DNA 10ul(約2ug/ul)和滅菌雙蒸水7ul。于37℃水浴中反應1小時，各加入10xLoading buffer 2ul以終止反應，各取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
3)pGEM3zf(+/-)質粒和p53 exon8PCR擴增產(chǎn)物的酶切及連接(1)pGEM3zf(+/-)質粒和p53 exon8PCR擴增產(chǎn)物的酶切pGEM3zf(+/-)質粒酶切體系EcoRI內切酶和PstI內切酶各1ul，10xH buffer2ul，質粒DNA 10ul(2ug)和滅菌雙蒸水6ul。p53exon8 PCR擴增產(chǎn)物的酶切體系同pGEM3zf(+/-)質粒酶切體系。兩反應體系于37℃水浴中反應1小時；各取5ul加入10xLoadingbuffer 1ul，于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，其余放于4℃?zhèn)溆谩?br> (2)酶切產(chǎn)物的純化PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，步驟同前。
(3)pGEM3zf(+/-)質粒和p53 exon8的接連在滅菌管中加入T4 DNA Ligase 1ul，10xT4 DNA LigaseBuffer 2.5ul，exon8 DNAlul(0.83pmol)，質粒DNAlul(0.83pmol)和滅菌雙蒸水19.5ul，于16℃水浴過夜；取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
4)反義表達載體pGEM3zf(+/-)p53exon8’的構建(重組質粒轉化、提取及酶切鑒定)(1)重組質粒轉化大腸肝菌方法同pGEM3zf(+/-)質粒轉化大腸肝菌。
(2)重組質粒的擴增在轉化有重組質粒的平板中挑取10個孤立、飽滿、半徑約2mm的白斑菌落克隆，分別放于5ml Amp+LB培養(yǎng)基中，空氣搖床37℃300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(3)SDS堿裂解法提取質粒步驟同pGEM3zf(+/-)質粒的提取。
(4)重組質粒的酶切鑒定在滅菌的離心管中加入EcoRI內切酶和PstI內切酶各1ul，10xHbuffer2ul，10個克隆提取的重組質粒DNA 10ul和滅菌雙蒸水6ul，37℃水浴反應1小時；分別取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
(5)重組質粒測序取2ml培養(yǎng)菌液送大連寶生物公司測序，驗證外源DNA成功插入。結果與p53外顯子8 Gene bank參考序列[gi4731629]進行同源性比較。
5)Mt-p53 exon8反義RNA的制備(體外轉錄)(1)線性模板DNA的制備①用于制備反義RNA的線性模板DNA的制備在滅菌的離心管中加入EcoRI內切酶1ul，10xH buffer 2ul，重組質粒DNA 10ul和滅菌雙蒸水7ul，37℃水浴反應1小時；取5ul1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
②用于制備正義RNA的線性模板DNA的制備在滅菌的離心管中加入HindIII內切酶1ul，10xM buffer2ul，重組質粒DNA 10ul，和滅菌雙蒸水7ul，37℃水浴反應1小時；取5ul1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
③線性模板DNA的純化酶切反應后的線性質粒加入等體積的酚∶氯仿(1∶1)，振蕩混勻；4℃、12000rpm離心5分鐘；移取上層的水相至新的離心管內，加入等體積的氯仿，振蕩混勻；4℃、12000rpm離心5分鐘；移取上層的水相至新的離心管內，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻；4℃、12000rpm離心10分鐘；棄上清，取500ul 70％乙醇洗滌沉淀；吸棄乙醇，重復洗滌1次，吸干乙醇，并于室溫下放置使殘存的痕量乙醇揮發(fā)；沉淀重懸于50ul無菌水。取500ul純化物于Microcon濾筒的樣品池中，室溫下，2200rpm離心15分鐘，取下樣品池倒置插入另一離心管中，室溫下，5000rpm離心2分鐘回收DNA，分別取2ul于分光光度儀上測濃度及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余保存4℃。
(2)反義RNA的制備①制備反義p53exon8’RNA在DEPC處理的離心管內依次加入10xSP6 RNA Polymerase Buffer2ul，100mM DTT 2ul，0.1％BSA 2ul，NTP Mixture(each 2.5mM)4ul，RNase Inhibitor(40U/ul)0.5ul，EcoRI內切酶處理的模板DNA1ul(0.5-lug/ul)，SP6 RNA Polymerase 1ul(50U)，加DEPC處理過的雙蒸水使終體積至20ul。38℃反應1小時；加入無Rnase的DNaseI 1ul，37℃反應15分鐘；取5ul電泳鑒定。
