專利名稱：在cho細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在CHO細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)重組產(chǎn)物基因的方法，涉及重組CHO細(xì)胞系，還涉及新的表達(dá)載體構(gòu)建物。
中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)被廣泛用于生產(chǎn)重組蛋白。除了諸如雜交瘤細(xì)胞系等淋巴細(xì)胞系之外，它是極少數(shù)能夠簡單而有效地進(jìn)行高密度動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系之一。而且，它們的產(chǎn)品得率非常高，抗代謝壓力能力較強(qiáng)，淋巴細(xì)胞則較難進(jìn)行產(chǎn)業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)。考慮到生產(chǎn)成本，這對于獲得生物反應(yīng)器每輪運行的蛋白最大得率來說至關(guān)重要。培養(yǎng)基組成的選擇，生物反應(yīng)器的設(shè)計和操作這些參數(shù)影響著得率，但其優(yōu)化十分復(fù)雜。增強(qiáng)調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動子的強(qiáng)度和轉(zhuǎn)錄活性更有可能提高得率。在靜止期以106至107細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度進(jìn)行基因表達(dá)的高密度或補(bǔ)料分批批培養(yǎng)中，單細(xì)胞表達(dá)水平的增長將轉(zhuǎn)化為相當(dāng)可觀的得率增長。
US5,866,359描述了一種在CHO細(xì)胞和NSO細(xì)胞內(nèi)通過弱啟動子與腺病毒E1A的共表達(dá)來增強(qiáng)本已很強(qiáng)的hCMV啟動子的表達(dá)。E1A是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，作用于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，同時具有獨立轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域和抑制功能結(jié)構(gòu)域。將E1A表達(dá)水平精調(diào)到較低水平是實現(xiàn)基因的反式激活和避免對細(xì)胞周期進(jìn)展造成不利影響之間理想平衡的關(guān)鍵。除了需要仔細(xì)選擇啟動子驅(qū)動的E1A表達(dá)之外，該系統(tǒng)的缺點還在于部分抑制E1A表達(dá)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成能力而不是目標(biāo)重組蛋白的表達(dá)。
WO95/17516在B細(xì)胞系的淋巴細(xì)胞例如廣泛使用的NSO骨髓瘤內(nèi)用鼠免疫球蛋白γ2A基因座將表達(dá)載體構(gòu)建物導(dǎo)向高活性基因座。NSO細(xì)胞是一種鼠漿細(xì)胞或B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系。唯有在B細(xì)胞內(nèi)，還該免疫球蛋白基因座的染色質(zhì)才處于完全活化且開放的狀態(tài)，才允許整合于這些基因座中的天然免疫球蛋白啟動子或重組表達(dá)構(gòu)建物表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)錄活性。
其缺點在于，由于同源重組原則，只有在含有該重組熱點的γ2A導(dǎo)向序列相匹配的鼠細(xì)胞系內(nèi)，導(dǎo)向序列才能有效定向；要獲得高水平的表達(dá)，γ2A基因座區(qū)必需是一個基因轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，這限制了導(dǎo)向序列與B細(xì)胞類細(xì)胞同源重組的有效性。
本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種適合CHO蛋白表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)啟動子的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，為CHO細(xì)胞的表達(dá)載體配備一段原用于在鼠B細(xì)胞內(nèi)同源重組的基因?qū)蛐蛄谐鋈艘饬系貙崿F(xiàn)了這一目標(biāo)。
附圖顯示了本發(fā)明幾種可能的實施方式。其中
圖1CHO-K1細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染中，hCMV啟動子和hCMV啟動子在IgG 2A熱點序列存在下的綠熒光蛋白(GFP)相對表達(dá)水平。
圖2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞內(nèi)，hCMV啟動子和hCMV啟動子在IgG 2A熱點序列存在下的GFP相對表達(dá)水平。
圖3帶有IgG 2A導(dǎo)向序列的hCMV-MIE表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。
根據(jù)本發(fā)明，一段用于在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組基因的DNA序列包含重組產(chǎn)物基因和調(diào)控該產(chǎn)物基因表達(dá)的啟動子，以CMV啟動子為佳，還包含能夠增強(qiáng)啟動子所調(diào)控表達(dá)的鼠免疫球蛋白γ2A基因座DNA序列或其片段或其序列變體。根據(jù)本發(fā)明，這樣的DNA序列可用于構(gòu)建在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組產(chǎn)物的表達(dá)載體。
根據(jù)本發(fā)明，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)包括以下步驟a.培養(yǎng)以表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，該表達(dá)載體含有能在CHO細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動重組蛋白表達(dá)的啟動子和能夠增強(qiáng)所述啟動子活性的鼠IgG 2A基因座DNA或其序列變體或其片段，和b.收獲產(chǎn)物蛋白。
本發(fā)明的重組產(chǎn)物指希望大量表達(dá)和收獲的產(chǎn)物蛋白。它可以是各種感興趣的蛋白質(zhì)，例如白介素之類治療用蛋白質(zhì)，酶，或抗體等多聚體蛋白的亞基，或它們的片段。重組產(chǎn)物基因可包含一段信號序列，其編碼的序列令表達(dá)的多肽向宿主生產(chǎn)細(xì)胞外分泌。本發(fā)明另一優(yōu)選實施方式中，所述產(chǎn)物蛋白是分泌蛋白。更好的是，第一蛋白或產(chǎn)物蛋白是抗體或基因工程抗體或其片段，最好是免疫球蛋白G(IgG)抗體。
鼠免疫球蛋白γ2A基因座(IgG 2A)的DNA序列最早在WO95/17516中被設(shè)計用作基因組導(dǎo)向序列用于產(chǎn)生高表達(dá)重組產(chǎn)物的穩(wěn)定重組B淋巴細(xì)胞系。B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞一般以極高的水平表達(dá)Ig重鏈基因座的免疫球蛋白RNA，這可能是因為其細(xì)胞類型特異性啟動子/轉(zhuǎn)錄因子活性和開放式染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明優(yōu)選的鼠免疫球蛋白γ2A基因序列與WO95/17516所用的導(dǎo)向序列相同。這是一段5.1kb的BamHI基因組片段，包括除CH1外顯子最5’部分之外全部的鼠Igγ 2A編碼區(qū)(Yamawaki-Kataoka，Y.等，美國科學(xué)院學(xué)報(1982)792623-2627；Hall，B等，分子免疫學(xué)(1989)26819-826；Yamawaki-Kataoka，Y.等，核酸研究(1981)91365-1381)。根據(jù)本發(fā)明，促進(jìn)定點同源重組不是相關(guān)的免疫球蛋白γ2A(IgG 2A)基因特性。因此，所述IgG 2A基因序列的各種變體或其片段或變體的片段，如果在CHO細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)條件下都能夠增強(qiáng)重組產(chǎn)物基因在啟動子例如優(yōu)選的hCMV啟動子調(diào)控下的表達(dá)，則都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
這樣，“功能性”變體包括例如堿基的插入、缺失或點突變，并可用本領(lǐng)域熟知的方法來產(chǎn)生，例如引物引導(dǎo)的PCR，“易錯”PCR，“基因改組(gene-shuffling)”PCR即通過PCR將交疊的DNA片段進(jìn)行重新組合，或者先對細(xì)菌克隆進(jìn)行體內(nèi)隨機(jī)誘變?nèi)缓笤贑HO細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因庫轉(zhuǎn)染和功能選擇。例如，隨機(jī)誘變可按照Miller，J.，的《分子遺傳學(xué)實驗》(冷泉港，1972)所述用烷基化劑或UV-輻照進(jìn)行?；蛘撸€可以采用宿主菌的天然突變株。
在DNA序列中，這樣的變體序列或序列片段與天然免疫球蛋白γ2A基因座相應(yīng)部分的序列同源性至少為65％，至少75％為佳，至少90％最好。例如，可以在位于膜外顯子2(M2)上游39bp處的天然StuI位點插入一個SalI限制位點作為鼠免疫球蛋白γ2A序列內(nèi)一個獨特的線性化位點；這樣的序列變體最初被設(shè)計用于定點重組導(dǎo)向，但也可用于本發(fā)明目的。
“啟動子”指引導(dǎo)RNA聚合酶與DNA結(jié)合并啟動RNA合成的一段DNA序列。本發(fā)明的啟動子是在CHO細(xì)胞內(nèi)有活性的啟動子。這樣的啟動子最好是強(qiáng)啟動子。強(qiáng)啟動子指在CHO-KI細(xì)胞內(nèi)引發(fā)mRNA合成的頻率等于或高于hCMV核心啟動子/增強(qiáng)子片段(US5168062)的啟動子。這樣的啟動子可以是例如US5589392所述的細(xì)胞類型依賴性啟動子，但更好的是通用強(qiáng)啟動子，尤其是組成型活性的病毒啟動子，例如SV40病毒的早期或晚期啟動子，人或鼠巨細(xì)胞病毒(mCMV或hCMV)的立即早期啟動子，單純性皰疹病毒的胸苷激酶(TK)啟動子，Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)啟動子(RS-LTR)，尤其好的是US5,385,839和/或EP-323997-A1所述的呈2.1kb PstI片段的hCMV-MIE啟動子。EP-323 997-A1所述的帶有hCMV主要立即早期(MIE)基因的完整首個功能性內(nèi)含子的hCMV啟動子尤為本發(fā)明實施方式所優(yōu)選。
用于本發(fā)明的hCMV啟動子在其上游/增強(qiáng)子部分最好沒有“調(diào)節(jié)子(modulator)”序列部分。已發(fā)現(xiàn)，“調(diào)節(jié)子”序列對hCMV啟動子在CHO細(xì)胞內(nèi)的活性不利，該序列從MIE轉(zhuǎn)錄起始位點-750bp處延伸至-1150bp(Meier等，1996，Intervirology39331-342，“hCMV立即早期基因表達(dá)的調(diào)控”)，在瞬時轉(zhuǎn)染中尤其不利。沒有調(diào)節(jié)子序列的IgG 2A熱點序列(無調(diào)節(jié)子或縮寫為mod-)對hCMV啟動子的增強(qiáng)效應(yīng)甚至更明顯。
瞬時轉(zhuǎn)染的特征在于不對載體所帶的選擇標(biāo)記施加任何選擇壓力。瞬時轉(zhuǎn)染所得的是一混合細(xì)胞群，其中既有攝取了外源DNA并能夠表達(dá)的細(xì)胞也有沒有攝取外源DNA的細(xì)胞。那些表達(dá)外源表達(dá)盒的細(xì)胞常常還沒有將轉(zhuǎn)染的DNA整合到基因組內(nèi)，因而容易丟失外源DNA，而且其在瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞群培養(yǎng)物中的生長優(yōu)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所以，剛轉(zhuǎn)染后的表達(dá)最強(qiáng)，而后逐漸減弱。較好的是，將本發(fā)明所述的瞬時轉(zhuǎn)染子理解為能夠在轉(zhuǎn)染后，在無選擇壓力的條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)物中維持90小時的細(xì)胞。
較好的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，尤其是就前述hCMV啟動子而言。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染即新引入的外源DNA通過隨機(jī)非同源重組被整合到基因組DNA內(nèi)；就載體序列而言，本發(fā)明所述的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可能丟失與重組產(chǎn)物基因表達(dá)非直接相關(guān)的部分載體序列，例如在基因組整合后成為多余的細(xì)菌拷貝數(shù)控制區(qū)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞至少向基因組內(nèi)整合了表達(dá)載體的一部分或多個不同部分。類似的，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞還包括用兩個或數(shù)個DNA序列轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞從而至少在體內(nèi)形成本發(fā)明表達(dá)載體必需元件的功能性對等物，即合適的啟動子和IgG 2A熱點序列調(diào)控下的產(chǎn)物基因。關(guān)于DNA片段轉(zhuǎn)染后功能性DNA序列的體內(nèi)裝配可參見例如WO99/53046。如果進(jìn)一步受到為基因擴(kuò)增而施加的選擇壓力，這樣的穩(wěn)定整合可能會在CHO細(xì)胞內(nèi)形成雙微染色體。這也屬于本發(fā)明所述的“穩(wěn)定”。本發(fā)明表達(dá)載體隨機(jī)整合到CHO細(xì)胞基因組內(nèi)后，導(dǎo)向序列將增強(qiáng)啟動子促進(jìn)重組產(chǎn)物蛋白表達(dá)的活性。這一效應(yīng)是無法基于成熟鼠B細(xì)胞系例如漿細(xì)胞瘤(plasmacytoma)骨髓瘤細(xì)胞系內(nèi)的同源基因定向所實現(xiàn)或預(yù)見的；在那樣的定向中，IgG 2A導(dǎo)向序列的作用僅限于提高高得率同源整合子(integrants)的頻率，因為IgG 2A基因座是一重組“熱點”。如上所述，在合適的目標(biāo)B細(xì)胞內(nèi)，免疫球蛋白基因組區(qū)的染色質(zhì)處于開放的高活性狀態(tài)。
“表達(dá)載體”指轉(zhuǎn)染后mRNA在合適的哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。正確構(gòu)建的表達(dá)載體通常應(yīng)包含至少一個可在動物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記，用于插入重組產(chǎn)物基因的表達(dá)盒使其處于上游啟動子區(qū)調(diào)控之下的數(shù)量有限的有用的限制位點。如果僅用于瞬時/游離型表達(dá)，表達(dá)載體還可以包含一個復(fù)制起點，例如Eppstein Barr病毒(EBV)或SV40病毒的復(fù)制起點，用于在真核細(xì)胞宿主內(nèi)自我復(fù)制/游離型維持，但可以沒有選擇性標(biāo)記。表達(dá)載體例如但不限于線性DNA片段，包含細(xì)胞核定向序列或針對與轉(zhuǎn)染劑之間的相互作用而進(jìn)行了優(yōu)化的DNA片段，動物病毒或可以在細(xì)菌之間穿梭和復(fù)制的合適的質(zhì)粒。可以采用各種常用選擇標(biāo)記，例如胸苷激酶(tk)，二氫葉酸還原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。優(yōu)選實施方式之一采用了可表達(dá)的GS選擇標(biāo)記(Bebbington等，1992，“以谷氨酰胺合成酶基因作為可擴(kuò)增選擇標(biāo)記，重組抗體在骨髓瘤細(xì)胞中的高水平表達(dá)”，Bio/Technology10169-175；Cockett等，1990，“利用谷氨酰胺合成酶基因擴(kuò)增，金屬蛋白酶組織抑制劑在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞內(nèi)的高水平表達(dá)”，Bio/Technology8662-667)。GS系統(tǒng)是僅有的兩種對治療用蛋白質(zhì)生產(chǎn)來說特別重要的系統(tǒng)之一。與二氫葉酸還原酶(DHFR)系統(tǒng)相比，GS系統(tǒng)在生長過程中具有很大的時間優(yōu)勢，因為該系統(tǒng)一般可由最初的轉(zhuǎn)染子形成高產(chǎn)細(xì)胞系，這樣就不必通過不斷提高選擇試劑濃度的多輪選擇來實現(xiàn)基因擴(kuò)增(Brown等，1992，“用谷氨酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)生產(chǎn)重組抗體的方法的發(fā)展”，Cytotechnology9231-236)。不用說，與采用表達(dá)標(biāo)記基因的第二轉(zhuǎn)錄單元等效的是利用例如常用的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點，一個表達(dá)單元可以用一個單順反子表達(dá)盒同時表達(dá)產(chǎn)物基因和標(biāo)記基因。反之，本發(fā)明的熱點IgG 2A序列和包含啟動子和/或標(biāo)記盒的表達(dá)盒不一定要在同一表達(dá)載體上順式運作；上述元件可以由共轉(zhuǎn)染的不同載體或DNA片段攜帶，然后在染色體上唯一的串聯(lián)整合位點進(jìn)行整合。
