專利名稱：抑癌基因pinx1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及利用抑癌基因PINX1基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療髓母細(xì)胞瘤等癌癥的方法，以及含有PINX1基因和/或蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
髓母細(xì)胞瘤是兒童期顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占腦瘤總數(shù)的五分之一。它不僅惡性程度高且極具侵犯性，易發(fā)生脊髓轉(zhuǎn)移，患者長期存活率低，是嚴(yán)重人類生存的重要疾病。
細(xì)胞原癌基因的過度表達(dá)、抑癌基因的失活和DNA錯配修復(fù)基因的缺陷是各種腫瘤、癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要原因。有所不同的是，眾多研究顯示原癌基因的活化、擴(kuò)增和過表達(dá)在髓母細(xì)胞瘤中并不常見，而是多表現(xiàn)為以等位基因雜合性缺失(LOH)為特征的抑癌基因失活。
然而，迄今為止，尚沒有揭示髓母細(xì)胞瘤產(chǎn)生和發(fā)展的確切原因，也沒有揭示髓母細(xì)胞瘤與某種抑癌基因及其編碼蛋白存在直接的相關(guān)性。此外，本領(lǐng)域也缺乏早期診斷髓母細(xì)胞瘤的有效方法以及除手術(shù)和放療以外的治療髓母細(xì)胞瘤的有效手段。
PINX1又稱為PIN2相互作用蛋白1，它是一種已知蛋白，基本信息如下英文Homo sapiens PIN2-interacting protein 1 PINX1(hepatocellular carcinoma-related putative tumor suppressor)NCBIContigNT_008010mRNAHomo sapiens PIN2-interacting protein 1(PINX1)，mRNAgi|16975485|ref|NM_017884.1|[6975485]PINX1的DNA序列如SEQ ID NO1所示，ORF位于第90-1073位，編碼一個全長328個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。PINX1的其他信息可以從Http//www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。
曾有研究表明，8號染色體短臂是許多癌癥和腫瘤組織中發(fā)生雜合性缺失的熱點(diǎn)區(qū)域，強(qiáng)烈提示此處存在著在各類腫瘤及癌癥中發(fā)揮重要作用的抑癌基因。同時有報道說，定位于8P23區(qū)域的PIN2蛋白相互作用蛋白1(PINX1)可能與細(xì)胞端粒酶活力和細(xì)胞凋亡有關(guān)。但人們對于PINX1的功能還了解甚少，不知其與髓母細(xì)胞瘤等癌癥的相關(guān)性。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的診斷和治療髓母細(xì)胞瘤的有效方法，以及相關(guān)的治療藥物，診斷技術(shù)和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供一種新的診斷(尤其是早期診斷)髓母細(xì)胞瘤等癌癥的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療癌癥，尤其是髓母細(xì)胞瘤的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療癌癥，尤其是髓母細(xì)胞瘤的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的癌癥，尤其是髓母細(xì)胞瘤易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的PINX1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的PINX1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患癌癥，尤其是患髓母細(xì)胞瘤的可能性高于正常人群。
較佳地，被檢測的是PINX1的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常PINX1核苷酸序列比較差異。更佳地，所述的差異選自SEQ ID NO1中第162位G162變?yōu)锳162；SEQ ID NO1中第367位C367變?yōu)門367。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種治療癌癥，尤其是髓母細(xì)胞瘤的方法，它包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常PINX1蛋白。較佳地，PINX1蛋白被局部施用于腫瘤組織。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種PINX1蛋白在制備藥物組合物方面的的用途以及相應(yīng)的藥物組合物，它含有安全有效量的人PINX1蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。較佳地，它是靶向藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測癌癥，尤其是髓母細(xì)胞瘤的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增PINX1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。較佳地，它還含有與突變部位結(jié)合的探針。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種檢測人PINX1基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人PINX1基因的SEQ ID NO1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性G162→A162和C367→T367。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了PINX1基因中的序列變化，其中第162位G162變?yōu)锳162；第367位C367變?yōu)門367。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了PIN2相互作用蛋白1(PINX1)是一抑癌基因，與髓母細(xì)胞瘤等癌癥密切相關(guān)，它的改變將促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤和其它癌癥的產(chǎn)生和發(fā)展，是導(dǎo)致癌癥的直接原因之一。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
通過對32例髓母細(xì)胞瘤標(biāo)本和部分對照血樣的研究，已發(fā)現(xiàn)多例體細(xì)胞PINX突變。進(jìn)一步的研究表明，人PINX1與髓母細(xì)胞瘤密切相關(guān)，它的正常表達(dá)是抑制癌癥特別是髓母細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展，維持正常生理狀態(tài)的關(guān)鍵。根據(jù)蛋白同源性比較，人類PIN2相互作用蛋白1(PINX1)在物種間有較高保守性，作用重要。同時，表達(dá)研究顯示，PINX1基因在人體許多重要組織中表達(dá)。因此人類PIN2相互作用蛋白1(PINX1)的突變是導(dǎo)致人類癌癥特別是髓母細(xì)胞瘤的重要原因，根據(jù)此基因及其表達(dá)產(chǎn)物設(shè)計的藥物和診斷治療技術(shù)，可用于診斷和治療人類髓母細(xì)胞瘤等癌癥。