②制備正義p53exon8’RNA在DEPC處理的1.5ml離心管內依次加入10xT7 RNA PolymeraseBuffer 2ul，50mM DTT 2ul，NTP Mixture(each 2.5mM)4ul，RNaseInhibitor(40U/u l)0.5ul，HindIII內切酶處理的模板DNA1ul(0.5-1ug/ul)，T7 RNA Polymerase 1ul(50U)，加DEPC處理過的雙蒸水使終體積至20ul。37℃反應1小時；加入無Rnase的DNaseI 1ul，37℃反應15分鐘；取5ul電泳鑒定。
③RNA產(chǎn)物的純化利用RNA純化試劑盒(RNeasy kit)純化體外轉錄的RNA產(chǎn)物。取100ul RNA產(chǎn)物加入350ulβ-巰基乙醇-RLT緩沖液，混勻；加入250ul無水乙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置15分鐘；將全部液體轉移至純化柱中，純化柱套入收集管中，室溫靜置2分鐘；室溫，12000rpm離心5分鐘；棄去收集管中液體，向純化柱內加入500ul RPE緩沖液，室溫，12000rpm離心15秒鐘；棄去收集管中液體，向純化柱內加入500ul RPE緩沖液，室溫，12000rpm離心2分鐘；棄去收集管中液體，室溫，12000rpm離心1分鐘；將純化柱置于另一個新的1.5ml離心管中，加入30ul 60℃預熱的DEPC水；室溫靜置3分鐘，室溫，12000rpm離心1分鐘；加入30ul 60℃預熱的DEPC水；室溫靜置3分鐘，室溫，12000rpm離心1分鐘。取部分純化產(chǎn)物測濃度及電泳鑒定，其余保存-80℃。
2.結果判定2.1培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)MCF-7和MDA-MB-231人類乳腺癌上皮細胞株都是從轉移性乳腺癌病人的胸腔積液中分離出來的，MCF-7為單層貼壁生長的類圓形細胞，MDA-MB-231則為單層貼壁生長的梭形細胞。
2.2免疫染色結果MDA-MB-231人類乳腺癌上皮細胞株p53免疫染色陽性。
2.3PCR-SSCP法檢測及測序結果MDA-MB-231人類乳腺癌上皮細胞株p53第8外顯子在62位密碼子由AGA突變成AAA(氨基酸由精氨酸變成賴氨酸)。
2.4pGEM3zf(+/-)質粒和p53 exon8 PCR擴增產(chǎn)物的酶切及連接電泳結果經(jīng)EcoRI和PstI內切酶共處理的pGEM3zf(+/-)質粒載體和p53 exon8 PCR擴增產(chǎn)物，電泳可見在3000bp和100bp處有特異性條帶。經(jīng)酶切處理后的pGEM3zf(+/-)質粒載體和p53 exon8在T4 DNA連接酶的作用下形成的重組質粒電泳條帶，在大于3000bp處有特異性條帶。在只有pGEM3zf(+/-)質粒載體的反應體系中，pGEM3zf(+/-)質粒載體自連接成大于6000bp的產(chǎn)物。
2.5重組質粒轉化、提取及酶切鑒定結果pGEM3zf(+/-)質粒載體LacZ基因編碼β-半乳糖苷酶的多克隆位點，在含有X-gal和IPTG的瓊脂培養(yǎng)基，通過α互補形成藍色菌落。外源p53 exon8 DNA片段插入到多克隆位點，產(chǎn)生不具有α互補功能的片段，帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。挑選10個白色菌落，經(jīng)SDS堿裂解法提取質粒，并用EcoRI+PstI雙酶切鑒定，10個克隆均有pGEM3zf(+/-)(3100bp)和p53 exon8(96bp)目的片段切出，證明反義表達載體pGEM3zf(+/-)p53exon8’構建成功。
2.6重組質粒的測序結果及與參考序列的同源性進行比較結果在Gene bank內應用Blast軟件對測序結果進行p53第8外顯子序列同源性比較，結果與第一部分研究的p53第8外顯子測序結果一致，密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸，證明重組質粒pGEM3zf(+/-)p53exon8’構建成功。
2.7Mt-p53exon8反義RNA的體外轉錄結果重組質粒DGEM3zf(+/-)p53exon8’經(jīng)EcoRI內切酶或HindIII內切酶處理后成線性質粒，電泳呈一條帶。未經(jīng)酶切處理的質粒是環(huán)狀和線狀共存，電泳呈兩條帶。以mt-p53exon8基因片段為轉錄模板，利用T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶，誘導重組質粒上的T7啟動子和SP6啟動子合成正義p53exon8’RNA和反義p53exon8’RNA，體外轉錄合成的RNA在紫外分光儀測定濃度及分析OD260/OD280。
二.反義核酸特異性封閉p53基因突變點1.技術措施1.1三種方法介導ASp53exon8’RNA轉染MDA-MB-231①分組反義RNA直接加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液內轉染細胞設為無血清細胞培養(yǎng)液組；加入生理鹽水內轉染細胞設為生理鹽水組；利用脂質體介導轉染設為脂質體介導組。每組再設空白對照組，轉染正義RNA對照組和轉染反義RNA的實驗組。
