專利名稱：乳酸乳球菌的食品級載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸菌載體，尤其涉及一種乳酸乳球菌ΔthyA突變株的食品級載體pSH91。
背景技術(shù)：
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱，它包括乳酸球菌，乳酸桿菌，雙歧桿菌，腸球菌等二十幾個屬。乳酸菌是在食品中應(yīng)用最廣泛的重要工業(yè)菌株，很早就被人類用于制作泡菜、醬油，生產(chǎn)面包、奶酪、酸奶和其它奶制品；乳酸菌也存在于動物包括人類的腸道中，因而被公認(rèn)為是安全的食品級微生物(generally regarded as safe，GRAS)。越來越多的研究表明，乳酸菌的某些菌株對人類的健康有重要促進(jìn)作用，包括生物學(xué)屏障、合成多種維生素、控制內(nèi)毒素血癥、抑制腐敗細(xì)菌在腸道中腐化、預(yù)防和治療抗生素相關(guān)性腹瀉、抗腫瘤、抗變應(yīng)原、抗感染、降低膽固醇等。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)為兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，該菌是乳球菌屬(Lactococcus)中最重要和最典型的一個種，通常被作為乳酸菌的模式菌(model LAB)。目前乳酸乳球菌IL1403菌株的全基因組序列測定已經(jīng)完成。人們對乳酸菌的興趣除染色體外，還包括染色體以外的遺傳物質(zhì)，即質(zhì)粒和噬菌體。乳酸乳球菌中存在大量的染色體外物質(zhì)，為其分子遺傳學(xué)研究、分子生物學(xué)研究和基因載體系統(tǒng)的發(fā)展提供了極好的材料，比如可發(fā)展質(zhì)粒載體，誘變無質(zhì)粒菌株。由于乳酸乳球菌易于培養(yǎng)，生長迅速，易于進(jìn)行實驗室操作，為厭氧菌、革蘭氏陽性菌的生理生化研究提供了簡單代謝的模式菌，而且由乳酸乳球菌發(fā)展起來的許多遺傳學(xué)工具，不需改進(jìn)或稍加改進(jìn)后便可用于其它乳酸菌。乳酸乳球菌的質(zhì)粒復(fù)制子可以在許多其它乳酸菌中發(fā)揮作用。近年來，隨著乳酸乳球菌內(nèi)源性質(zhì)粒的消除和電轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立以及乳酸乳球菌中表達(dá)信號的分離和克隆，已建立和發(fā)展了一系列具有不同用途的乳酸菌載體和受體系統(tǒng)。這些載體包括基本的克隆載體，含啟動子、終止子和分泌信號等的表達(dá)載體以及各類整合載體。
但是，傳統(tǒng)的乳酸菌載體都帶有一個或多個編碼特定抗生素(如紅霉素、氯霉素)抗性的基因。雖然這為遺傳操作時保存一定的選擇壓力，對載體的選擇作用是有效的。但將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內(nèi)，由于抗性因子的轉(zhuǎn)移，將帶來生物安全性的嚴(yán)重后果。因此，這一類載體離實際應(yīng)用還有一定的距離。為了防止使用抗生素抗性標(biāo)記所引起的危害，最有效的辦法是使用對人體和環(huán)境安全的食品級選擇標(biāo)記取代抗生素抗性標(biāo)記，建立食品級選擇標(biāo)記的載體，這也是近年來乳酸菌基因表達(dá)載體和受體系統(tǒng)研究領(lǐng)域中的前沿和熱點(diǎn)。乳酸菌食品級基因表達(dá)系統(tǒng)必須具備如下條件(1)載體必須是食品級的，不得含有非食品級功能性DNA片段，如抗生素抗性基因；(2)表達(dá)宿主必須是安全、特性清楚而穩(wěn)定的食品級微生物，如乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌及其它已在食品工業(yè)中得到長期而廣泛應(yīng)用的菌株。必須用先進(jìn)的分類方法去鑒定宿主菌，用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)技術(shù)，如DNA序列分析、PCR擴(kuò)增、DNA雜交等手段去確認(rèn)表達(dá)宿主的遺傳組成。此外，食品級系統(tǒng)的宿主菌在生產(chǎn)狀況下，在食品中和進(jìn)入人體后必須是足夠穩(wěn)定的；(3)誘導(dǎo)物必須是食品級的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳鏈菌肽等可被人類食用的物質(zhì)。
目前已經(jīng)成功地獲得了許多可在乳酸乳球菌及其它乳酸菌中使用的食品級標(biāo)記基因，所有這些標(biāo)記基因都來源于乳酸菌或其它在食品中有長期安全使用史的細(xì)菌。把這些標(biāo)記基因克隆到乳酸菌來源的質(zhì)粒或整合到染色體中，即可建立起食品級載體系統(tǒng)。用于乳酸菌食品級載體系統(tǒng)的食品級選擇標(biāo)記主要可分為三類(1)細(xì)菌代謝或生物表型的改變?nèi)缣穷惱脴?biāo)記；(2)利用細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)；(3)細(xì)菌素抗性或其它抗性標(biāo)記。但各種不同的選擇標(biāo)記都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，特別是有的選擇性標(biāo)記存在選擇壓力局限問題。
細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的原理，即細(xì)菌的某些基因如管家基因編碼的產(chǎn)物催化細(xì)菌的基本代謝反應(yīng)，其突變或缺失后，導(dǎo)致細(xì)菌在外界環(huán)境中或基本培養(yǎng)基上不能正常生長，而需要相應(yīng)的底物存在，稱為細(xì)菌的營養(yǎng)缺陷型(auxotrophy)。營養(yǎng)缺陷型菌株在其質(zhì)粒上克隆入同源或異源的、功能完整的基因后，可使受體菌恢復(fù)原始的生物表型。一般來講，管家基因缺陷型菌株應(yīng)該滿足兩點(diǎn)要求(1)基因缺失或突變的位點(diǎn)是明確的，理論上不會發(fā)生回復(fù)突變；(2)缺陷型菌株在生長環(huán)境中所需的營養(yǎng)物質(zhì)的含量很低，不足以滿足其生長。
胸苷酸合成酶(thymidylate synthase)由thyA基因編碼，在生物體內(nèi)的DNA合成中起關(guān)鍵作用。它催化dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的甲基化，同時使5，10-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，8-二氫葉酸。胸苷酸合成酶缺陷的突變株依靠外源性胸腺嘧啶(thymine)或胸腺嘧啶核苷(thymidine)進(jìn)行DNA的生物合成，如果突變株生存的環(huán)境不能提供足夠濃度的胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，突變株將因DNA合成受阻而停止生長或死亡。一般地，將細(xì)菌涂于含thymine或thymidine和抗葉酸的藥物如三甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、氨基喋呤(aminopterin)或氨甲喋呤(amethopterin)的培養(yǎng)基上，可以篩選出thyA基因突變的菌株。此外還可以通過同源重組的方法獲得thyA基因缺失突變株。某些菌株的thyA基因可以對同種屬或不同種屬的thyA基因缺陷的菌株提供功能互補(bǔ)作用，使thyA基因缺陷株恢復(fù)野生型表型。目前已有不少文獻(xiàn)報道以thyA基因為基礎(chǔ)建立的染色體-質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)(chromosome-plasmidbalanced lethal system)[Morona R，et al.Gene.1991；107(1)139-144.Fu X，etal.Microbiol.Immunol.2000；44(7)551-556]。這些研究結(jié)果為以thyA基因作為選擇標(biāo)記取代抗生素抗性標(biāo)記，建立食品級載體系統(tǒng)提供了重要的依據(jù)。選擇thyA基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建乳酸乳球菌的食品級載體系統(tǒng)，目前國內(nèi)外尚無這方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有產(chǎn)品存在的上述缺點(diǎn)，而提供一種乳酸乳球菌的食品級載體，選擇使用對人體和環(huán)境安全的食品級選擇標(biāo)記取代抗生素抗性標(biāo)記，建立食品級選擇標(biāo)記的載體，克服以抗生素抗性為選擇壓力的基因表達(dá)系統(tǒng)存在的缺陷。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明構(gòu)建了一種乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，其包括來自乳酸乳球菌MG1363的rhA基因選擇標(biāo)記；來自乳酸乳球菌乳脂亞種Wg2隱性質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子(RepA、ORF C和ori+)和來自pUC18質(zhì)粒的全部多克隆位點(diǎn)即HindIII、SphI、PstI、SalI、XbaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRI。