本發(fā)明的另一目的是提供用本發(fā)明DNA序列轉(zhuǎn)染的CHO宿主細(xì)胞。其它目的還包括轉(zhuǎn)染此類宿主細(xì)胞的方法和在此類宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組產(chǎn)物基因的方法。本發(fā)明說明書中對優(yōu)選實施方式的解說和引用同樣適用于以上所述本發(fā)明的其它目的。需要指出的是，用本發(fā)明DNA序列或載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞應(yīng)理解為瞬時轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。本發(fā)明可根據(jù)宿主細(xì)胞類型選用各種轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如本領(lǐng)域熟知的電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染等。
合適的宿主細(xì)胞系可以是各種中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(Puck等，1958，試驗醫(yī)學(xué)雜質(zhì)108945-955)?！八拗骷?xì)胞”指能在培養(yǎng)物中生產(chǎn)并表達(dá)所需的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細(xì)胞。合適的細(xì)胞系可以是例如CHO KI(ATCC CCL-61)，CHOpro-3，CHO DG44，CHO P12或dhfr-CHO細(xì)胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS77，1980，4216-4220)或DUXB 11(Simonsen等，PNAS80，1983，2495-2499)。在CHO細(xì)胞中，免疫球蛋白基因的基因座是不活躍的，因而染色質(zhì)處于緊密包裝(packaged)或閉合狀態(tài)。這樣，由于染色質(zhì)的這種特殊狀態(tài)，整合到免疫球蛋白基因座內(nèi)的任何基因構(gòu)建物都不能高水平地表達(dá)重組蛋白，除非該構(gòu)建物自帶能夠開啟染色質(zhì)中該表達(dá)盒兩側(cè)的旁側(cè)基因座調(diào)控區(qū)。而且，免疫球蛋白基因序列，尤其是其內(nèi)含子部分，表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)姆N間差異，例如在小鼠和倉鼠之間的差異。免疫球蛋白基因座的啟動子或增強(qiáng)子元件都是種特異性且組織特異性的，而且只在B細(xì)胞內(nèi)具有活性。各種天然免疫球蛋白啟動子可產(chǎn)物編碼完整IgG重鏈的全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，本發(fā)明鼠IgG 2A序列即使沒有這樣的天然啟動子存在仍然能夠在CHO細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)基因的表達(dá)。較好的是，本發(fā)明IgG 2A序列沒有這樣的啟動子。出人意料的是，用本發(fā)明表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，鼠IgG 2A導(dǎo)向序列甚至增強(qiáng)了CHO細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)(圖1)；這樣的瞬時表達(dá)是本發(fā)明方法的又一優(yōu)選實施方式。一般發(fā)生在轉(zhuǎn)染后20-50小時的瞬時表達(dá)試驗中，轉(zhuǎn)染載體一直是染色體外元件，沒有整合到基因組內(nèi)。
適合哺乳動物細(xì)胞系的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可參見例如US5633162。用于實驗室錐瓶培養(yǎng)或低密度細(xì)胞培養(yǎng)并根據(jù)不同細(xì)胞類型的需要而進(jìn)行了改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基有例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基(Morre，G.，美國醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志，199，p.519 f.1967)，L-15培養(yǎng)基(Leibovitz，A.等，美國衛(wèi)生雜志，78，1p.173 ff.1963)，Dulbecco’s改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)，Eagle’s基本必需培養(yǎng)基(MEM)，Ham’s F12培養(yǎng)基(Ham，R.等，美國科學(xué)院學(xué)報53，p288 ff.1965)或Iscoves’s改進(jìn)的無白蛋白、運鐵蛋白和卵磷脂的DMEM(Iscoves等，試驗醫(yī)學(xué)雜志1，p.923 ff.，1978)。例如，Hams’s F10或F12培養(yǎng)基是專門為CHO細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的。其它適合CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基可參見EP-481 791。已知，可在這樣的培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)加胎牛血清(FBS，又稱FCS)，從而提供激素和生長因子的充沛的天然來源。動物細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在已經(jīng)是一種常規(guī)操作，在科教課本和手冊中有詳盡的描述，例如，在R.Ian Fresney，《動物細(xì)胞培養(yǎng)手冊》第4版(Wiley-Liss/N.Y.，2000)有詳細(xì)的記載。
較好的是，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基不含胎牛血清(FBS或FCS)，可稱為“無血清”。在無血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞一般需要胰島素和運鐵蛋白以達(dá)到最佳生長狀態(tài)。至少部分運鐵蛋白可以用非肽類螯合劑或WO94/02592所述的環(huán)庚三烯酚酮等鐵載體取代，或通過提高某種有機(jī)鐵的含量并最好配以抗氧化劑例如維生素C來取代。大多數(shù)細(xì)胞系需要一種或多種合成生長因子(包含重組多肽)，包括例如表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，胰島素樣生長因子I和II(IGFI，IGFII)等。可能需要的其它因子還包括前列腺素，轉(zhuǎn)運和結(jié)合蛋白(例如血漿銅藍(lán)蛋白，高密度和低密度載脂蛋白，牛血清白蛋白(BSA))，激素，包括甾體類激素，以及脂肪酸。多肽因子試驗最好按步驟進(jìn)行，即在已知促生長多肽存在下測試新的多肽因子。那些生長因子是合成或重組的。在動物培養(yǎng)方面有多種方法，其中之一如下所述。首先需確定細(xì)胞從加血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移過來后能夠存活和/或緩慢生長3-6天的條件。對大多數(shù)細(xì)胞類型來說，這至少部分取決于接種密度。一旦找到了最適的激素/生長因子/多肽補(bǔ)劑就可降低存活所需的接種密度。在一更好的實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基不含蛋白質(zhì)，即沒有胎牛血清和各種蛋白質(zhì)生長因子補(bǔ)劑或諸如重組運鐵蛋白之類其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明方法即重組蛋白表達(dá)和收獲的一種可能的實施方式是動物宿主細(xì)胞在例如工業(yè)分批生物反應(yīng)器內(nèi)的高密度生長。然后可進(jìn)行傳統(tǒng)的下游加工。為此，必需采用高密度生長培養(yǎng)基。此類高密度生長培養(yǎng)基通?？裳a(bǔ)充以全氨基酸等營養(yǎng)素，前述含量的葡萄糖之類能源，無機(jī)鹽，維生素，微量元素(即最終濃度以微摩爾計的無機(jī)化合物)，緩沖劑，四種核苷或相應(yīng)的核苷酸，(還原態(tài))谷胱苷肽、維生素C等抗氧化劑，以及其它重要成分，例如重要的膜脂類，例如膽固醇或磷酯酰膽堿，或脂類前體，例如膽堿或肌醇。高密度培養(yǎng)基中上述化合物中的大多數(shù)或全部被增濃(強(qiáng)化)，使得它們的含量高于前述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，將GB2251249與RPMI1640相比既可看出這一點，但是作為滲透壓調(diào)節(jié)基準(zhǔn)的無機(jī)鹽沒有被增濃。較好的是，本發(fā)明的高密度培養(yǎng)基中完全氨基酸除色氨酸外都被均衡強(qiáng)化，含量超過每升培養(yǎng)基75mg。較好的是，在達(dá)到氨基酸總體要求之外，谷氨酰胺和/或天冬酰胺的含量超過1g/L，超過2g/L更好。本發(fā)明中，高密度細(xì)胞培養(yǎng)物指動物細(xì)胞群中活細(xì)胞的即時密度至少為105個/毫升，至少106個/毫升更好，該集群由單細(xì)胞或低活細(xì)胞密度的接種物在恒量或遞增量的培養(yǎng)基中連續(xù)配以而得。
更好的實施方式中，分批培養(yǎng)物是一個培養(yǎng)物系統(tǒng)，其中，如GB2251249所述，在通過分批補(bǔ)料來控制葡萄糖濃度之外，至少向細(xì)胞培養(yǎng)物中補(bǔ)加谷氨酰胺，或者還有一種或數(shù)種其它氨基酸(優(yōu)選甘氨酸)以保持它們在培養(yǎng)基中的濃度。更好的是，將谷氨酰胺或許還有一種或數(shù)種其它氨基酸的補(bǔ)加與一種或多種能源例如葡萄糖的補(bǔ)加相結(jié)合，如EP-229809A所述。首次補(bǔ)料一般在培養(yǎng)開始后25-60小時；例如，可以在細(xì)胞密度達(dá)到106個/毫升左右時開始加料。眾所周知，在培養(yǎng)的動物細(xì)胞中，“谷氨酰胺分解”(McKeehan等，1984，“動物細(xì)胞中的谷氨酰胺分解”，培養(yǎng)細(xì)胞中的糖代謝，M.J.Morgan編輯，Plenum出版社，紐約，pp.11-150)可能成為生長期的重要能源。補(bǔ)加谷氨酰胺和/或天冬酰胺(關(guān)于用天冬酰胺替代谷氨酰胺可參見Kurano，N等，1990，生物技術(shù)雜志15，113-128)的總量一般為0.5-10g/L培養(yǎng)物，以1-2g/L為佳；補(bǔ)料中可以包含的其它氨基酸的總補(bǔ)料量為10-300mg/L培養(yǎng)物，具體地說，甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的補(bǔ)料量可以相對較高，至少150-200mg。所述補(bǔ)料可以是間歇式添加(shot-addition)或連續(xù)泵送添加，優(yōu)選幾乎連續(xù)地向生物反應(yīng)器泵送補(bǔ)料。不用說，在分批培養(yǎng)過程中，通過加堿或緩沖劑，生物反應(yīng)器內(nèi)的pH被精心調(diào)控為最適合給定細(xì)胞系的生理pH。用葡萄糖作為能源時，總葡萄糖補(bǔ)料量一般為1-10g/L培養(yǎng)物，以3-6g/L為佳。補(bǔ)料中除氨基酸外最好還含有少量例如5-20mg/L培養(yǎng)物的膽堿。更好的是，膽堿的補(bǔ)加與乙醇胺的補(bǔ)加相結(jié)合，就象US6048728所述，尤其是同時補(bǔ)加谷氨酰胺的時候。不用說，如果采用GS-標(biāo)記系統(tǒng)，谷氨酰胺的需量低于非GS-標(biāo)記系統(tǒng)，內(nèi)源性產(chǎn)生的谷氨酰胺之外過量谷氨酰胺的累積會產(chǎn)生氨和中毒。對GS來說，培養(yǎng)基或補(bǔ)料中的谷氨酰胺一般可用它的對等物和/或前體代替，即用天冬酰胺和/或谷氨酸。
本發(fā)明的另一個目的在于設(shè)計一種表達(dá)載體，它包含至少一個(第一)產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄單元，該單元在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后即產(chǎn)生蛋白質(zhì)，而且該單元受小鼠巨細(xì)胞病毒啟動子(mCMV啟動子)調(diào)控，還包含一個第二轉(zhuǎn)錄單元，該單元包含谷氨酰胺合成酶(GS)標(biāo)記基因。所述產(chǎn)物基因，或稱之為感興趣基因(GOI)，可以是例如免疫球蛋白編碼序列。谷氨酰胺合成酶標(biāo)記基因是編碼具有酶活性的GS的序列，包括天然序列或其變體。前文關(guān)于“功能性變體”的定義，包括序列同源性優(yōu)選范圍，同樣適用于此。較好的是，所述GS標(biāo)記基因是一哺乳動物GS標(biāo)記基因或其衍生物。出人意料的是，與第一轉(zhuǎn)錄單元中感興趣基因受hCMV啟動子調(diào)控的表達(dá)載體相比，這樣的載體進(jìn)入CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率高得多。這并非因為mCMV啟動子在CHO細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性比mCMV啟動子高得多；通常認(rèn)為，轉(zhuǎn)染后，較高的代謝負(fù)荷會降低克隆的存活率，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染子較少。這樣，不能簡單地將這一效果與所表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量或意料之外的不利于轉(zhuǎn)染子生長的毒性相關(guān)聯(lián)。實際上，以上發(fā)現(xiàn)大大出乎本領(lǐng)域技術(shù)人員的預(yù)料。
本發(fā)明的其它目的包括以表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的動物宿主細(xì)胞尤其是CHO細(xì)胞和相關(guān)轉(zhuǎn)染方法，所述載體可以保持處于染色體外，也可穩(wěn)定地整合到基因組內(nèi)。同樣，用兩個或更多個基因片段轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞尤其是CHO細(xì)胞，這多個基因片段體內(nèi)形成作為本發(fā)明目標(biāo)的轉(zhuǎn)錄單元的功能對等物，這也包括在轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞這一定義之中。較好的是，所述宿主細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，即第一和第二轉(zhuǎn)錄單元都整合到染色體內(nèi)。
本發(fā)明的另一目的是提供mCMV啟動子用于提高在CHO細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染率的用途，優(yōu)選用如下表達(dá)載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體包含至少一個第一產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄單元，該單元在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后即產(chǎn)生蛋白質(zhì)，而且該單元受小鼠巨細(xì)胞病毒啟動子(mCMV啟動子)調(diào)控，還包含一個第二轉(zhuǎn)錄單元，該單元包含谷氨酰胺合成酶(GS)標(biāo)記基因。所述第一和第二表達(dá)序列由不同的載體攜帶，或者作為分處不同表達(dá)單元中的基因片段。而且，可以用帶有mCMV的第一轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)染表達(dá)GS的已重組CHO細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，“提高轉(zhuǎn)染率”通過在相同轉(zhuǎn)染條件和相同細(xì)胞培養(yǎng)條件下，對相同宿主細(xì)胞，將mCMV啟動子和本發(fā)明表達(dá)載體存在下的轉(zhuǎn)染率與相同表達(dá)載體中mCMV被換以US5658759所述和本發(fā)明SEQID NO3所示hCMV-第一內(nèi)含子增強(qiáng)子/啟動子構(gòu)建物的轉(zhuǎn)染率相比較來定義。對于給定的相同產(chǎn)物基因，該hCMV-內(nèi)含子MIE-啟動子構(gòu)建物是測定轉(zhuǎn)染率增強(qiáng)效果的參照標(biāo)準(zhǔn)。較好的是，mCMV可將轉(zhuǎn)染率提高至少10倍。
以上定義都同樣適用于本發(fā)明的各項目的。需要強(qiáng)調(diào)的是，鼠IgG 2A導(dǎo)向序列并不是實現(xiàn)本發(fā)明目標(biāo)的前提。
鼠細(xì)胞巨噬病毒(mCMV)是高度多樣性的皰疹病毒科的一員。即使是不同宿主的巨噬細(xì)胞病毒之間也可能存在顯著差異。例如，mCMV與人巨噬細(xì)胞病毒(hCMV)在生物學(xué)特性、立即早期(IE)基因組織和總體核酸序列上都存在相當(dāng)大的差異。而且，235kbp的mCMV沒有hCMV特征性的內(nèi)部重復(fù)序列和末端重復(fù)序列。所以，mCMV基因組沒有異構(gòu)體(Ebeling，A等，1983，病毒學(xué)雜志47，421-433；Mercer J.A.等，(1983)，病毒學(xué)129，94-126)。根據(jù)本發(fā)明，可以利用基本對應(yīng)于US4968615所述約2.1kb PstI片段的啟動子區(qū)或其功能性片段。更好的實施方式中，所用的cMCV啟動子片段包含轉(zhuǎn)錄起始點(+0)至此前-500bp序列。出人意料的是，這一片段驅(qū)動的表達(dá)比自-500bp再向前多800bp的啟動子盒更強(qiáng)。在最好的實施方式中使用的是啟動子核心區(qū)，即自轉(zhuǎn)錄起始點至上游-150bp左右處的Xho I限制位點，甚至從天然轉(zhuǎn)錄起始點至上游-100bp的序列。不用說，為了包含合適的限制位點以便插入重組產(chǎn)物基因，可以人工改造轉(zhuǎn)錄起始點。