②轉染前細胞的準備MDA-MB-231計數(shù)至5×104/ml種植到24孔板，每孔1ml。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時。
③制備RNA轉染同一天依照上述方法體外轉錄方案制備Sp53exon8’RNA和ASp53exon8’RNA，純化后測濃度和用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
④無血清細胞培養(yǎng)液組轉染步驟移出培養(yǎng)板內的培養(yǎng)液，DEPC處理的0.01M PBS洗滌細胞2次，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液200ul的為空白對照組；加入0.8ug Sp53exon8’RNA配制的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液200ul的為正義RNA對照組；加入0.8ugASp53exon8’RNA配制的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液200ul的為實驗組。CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3小時后移出溶液，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
⑤生理鹽水組轉染步驟移出培養(yǎng)板內的培養(yǎng)液，DEPC處理的0.01M PBS洗滌細胞2次，加入DEPC處理的生理鹽水200ul的為空白對照組；加入0.8ug Sp53exon8’RNA配制的生理鹽水200ul的為正義RNA對照組；加入0.8ug ASp53exon8’RNA配制的生理鹽水200ul的為實驗組。CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1小時后移出溶液，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
⑥脂質體介導組轉染步驟(依照RNA轉染真核細胞試劑盒操作)分別在DEPC處理過的3個離心管中加入Enhaneer R1.6ul和BufferEC-R(根據(jù)轉染的RNA濃度調制，使Enhancer R、Buffer EC-R和RNA溶液的終體積為100ul)，充分混勻；加入0.8ug Sp53exon8’RNA(正義RNA對照組)和0.8ug ASp53exon8’RNA(實驗組)，混勻后室溫靜置5分鐘；加入TransMessenger transfection reagent(含陽離子脂質體)2ul，混勻后室溫靜置10分鐘，加無血清RPMI-1640培養(yǎng)液100ul后即轉染細胞。3h后移出轉染溶液，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1次，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
1.2細胞生長實驗細胞于轉染后的24小時(1天)、48小時(2天)、72小時(3天)、96小時(4天)和120小時(5天)計數(shù)，并計算生長抑制率。方法如下吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，加入0.25％胰酶消化，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2分鐘，鏡下觀察細胞變圓并將近脫壁時，加入培養(yǎng)液終止消化，吸管移至無菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入1ml培養(yǎng)液，用吸管吹打細胞制成單個細胞懸液。吸出40ul作計數(shù)用，其余放回培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。在顯微鏡100倍放大倍數(shù)下計數(shù)血細胞計數(shù)板10個大方格中的細胞，重復計數(shù)一次。細胞總數(shù)(個/ml)＝細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×103。生長抑制率＝[(Nnc-Na)-(Nnc-Ns)]/(Nnc-No)×100％。No開始接種時的細胞數(shù)，Na培養(yǎng)N天后轉染ASp53exon8’RNA的細胞數(shù)，NsN天之后轉染Sp53exon8’RNA對照組的細胞數(shù)，NncN天之后空白對照組的細胞數(shù)。
1.3MTT比色法測定細胞生長活性MDA-MB-231細胞計數(shù)至3×105/ml種植到96孔板，每孔100ul。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時，依照2.2.31)3種方法轉染細胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時；加20ul 0.5％MTT溶液于各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4小時；去除培養(yǎng)孔內全部液體，每孔加入150ulDMSO，充分振蕩；在酶標儀上測定570nm波長的吸光度值(A值)，取平均值代表細胞生長活性。結果于CS2000統(tǒng)計軟件行t檢驗分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