鑒于人類PINX1的變異是導(dǎo)致髓母細(xì)胞瘤的直接原因之一。因此，根據(jù)此基因及其表達(dá)產(chǎn)物設(shè)計的藥物和診斷治療技術(shù)，可用于診斷和治療人類的癌癥，尤其是髓母細(xì)胞瘤。
本發(fā)明的人PINX1核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)PINX1的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
將PINX1編碼序列插入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，就可以分離出PINX1蛋白。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，PINX1蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療PINX1蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如各種腫瘤，尤其是髓母細(xì)胞瘤)，和用于篩選促進(jìn)PINX1蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人PINX1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能刺激人PINX1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人PINX1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人PINX1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人PINX1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人PINX1蛋白的分子，也包括那些并不影響人PINX1蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人PINX1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人PINX1蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人PINX1蛋白功能的抗體以及不影響人PINX1蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人PINX1基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PINX1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人PINX1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人PINX1蛋白。一種優(yōu)選的抗PINX1抗體是不識別正常PINX1但識別突變PINX1(如SEQ ID NO4)的抗體，或者識別正常PINX1但不識別突變PINX1的抗體。利用該抗體對正常和異常PINX1蛋白的特異性差異，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的髓母細(xì)胞瘤易感性檢測。
利用本發(fā)明PINX1蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與PINX1蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明PINX1蛋白可在施用(給藥)給患者。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、或局部給藥(包括瘤內(nèi)給藥)。較佳地是局部給藥，例如瘤內(nèi)給藥。
正常的PINX1多肽可直接用于疾病治療，例如，用于髓母細(xì)胞瘤方面的治療。在使用本發(fā)明PINX1蛋白時，還可同時使用其他治療腫瘤的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明PINX1蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如針劑、片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的PINX1蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人PINX1蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于PINX1蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的PINX1蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖異常。構(gòu)建攜帶PINX1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，etal.)。另外重組人PINX1基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織(如腫瘤組織)中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人PINX1蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測檢測樣品中是否存在PINX1蛋白的方法是利用PINX1蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與PINX1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在PINX1蛋白。
PINX1蛋白的多聚核苷酸可用于PINX1蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，PINX1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測PINX1蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下PINX1蛋白的異常表達(dá)。如PINX1 DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷PINX1蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)和基因診斷。用PINX1蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測PINX1蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了一種檢測人PINX1基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人PINX1基因的SEQ ID NO1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)。具體SNP例子包括G162→A162C367→T367。