本發(fā)明構(gòu)建的食品級載體pSH91具有互補(bǔ)ΔthyA突變株乳酸乳球菌MBP71菌株的功能。其中乳酸乳球菌MBP71菌株在改良SA培養(yǎng)基上不生長，而在含有胸苷酸的改良SA培養(yǎng)基上恢復(fù)生長。將食品級載體pSH91導(dǎo)入乳酸乳球菌MBP71菌株后，MBP71/pSH91菌株恢復(fù)在改良SA培養(yǎng)基上的生長能力。
本發(fā)明構(gòu)建的食品級載體pSH91具有表6中所示的pSH91載體核苷酸序列的堿基序列。
本發(fā)明構(gòu)建的乳酸乳球菌的食品級載體pSH91，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號為CGMCCNO1253。
本發(fā)明所述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于食品級選擇標(biāo)記thyA基因來自乳酸乳球菌MG1363菌株，并通過PCR方法獲得的。
本發(fā)明所述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于多克隆位點(diǎn)來自pUC18質(zhì)粒。
本發(fā)明所述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)來自乳酸乳球菌乳脂亞種Wg2的隱性質(zhì)粒pWV01，并通過PCR方法獲得的。
本發(fā)明乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于，(1)選擇和獲取食品級選擇標(biāo)記thyA基因；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18:thyA；(3)獲取MCS-thyA片段；(4)獲取質(zhì)粒復(fù)制區(qū)Rep片段；(5)構(gòu)建食品級載體pSH91。
前述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其中所述選擇和獲取食品級選擇標(biāo)記thyA基因是根據(jù)乳酸乳球菌MG1363的thyA基因序列設(shè)計特異性引物對(1)和(2)，通過PCR擴(kuò)增獲得的；所述構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18:thyA是thyA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindIII限制性內(nèi)切酶酶切后克隆至pUC18質(zhì)粒后獲得的；所述獲取MCS-thyA片段是以重組質(zhì)粒pUC18:thyA為模板，采用引物對(3)和(4)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的；所述獲取質(zhì)粒復(fù)制區(qū)Rep片段，是根據(jù)質(zhì)粒pWV01序列，以質(zhì)粒pWV01的衍生質(zhì)粒pGK12為模板，采用引物對(5)和(6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的；所述構(gòu)建食品級載體pSH91是采用PCR方法將MCS-thyA片段與Rep片段進(jìn)行連接而成，即采用DNA膠回收試劑盒分別回收MCS-thyA PCR擴(kuò)增片段和Rep PCR擴(kuò)增片段；以回收純化的MCS-thyA和Rep片段為模板，采用引物對(7)和(8)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；取擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，加入新引物對(9)和(10)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，通過兩輪PCR擴(kuò)增使MCS-thyA和Rep片段被連接成環(huán)狀，取第二輪PCR擴(kuò)增混合物以CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌X51菌株，在CBT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化子，從平板上隨機(jī)挑取部分菌落提取質(zhì)粒鑒定，并將獲得的質(zhì)粒命名為pSH91。
前述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其中所述引物1為5′-CGAAGCTTTTGGGAAATACTATTGAA-3′，其含有HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物2為5′-CGAAGCTTTAGATTAATTTAAATTGC-3′，其含有HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；所述引物3為5′-ATGACCATGATTACGAAT-3′，引物4為5′-TTGGGAAATACTATTGAA-3′；所述引物5為5′-TGAAAGCCGATGACTGAATG-3′，引物6為5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′；所述引物7為5′-ATGACCATGATTACGAAT-3′，引物8為5′-TCATGGTCATGAAAGCCGATGACTGAATG-3′；所述引物9為5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′，引物10為5′-CGAAGGGGGTTTGGGAAATACTATTGAA-3′。
四

圖1為本發(fā)明pUC18:thyA質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2為本發(fā)明pSH91質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖3為本發(fā)明Lactococcus lactis MG1363 thyA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖中泳道M為DNA Marker；泳道1-2為thyA基因PCR產(chǎn)物。
圖4為本發(fā)明pUC18:thyA重組質(zhì)粒鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖中泳道M為DNAMarker、泳道1為pUC18、泳道2為pUC18:thyA、泳道3為pUC18質(zhì)粒HindIII酶切產(chǎn)物、泳道4為pUC18:thyA重組質(zhì)粒HindIII酶切產(chǎn)物、泳道5為thyA基因PCR產(chǎn)物。
圖5為本發(fā)明MCS-thyA片段和Rep片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖中泳道M為DNA Marker、泳道1為MCS-thyA片段PCR產(chǎn)物、泳道2為Rep片段PCR產(chǎn)物。
圖6為本發(fā)明pSH91質(zhì)粒酶切分析的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖中泳道M為DNAMarker；泳道1為pSH91質(zhì)粒；泳道2為pSH91質(zhì)粒EcoRI酶切產(chǎn)物；泳道3為pSH91質(zhì)粒SacI酶切產(chǎn)物；泳道4為pSH91質(zhì)粒KpnI酶切產(chǎn)物；泳道5為pSH91質(zhì)粒SmaI酶切產(chǎn)物；泳道6為pSH91質(zhì)粒BamHI酶切產(chǎn)物；泳道7為pSH91質(zhì)粒XbaI酶切產(chǎn)物；泳道8為pSH91質(zhì)粒SalI酶切產(chǎn)物；泳道9為pSH91質(zhì)粒PstI酶切產(chǎn)物；泳道10為pSH91質(zhì)粒SphI酶切產(chǎn)物；泳道11為pSH91質(zhì)粒HindIII酶切產(chǎn)物。
圖7為本發(fā)明pSH91質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Lactococcus lactis MBP71的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖中泳道M為DNA Marker；泳道1為pSH91(陽性對照)；泳道2為MBP71(陰性對照)泳道3～5為MBP71/pSH91。