根據(jù)本發(fā)明，受mCMV啟動子調(diào)控的第一轉(zhuǎn)錄單元可以包含至少一段內(nèi)含子序列。這一做法是本領(lǐng)域的常識，是為了穩(wěn)定RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以提高由相應(yīng)的mRNA合成蛋白質(zhì)的效率。但是，為了蛋白質(zhì)合成的效率，不考慮對轉(zhuǎn)染率的影響，不建議在mCMV啟動子構(gòu)建物內(nèi)包含mCVM的天然內(nèi)含子。與hCMV啟動子的情形(US5591639)相反，這樣的mCMV第一內(nèi)含子會降低mCMV啟動子下重組基因的表達(dá)，所以不是優(yōu)選實施方式。
序列表給出了GS標(biāo)記基因盒的優(yōu)選、可能實施方式。SEQ ID NO1(pEE15.1hCMV/GFP+熱點)和SEQ ID NO2(pEE14.4 hCMV/GFP)是適宜的SV40(早、晚)啟動子調(diào)控的GS基因盒范例，這是一個中等偏弱啟動子，序列中還包含一個hCMV啟動子調(diào)控下的GFP(綠熒光蛋白)表達(dá)盒。SEQ ID NO1是SV40早期啟動子調(diào)控下的GS cDNA序列，有關(guān)其細(xì)節(jié)詳見附圖3。SEQ ID NO2一人造GS小基因盒，其中包含一個SV40晚期啟動子調(diào)控下的內(nèi)含子。CHO細(xì)胞不是天然谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷型的，所以可以進(jìn)行Cockett等所述的選擇方案(1990，“利用谷氨酰胺合成酶基因擴(kuò)增在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)金屬蛋白酶的組織抑制劑”，Bio/Technology8662-667)。該文獻(xiàn)還例舉了適合CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法例如，可以采用經(jīng)典的磷酸鈣沉淀法或較新的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)。轉(zhuǎn)染率一般定義為受轉(zhuǎn)染細(xì)胞群中轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞(瞬時轉(zhuǎn)染)或克隆(選擇期后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)的數(shù)量。本發(fā)明的效果可以通過例如用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(任意市售試劑和生產(chǎn)商的說明書)以包含SEQ ID NO3(pEE12.4 hCMV-GFP+SV 40早期啟動子/GS cDNA)或SEQ IDNO4(pEE12.4 mCMV-GFP+SV 40早期啟動子/GS cDNA)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞來展現(xiàn)?？蓪⑥D(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)在各種常規(guī)培養(yǎng)基中。這些培養(yǎng)基可以是前述含血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。較好的是含血清培養(yǎng)基，尤其是補(bǔ)充了至少1％(v/v)胎血清，最好是至少5％(v/v)胎血清，例如胎牛血清。另一優(yōu)選實施方式采用電穿孔轉(zhuǎn)染法。
實施例實驗1包含熱點序列的GFP載體在CHO-K1內(nèi)的瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)CHO-K1細(xì)胞(ATCC CCL-6)在含10％FCS的普通細(xì)胞培養(yǎng)基(GMEM-S)中適應(yīng)和培養(yǎng)。為了進(jìn)行GS選擇，培養(yǎng)基必須完全不含谷氨酰胺，如后文表1所示；因此必需使用經(jīng)透析FCS。培養(yǎng)均為36.5℃、125rpm的搖瓶培養(yǎng)。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(SuperfectinTM，Gibco，UK)，轉(zhuǎn)染子細(xì)胞群的綠熒光在FACS中用488nm激發(fā)波長測定。對每一種GS/GFP載體構(gòu)建物，各進(jìn)行5次轉(zhuǎn)染，所有數(shù)據(jù)都是分析5個獨立細(xì)胞群所得的平均值。從轉(zhuǎn)染后48小時的瞬時轉(zhuǎn)染子開始，挑選細(xì)胞數(shù)vs.熒光度圖中表達(dá)水平為最高值10％的活細(xì)胞來確定平均熒光度(圖1)。通過在正向vs.側(cè)向散射圖(Forward vs.Sideward scatter diagram)中通過門控(gating)挑選出活細(xì)胞群。
為了產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子，轉(zhuǎn)染后24小時，在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中添加25μMMSX(甲硫氨酸sulphoximine，Crockett等，ibd.)，繼續(xù)培養(yǎng)且定期分割培養(yǎng)物，持續(xù)26天，如此選擇GS標(biāo)記。觀察其它氨基酸水平的中值對于MSX選擇強(qiáng)度的影響，參見Bebbington等，US5827739。然后如上所述進(jìn)行熒光度分析(圖2)。
以非轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照。SEQ ID NO1展示了熱點載體(pEE15.1’hCMV+熱點)，它驅(qū)動GFP在hCMV啟動子調(diào)控下的表達(dá)，該啟動子含有完整的CMV第一內(nèi)含子，該載體實際上就是圖3所示的pEE15.1載體內(nèi)多接頭區(qū)的Eco RI限制位點插入了GFP序列。對應(yīng)于SEQ ID NO3的pEE 12.4‘hCMV與pEE 15.1’hCMV+熱點的區(qū)別僅在于不含內(nèi)有IgG 2A序列的5.1kb的Bam H1片段。將pEE 12.4作為載體對照。另一個載體對照是pEE 12.4‘hCMV(Kozak-)’，是通過引物引導(dǎo)的誘變(Sambrook等，《分子克隆》，冷泉港，1983)將與翻譯起始點重合的克隆位點的Kozak序列(GCCGCCACCATGG)移碼突變?yōu)楣δ苄訩ozak序列(ACCATGGTCCATGG)而形成的，由此消除了原先的Kozak翻譯起始點。SEQID NO1所示的載體被進(jìn)一步刪除hCMV增強(qiáng)子部分400bp的調(diào)節(jié)子區(qū)，刪除轉(zhuǎn)錄起點上游-750bp處的增強(qiáng)子元件，由此形成pEE 15.1‘hCMV(mod-)/GS cDNA’。如圖2所示，將pEE 15.1(圖3)的GS cDNA盒換作SEQ ID NO2所示的pEE 14.4‘hCMV(mod-)/GFP的GS(小基因)，形成pEE 15.1‘hCMV(mod-)/GS小基因。這樣，所有被轉(zhuǎn)染細(xì)胞都含有包含GFP編碼序列的質(zhì)粒載體。GS小基因含有單個GS基因的第一內(nèi)含子和一段約1kb的3’側(cè)翼DNA，處于SV40晚期啟動子調(diào)控下；據(jù)信，基因組GS DNA的3’部分可提高載體DNA的拷貝數(shù)，因而可提高被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的GS含量(見US4770359，Bebbington等)。雖然本發(fā)明的所用的hCMV載體都表達(dá)GS cDNA序列中的GS標(biāo)記基因，仍使用GS小基因作為又一對照來排除GS拷貝數(shù)和表達(dá)水平可能造成的影響。
為了分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GHO細(xì)胞的產(chǎn)生和表達(dá)，用線性化的熱點載體pEE 15.1‘hCMV+熱點’載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Sal I線性化質(zhì)粒在含IgG 2A的序列部分被切斷，游離的DNA末端可能促進(jìn)基因組區(qū)域的重組，所述基因組區(qū)域的兩側(cè)DNA需與所述末端具有一定程度同源性，由此可測試鼠IgG 2A在CHO細(xì)胞內(nèi)可能具有的定向效果。Pvu I切斷在細(xì)菌內(nèi)酰胺酶標(biāo)記基因內(nèi)，因而能夠促進(jìn)異源隨機(jī)重組。實際上，Pvu I線性化轉(zhuǎn)染子內(nèi)的熒光度較高，說明載體線性化有一定的影響，而且CHO細(xì)胞內(nèi)向免疫球蛋白基因座的定向不能解釋本發(fā)明的效果。此外，在瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞群中也一樣觀察到啟動子活性增強(qiáng)與各個載體構(gòu)建物的相對強(qiáng)度密切相關(guān)。顯然，在轉(zhuǎn)染早期沒有發(fā)生基因組整合。
圖3顯示了約12830bp的載體pEE 15.1。有關(guān)GS標(biāo)記和hCMV-p/內(nèi)含子表達(dá)盒的詳細(xì)描述可參見US5827739和US5591639。pEE 15.1是本發(fā)明表達(dá)載體的一種可能實施方式，但其多接頭位點中沒有插入編碼重組產(chǎn)物蛋白的DNA序列。SEQ ID NO1展示了含有GFP的pEE 15.1構(gòu)建物全部13535bp的序列其中，GFP編碼序列插在讀碼框內(nèi)的Eco RI限制位點，該位點位于中部的12814堿基處；該獨特限制位點含有ATG起始密碼并優(yōu)化了起始密碼的Kozak序列環(huán)境，其詳述可參見US5591639。這樣，GFP蛋白表達(dá)就處于hCMV-重要立即早期基因啟動子(hCMF-MIE或簡寫為hCMV)調(diào)控下，其后則緊接hCMV-MIE基因的第一內(nèi)含子，再后面是Nco I位點(見US5591639)。多接頭區(qū)下游的SV40聚A位點確保了聚腺苷酸化的完成。pEE 15.1還含有一段編碼倉鼠谷氨酰胺合成酶(GS)的cDNA序列，該序列受SV40早期啟動子調(diào)控，其后是SV40內(nèi)含子+聚A序列。IgG 2A基因座或“熱點”序列(陰影框CH1，Hi，CH2，CH3，M1和M2代表重鏈恒區(qū)，鉸鏈區(qū)，細(xì)胞膜錨定區(qū))即WO9517516及其參考文獻(xiàn)中所述的鼠IgG 2A基因座的5.1kb BamH I片段。圖中顯示了獨特的Pvu I和Sal I限制位點。
實驗2用電穿孔法以mCMV p12.4-GFP構(gòu)建物(SEQ ID NO4)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞將附壁CHO-K1細(xì)胞(ATCC CCL-61)培養(yǎng)在EP-48791所述含2mM谷氨酰胺并補(bǔ)加了10％FCS的Iscoves’s DMEM培養(yǎng)基中?？蛇x的是，在如實驗1所述進(jìn)行GS標(biāo)記選擇之前，可用表1所示含2mM谷氨酰胺的G-MEM培養(yǎng)基。使細(xì)胞脫壁，沉淀，然后在無血清培養(yǎng)基中重懸兩次，最后配成每毫升5.3×106個細(xì)胞的密度。每批750μl，總共4×106個細(xì)胞接受電穿孔。如《分子生物學(xué)方法》，JA Nickoloff編，Humana出版社，1995，Vol.48/Chap.8“動物細(xì)胞電穿孔和電融合方法”所述進(jìn)行電穿孔。將p12.4mCMV-GFP載體DNA(SEQ ID NO4)線性化。將50μl(20μg)DNA加入電穿孔小杯內(nèi)的750μl細(xì)胞中，進(jìn)行300V/750μFD，約12-14毫秒的電穿孔。然后，將800μl細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T75錐形瓶中的25ml改進(jìn)型Glasgow-MEM(GMEM，Gibco)培養(yǎng)基(含10％胎血清，但不含谷氨酰胺，詳見表1)中進(jìn)行GS選擇。將12.9ml分入第二T75錐形瓶，37℃和10％CO2中培養(yǎng)過夜。
次日，加入補(bǔ)充了10％FBS+33.3μM MSX的GS選擇GMEM培養(yǎng)基。這樣，MSX的最終濃度約為25μM。繼續(xù)培養(yǎng)26天后，計點每瓶中的菌落數(shù)亦即轉(zhuǎn)染子數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)倒置顯微鏡對每一培養(yǎng)瓶進(jìn)行顯微鏡檢，陽性克隆發(fā)出亮綠的光，因而很容易計點。
SEQ ID NO4所示的mCMV構(gòu)建物產(chǎn)生的菌落數(shù)比SEQ ID NO3所示hCMV構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞多20倍。這兩種載體構(gòu)建物的區(qū)別僅在于驅(qū)動GFP表達(dá)的CMV啟動子不同，載體的其余部分是一樣的(包括GS標(biāo)記；p12.4的cDNA GS-標(biāo)記盒)。如果在轉(zhuǎn)染后立即將細(xì)胞稀釋并加入96格培養(yǎng)板，mCMV細(xì)胞形成的菌落(＞400個)仍比hCMV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(約45個)多。
表1GS選擇培養(yǎng)基A.儲備液
1.雙蒸水高壓滅菌，每份400ml2.10×Glasgow MEM(GMEM)培養(yǎng)基，不含谷氨酰胺(GIBCO042-2541，在UK)。4℃保存。
3.7.5％碳酸氫鈉(GIBCO043-05080，在UK；670-5080，在US)。4℃保存。
4.100×非必需氨基酸(NEAA)(GIBCO043-01140，在UK；320-1140，在US)。4℃保存。
5.100×谷氨酸+天冬酰胺(G+A)加600mg谷氨酸和600mg天冬酰胺(Sigma)。用蒸餾水配制成100ml，經(jīng)2μm濾膜(Nalgene)過濾除菌。4℃保存。
6.100mM丙酮酸鈉(GIBCO043-01360，在UK；320-1360，在US)7.50×核苷35mg腺苷35mg鳥苷35mg胞苷35mg尿苷12mg胸苷都購自Sigma。用水配制成100ml溶液，過濾除菌，分成每份10ml于-20℃保存。
8.經(jīng)透析FCS(GIBCO014-06300)。在56℃熱滅活30分鐘，-20℃保存。采用GS選擇時，必需使用經(jīng)透析FCS。
9.每毫升5000單位的青霉素-鏈霉素(P/SGIBCO043-05070，在UK；600-5070，在US)。
10.100mM L.MSX(Sigma)配成18mg/ml的PBS溶液。過濾除菌，-20℃保存。
B.培養(yǎng)基的制備以無菌操作按以下順序依次加入以下物質(zhì)，配制成GMEM-S培養(yǎng)基。
1.水400ml2.10×GMEM 50ml3.碳酸氫鈉 18.1ml4.NEAA 5ml5.G+A 5ml6.丙酮酸鈉 5ml7.核苷 10ml
8.經(jīng)透析FCS 50ml9.青霉素-鏈霉素 5mlGMEM-S培養(yǎng)基含有非必需氨基酸，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，脯氨酸和絲氨酸(100μM)，谷氨酸和天冬酰胺(500μM)，腺苷，鳥苷，胞苷和尿苷(30μM)，以及胸苷(10μM)。
序列表<110>英國龍沙生物醫(yī)藥股份有限公司<120>在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白的方法<130>049369<150>GB0216648.6<151>2002-07-19<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6679<212>DNA<213>倉鼠(Hamster sp.)<220>
<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.4環(huán)形質(zhì)粒GS載體p12.4短mCMV-GFP/克隆3<400>1gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420
cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct 480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt 540tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca 600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca 660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg 720cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc 780tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc 840cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa 900cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg 960acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa1020aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt1080tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct1140gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct1200cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc1260cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt1320atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc1380tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat1440ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa1500acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa1560aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga1620aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct1680tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga1740cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc1800catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg1860ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat1920aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat1980ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg2040caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc2100attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa2160agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc2220actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt2280ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag2340
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2400gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2460atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2520cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2580gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 2640gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 2700ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 2760gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggccctga tggctctttg cggcacccat 2820cgttcgtaat gttccgtggc accgaggaca accctcaaga gaaaatgtaa tcacactggc 2880tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat aaggagacac tttatgttta agaaggttgg 2940taaattcctt gcggctttgg cagccaagct agatccggct gtggaatgtg tgtcagttag 3000ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 3060agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 3120tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 3180ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 3240aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 3300gcctaggctt ttgcaaaaag ctagcttggg gccaccgctc agagcacctt ccaccatggc 3360cacctcagca agttcccact tgaacaaaaa catcaagcaa atgtacttgt gcctgcccca 3420gggtgagaaa gtccaagcca tgtatatctg ggttgatggt actggagaag gactgcgctg 3480caaaacccgc accctggact gtgagcccaa gtgtgtagaa gagttacctg agtggaattt 3540tgatggctct agtacctttc agtctgaggg ctccaacagt gacatgtatc tcagccctgt 3600tgccatgttt cgggacccct tccgcagaga tcccaacaag ctggtgttct gtgaagtttt 3660caagtacaac cggaagcctg cagagaccaa tttaaggcac tcgtgtaaac ggataatgga 3720catggtgagc aaccagcacc cctggtttgg aatggaacag gagtatactc tgatgggaac 3780agatgggcac ccttttggtt ggccttccaa tggctttcct gggccccaag gtccgtatta 3840ctgtggtgtg ggcgcagaca aagcctatgg cagggatatc gtggaggctc actaccgcgc 3900ctgcttgtat gctggggtca agattacagg aacaaatgct gaggtcatgc ctgcccagtg 3960ggaactccaa ataggaccct gtgaaggaat ccgcatggga gatcatctct gggtggcccg 4020tttcatcttg catcgagtat gtgaagactt tggggtaata gcaacctttg accccaagcc 4080cattcctggg aactggaatg gtgcaggctg ccataccaac tttagcacca aggccatgcg 4140ggaggagaat ggtctgaagc acatcgagga ggccatcgag aaactaagca agcggcaccg 4200gtaccacatt cgagcctacg atcccaaggg gggcctggac aatgcccgtg gtctgactgg 4260
gttccacgaa acgtccaaca tcaacgactt ttctgctggt gtcgccaatc gcagtgccag 4320catccgcatt ccccggactg tcggccagga gaagaaaggt tactttgaag accgcggccc 4380ctctgccaat tgtgacccct ttgcagtgac agaagccatc gtccgcacat gccttctcaa 4440tgagactggc gacgagccct tccaatacaa aaactaatta gactttgagt gatcttgagc 4500ctttcctagt tcatcccacc ccgccccaga gagatctttg tgaaggaacc ttacttctgt 4560ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa 4620tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcca 4680acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt 4740tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat gaggctactg ctgactctca acattctact 4800cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact ttccttcaga attgctaagt 4860tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt gctttgctat ttacaccaca 4920aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa aatattctgt aacctttata 4980agtaggcata acagttataa tcataacata ctgttttttc ttactccaca caggcataga 5040gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa 5100ggggttaata aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac 5160cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 5220acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 5280ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 5340tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctctagct tcgtgtcaag 5400gacggtgagg cgcgcctact gagtcattag ggactttcca atgggttttg cccagtacat 5460aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat 5520agggactttc cattgggttt tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt 5580ttttcccatt attggcacgt acataaggt caataggggtg agtcattggg tttttccagc 5640caatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta 5700atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct 5760cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt 5820ttcccctgga aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt 5880ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc 5940agaagcttgc cgccaccatg gtgagcaagc agatcctgaa gaacaccggc ctgcaggaga 6000tcatgagctt caaggtgaac ctggagggcg tggtgaacaa ccacgtgttc accatggagg 6060gctgcggcaa gggcaacatc ctgttcggca accagctggt gcagatccgc gtgaccaagg 6120gcgcccccct gcccttcgcc ttcgacatcc tgagccccgc cttccagtac ggcaaccgca 6180
ccttcaccaa gtaccccgag gacatcagcg acttcttcat ccagagcttc cccgccggct 6240tcgtgtacga gcgcaccctg cgctacgagg acggcggcct ggtggagatc cgcagcgaca 6300tcaacctgat cgaggagatg ttcgtgtacc gcgtggagta caagggccgc aacttcccca 6360acgacggccc cgtgatgaag aagaccatca ccggcctgca gcccagcttc gaggtggtgt 6420acatgaacga cggcgtgctg gtgggccagg tgatcctggt gtaccgcctg aacagcggca 6480agttctacag ctgccacatg cgcaccctga tgaagagcaa gggcgtggtg aaggacttcc 6540ccgagtacca cttcatccag caccgcctgg agaagaccta cgtggaggac ggcggcttcg 6600tggagcagca cgagaccgcc atcgcccagc tgaccagcct gggcaagccc ctgggcagcc 6660tgcacgagtg ggtgtaata6679<210>2<211>8251<212>DNA<213>倉鼠(Hamster sp.)<220>
<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.3環(huán)形質(zhì)粒GS載體p12.4 hCMVp-6FP/克隆13<400>2gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt540tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg720
cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc780tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc840cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa900cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg960acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1020aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1080tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1140gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1200cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1260cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1320atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 1380tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 1440ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 1500acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 1560aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 1620aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 1680tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 1740cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1800catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 1860ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 1920aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 1980ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2040caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2100attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2160agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2220actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 2280ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 2340ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2400gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2460atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2520cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2580gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 2640