檢測PINX1基因的突變也可用于診斷髓母細(xì)胞瘤。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。PINX1蛋白突變的形式包括與正常野生型PINX1 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1確定PINX1突變是導(dǎo)致髓母細(xì)胞瘤的直接原因1.1對象收集32例髓母細(xì)胞瘤的石蠟包埋標(biāo)本及部分患者外周血。
1.2病理檢查對患者病理組織石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。所取組織片中80％以上為癌細(xì)胞。
1.3個體鑒定利用6對微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記對患者病理組織和外周血進(jìn)行個體鑒定?；颊卟±斫M織和其外周血的基因分型完全一致。
1.4候選基因篩選及檢測經(jīng)研究，將在8號染色體短臂上PIN2相互作用蛋白1(PINX1)定為一個重要的候選基因。該基因在腦等各種重要組織中表達(dá)。
用DNA抽提試劑盒(Qigen公司)從石蠟包埋的病理組織中抽提基因組DNA，將其作為模板。同時設(shè)計并合成了九對引物。這些引物覆蓋了該基因所有外顯子，內(nèi)含子與外顯子的邊際，部分操作子的序列


利用這九對引物采用PCR擴(kuò)增、直接測序的方法，對髓母細(xì)胞瘤病理標(biāo)本進(jìn)行PINX1基因突變檢測。
經(jīng)過對32例髓母細(xì)胞瘤病理組織和部分外周血DNA的PINX1基因測序，發(fā)現(xiàn)其中PINX1-2，PINX1-4兩對引物檢測到病理組織中PINX1基因與正常不同。全自動測序儀檢測突變結(jié)果如下cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc 60agaggcggcg gtatcacagg ctctccgaca tgtctatgct ggctgaacgt cggcggaagc 120agaagtgggc tgtggatcct cagaacactg cctggagtaa tGacgattcc aagtttggcc 180agcggatgct agagaagatg gggtggtcta aaggaaaggg tttaggggct caggagcacg 240gagccacaga tcatattaaa gttcaagtga aaaataacca cctgggactc ggagctacca 300tcaataatga agacaactgg attgcccatc aggatgattt taaccagctt ctggccgaac 360tgaacaCttg ccatgggcag gaaaccacag attcctcgga caagaaggaa aagaaatctt 420ttagccttga ggaaaagtcc aaaatctcca aaaaccgtgt tcactatatg aaattcacaa 480aagggaagga tctgtcatct cggagcaaaa cagatcttga ctgcattttt gggaaaagac 540agagtaagaa gactcccgag ggcgatgcca gtccctccac tccagaggag aacgaaacca 600cgacaaccag cgccttcacc atccaggagt actttgccaa gcggatggca gcactgaaga 660acaagcccca ggttccagtt ccagggtctg acatttctga gacgcaggtg gaacgtaaaa 720gggggaagaa aataaataaa gaggccacag gtaaagatgt ggaaagttac ctccagccta 780aggccaagag gcacacggag ggaaagcccg agagggccga ggcccaggag cgagtggcca 840agaagaagag cgcgccagca gaagagcagc tcagaggccc ctgctgggac cagagttcca 900aggcctctgc tcaggatgca ggggaccatg tgcagccgcc tgagggccgg gacttcaccc 960tgaagcccaa aaagaggaga gggaagaaaa agctgcaaaa accagtagag atagcagagg 1020acgctacact agaagaaacg ctagtgaaaa agaagaagaa gaaagattcc aaatgaatcc 1080ttcccagccg gggccttccg accactcagc tgtcagggca ctgcgggggc agacacctct 1140ggcctgaagt cacagcagag ttcaccccag agcgcctggg cgcatcttgt ggcatgccca 1200tgggctgccg agtcctgccc tctcgccaca tttcccccaa gttacattcc caggaggacc 1260tttttaatgt tctcaatcgt ggctctcaga cacaaataaa tttttttgta aactctgaaa 1320aaaaaaaaaa aa 1332(SEQ ID NO1)如上所示，正常人序列“…aatGacg…”在1例髓母細(xì)胞瘤病理組織中純合變化為“…aatAacg…”，這一變化直接導(dǎo)致了其編碼產(chǎn)物SEQ ID NO2中第25位由天冬氨酸(D)變?yōu)樘於０?N)(外顯子2，mRNA編碼序列中第162位的G162→A162，見圖1A)。
正常人序列“…acaCttg…”在1例髓母細(xì)胞瘤病理組織中純合改變?yōu)椤啊璦caTttg…”，這一變化直接導(dǎo)致了其編碼產(chǎn)物SEQ ID NO2中第93位由蘇氨酸(T)變?yōu)楫惲涟彼?I)(外顯子4，mRNA編碼序列中第367位的C367→T367，見圖1B)。
含有G162→A162和C367→T367突變(SNP)的PINX1序列示于SEQ IDNO3，其編碼的突變蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。應(yīng)指出，這些序列代表了含有G162→A162和/或C367→T367突變，以及含有Asp25→Asn25和/或Thr93→Ile93突變的序列。
此外，為了驗(yàn)證突變位點(diǎn)對髓母細(xì)胞瘤發(fā)生的特異性，隨機(jī)檢查了300個沒有親源關(guān)系的人在所述位點(diǎn)的情況，沒有發(fā)現(xiàn)有任何突變。這說明所述位點(diǎn)的突變并非人群中的多態(tài)性所致，而是髓母細(xì)胞瘤的特異性突變位點(diǎn)。因此表明了PINX1與人類的髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)，此基因及其編碼產(chǎn)物可對人類的髓母細(xì)胞瘤起重要作用。
1.5 PINX1基因的等位基因雜合性缺失(LOH)利用位于8P22位點(diǎn)的微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記D8S1130對發(fā)生G162→A162突變的患者病理組織和外周血進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)等位基因雜合性缺失現(xiàn)象。此外，該患者病理標(biāo)本PINX1基因外顯子3的測序結(jié)果進(jìn)一步證明了LOH的存在(見圖1C)。