圖8為本發(fā)明pSH91質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Lactococcus lactis MBP71的Southern blot結(jié)果圖。
圖中泳道1為pSH91(陽性對照)；泳道2為MBP71(陰性對照)；泳道3～5為MBP71/pSH91。
圖9A為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA+thymidine培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。
圖9B為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。
圖中A為L.lactis MBP71、B為L.lactis CHCC373、C為L.lactisMBP71/pSH91。
圖10為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的生長曲線(OD600)圖。
圖11為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在GM17培養(yǎng)基中的生長曲線(OD600)圖。
圖12為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的酸化能力(pH值)圖。
圖13為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在GM17中的酸化能力(pH值)圖。
五具體實施例方式
近年來，基因工程疫苗的研制取得了飛速的發(fā)展，但還存在一些問題，即目前重組的細(xì)菌性保護(hù)性抗原的表達(dá)受體主要是活的、減毒的病原菌，其免疫效果有賴于所用受體菌的繁殖能力、侵襲能力、存活時間及相應(yīng)抗原基因的表達(dá)水平，疫苗的免疫保護(hù)力往往與菌株的殘余毒力成正比。所以人們一直在試圖尋找能良好地表達(dá)外源性抗原基因且安全的菌株。理想的可直接食用的微生物菌種應(yīng)該具備1、不會使人和動物致病，不與病原微生物產(chǎn)生雜交種；2、在體內(nèi)外易于繁殖，在體外繁殖速度快；3、在低pH值和膽汁中能夠存活，并能植入腸粘膜；4、在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生乳酸和過氧化氫等物質(zhì)；5、能合成對沙門氏菌、葡萄球菌、致病性大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌等腸道致病菌的抑制物而不影響自己的活性；6、經(jīng)加工后活菌存活率高，混入飼料后高溫下穩(wěn)定性好；7、最好來自人或動物自身腸道中；8、有利于促進(jìn)宿主的生長發(fā)育及提高抗病能力。乳酸菌很早就被人類利用，被認(rèn)為是安全的食品級微生物，其本身具有重要的健康促進(jìn)作用及非特異性的抗感染能力，因此目前以乳酸菌為疫苗載體已引起人們的極大興趣。
但是，已有報道的疫苗表達(dá)載體系統(tǒng)均以抗生素抗性作為外源性基因穩(wěn)定表達(dá)的壓力。以抗生素抗性為選擇壓力的基因表達(dá)系統(tǒng)存在著以下缺陷1、在生產(chǎn)中需加入抗生素，以確保外源性基因的穩(wěn)定表達(dá)，使生產(chǎn)成本增加；2、在缺乏抗生素的情況下質(zhì)粒容易丟失；3、臨床上，尤其是應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的菌株，如果含有位于質(zhì)粒上的耐藥性基因，有可能會造成耐藥性基因的擴(kuò)散，增加了向環(huán)境傳播的可能性。近年來，人們選擇使用對人體和環(huán)境安全的食品級選擇標(biāo)記取代抗生素抗性標(biāo)記，建立食品級選擇標(biāo)記的載體。食品級載體的優(yōu)點(diǎn)是不需要外加抗生素進(jìn)行選擇，因此具有重要的應(yīng)用價值。目前建立的食品級載體有1、糖類利用標(biāo)記，如Platteeuw等利用lacF基因作為選擇標(biāo)記構(gòu)建食品級載體(Platteeuw C，et al.Appl.Environ.Microbiol.1996；621008-1013)；2、細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)，如Bron等建立的以alr基因為選擇標(biāo)記的載體pGIP011和pGIP012(Bron PA，et al.Appl.Environ.Microbiol.2002；685663-5670)；3、細(xì)菌素抗性標(biāo)記，如以nisin抗性基因nsr為選擇標(biāo)記的載體pVS40、pFM011和pFK012(Froseth BR，et al.Appl.Environ.Microbiol.1988；542136-2139；von Wright A，et al.Appl.Environ.Microbiol.1990；562029-2035)。
本發(fā)明選擇胸苷酸合成酶(thymidylate synthase)thyA基因為食品級選擇標(biāo)記，thyA基因在生物體內(nèi)的DNA合成中起關(guān)鍵作用。它催化dUMP(脫氧尿嘧啶單核苷酸)轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP(脫氧胸腺嘧啶單核苷酸)的甲基化，同時使5，10-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，8-二氫葉酸。thyA基因缺失的突變株需要依靠外源性胸腺嘧啶(thymine)或胸腺嘧啶核苷(thymidine)進(jìn)行DNA的生物合成，如果突變株生存的環(huán)境不能提供足夠濃度的胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，突變株將因DNA合成受阻而停止生長或死亡。但是，如果在質(zhì)粒中提供同源或異源的功能互補(bǔ)的thyA基因后，缺陷株在不含外源性胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷的情況下也能恢復(fù)生長，此即細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的原理。
具體實施步驟(一)本發(fā)明實驗中使用和涉及到的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒。
①Escherichia coli X51[LE392，thyA-，采用thyA突變株的篩選方法獲得(Okada T，et al.Nature.1960；188340-341)]；②Lactococcus lactis MG1363(NCDO712，plasmid free，Gasson MJ，J.Bacteriol.1983；154(1)1-9)；③Lactococcus lactis CHCC373(Chr.Hansen Culture Collection.Chr.HansenA/S，Hrsholm，Denmark)；
④Lactococcus lactis MBP71(CHCC373，ΔthyA，Pedersen MP，et al.Appl.Environ.Microbiol.2002；68(6)3010-3023)；⑤pUC18(Ampicillinr，購自試劑公司)；⑥pGK12(Chloromycetinr，Erythromycinr，Kok J，et al.Appl.Environ.Microbiol.1984；48(4)726-731)；(二)本發(fā)明實驗中使用和涉及的培養(yǎng)基的配制。
①LB培養(yǎng)基胰蛋白胨 10.0g酵母粉5.0g氯化鈉10.0g加蒸餾水定容至1000ml，pH7.2。
15lbf/in2高壓蒸氣滅菌15～20分鐘。
②CBT培養(yǎng)基5×M9鹽溶液 200ml葡萄糖20.0g酪蛋白胨 0.5g色氨酸(10mg/ml) 1.0ml維生素B1(1mg/ml) 1.0ml*5×M9鹽溶液的配制Na2HPO4·7H2O 64.0gKH2PO415.0gNaCl 2.5gNH4Cl5.0g加蒸餾水定容至1000ml，pH7.2。
8lbf/in2高壓蒸氣滅菌15～20分鐘。
③MRS培養(yǎng)基胰蛋白胨 10.0g牛肉膏10.0g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g乙酸鈉5.0g
檸檬酸銨 2.0gTween 80 1.0mlK2HPO42.0gMgSO4·7H2O0.2gMnSO4·H2O 0.05g加蒸餾水定容至1000ml，pH6.8。
8lbf/in2高壓蒸氣滅菌15～20分鐘。
④改良SA培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)(Jensen PR，et al.Appl.Environ.Microbiol.1993；594363-4366)，并稍作改進(jìn)。