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 2700ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 2760gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggccctga tggctctttg cggcacccat 2820cgttcgtaat gttccgtggc accgaggaca accctcaaga gaaaatgtaa tcacactggc 2880tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat aaggagacac tttatgttta agaaggttgg 2940taaattcctt gcggctttgg cagccaagct agatccggct gtggaatgtg tgtcagttag 3000ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 3060agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 3120tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 3180ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 3240aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 3300gcctaggctt ttgcaaaaag ctagcttggg gccaccgctc agagcacctt ccaccatggc 3360cacctcagca agttcccact tgaacaaaaa catcaagcaa atgtacttgt gcctgcccca 3420gggtgagaaa gtccaagcca tgtatatctg ggttgatggt actggagaag gactgcgctg 3480caaaacccgc accctggact gtgagcccaa gtgtgtagaa gagttacctg agtggaattt 3540tgatggctct agtacctttc agtctgaggg ctccaacagt gacatgtatc tcagccctgt 3600tgccatgttt cgggacccct tccgcagaga tcccaacaag ctggtgttct gtgaagtttt 3660caagtacaac cggaagcctg cagagaccaa tttaaggcac tcgtgtaaac ggataatgga 3720catggtgagc aaccagcacc cctggtttgg aatggaacag gagtatactc tgatgggaac 3780agatgggcac ccttttggtt ggccttccaa tggctttcct gggccccaag gtccgtatta 3840ctgtggtgtg ggcgcagaca aagcctatgg cagggatatc gtggaggctc actaccgcgc 3900ctgcttgtat gctggggtca agattacagg aacaaatgct gaggtcatgc ctgcccagtg 3960ggaactccaa ataggaccct gtgaaggaat ccgcatggga gatcatctct gggtggcccg 4020tttcatcttg catcgagtat gtgaagactt tggggtaata gcaacctttg accccaagcc 4080cattcctggg aactggaatg gtgcaggctg ccataccaac tttagcacca aggccatgcg 4140ggaggagaat ggtctgaagc acatcgagga ggccatcgag aaactaagca agcggcaccg 4200gtaccacatt cgagcctacg atcccaaggg gggcctggac aatgcccgtg gtctgactgg 4260gttccacgaa acgtccaaca tcaacgactt ttctgctggt gtcgccaatc gcagtgccag 4320catccgcatt ccccggactg tcggccagga gaagaaaggt tactttgaag accgcggccc 4380ctctgccaat tgtgacccct ttgcagtgac agaagccatc gtccgcacat gccttctcaa 4440tgagactggc gacgagccct tccaatacaa aaactaatta gactttgagt gatcttgagc 4500ctttcctagt tcatcccacc ccgccccaga gagatctttg tgaaggaacc ttacttctgt 4560
ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa 4620tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcca 4680acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt 4740tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat gaggctactg ctgactctca acattctact 4800cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact ttccttcaga attgctaagt 4860tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt gctttgctat ttacaccaca 4920aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa aatattctgt aacctttata 4980agtaggcata acagttataa tcataacata ctgttttttc ttactccaca caggcataga 5040gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa 5100ggggttaata aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac 5160cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 5220acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 5280ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 5340tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctagcttc gtgtcaagga 5400cggtgactgc agtgaataat aaaatgtgtg tttgtccgaa atacgcgttt tgagatttct 5460gtcgccgact aaattcatgt cgcgcgatag tggtgtttat cgccgataga gatggcgata 5520ttggaaaaat cgatatttga aaatatggca tattgaaaat gtcgccgatg tgagtttctg 5580tgtaactgat atcgccattt ttccaaaagt gatttttggg catacgcgat atctggcgat 5640agcgcttata tcgtttacgg gggatggcga tagacgactt tggtgacttg ggcgattctg 5700tgtgtcgcaa atatcgcagt ttcgatatag gtgacagacg atatgaggct atatcgccga 5760tagaggcgac atcaagctgg cacatggcca atgcatatcg atctatacat tgaatcaata 5820ttggccatta gccatattat tcattggtta tatagcataa atcaatattg gctattggcc 5880attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaacatt 5940accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 6000agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 6060ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 6120gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 6180ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 6240atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 6300catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 6360gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 6420gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 6480
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 6540agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 6600ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc 6660caagagtgac gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acccccttgg cttcttatgc 6720atgctatact gtttttggct tggggtctat acacccccgc ttcctcatgt tataggtgat 6780ggtatagctt agcctatagg tgtgggttat tgaccattat tgaccactcc cctattggtg 6840acgatacttt ccattactaa tccataacat ggctctttgc cacaactctc tttattggct 6900atatgccaat acactgtcct tcagagactg acacggactc tgtattttta caggatgggg 6960tctcatttat tatttacaaa ttcacatata caacaccacc gtccccagtg cccgcagttt 7020ttattaaaca taacgtggga tctccacgcg aatctcgggt acgtgttccg gacatgggct 7080cttctccggt agcggcggag cttctacatc cgagccctgc tcccatgcct ccagcgactc 7140atggtcgctc ggcagctcct tgctcctaac agtggaggcc agacttaggc acagcacgat 7200gcccaccacc accagtgtgc cgcacaaggc cgtggcggta gggtatgtgt ctgaaaatga 7260gctcggggag cgggcttgca ccgctgacgc atttggaaga cttaaggcag cggcagaaga 7320agatgcaggc agctgagttg ttgtgttctg ataagagtca gaggtaactc ccgttgcggt 7380gctgttaacg gtggagggca gtgtagtctg agcagtactc gttgctgccg cgcgcgccac 7440cagacataat agctgacaga ctaacagact gttcctttcc atgggtcttt tctgcagtca 7500ccgtccttga cacgaagctt gccgccacca tggtgagcaa gcagatcctg aagaacaccg 7560gcctgcagga gatcatgagc ttcaaggtga acctggaggg cgtggtgaac aaccacgtgt 7620tcaccatgga gggctgcggc aagggcaaca tcctgttcgg caaccagctg gtgcagatcc 7680gcgtgaccaa gggcgccccc ctgcccttcg ccttcgacat cctgagcccc gccttccagt 7740acggcaaccg caccttcacc aagtaccccg aggacatcag cgacttcttc atccagagct 7800tccccgccgg cttcgtgtac gagcgcaccc tgcgctacga ggacggcggc ctggtggaga 7860tccgcagcga catcaacctg atcgaggaga tgttcgtgta ccgcgtggag tacaagggcc 7920gcaacttccc caacgacggc cccgtgatga agaagaccat caccggcctg cagcccagct 7980tcgaggtggt gtacatgaac gacggcgtgc tggtgggcca ggtgatcctg gtgtaccgcc 8040tgaacagcgg caagttctac agctgccaca tgcgcaccct gatgaagagc aagggcgtgg 8100tgaaggactt ccccgagtac cacttcatcc agcaccgcct ggagaagacc tacgtggagg 8160acggcggctt cgtggagcag cacgagaccg ccatcgccca gctgaccagc ctgggcaagc 8220ccctgggcag cctgcacgag tgggtgtaat a 8251<210>3
<211>10369<212>DNA<213>倉鼠(Hamster sp.)<220>
<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.2環(huán)形質(zhì)粒GS-小基因載體p14.4 Delta調(diào)節(jié)子(mod-)hCMVp-GFP/克隆6<400>3gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt540tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg720cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc780tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc840cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa900cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg960acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1020aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1080tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1140gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1200cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1260cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1320
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 1380tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 1440ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 1500acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 1560aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 1620aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 1680tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 1740cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1800catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 1860ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 1920aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 1980ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2040caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2100attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2160agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2220actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 2280ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 2340ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2400gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2460atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2520cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2580gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 2640gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 2700ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 2760gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggccctga tggctctttg cggcacccat 2820cgttcgtaat gttccgtggc accgaggaca accctcaaga gaaaatgtaa tcacactggc 2880tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat aaggagacac tttatgttta agaaggttgg 2940taaattcctt gcggctttgg cagccaagct agatccagct ttttgcaaaa gcctaggcct 3000ccaaaaaagc ctcctcacta cttctggaat agctcagagg ccgaggcggc ctcggcctct 3060gcataaataa aaaaaattag tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt 3120aggggcggga tgggcggagt taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcatg 3180ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa 3240
ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct 3300aactgacaca cattccacag ggaagctagc ttggaattaa ttccccgccc ccttccaata 3360caaaaactaa ttagactttg agtgatcttg agcctttcct agtttttgta ttggaagggc 3420tcgtcgccag tctcattgag aaggcatgtg cggacgatgg cttctgtcac tgcaaagggg 3480tcacaattgg cagaggggcg gcggtcttca aagtaacctt tcttctcctg ccgagccgag 3540aatgggagta gagccgactg cttgattccc acaccaatct cctcgccgct ctcacttcgc 3600ctcgttctcg tggctcgtgg ccctgtccac cccgtccatc atcccgccgg ccaccgctca 3660gagcaccttc caccatggcc acctcagcaa gttcccactt gaacaaaaac atcaagcaaa 3720tgtacttgtg cctgccccag ggtgagaaag tccaagccat gtatatctgg gttgatggta 3780ctggagaagg actgcgctgc aaaacccgca ccctggactg tgagcccaag tgtgtagaag 3840agttacctga gtggaatttt gatggctcta gtacctttca gtctgagggc tccaacagtg 3900acatgtatct cagccctgtt gccatgtttc gggacccctt ccgcagagat cccaacaagc 3960tggtgttctg tgaagttttc aagtacaacc ggaagcctgc agagaccaat ttaaggcact 4020cgtgtaaacg gataatggac atggtgagca accagcaccc ctggtttgga atggaacagg 4080agtatactct gatgggaaca gatgggcacc cttttggttg gccttccaat ggctttcctg 4140ggccccaagg tccgtattac tgtggtgtgg gcgcagacaa agcctatggc agggatatcg 4200tggaggctca ctaccgcgcc tgcttgtatg ctggggtcaa gattacagga acaaatgctg 4260aggtcatgcc tgcccagtgg gaactccaaa taggaccctg tgaaggaatc cgcatgggag 4320atcatctctg ggtggcccgt ttcatcttgc atcgagtatg tgaagacttt ggggtaatag 4380caacctttga ccccaagccc attcctggga actggaatgg tgcaggctgc cataccaact 4440ttagcaccaa ggccatgcgg gaggagaatg gtctgaagta agtagctccc tctggaccat 4500ctttattctc atggggtgga aggcctttgt gttagggttg ggaaaagttg gacttctcac 4560aaactacatg ccatgctctt cgtgtttgtc ataagcctat cgttttgtac ccgttggaga 4620agtgacagta ctctaggaat agaattacag ctgtgatatg ggaaagttgt cacgtaggtt 4680caagcattta aaggtcttta gtaagaacta aatacacata caagcaagtg ggtgacttaa 4740ttcttactga tgggaagagg ccagtgatgg gggtcttccc atccaaaaga taattggtat 4800tacatgttga ggactggtct gaagcacttg agacataggt cacaaggcag acacagcctg 4860catcaagtat ttattggttt cttatggaac tcatgcctgc tcctgccctt gaaggacagg 4920tttctagtga caaggtcaga ccctcacctt tactgcttcc accaggcaca tcgaggaggc 4980catcgagaaa ctaagcaagc ggcaccggta ccacattcga gcctacgatc ccaagggggg 5040gctggacaat gcccgtggtc tgactgggtt ccacgaaacg tccaacatca acgacttttc 5100tgctggtgtc gccaatcgca gtgccagcat ccgcattccc cggactgtcg gccaggagaa 5160
gaaaggttac tttgaagacc gccgcccctc tgccaattgt gacccctttg cagtgacaga 5220agccatcgtc cgcacatgcc ttctcaatga gactggcgac gagcccttcc aatacaaaaa 5280ctaattagac tttgagtgat cttgagcctt tcctagttca tgccaccccg ccccagctgt 5340ctcattgtaa ctcaaaggat ggaatatcaa cggtcttttt attcctcgtg cccagttaat 5400ccttgctttt attggtcaga atagaggagt caagttctta atgcctatac accaacctca 5460tttcttttct atttagcttt ctacgtgggg gtgggagggg tagggagggg taggcgaagg 5520gaacgtaacc acatgcttca tctcatcagg aatgccatgt ccagtaggca gagctgccac 5580agagtgggtg tatttgtgga ggaggacttt ttcttcagga cagttaaaag agcaggtcca 5640ctgcttggat tgacaattcc cctataggta gagagcttgc tagttcttca ggtaaaccaa 5700ctttctattc caaatggaag ttaggtgagg agtagtggag gagttaatgc cctccatgaa 5760gacagctcag tgtatcacct gagacagatg ggtagcccta ctgtaaaaga aggaaaagtt 5820atttctgggt cctccattta taacacaaag cagtagtatt tttatattta aatgtaaaaa 5880caaaagttat atatatgata tgtggatata tgtgtatttc taattcagaa accatcctag 5940ttactgggtt tgccaagttt gaagagcttg gttaacaaga aaggatctct tgagtagagg 6000tgggggtgca gtaccaggaa aggtggttat ctggggctca gcgctttatt actatgtggg 6060gtttcccctg cccactctgc aggagcagat gctggacagg tagcagggtg ggacaccagt 6120gcttgccacc acctgtccct gtgcttaggc taagatgcat atgtatccac acagagttag 6180caggatggag ttggctggtc aacttgaaca ttgttactga taggggtggg tggggtttat 6240tttttggtgg gactagcatg tcactaaagc aggccttttg atatattaaa ttttttaaag 6300caaaacaagt tcagctttta atcaactttg tagggtttct aactttacag aattgcctgt 6360ttgtttcagt gtctccatcc actttgctct tggaggaacg gaggacaggc agacctggag 6420ttaaaacatt tgtcattttg tgtcatagtg tctactttct cccagcagaa tattcctttc 6480cttcttagga gtcctatgga gttttgtttt tgtttttttt ctattacgat aaacataccc 6540cacctccatt ctggcttgcc ctgctgttct ctggttgttt gtgtgctgtc cgcagcaggc 6600tgcctgtggt tttctcttgc catgacgact tctaattgcc atgtacagta tgttcagtta 6660gataactcct cattgtaaac agactgtaac tgccagagca gcgcttataa atcaacctaa 6720catttataag atttcctctt gacttgtttc tttgtggttg ggggaggaag aaaaaaaaaa 6780gcgtgcagta tttttttgtt ccttcatttc ctatcaaaag aaaggggagt ggttctgttt 6840tgtttactcg caaaataagc tagcttatct attggctttt cttttttttt ttttttttaa 6900acgggctttt tcttgtacct ataatttggg gtaaggtgtg agagttttta tagttttttg 6960agacagggtc ttggtgtata cccttggctg gcctggagct aactatgtag actgggctag 7020cctttaactt gcagttctgc tttcaattag ggtttataca tttagtcttg gcaattccta 7080
gttccacgtt taatctcttt acatttcaaa gcagtgttat ctgaagagtt caggcgcaga 7140gtcaattcaa tagagttaca caaaaaccta aaaaacaagt tttaaatacc aagttatgtt 7200ggcctggcca cttttcacag ctgtccacaa ctcaatgtga caaggctaca aattggatat 7260actagaattt cctggtgatt tggaacccct gcttcatttc ccggaaccag ggcttttggt 7320gacagtccta gcttatcaga ttatttaaaa cagttactct tcctgccctt cttcctgaga 7380cctttgtcca gctgccatga gccatctaca cagtacttgc ttccctgttg aagtcactga 7440aggcacatca gcccaagaca taaaggcttg tcccggattc actagcctgg tgaacttgtg 7500gttctctgat gttttgtcct gttttgttgt gatttagtct caaatttccc agcctggttt 7560gaaaatctgg gctcccagcc ttcaataagg aggactacag atatgtacga ctgagccttg 7620attccagcct catgtttata cgtctgtgct cagctccctg aaggttccag tttgaaactc 7680aataatccag gggtcagaaa gtcttgatct tatccccaca gtatggcacc aagcctggct 7740gagccttctg acttagtctg ccctgttgct atttaagcac ttttcttcac taggctaaaa 7800ataaaaggag cttcctcctt tgccatggcg ctgtgcatga taggaaaagg tagctatcta 7860ctagcatatt aactccactg tttttgcttt gtgtgtttgg tttttgagga agggtctcaa 7920ctgtgtatcc ctggctggcc tggccggatc tagcttcgtg tcaaggacgg tgaggcgcgc 7980caatattggc tattggccat tgcatacgtt gtatccatat cataatatgt acatttatat 8040tggctcatgt ccaacattac cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 8100atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 8160ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 8220gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 8280acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 8340tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 8400ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 8460ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 8520ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 8580tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 8640tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt 8700tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc ggccgggaac ggtgcattgg 8760aacgcggatt ccccgtgcca agagtgacgt aagtaccgcc tatagagtct ataggcccac 8820ccccttggct tcttatgcat gctatactgt ttttggcttg gggtctatac acccccgctt 8880cctcatgtta taggtgatgg tatagcttag cctataggtg tgggttattg accattattg 8940accactcccc tattggtgac gatactttcc attactaatc cataacatgg ctctttgcca 9000
caactctctt tattggctat atgccaatac actgtccttc agagactgac acggactctg9060tatttttaca ggatggggtc tcatttatta tttacaaatt cacatataca acaccaccgt9120ccccagtgcc cgcagttttt attaaacata acgtgggatc tccacgcgaa tctcgggtac9180gtgttccgga catgggctct tctccggtag cggcggagct tctacatccg agccctgctc9240ccatgcctcc agcgactcat ggtcgctcgg cagctccttg ctcctaacag tggaggccag9300acttaggcac agcacgatgc ccaccaccac cagtgtgccg cacaaggccg tggcggtagg9360gtatgtgtct gaaaatgagc tcggggagcg ggcttgcacc gctgacgcat ttggaagact9420taaggcagcg gcagaagaag atgcaggcag ctgagttgtt gtgttctgat aagagtcaga9480ggtaactccc gttgcggtgc tgttaacggt ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt9540tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag ctgacagact aacagactgt tcctttccat9600gggtcttttc tgcagtcacc gtccttgaca cgaagcttgc cgccaccatg gtgagcaagc9660agatcctgaa gaacaccggc ctgcaggaga tcatgagctt caaggtgaac ctggagggcg9720tggtgaacaa ccacgtgttc accatggagg gctgcggcaa gggcaacatc ctgttcggca9780accagctggt gcagatccgc gtgaccaagg gcgcccccct gcccttcgcc ttcgacatcc9840tgagccccgc cttccagtac ggcaaccgca ccttcaccaa gtaccccgag gacatcagcg9900acttcttcat ccagagcttc cccgccggct tcgtgtacga gcgcaccctg cgctacgagg9960acggcggcct ggtggagatc cgcagcgaca tcaacctgat cgaggagatg ttcgtgtacc 10020gcgtggagta caagggccgc aacttcccca acgacggccc cgtgatgaag aagaccatca 10080ccggcctgca gcccagcttc gaggtggtgt acatgaacga cggcgtgctg gtgggccagg 10140tgatcctggt gtaccgcctg aacagcggca agttctacag ctgccacatg cgcaccctga 10200tgaagagcaa gggcgtggtg aaggacttcc ccgagtacca cttcatccag caccgcctgg 10260agaagaccta cgtggaggac ggcggcttcg tggagcagca cgagaccgcc atcgcccagc 10320tgaccagcct gggcaagccc ctgggcagcc tgcacgagtg ggtgtaata 10369<210>4<211>13535<212>DNA<213>倉鼠(Hamster sp.)<220>