討論G162→A162的體細(xì)胞純合性突變，使得PINX1蛋白在25位由天冬氨酸(D)變?yōu)樘於０?N)。在對三百個正常人的該序列比較中，均未發(fā)現(xiàn)此變化。結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該區(qū)域是PINX1蛋白的磷酸化位點(diǎn)，天冬氨酸到天冬酰胺的變化可能影響蛋白二級結(jié)構(gòu)的正常形成。此外，經(jīng)過與其它物種同源比較，該突變處的氨基酸有高度保守性，且位于關(guān)鍵的G-PATH邊緣區(qū)域，提示25位的天冬氨酸是維持蛋白功能的基礎(chǔ)。此外，該對樣本8P22位點(diǎn)處微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記D8S1130的基因分型顯示在病理組織中存在等位基因的雜合性缺失(LOH)。病理樣品PINX1基因外顯子3的測序結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了LOH的出現(xiàn)。
PINX1 mRNA上C367→T367的純合突變，直接導(dǎo)致了其編碼產(chǎn)物93位點(diǎn)由蘇氨酸(T)變?yōu)楫惲涟彼?I)。該位點(diǎn)在小鼠中呈現(xiàn)保守性，在三百個正常人PINX1序列比較中也未出現(xiàn)相同變化，提示93位的蘇氨酸對維持蛋白的功能起重要的作用。
總之，本發(fā)明首次公開了PIN2相互作用蛋白1(PINX1)與人類癌癥特別是髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，此基因及其編碼產(chǎn)物對人類的癌癥特別是髓母細(xì)胞瘤起重要作用。
此外，8號染色體短臂是許多癌癥和腫瘤組織中發(fā)生雜合性缺失(LOH)的熱點(diǎn)區(qū)域。這強(qiáng)烈提示此處存在著在各類腫瘤及癌癥中發(fā)揮重要作用的抑癌基因。PINX1正是定位于該區(qū)域內(nèi)。已有的研究表明，該基因與細(xì)胞端粒酶活力和細(xì)胞凋亡有關(guān)，暗示了其與癌癥、腫瘤發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。
本發(fā)明首次揭示了PINX1與髓母細(xì)胞瘤密切相關(guān)，它的改變將促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生和發(fā)展。由于PINX1基因在心臟、腦、腎、肺、胃、肝、胰腺、前列腺、卵巢、皮膚、子宮、食道、肌肉等眾多人體重要組織中均有較高表達(dá)，廣泛的表達(dá)范圍從另一個側(cè)面證實(shí)了該基因的重要性，并暗示PINX1的功能缺失是導(dǎo)致除髓母細(xì)胞瘤以外的多種癌癥、腫瘤的直接原因之一。這些癌癥包括(但并不限于)胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌等。
實(shí)施例3髓母細(xì)胞瘤診斷檢測試劑盒的制備制備一試劑盒，它含有

抽取待檢測病人的血液3ml或腫瘤組織20-30mg，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液或組織中提取DNA。將髓母細(xì)胞瘤檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用檢測試劑盒所提供的PRC產(chǎn)物純化盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)后直接進(jìn)行測序。觀測所得到的擴(kuò)增序列是否存在點(diǎn)突變G162→A162和/或C367→T367。
實(shí)施例4藥物組合物的制備將PINX1所編碼的正常蛋白與常規(guī)的醫(yī)用緩沖液溶液一起配制成針劑，其中PINX1蛋白含量為0.5％。該針劑可補(bǔ)充病灶處的PINX1編碼蛋白，使病人的生理狀況得到改善，從而達(dá)到治療的目的。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種對個體的癌癥易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的PINX1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的PINX1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患癌癥的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌癥是髓母細(xì)胞瘤，且檢測的是PINX1的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常PINX1核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中第162位G162變?yōu)锳162；和SEQ ID NO1中第367位C367變?yōu)門367。
4.一種治療癌癥的方法，其特征在于，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常PINX1蛋白，或者將正常的PINX1基因靶向?qū)肽[瘤組織，使其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的癌癥是髓母細(xì)胞瘤，且所述的PINX1蛋白被施用于腫瘤組織。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的PINX1蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。
7.一種檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增PINX1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的癌癥是髓母細(xì)胞瘤，且所述試劑盒還含有與突變部位結(jié)合的探針。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自SEQ ID NO1中第162位G162變?yōu)锳162；SEQ ID NO1中第367位C367變?yōu)門367。
10.一種檢測人PINX1基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人PINX1基因的SEQ ID NO1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性G162→A162和C367→T367。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷髓母細(xì)胞瘤等癌癥的方法，它包括檢測個體的PINX1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患髓母細(xì)胞瘤等癌癥的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒，以及治療癌癥尤其是髓母細(xì)胞瘤的方法和藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK1465704SQ02112398
公開日2004年1月7日 申請日期2002年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月5日
發(fā)明者孔祥銀, 李靖, 胡蘭靛 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院