A、20×氨基酸混合液纈氨酸3.0g谷氨酸3.0g蛋氨酸2.5g亮氨酸2.0g組氨酸0.5g異亮氨酸 1.0g谷氨酰氨 1.0g天冬酰氨 1.0g*將上述氨基酸溶于蒸餾水中，加入10N的NaOH溶液直至完全溶解，定容至500ml，4℃保存。
B.、20×SA鹽溶液氯化鈉 30.0g乙酸鈉 12.5g氯化氨 5.0g磷酸氫鉀 2.0g氯化鎂 1.0g硫酸鉀 0.5g硫酸鐵 20.0mg氯化鈣 1.0mg*將上述鹽溶于500ml蒸餾水中，分裝后置于-20℃保存。
C、200×混合維生素溶液
維生素B1 20.0mg維生素B6 50.0mg生物素20.0mg核黃素20.0mg泛酸鈣20.0mg葉酸 20.0mg煙酸 20.0mg*將上述維生素溶于100ml 0.067mol/L磷酸鉀溶液中，4℃避光保存。
將上述A、B、C溶液混合至終濃度為1×，然后加入20.0g葡萄糖，0.5g酪蛋白胨，15.0g MOPS[3-(N-嗎啉代)丙磺酸]，加蒸餾水定容至1000ml，pH7.0。
8lbf/in2高壓蒸氣滅菌15～20分鐘。
⑤GM17培養(yǎng)基(Terzaghi BE，et al.Appl.Environ.Microbiol.1975；29807-813)多價蛋白胨 5.0g酪蛋白胨5.0g牛肉膏 5.0g葡萄糖 5.0g酵母粉 2.5g維生素C 0.5gMgSO4·7H2O 0.25gGP(β-磷酸甘油鈉) 19.0g加蒸餾水定容至1000ml，pH7.0。
8lbf/in2高壓蒸氣滅菌15～20分鐘。
⑥S-GM17培養(yǎng)基在GM17培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入0.3mol/L的Sucrose。
⑦GS-GM17培養(yǎng)基GM17培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入0.3mol/L的Sucrose和2％的Glycine。
⑧S-GM17/MC培養(yǎng)基在GM17培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入0.3mol/L的Sucrose、20mmol/L的MgCl2和2mmol/L的CaCl2。
大腸桿菌使用LB或CBT培養(yǎng)基，而乳酸乳球菌使用MRS、GM17或改良SA培養(yǎng)基。如果需要，大腸桿菌使用抗生素的終濃度是氨芐青霉素100μg/ml，紅霉素150μg/ml，而乳酸乳球菌使用的抗生素終濃度是紅霉素10μg/ml。thymine和thymidine使用的終濃度為20μg/ml。
(三)本發(fā)明實驗中使用和涉及的主要試劑。
Taq DNA Polymerase購自華美生物工程公司；Pfu DNA Polymerase購自SANGON公司；PCR產(chǎn)物及DNA酶切片段回收采用QIAGEN的QIAquick Gel ExtractionKit；dNTPs，T4 DNA Ligase，HindIII、SphI、PstI、SalI、XbaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRI等限制性內(nèi)切酶，RNA酶，蛋白酶K，堿性磷酸酶等均購自Promega公司；DNA探針標(biāo)記及檢測試劑盒為Roche DIG DNA Labeling and DetectionKit；TMP，Thymine，Thymidine購自Sigma公司；其余試劑均為市售的AR級試劑。
(四)本發(fā)明實驗中使用和涉及的主要儀器。
離心機(jī)為Eppendorf Centrifuge 5415D和Beckman COULTER；PCR儀為FeroTec Thermal cycler；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad Gel Doc 2000；電擊儀為Bio-Rad Gene Pulser；分光光度計為上海分析儀器廠7230型；pH計為HANNA HI98128。
(五)乳酸乳球菌ΔthyA株的食品級載體pSH91的具體構(gòu)建步驟。
1、食品級選擇標(biāo)記thyA基因的選擇和獲取。
選擇的thyA基因來自L.Lactis，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的L.lactis thyA基因序列(Ross P，et al.Appl.Environ.Microbiol.1990；56(7)2156-2163)，設(shè)計一對特異性引物(引物1和引物2)，并在兩引物的5’末端均加上HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以L.lactis MG1363染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的大小為937bp。實驗得到與預(yù)期大小相符的特異性DNA片段，如圖3所示。
引物15′-CGAAGCTTTTGGGAAATACTATTGAA-3′(含HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))引物25′-CGAAGCTTTAGATTAATTTAAATTGC-3′(含HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))PCR反應(yīng)體系(20μl)為10×buffer 2μl，dNTPs 1.0μl(終濃度為125μmol/L)，上下游引物各1μl(終濃度為0.25μmol/L)，DNA模板1μl，Pfu DNA聚合酶0.5U，Taq DNA聚合酶0.5U(Pfu DNA聚合酶∶Taq DNA聚合酶的量為1∶1)，以去離子水補(bǔ)至20μl。
PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5′，94℃變性1′，50℃復(fù)性1′，72℃延伸1′，30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸7′。
2、重組質(zhì)粒pUC18:thyA的構(gòu)建。
thyA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒回收純化，用HindIII限制性內(nèi)切酶消化，與經(jīng)HindIII限制性內(nèi)切酶消化并經(jīng)去磷酸化處理的pUC18載體連接，以CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，在含有Ampicillin及X-gal、IPTG的LB瓊脂平板上挑選白色菌落。將獲得的克隆子經(jīng)質(zhì)粒提取，HindIII酶切以及PCR擴(kuò)增等鑒定，獲得了含thyA基因的重組質(zhì)粒，命名為pUC18:thyA，如圖1、圖4所示。
DNA片段的回收參考試劑盒操作手冊，質(zhì)粒提取，DNA片段的酶切、去磷酸化和DNA片段的連接及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定等操作同一般的分子生物學(xué)方法。
3、MCS-thyA片段的獲取。
以重組質(zhì)粒pUC18:thyA為模板，采用pUC18-thyA引物對(引物3和引物4)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段即為MCS-thyA片段，其長度為986bp，如圖5所示。MCS-thyA片段包含了完整的pUC18多克隆位點(diǎn)(Multiple Cloning Site，MCS)以及不含酶切位點(diǎn)的thyA基因。
引物35′-ATGACCATGATTACGAAT-3′引物45′-TTGGGAAATACTATTGAA-3′PCR反應(yīng)體系(20μl)為10×buffer 2μl，dNTPs 1.0μl(終濃度為125μmol/L)，上下游引物各1μl(終濃度為0.25μmol/L)，DNA模板1μl，Pfu DNA聚合酶0.5U，Taq DNA聚合酶0.5U(Pfu DNA聚合酶∶Taq DNA聚合酶的量為1∶1)，以去離子水補(bǔ)至20μl。
PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5′，94℃變性1′，52℃復(fù)性1′，72℃延伸1′，30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸7′。
4、質(zhì)粒復(fù)制區(qū)Rep片段的獲取。
質(zhì)粒pWV01為L.lactis subsp.cremoris Wg2的隱性質(zhì)粒(cryptic plasmid)(Leenhouts KJ，et al.Plasmid.1991；26(1)55-66)。pWV01為穿梭質(zhì)粒，可以在革蘭氏陽性菌如乳球菌和革蘭氏陰性菌如大腸桿菌中存在。質(zhì)粒pGK12含有完整的pWV01的復(fù)制子區(qū)。根據(jù)pWV01的序列(Leenhouts KJ，et al.Plasmid.1991；26(1)55-66)，以質(zhì)粒pGK12為模板，采用Rep引物對(引物5和引物6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段即為Rep片段，其長度約為1536bp。Rep片段包含了pWV01中的ori+、RepA基因、ORF C區(qū)域及其兩端的部分序列。RepA基因與質(zhì)粒的自主復(fù)制有關(guān)，而ORF C則與維持質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)，因此選擇二者作為擬構(gòu)建質(zhì)粒的復(fù)制子。