<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.1環(huán)形質(zhì)粒GS+IgG 2A熱點導(dǎo)向載體pEE 15.1 hCMVp-GFP/克隆11<400>4gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc 300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa 360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg 420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct 480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt 540tcaacaggtc tagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca 600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca 660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcga atatgccggc 720atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 780gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 840ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg 900tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag 960agcgtcgagt cctccgtgtt cgaagcgatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc1020tgtcctgcag tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg1080gcccagccag tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa1140gaaaattggt gaggaaaaca aggggagtag aggttcacaa gtgattagtc taaggcctta1200gcctagctag accagccagg atcagcagcc atcaccaaaa atgggaactt ggcccagaag1260agaaggagat actgactgtg actccctctt ggaaacttct aactatgacc acctaccttc1320aaggtcatga tcctctagga tagatgtcct tggtcatttc caggatcatc ctgacctaag1380gccataccca gggacaaagt ccctggtttg gtgccttttc tccttcaaac ttgagtaacc1440cccagccttc tctctgcaga gcccagaggg cccacaatca agccctgtcc tccatgcaaa1500tgcccaggta agtcactaga ccagagctcc acccgggaga atggtaagtg ctgtaaacat1560ccctgcacta gaggataagc catgtacaga tccatttcca tctctcctca tcagcaccta1620acctcttggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga1680tctccctgag ccccatagtc acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg1740
tccagatcag ctggtttgtg aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata 1800gagaggatta caacagtact ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact 1860ggatgagtgg caaggagttc aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg 1920agagaaccat ctcaaaaccc aaaggtgaga gctgcagcct gactgcatgg gggctgggat 1980gggcataagg ataaaggtct gtgtggacag ccttctgctt cagccatgac ctttgtgtat 2040gtttctaccc tcacagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 2100gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 2160gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 2220ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 2280aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 2340cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaatgag ctcagcaccc acaaaactct 2400caggtccaaa gagacaccca cactcatctc catgcttccc ttgtataaat aaagcaccca 2460ccaatgcctg ggaccatgta aaactgtcct ggttctttcc aaggtataga gcatagctca 2520caggctgata tttctggcca gggttggagg acagccttgt ctataggaag agaatgaggt 2580ttttgcactg caggactcag agctcattag ttatcctgcc ttggagtgtt ggggcttggc 2640tttaggcagt gccttttcct tgccttccta cgaaccagca gctgccatac atagagataa 2700tcctaggaag cctcaaatgg agaaggacac aaacccacct ccctcaggct gttcctctat 2760cccggcccca cttctttacc taggggtttc tctgagtcta ttgtggagtt acacatggcc 2820aggggcattc cagagaccct tgtcatccat acactcaact caggcagctt tgcacaaaca 2880aagtctgcac acccatacag atggctcact cttgcctgtg ccatgtaggg ctgaggcaca 2940tggctcttgc tgccccaagg gagggactat tagatagcca cactcatgct gaatcctggc 3000ccattcaaat tagcctgctg aacaccatcc agtccatata gcacatgtat ccacatgcac 3060gtgtgcacaa aacgcattta atacactggg acaacaattc tgtgccctgc acagcaccta 3120tatccagcaa tgtatcacca tacacacgac caaaaaaatt caatgcccac gtttctgcca 3180tcacaaacag acacatcttt cctctctgtg gccactgcat tatatgctca acacaagacc 3240tctgaagcca gatccatctc tggcacctcg gggtcatgct tcaaccccac atgaattatg 3300caaaccatag ccataatggt ctgaatcact tcacactggg atgttcccaa gttcaggcaa 3360gacgagccac aggctctgct gatgactgaa ggacagcaaa gggtcagtcc agctgtatag 3420ccactgttga cctgggtcac aggccctgct gaccctccac cttctcctgt actgaaggaa 3480tgaaagatga gacaagcata gagggcactt gaataatcca ggtcactctg aggtccaccc 3540aaggcattat tggactcagg tgggaagctg agactggtgt cccagaggga aaggaaggaa 3600agcaggcccc ggggagggtc tgctgtccca gtcaggctgg agatctctcc tctgaatcca 3660
tgcagacatg tctgcctcac agggaatctc tcccagcacc aaccatgttg ggacaaacac 3720tgactgtcct ctctgttcag ggctagacct ggatgatgtc tgtgctgagg cccaggacgg 3780ggagctggac ggcctctgga cgaccatcac catcttcatc agcctcttcc tgctcagcgt 3840gtgctacagc gcctctgtca cactcttcaa ggttggcact gtctcccacc ctctgctgtg 3900atggctacac tgaccacaaa atgtcctctc actcctcccc agatgtagta ggacgttact 3960ttgctgcccc tactctgtcc cacacaccat ttcctccatt ccctgagcca tcccacattg 4020ttctatgtga ctccacattg tgtcccatac agtctgccct tctgtctctc tggctgtcct 4080gcgtgatcct gatactgtct tatgagacca aacctccttg cattccacac tagccttcat 4140gaggttcaat gctgtcttac acacaatccc ctcagcctca ccatggctca aggtactctg 4200tgagctatcc tcataccatc tccacctcaa ctcccacaat atctccactc tgacccctcc 4260catacccagt ctcctacctg tatgaaggga attgaaggag agacaggtcg acctctgtct 4320ttcccacaga ttggagggtc tgagcatggg cgtggtctct gactttctct cacttcccca 4380caggtaaagt ggatcttctc ctctgtggtg gagctgaagc agacgatctc ccctgactac 4440agaaacatga ttgggcaggg agcctaggcc acttcctctg ggatcagaag agcttcctag 4500gccctgcaga agcccatcca tcctactgtg cagcctaaca gggaggccac actctagccc 4560tatgactctc tgatcagaac tcccatggtc tcctctttgg aggaccacgt gcagtgcagg 4620ctttgcccag acctaaacac ttccacagca gtcgccagat atctaactac tccggaccag 4680aagaaccatc tccttccaaa ccagcactag ggatctgaga tctcagaatg tttgcctaag 4740aagagctgga aatccaggct tcctgtgttc tgctacaagg acatcagcct ggatttgacc 4800tggaccacac attttcatct aaatgagttt tccacaaagg acacgtttca gatccttgaa 4860tgagacctct acatggaaga ccagagtcac tatacccaaa ggtcactctg tatccttgca 4920ccagctatac tggacagctt ccttcctggt acttcagtga ccctggctga ggaaaggatc 4980tgtgacctca actgtttgga gagcctctgg aagatgtagt cttctcttcc tgctaccacc 5040aacatgctgg atctcagatg cagaatccaa tccacagaca ccactgacca cacaacctga 5100agacaaggcc attgccacct ccacagagat gccatccaca ctctgtggag aaataaggag 5160tgctttgtgc agcctctgca aagctctggc agggattaga gtatacacac tgagtactga 5220ctaggtgacc aggcagaaaa acctccagga gaaggaacaa tgggggagag atgtgaacag 5280atagttagaa aaagcatggt gtcacaggtc tgctctgtgg actgatttcc agattggacc 5340acctacagca gaaaccatcg gttgcagtgg caatctagga ggaccaacct ggaataggag 5400ggctgctgtg gtcaatggag agtagacctg tatctatttc tccactgcct cttatgacca 5460ataagaagcc agagtctcca gacagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 5520gaaagagaga gagagagaga gagagagaga gaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa 5580
ggaaggaagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggaga gagagagaga gagagagaga 5640gagagagaga gagcaccagc ttttctgtga ctggaaggaa atgcttagag agcttggatc 5700tttaaagctt cttttttcta gagaccatga atgtctttgt tctctctctc tctctctctc 5760tctctctctc tctctctctc tctctctgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg 5820tgcatgcacg ctattgtttt ggcatttgaa acaataaaac attcttttaa tattctgtat 5880ctcatggttc cccttctgtg tggatcagcc ctaacaccca ggaacagggg acaataaaca 5940gaccacagcc atgtacagcc ttctacctcc cttctggttc tgacctccca gaggtccctc 6000agtgggcccc tcacagctgg gtttcttccc tggcagtgcc accaagagct caggcacctc 6060tgagctggag gctgtcctga tgccataggc aggctatgga gcagagatga tgaccacggt 6120ggactccagg tgagccaggc aaagcctccc atgccagaag agaagcgtgt ggtactcact 6180ggcctcgggc tgctacggat tcagcaaaga gcatggatcg cttcgaagcc tccaagctcg 6240acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6300aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6360tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6420gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct 6480cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6540cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6600atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6660tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 6720ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6780acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6840aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 6900aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 6960tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 7020cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 7080catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 7140ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 7200aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 7260ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7320caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7380attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 7440agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 7500