1.4TUNEL法檢測細胞凋亡依照2.2.31)三種方法轉染MDA-MB-231細胞，轉染后計數(shù)并制成7×104/ml細胞懸液，取100ul于載玻片上，培養(yǎng)2h后加培養(yǎng)液至載玻片全部被浸在培養(yǎng)液中；放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至轉染后48h；PBS沖洗2次，4％多聚甲醛室溫固定30分鐘；PBS沖洗1次，0.3％H2O2甲醇溶液室溫孵育30分鐘；PBS沖洗1次，0.1％TritonX-100溶液冰浴中孵育2分鐘；PBS沖洗3分鐘×2次，滴加50ul TUNEL反應混合液(含末端脫氧核糖核酸轉移酶)，37℃、濕盒中孵育60分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘，滴加50ul轉化劑-POD，37℃、濕盒中孵育30分鐘；PBS沖洗3分鐘×3次，加入50ul DAB，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗，蘇木精覆染，封片。
1.5免疫組化法檢測突變P53蛋白表達三種方法轉染的MDA-MB-231細胞進行計數(shù)，制成7×104/ml細胞懸液，取100ul于載玻片上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時后加培養(yǎng)液至載玻片全部被浸在培養(yǎng)液中；培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至轉染后48小時進行免疫組化染色檢測突變型p53蛋白表達情況，方法同上。
1.6免疫組化法檢測脂質體介導ASp53exon8’RNA轉染細胞后不同時間P53蛋白的表達依照上述方法RNA轉染真核細胞試劑盒轉染MDA-MB-231細胞，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3小時后換入10％FBS RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時。制成7×104/ml細胞懸液，取100ul于載玻片上，培養(yǎng)2小時后加培養(yǎng)液至載玻片全部被浸在培養(yǎng)液中；繼續(xù)培養(yǎng)至轉染后12小時，24小時，48小時，72小時并分別做p53免疫組化染色檢測p53蛋白表達情況，p53免疫組化方法同上。計算低倍鏡下隨機10個視野中100個細胞的染色結果，細胞核棕色染色為陽性細胞(++)，示mt-p53蛋白的表達未受阻斷；淺棕色染色為弱陽性細胞(+)，示部分mt-p53蛋白的表達受到阻斷；淺藍色染色為陰性細胞(-)，示mt-p53蛋白的表達被完全阻斷。計算結果用CS2000統(tǒng)計軟件進行方差分析。
2.結果判定2.1轉染細胞的生長狀態(tài)細胞在含RNA的生理鹽水中培養(yǎng)1小時后，大部分細胞變圓，但未從培養(yǎng)板上脫離。換入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)3小時后，細胞形態(tài)恢復。細胞在含RNA的無血清培養(yǎng)液和脂質體介導的轉染溶液中孵育3小時，生長狀態(tài)良好。脂質體介導轉染的細胞在10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，空白對照組細胞生長狀態(tài)良好，但在轉染Sp53exon8’RNA和ASp53exon8’RNA的兩組培養(yǎng)板內可見部分細胞殘骸存在。
2.2轉染細胞的生長抑制率MDA-MB-231細胞經(jīng)三種方法轉染后，在相同的細胞培養(yǎng)(含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng))條件下，轉染24小時始計數(shù)，連續(xù)計數(shù)5天，并按細胞生長實驗中的公式計算細胞生長抑制率。各組用ASp53exon8’RNA處理的細胞于轉染后48小時比各自對照組生長緩慢，并于48小時時生長抑制率最高。無血清培養(yǎng)液組48小時生長抑制率為28.90％，脂質介導組48小時生長抑制率為21.65％，生理鹽水組為31.80％，隨后生長抑制率降低。
2.3MTT吸收值經(jīng)ASp53exon8’RNA處理過的實驗細胞于48小時作MTT吸收實驗，MTT吸收值均較空白組和對照組細胞吸收值減弱，無血清培養(yǎng)液組中空白對照組的吸收均值為1.178±0.015，Sp53exon8’RNA對照組為1.163±0.034，ASp53exon8’RNA實驗組為1.053±0.057。脂質體介導組中空白對照組的吸收均值為1.161±0.029，S p53exon8’RNA對照組為0.798±0.074，ASp53exon8’RNA實驗組為0.718±0.011。生理鹽水組中空白對照組的吸收值為1.170±0.011，Sp53exon8’RNA對照組為1.156±0.017，ASp53exon8’RNA實驗組為1.003±0.077。實驗組與空白組和對照組相比較，有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