引物55′-TGAAAGCCGATGACTGAATG-3′引物65-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′PCR反應(yīng)體系(20μl)為10×buffer 2μl，dNTPs 1.0μl(終濃度為125μmol/L)，上下游引物各1μl(終濃度為0.25μmol/L)，DNA模板1μl，Pfu DNA聚合酶0.5U，Taq DNA聚合酶0.5U(Pfu DNA聚合酶∶Taq DNA聚合酶的量為1∶1)，以去離子水補(bǔ)至20μl。
PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5′，94℃變性1′，56℃復(fù)性1，72℃延伸1′30″，30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10′。
5、食品級載體pSH91的構(gòu)建。
將MCS-thyA片段與Rep片段連接起來，即為食品級載體pSH91，我們采用PCR方法將兩個片段進(jìn)行連接。具體步驟是用QIAGEN QIAquick GelExtraction Kit膠回收試劑盒(QIAGEN，Germany)分別回收MCS-thyA PCR擴(kuò)增片段和Rep PCR擴(kuò)增片段。以回收純化的MCS-thyA和Rep片段為模板，采用引物對(引物7和引物8)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；取1.0μl擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，加入新的引物對(引物9和引物10)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。由于兩種引物對的5’末端均有一段10余個堿基組成的反向互補(bǔ)序列，因此經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增后，MCS-thyA和Rep片段被連接成環(huán)狀，取2.0μl第二輪PCR擴(kuò)增混合物以CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化E.coli X51，在CBT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化子。
從平板上隨機(jī)挑取部分菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后均發(fā)現(xiàn)有一大小約2.5kb的質(zhì)粒條帶。將此質(zhì)粒分別以EcoRI，SacI，KpnI，SmaI，BamHI，XbaI，SalI，PstI，SphI，HindIII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，結(jié)果質(zhì)粒均被切為線性，見附圖6所示。說明該質(zhì)粒存在上述酶切位點(diǎn)，將該質(zhì)粒命名為pSH91，pSH91質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如附圖2所示。
引物75′-ATGACCATGATTACGAAT-3′引物85′-TCATGGTCATGAAAGCCGATGACTGAATG-3′引物95-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′引物105′-CGAAGGGGGTTTGGGAAATACTATTGAA-3′PCR反應(yīng)體系(20μl)為10×buffer 2μl，dNTPs 1.0μl(終濃度為125μmol/L)，上下游引物各1μl(終濃度為0.25μmol/L)，DNA模板1μl，Pfu DNA聚合酶0.5U，Taq DNA聚合酶0.5U(Pfu DNA聚合酶∶Taq DNA聚合酶的量為1∶1)，以去離子水補(bǔ)至20μl。
PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5′，94℃變性1′，50℃復(fù)性1，72℃延伸2′，30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10′。
對pSH91質(zhì)粒進(jìn)行了全序列測定，并將pSH91質(zhì)粒的全序列與發(fā)表的原始序列進(jìn)行了比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)pSH91質(zhì)粒中的thyA基因編碼序列與發(fā)表的序列完全一致；(2)pSH91質(zhì)粒中的ori+、RepA基因、ORF C序列與發(fā)表的序列完全一致；(3)pSH91質(zhì)粒中含有完整的來自pUC18質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。其堿基序列見表6所示的序列表。
測序主要由SANGON完成，測序儀為ABI PRISM 377 DNASEQUENCER。測序結(jié)果采用DNA Star軟件進(jìn)行序列拼接，并與原始序列進(jìn)行比對分析。
(六)質(zhì)粒pSH91性能的測定。
1、質(zhì)粒pSH91對乳酸乳球菌ΔthyA株MBP71的轉(zhuǎn)化和互補(bǔ)作用。
L.lactis MBP71為ΔthyA精確缺失株，由Dr.Martin B.Pedersen構(gòu)建(Pedersen MP，et al.Appl.Environ.Microbiol.2002；68(6)3010-3023)。采用電轉(zhuǎn)化方法(見后)，將質(zhì)粒pSH91轉(zhuǎn)化L.lactis MBP71，在改良SA的瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，結(jié)果獲得了大量轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取部分轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌含有與對照質(zhì)粒pSH91大小一致的條帶，而出發(fā)菌株無此條帶，如附圖7所示。以pSH91全質(zhì)粒標(biāo)記探針，與轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果轉(zhuǎn)化子均出現(xiàn)了與對照質(zhì)粒pSH91一致的雜交條帶，而出發(fā)菌株無雜交條帶，如圖8所示。因此質(zhì)粒pSH91已被成功的轉(zhuǎn)化到L.lactis MBP71中，所獲得的重組菌株稱為MBP71/pSH91。
質(zhì)粒pSH91可以對乳酸乳球菌ΔthyA株MBP71進(jìn)行良好的功能互補(bǔ)。MBP71經(jīng)導(dǎo)入pSH91后，恢復(fù)了在改良SA瓊脂平板上的生長能力，其菌落形態(tài)與野生株CHCC373完全相似，也與MBP71在含thymidine的改良SA瓊脂平板上的菌落形態(tài)完全相似，菌落形態(tài)如圖9A、圖9B所示。
乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化方法。
乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化方法主要參考Holo等(Holo H，et al.Appl.Environ.Microbiol.1989；553119-3123)，并稍作修改。
(1)感受態(tài)細(xì)胞的制備①將-80℃凍存的L.lactis MBP71菌種接種至MRS瓊脂平板，培養(yǎng)24～36小時，至平板上出現(xiàn)大小適中的單菌落；②從MRS平板上挑取單菌落至S-GM17液體培養(yǎng)基，并加入thymidine至終濃度20μg/ml，30℃靜置培養(yǎng)過夜(約12小時)；③將過夜培養(yǎng)的菌液按1％的比例接種至GS-GM17液體培養(yǎng)基，并加入thymidine至終濃度20μg/ml，30℃靜置培養(yǎng)4～5小時，至OD600約為0.4～0.6；④將培養(yǎng)物置冰浴中10～20分鐘；⑤集菌，12000rpm室溫快速離心30秒，收集1.5～3.0ml菌液(以下所有操作除離心步驟外均在冰上進(jìn)行)；⑥棄上清，加入1ml 4℃預(yù)冷的電擊緩沖液(*電擊緩沖液的配制10mmol/L HEPES，0.5mol/L Sucrose，以0.22μm的濾器過濾除菌)，重新懸浮細(xì)菌，12000rpm室溫快速離心30秒；⑦重復(fù)上述步驟2次；⑧去除殘留液體，最后以50μl的電擊緩沖液重懸細(xì)菌，置冰上；⑨加入2～5μl外源DNA，置冰上約5分鐘。