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 7560ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 7620ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 7680gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 7740atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 7800cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 7860gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 7920gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 7980ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 8040gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggccctga tggctctttg cggcacccat 8100cgttcgtaat gttccgtggc accgaggaca accctcaaga gaaaatgtaa tcacactggc 8160tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat aaggagacac tttatgttta agaaggttgg 8220taaattcctt gcggctttgg cagccaagct agagatccgg ctgtggaatg tgtgtcagtt 8280agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 8340ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 8400catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 8460aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 8520agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg 8580aggcctaggc ttttgcaaaa agctagcttg gggccaccgc tcagagcacc ttccaccatg 8640gccacctcag caagttccca cttgaacaaa aacatcaagc aaatgtactt gtgcctgccc 8700cagggtgaga aagtccaagc catgtatatc tgggttgatg gtactggaga aggactgcgc 8760tgcaaaaccc gcaccctgga ctgtgagccc aagtgtgtag aagagttacc tgagtggaat 8820tttgatggct ctagtacctt tcagtctgag ggctccaaca gtgacatgta tctcagccct 8880gttgccatgt ttcgggaccc cttccgcaga gatcccaaca agctggtgtt ctgtgaagtt 8940ttcaagtaca accggaagcc tgcagagacc aatttaaggc actcgtgtaa acggataatg 9000gacatggtga gcaaccagca cccctggttt ggaatggaac aggagtatac tctgatggga 9060acagatgggc acccttttgg ttggccttcc aatggctttc ctgggcccca aggtccgtat 9120tactgtggtg tgggcgcaga caaagcctat ggcagggata tcgtggaggc tcactaccgc 9180gcctgcttgt atgctggggt caagattaca ggaacaaatg ctgaggtcat gcctgcccag 9240tgggaactcc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct ctgggtggcc 9300cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt tgaccccaag 9360cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac caaggccatg 9420
cgggaggaga atggtctgaa gcacatcgag gaggccatcg agaaactaag caagcggcac9480cggtaccaca ttcgagccta cgatcccaag gggggcctgg acaatgcccg tggtctgact9540gggttccacg aaacgtccaa catcaacgac ttttctgctg gtgtcgccaa tcgcagtgcc9600agcatccgca ttccccggac tgtcggccag gagaagaaag gttactttga agaccgcggc9660ccctctgcca attgtgaccc ctttgcagtg acagaagcca tcgtccgcac atgccttctc9720aatgagactg gcgacgagcc cttccaatac aaaaactaat tagactttga gtgatcttga9780gcctttccta gttcatccca ccccgcccca gagagatctt tgtgaaggaa ccttacttct9840gtggtgtgac ataattggac aaactaccta cagagattta aagctctaag gtaaatataa9900aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc9960caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag gaaaacctgt 10020tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct caacattcta 10080ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca gaattgctaa 10140gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct atttacacca 10200caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct gtaaccttta 10260taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca cacaggcata 10320gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt ttaatttgta 10380aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcat aatcagccat 10440accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg 10500aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac 10560aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 10620tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatctctag cttcgtgtca 10680aggacggtga ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat 10740ttctgtcgcc gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc 10800gatattggaa aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt 10860tctgtgtaac tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg 10920cgatagcgct tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat 10980tctgtgtgtc gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg 11040ccgatagagg cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc 11100aatattggcc attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt 11160ggccattgca tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa 11220cattaccgcc atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 11280cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 11340
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 11400taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 11460acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 11520gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 11580agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 11640atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 11700atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 11760ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 11820gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 11880gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 11940gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt 12000atgcatgcta tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg 12060tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt 12120ggtgacgata ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt 12180ggctatatgc caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat 12240ggggtctcat ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca 12300gtttttatta aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg 12360ggctcttctc cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg 12420actcatggtc gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca 12480cgatgcccac caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa 12540atgagctcgg ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag 12600aagaagatgc aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg 12660cggtgctgtt aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg 12720ccaccagaca taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca 12780gtcaccgtcc ttgacacgaa gcttgccgcc accatggtga gcaagcagat cctgaagaac 12840accggcctgc aggagatcat gagcttcaag gtgaacctgg agggcgtggt gaacaaccac 12900gtgttcacca tggagggctg cggcaagggc aacatcctgt tcggcaacca gctggtgcag 12960atccgcgtga ccaagggcgc ccccctgccc ttcgccttcg acatcctgag ccccgccttc 13020cagtacggca accgcacctt caccaagtac cccgaggaca tcagcgactt cttcatccag 13080agcttccccg ccggcttcgt gtacgagcgc accctgcgct acgaggacgg cggcctggtg 13140gagatccgca gcgacatcaa cctgatcgag gagatgttcg tgtaccgcgt ggagtacaag 13200ggccgcaact tccccaacga cggccccgtg atgaagaaga ccatcaccgg cctgcagccc 13260
agcttcgagg tggtgtacat gaacgacggc gtgctggtgg gccaggtgat cctggtgtac 13320cgcctgaaca gcggcaagtt ctacagctgc cacatgcgca ccctgatgaa gagcaagggc 13380gtggtgaagg acttccccga gtaccacttc atccagcacc gcctggagaa gacctacgtg 13440gaggacggcg gcttcgtgga gcagcacgag accgccatcg cccagctgac cagcctgggc 13500aagcccctgg gcagcctgca cgagtgggtg taata 1353權(quán)利要求
1.一種以表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含在CHO細(xì)胞內(nèi)具有活性并驅(qū)動重組產(chǎn)物蛋白表達(dá)的啟動子和鼠IgG 2A基因座DNA內(nèi)增強(qiáng)所述啟動子活性部分。
2.如權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞，所述載體還包含編碼選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄單元，所述選擇標(biāo)記以谷氨酰胺合成酶標(biāo)記為佳。
3.如權(quán)利要求1或2所述的CHO細(xì)胞，所述CHO細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
4.一種表達(dá)重組蛋白的方法，包括以下步驟c.培養(yǎng)以表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含在CHO細(xì)胞內(nèi)具有活性并驅(qū)動重組產(chǎn)物蛋白表達(dá)的啟動子和鼠IgG 2A基因座DNA內(nèi)增強(qiáng)所述啟動子的活性的部分；d.收獲產(chǎn)物蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，所述啟動子是強(qiáng)病毒啟動子，以hCMV啟動子為佳。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，所述IgG 2A基因座部分沒有天然免疫球蛋白啟動子。
7.一種哺乳動物表達(dá)載體，至少包括包含產(chǎn)物基因并受mCMV啟動子調(diào)控的第一轉(zhuǎn)錄單元，還包括包含谷氨酰胺合成酶標(biāo)記基因的第二轉(zhuǎn)錄單元。
8.用權(quán)利要求7所述載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。
全文摘要
一種用包含鼠IgG 2A基因座的表達(dá)載體在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白的方法。
文檔編號C12N15/87GK1668749SQ03816914
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者R·卡利邁耶, R·蓋伊 申請人:英國龍沙生物醫(yī)藥股份有限公司