2.4TUNEL法檢測細胞凋亡結果經(jīng)ASp53exon8’RNA處理的實驗組細胞，細胞核內可見被染成棕色月牙狀的凋亡小體，其中無血清培養(yǎng)液組和生理鹽水組較脂質介導組顯著。另外，凋亡小體在兩個對照組的部分細胞內也被同時觀察到。
2.5轉染細胞的p53免疫組化染色結果經(jīng)三種方法介導的細胞轉染，分別于48小時后作p53免疫組化染色，結果見無血清培養(yǎng)液組和生理鹽水組中轉染ASp53exon8’RNA的實驗細胞，部分細胞核為淺藍色染色，部分細胞核呈棕色染色，還有部分細胞核呈淺棕色染色。無血清培養(yǎng)液組中的空白對照組和轉染Sp53exon8’RNA對照組及生理鹽水組中的空白對照組的細胞核呈棕色染色；脂質介導組轉染ASp53exon8′RNA的實驗細胞大部分為淺棕色染色，部分呈淺藍色染色，小部分細胞呈棕色染色?？瞻讓φ战M和轉染Sp53exon8’RNA對照組細胞都呈棕色染色。脂質體介導組與其余兩組比較，淺藍色和淺棕色核著色的細胞數(shù)明顯多過無血清培養(yǎng)液組和生理鹽水組，而呈棕色著色的細胞數(shù)少于其他兩組。
2.6脂質體介導ASp53exon8’RNA轉染細胞后的p53免疫組化染色結果細胞通過脂質體介導轉染ASp53exon8’RNA后12h，24h，48h和72小時作p53免疫組化染色，可見12小時，24小時和48小時的實驗組細胞，以細胞核呈淺藍色和淺棕色染色為主。而72小時的實驗組細胞均呈棕色染色。隨機計算低倍鏡下10個視野中100個細胞的染色結果，棕色著色的細胞為陽性細胞，示p53蛋白合成沒被阻斷。淺棕色著色細胞為弱陽性細胞，示部分p53蛋白合成被阻斷。淺藍色著色細胞為陰性細胞，示p53蛋白合成被完全阻斷。
計算結果轉染ASp53exon8’RNA的實驗組細胞，12小時沒被阻斷細胞占34％，部分阻斷細胞占42％，完全阻斷細胞占25％。24小時沒被阻斷細胞率占23％，部分阻斷細胞占27％，完全阻斷細胞率占48％。48小時沒被阻斷細胞率占30％，部分阻斷細胞占52％，完全阻斷細胞占17％。
結果經(jīng)方差分析統(tǒng)計，示免疫組化結果與時間有密切關系(p＜0.001)。細胞轉染ASp53exon8’RNA 12小時開始，p53表達即可被抑制，24小時時抑制作用最強，陰性細胞從25％增高到49％，隨后抑制作用逐漸下降，至72小時完全消失。
權利要求
1.一種突變型p53基因反義表達載體，其特征在于該載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列GAATTCGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAA AGACCGGCGCACAGAGGAAG GAGGTCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACTGCAGGCATGCAAGGCT；并由此載體能夠轉錄出與此突變點特異性結合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達。
2.一種突變型p53基因反義表達載體的制備方法，其特征在于以免疫組化篩選突變型p53細胞系、PCR-SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質粒載體的多克隆位點處，構建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于反義p53exon8’RNA是用EcoRI限制性內切酶處理重組載體質粒，使環(huán)狀重組質粒成線狀質粒，在SP6 RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的反義RNA，p53第8外顯子的第62位密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種突變型p53基因反義表達載體及其制備方法，屬于基因工程技術。本發(fā)明載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列，并能夠轉錄出與此突變點特異性結合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達；其制備方法是采用免疫組化篩選突變型p53細胞系、PCR－SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/－)質粒載體的多克隆位點處，構建pGEM3zf(+/－)p53exon8’重組載體。這樣制備的反義RNA被直接導入研究細胞內，因為是直接導入反義RNA本身，所導入的RNA分子量小，較易進入細胞內，操作簡單；由于體外轉錄系統(tǒng)能合成較多量的產(chǎn)物，可隨時重復操作，滿足需要的RNA量。
文檔編號C12N15/63GK1796562SQ20041009401
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權日2004年12月24日
發(fā)明者付麗, 許少峰, 張斌, 張媛媛, 馮玉海 申請人:天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院