(2)電擊轉(zhuǎn)化①將含有外源DNA的上述細(xì)菌懸液加入預(yù)冷的無菌電擊杯中(選用的電擊杯內(nèi)徑為0.2cm)，輕輕敲擊電擊杯，確保液體位于電擊杯底部，置冰上；②電擊的操作步驟按電擊儀的要求進(jìn)行；③電擊時選擇的參數(shù)是電壓為1.8kV；電容為25μF；電阻為200Ω；時間常數(shù)t通常為4.5～4.8msec；④電擊完成后，將電擊杯置冰上約5分鐘，加入1ml S-GM17/MC培養(yǎng)基至電擊杯中；⑤將電擊杯中的電擊混合物與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至無菌玻璃試管中，并補(bǔ)充S-GM17/MC培養(yǎng)基至5ml，30℃靜置培養(yǎng)2.5～3.5小時；⑥取50～100μl菌液，加入改良SA瓊脂平板，用無菌玻璃涂棒將細(xì)菌均勻涂布到整個平板表面；
⑦待平板干燥后，倒置放在30℃溫箱中培養(yǎng)36～48小時；⑧觀察平板上轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的情況，并將轉(zhuǎn)化子作進(jìn)一步的鑒定。
2、質(zhì)粒pSH91對乳酸乳球菌ΔthyA株MBP71的轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性。
以質(zhì)粒pGK12為參照比較了質(zhì)粒pSH91對L.lactis MBP71的轉(zhuǎn)化效率，前者在含Erythromycin的MRS瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，而后者在改良SA瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落。結(jié)果pSH91轉(zhuǎn)化效率比pGK12略高，在本發(fā)明的實驗條件下，質(zhì)粒pSH91對L.lactis MBP71的轉(zhuǎn)化效率約為105/μg DNA。說明thyA基因同Chloromycetin或Erythromycin等抗性基因一樣，可以作為有效的選擇標(biāo)記。
MRS培養(yǎng)基為營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基，其中含的thymidine能夠滿足L.lactisMBP71菌株的正常生長，因此可以認(rèn)為含pSH91質(zhì)粒的L.lactis MBP71菌株生長在MRS培養(yǎng)基中不存在選擇壓力。將含pSH91質(zhì)粒的L.lactis MBP71接種至5ml MRS液體培養(yǎng)基中，每隔12小時按1％的比例將菌液接種至新鮮的5ml MRS液體培養(yǎng)基，如此進(jìn)行傳代，每5代取部分菌液分別涂改良SA瓊脂平板(只有含pSH91質(zhì)粒的MBP71菌株能夠生長，并隨機(jī)挑選部分菌落作質(zhì)粒提取鑒定)和改良SA+thymidine瓊脂平板(所有菌株均能生長)，計算平板上的菌落數(shù)。以改良SA瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)除以改良SA+thymidine瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)，即可計算出pSH91質(zhì)粒在MBP71菌株中的穩(wěn)定性，如表5所示。
3、質(zhì)粒pSH91對L.lactis MBP71菌株在不同培養(yǎng)基中生長速率的影響。
為了觀察L.lactis MBP71在導(dǎo)入質(zhì)粒pSH91后，其在不含或者含微量thymidine的培養(yǎng)基中的生長情況，本發(fā)明采用改良SA培養(yǎng)基和GM17培養(yǎng)基進(jìn)行了生長速率的測定，其結(jié)果見表1、圖10和表3、圖12所示。
4、質(zhì)粒pSH91對L.lactis MBP71菌株在不同培養(yǎng)基中酸化能力的影響。
乳酸菌最典型的特征之一就是它能產(chǎn)生大量的乳酸，同時引起環(huán)境或培養(yǎng)基的酸化，pH值降低。為了了解含pSH91質(zhì)粒的L.lactis MBP71菌株產(chǎn)酸的能力是否受到影響，本發(fā)明采用改良SA培養(yǎng)基和GM17培養(yǎng)基，測定了乳酸乳球菌不同菌株在不同時間的pH值，來反映乳酸乳球菌的產(chǎn)酸能力。結(jié)果見表2、圖11和表4、圖13所示。
本發(fā)明將L.lactis MG1363的thyA基因克隆到質(zhì)粒pUC18中，獲得了重組質(zhì)粒pUC18:thyA。將pUC18:thyA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌thyA-株X51，結(jié)果E.coliX51恢復(fù)了在不含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷的CBT培養(yǎng)基上的生長。說明我們選擇的乳酸乳球菌thyA基因可以對大腸桿菌thyA-株X51進(jìn)行有效的功能互補(bǔ)，為進(jìn)一步在乳酸乳酸菌中使用該基因取代抗生素抗性基因建立食品級載體系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明構(gòu)建的載體pSH91包括3個部分，來自L.lactis MG1363的thyA選擇標(biāo)記；來自L.lactis subsp.cremoris Wg2隱性質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子(RepA、ORF C和ori+)和來自pUC18質(zhì)粒的全部多克隆位點(diǎn)(HindIII、SphI、PstI、SalI、XbaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRI)。pWV01及其衍生質(zhì)粒pGK12為穿梭質(zhì)粒，在許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中均能復(fù)制。同樣，pSH91能夠在乳酸乳球菌和大腸桿菌中存在，因此pSH91也屬于穿梭質(zhì)粒，這為利用大腸桿菌作為中間受體菌進(jìn)行外源基因的克隆提供了方便。質(zhì)粒pSH91除多克隆位點(diǎn)來自pUC18質(zhì)粒外，選擇性標(biāo)記thyA和復(fù)制子均來自食品級微生物乳酸乳球菌，同時它不含有任何抗生素抗性選擇標(biāo)記和其它的外源DNA成份，因此可以將質(zhì)粒pSH91看作為食品級的克隆載體。
pSH91轉(zhuǎn)化L.lactis ΔthyA株MBP71后，其在不含thymine和thymidine的改良SA培養(yǎng)基上恢復(fù)了正常生長，說明質(zhì)粒中的thyA基因提供了功能互補(bǔ)作用。進(jìn)一步的測定發(fā)現(xiàn)，含pSH91的L.lactis MBP71與出發(fā)菌株MBP71在含thymidine的改良SA培養(yǎng)基中的生長速度和酸化能力基本相同。同時與野生株L.lactis CHCC373在改良SA培養(yǎng)基的生長速度和酸化能力也基本相同。
本發(fā)明乳酸乳球菌ΔthyA突變株的食品級載體pSH91的有益效果本發(fā)明建立的這套乳酸乳球菌食品級載體系統(tǒng)同其它傳統(tǒng)克隆載體一樣，可以在此載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因的克隆，但又避免了傳統(tǒng)載體帶有抗生素抗性基因而不能直接應(yīng)用的缺點(diǎn)。因此本發(fā)明建立的這套乳酸乳球菌食品級載體系統(tǒng)為進(jìn)一步在乳酸乳球菌中進(jìn)行外源性抗原基因的克隆和表達(dá)奠定了很好的基礎(chǔ)，為發(fā)展新型、有效的疫苗表達(dá)系統(tǒng)提供可靠的工具，該系統(tǒng)的建立具有很高的實際應(yīng)用價值。
表1為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的生長速率(OD600)。
*MBP71時間(h)*MBP71**MBP71*CHCC373*MBP71/pSH91(Thymidine)00.0500.216 0.050 0.050 0.05010.0540.344 0.059 0.078 0.06920.0710.402 0.074 0.110 0.11230.0890.445 0.143 0.217 0.19040.1160.462 0.314 0.483 0.45050.1600.471 0.746 1.125 0.943
6 0.162 0.493 1.461 1.921 1.6997 0.170 0.481 1.683 2.504 2.3488 0.182 0.489 1.818 2.430 2.4889 0.190 0.496 1.998 2.488 2.41610 0.208 0.519 2.184 2.488 2.39411 0.203 0.533 2.226 2.426 2.38812 0.192 0.538 2.218 2.402 2.374*將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按1％稀釋后接種**將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按10％稀釋后接種表2為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的酸化能力(pH值)。
*MBP71時間(h)*MBP71**MBP71*CHCC373*MBP71/pSH91(Thymidine)07.00 6.89 7.00 7.007.0016.94 6.84 6.94 6.936.9326.92 6.78 6.91 6.906.9036.90 6.73 6.88 6.866.8746.87 6.68 6.81 6.736.7456.87 6.64 6.66 6.396.5166.78 6.56 6.01 5.035.4176.78 6.55 5.23 4.534.6186.80 6.54 5.12 4.434.4596.79 6.50 4.83 4.344.3610 6.78 6.46 4.60 4.314.3611 6.77 6.41 4.52 4.294.2712 6.76 6.34 4.33 4.244.23*將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按1％稀釋后接種**將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按10％稀釋后接種表3為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在GM17中的生長速率(OD600)*MBP71時間(h)*MBP71**MBP71*CHCC373*MBP71/pSH91(Thymidine)00.081 0.465 0.081 0.080 0.08110.082 0.562 0.081 0.080 0.08120.124 0.967 0.177 0.178 0.18230.246 1.347 0.428 0.506 0.49340.379 1.347 0.955 1.065 0.99150.533 1.201 1.854 1.959 1.88660.602 0.928 3.010 3.112 3.050
70.735 0.762 4.101 3.780 3.87680.562 0.618 4.194 3.852 3.73290.502 0.539 4.332 3.930 3.80410 0.474 0.483 4.296 4.041 3.98711 0.428 0.458 4.260 3.876 3.71112 0.396 0.424 4.260 3.780 3.711*將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按1％稀釋后接種**將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按10％稀釋后接種表4為本發(fā)明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的酸化能力(pH值)*MBP71時間(h)*MBP71**MBP71*CHCC373*MBP71/pSH91(Thymidine)0 7.00 6.89 7.00 7.00 7.001 6.94 6.84 6.94 6.93 6.932 6.92 6.78 6.91 6.90 6.903 6.90 6.73 6.88 6.86 6.874 6.87 6.68 6.81 6.73 6.745 6.87 6.64 6.66 6.39 6.516 6.78 6.56 6.01 5.03 5.417 6.78 6.55 5.23 4.53 4.618 6.80 6.54 5.12 4.43 4.459 6.79 6.50 4.83 4.34 4.3610 6.78 6.46 4.60 4.31 4.3611 6.77 6.41 4.52 4.29 4.2712 6.76 6.34 4.33 4.24 4.23*將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按1％稀釋后接種**將培養(yǎng)過夜(約12h)的菌液按10％稀釋后接種表5為本發(fā)明質(zhì)粒pSH91穩(wěn)定性分析。
CFU傳代數(shù) 質(zhì)粒穩(wěn)定性(％)改良SA改良SA+Thymidine5376 383 98.1710 325 361 90.0015 304 369 82.3820 272 382 71.2025 228 350 65.1430 165 369 44.7235 152 402 37.8140 90 378 23.81
45 6538217.0250 3634810.34表6為pSH91載體核苷酸序列<110>熊衍文，徐建國<120>乳酸乳球菌的食品級載體<160>1<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>2337<212>DNA<400>1tgaaagccga tgactgaatg aaataataag cgcagcgccc ttctatttcg gttggaggag 60gctcaaggga gtatgaggga atgaaattcc ctcatgggtt tgattttaaa aattgcttgc 120aattttgccg agcggtagcg ctggaaaatt tttgaaaaaa atttggaatt tggaaaaaaa 180tggggggaaa ggaagcgaat tttgcttccg tactacgacc ccccattaag tgccgagtgc 240caatttttgt gccaaaaacg ctctatccca actggctcaa gggtttaagg ggtttttcaa 300tcgccaacga atcgccaacg ttttcgccaa cgttttttat aaatctatat ttaagtagct 360ttattgttgt ttttatgatt acaaagtgat acactaactt tataaaatta tttgattgga 420gttttttaaa tggtgatttc agaatcgaaa aaaagagtta tgatttctct gacaaaagag 480caagataaaa aattaacaga tatggcgaaa caaaaaggtt tttcaaaatc tgcggttgcg 540gcgttagcta tagaagaata tgcaagaaag gaatcagaac aaaaaaaata agcgaaagct 600cgcgttttta gaaggatacg agttttcgct acttgttttt gataaggtaa ttatatcatg 660gctattaaaa atactaaagc tagaaatttt ggatttttat tatatcctga ctcaattcct 720aatgattgga aagaaaaatt agagagtttg ggcgtatcta tggctgtcag tcctttacac 780gatatggacg aaaaaaaaga taaagataca tggaatagta gtgatgttat acgaaatgga 840aagcactata aaaaaccaca ctatcacgtt atatatattg cacgaaatcc tgtaacaata 900gaaagcgtta ggaacaagat taagcgaaaa ttggggaata gttcagttgc tcatgttgag 960atacttgatt atatcaaagg ttcatatgaa tatttgactc atgaatcaaa ggacgctatt1020gctaagaata aacatatata cgacaaaaaa gatattttga acattaatga ttttgatatt1080gaccgctata taacacttga tgaaagccaa aaaagagaat tgaagaattt acttttagat1140atagtggatg actataattt ggtaaataca aaagatttaa tggcttttat tcgccttagg1200ggagcggagt ttggaatttt aaatacgaat gatgtaaaag atattgtttc aacaaactct1260agcgccttta gattatggtt tgagggcaat tatcagtgtg gatatagagc aagttatgca1320aaggttcttg atgctgaaac gggggaaata aaatgacaaa caaagaaaaa gagttatttg1380ctgaataatg aggaattaaa aaagatagga aaatttcatg acttacgcag atcaagtttt1440taaacaaaat atccaaaata tcctagataa tggtgttttt tcagaaaatg caagaccaaa1500gtataaggat ggtcaaatgg cgaatagcaa atatgtcact ggttcattcg ttacttatga1560tttgcaaaag ggggagtttc caattaccac tttgcgtcca attccaatca aatctgctat1620
taaagaattg atgtggatat accaagacca aacaagtgaa ctttctgttc tcgaagagaa1680gtatggagtc aaatactggg gagaatgggg aattggtgat ggtacgattg ggcaacgtta1740tggtgcaaca gtcaaaaaat ataatatcat tggtaaatta ttagaaggct tggccaaaaa1800tccatggaat cgtcgtaata tcatcaacct ttggcagtat gaagattttg aggaaacaga1860aggtctttta ccatgtgctt tccaaacgat gtttgatgtc cgtcgagaaa aagatggtca1920gatttatttg gatgccacac tgattcaacg ttcaaacgat atgcttgtag cccaccatat1980caatgcgatg caatatgttg ctttgcaaat gatgattgca aaacattttt cttggaaagt2040tgggaaattc ttttattttg taaataattt acatatttat gataatcagt ttgagcaggc2100aaatgaatta atgaagcgaa cagcttctga aaaagaacct cgtttggtcc ttaatgttcc2160tgatggtaca aactttttcg atattaaacc tgaagatttt gaacttgtgg actatgagcc2220agtaaaacct caattgaaat ttgatttagc aatttaaatt aatctaaagc ttgcatgcct2280gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcat 2337以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，其包括thyA基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子和質(zhì)粒pUC18的全部多克隆位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，其具有互補(bǔ)ΔthyA突變株的功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，其具有pSH91載體核苷酸序列表的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，其保藏號為CGMCC No.1253。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，所述thyA基因選擇標(biāo)記為乳酸乳球菌MG1363的thyA基因；所述質(zhì)粒pWV01為乳酸乳球菌乳脂亞種Wg2的隱性質(zhì)粒；所述pUC18質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)包括HindIII、Sph I、Pst I、Sal I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、EcoR I。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳酸乳球菌的食品級載體，其特征在于，所述互補(bǔ)ΔthyA突變株的功能是互補(bǔ)乳酸乳球菌ΔthyA突變株MBP71的功能。
7.一種如權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于，(1)選擇和獲取食品級選擇標(biāo)記thyA基因；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18thyA；(3)獲取MCS-thyA片段；(4)獲取質(zhì)粒復(fù)制區(qū)Rep片段；(5)構(gòu)建食品級載體pSH91。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述選擇和獲取食品級選擇標(biāo)記thyA基因是根據(jù)乳酸乳球菌MG1363的thyA基因序列設(shè)計特異性引物對(1)和(2)，通過PCR擴(kuò)增獲得的；所述構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18thyA是thyA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindIII限制性內(nèi)切酶酶切后克隆至pUC18質(zhì)粒后獲得的；所述獲取MCS-thyA片段是以重組質(zhì)粒pUC18thyA為模板，采用引物對(3)和(4)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的；所述獲取質(zhì)粒復(fù)制區(qū)Rep片段，是根據(jù)質(zhì)粒pWV01序列，以質(zhì)粒pWV01的衍生質(zhì)粒pGK12為模板，采用引物對(5)和(6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的；所述構(gòu)建食品級載體pSH91是采用PCR方法將MCS-thyA片段與Rep片段進(jìn)行連接而成，即采用DNA膠回收試劑盒分別回收MCS-thyA PCR擴(kuò)增片段和Rep PCR擴(kuò)增片段；以回收純化的MCS-thyA和Rep片段為模板，采用引物對(7)和(8)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；取擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，加入新引物對(9)和(10)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，通過兩輪PCR擴(kuò)增使MCS-thyA和Rep片段被連接成環(huán)狀，取第二輪PCR擴(kuò)增混合物以CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌X51菌株，在CBT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化子，從平板上隨機(jī)挑取部分菌落提取質(zhì)粒鑒定，并將獲得的質(zhì)粒命名為pSH91。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的乳酸乳球菌的食品級載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物1為5’-CGAAGCTTTTGGGAAATACTATTGAA-3’，其含有HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物2為5’-CGAAGCTTTAGATTAATTTAAATTGC-3’，其含有HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；所述引物3為5’-ATGACCATGATTACGAAT-3’，引物4為5’-TTGGGAAATACTATTGAA-3’；所述引物5為5’-TGAAAGCCGATGACTGAATG-3’，引物6為5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3’；所述引物7為5’-ATGACCATGATTACGAAT-3’，引物8為5’-TCATGGTCATGAAAGCCGATGACTGAATG-3’；所述引物9為5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3’，引物10為5’-CGAAGGGGGTTTGGGAAATACTATTGAA-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌的食品級載體，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號為CGMCCNO1253；其構(gòu)建了含有乳酸乳球菌MG1363 thyA基因選擇標(biāo)記、乳酸乳球菌乳脂亞種Wg2隱性質(zhì)粒pWV01復(fù)制子和pUC18質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的食品級載體pSH91，為外源基因在乳酸乳球菌中的克隆和表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/21GK1648255SQ20041009387
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者熊衍文, 徐建國 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所