專利名稱：一種無(wú)血清培養(yǎng)基與濃縮液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)用品，尤其是涉及一種用于在體外培養(yǎng)人和動(dòng)物的組織和細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基與濃縮液及其制備方法。
國(guó)外早在1979年就開(kāi)始進(jìn)行了無(wú)血清培養(yǎng)法的研究?，F(xiàn)國(guó)外生產(chǎn)的無(wú)血清培養(yǎng)基種類很多，分別適用于昆蟲(chóng)細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、皮膚角朊細(xì)胞、造血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，它們共同存在下述缺點(diǎn)(1)僅適用于某一特殊組織類型的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、角朊細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等；(2)均為1倍(1X)500-1000ml的工作液，少數(shù)也有粉末袋裝。在用于造血、腫瘤細(xì)胞以及干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基中，尚未見(jiàn)5倍(5X)或10倍(10X)經(jīng)過(guò)濃縮的無(wú)血清培養(yǎng)基濃縮液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種無(wú)血清培養(yǎng)基的濃縮液，它更易于運(yùn)輸和貯存，并且使用方便，只需按比例稀釋即可使用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基與濃縮液的制備方法。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的配方如下牛血清白蛋白溶液5--10mg/ml 胰島素溶液 8--20μg/ml純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液 1--30μg/ml膽固醇溶液 20--60μg/ml過(guò)氧化氫酶溶液 20--50μg/ml本發(fā)明的第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的5-10倍濃縮液的配方如下牛血清白蛋白溶液25--100mg/ml胰島素溶液 40--200μg/ml純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液 5--300μg/ml膽固醇溶液 100--600μg/ml過(guò)氧化氫酶溶液 100--500μg/ml本發(fā)明的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法為(1)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，縮寫B(tài)SA)溶液的配制將市售牛血清白蛋白粉末按下法去毒稱取市售的牛血清白蛋白粉末100g，使之溶于182ml三蒸水(或去離子水)中，在4℃冰箱內(nèi)靜置24小時(shí)，然后將其與10g樹(shù)脂珠混合，置4℃冰箱內(nèi)2小時(shí)，每15分鐘攪拌一次，去樹(shù)脂珠，再與10g樹(shù)脂珠混合，再將其在4℃冰箱內(nèi)和室溫下分別靜置1小時(shí)，去樹(shù)脂珠，測(cè)牛血清白蛋白的容量，每15ml牛血清白蛋白加1.1ml刀比科氏(Dulbecco’s)磷酸緩沖鹽水(--Mg2+、--Ca2+)10倍濃縮液，再用刀比科氏磷酸緩沖鹽水工作液稀釋為20％牛血清白蛋白溶液(重量/體積，即W/V)，過(guò)濾除菌，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(2)、胰島素(Insulin，縮寫Ins)溶液的配制將市售胰島素粉末用少量磷酸緩沖液(PBS)溶解，滴加0.01M鹽酸(HCL)，使之完全溶解，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基(Iscove’s modified Dulbecco’s media，縮寫IMDM)將其稀釋至配方中濃度的10倍貯存液，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(3)、純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Human Transferrin，縮寫HTf)溶液的配制將市售的純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白粉末溶于90mg/ml的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基中，每mg轉(zhuǎn)鐵蛋白加7.4×10-9M三價(jià)鐵離子Fe3+(以溶于0.1mM鹽酸中的FeCl3形式)，使1/3Fe2+飽和，稀釋10倍，得到貯存液，再將貯存液過(guò)濾除菌后置-20℃冰箱內(nèi)保存；(4)、膽固醇(Cholesterol，縮寫Chol)溶液的配制將50mg市售的膽固醇粉末加在50ml酸性培養(yǎng)基中，用帶2cm直徑肽探頭的超聲波粉碎器粉碎，在0℃冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時(shí)，使之完全分散，然后將懸液先后通過(guò)1.2μm和0.45μm的濾膜過(guò)濾，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(此酸性培養(yǎng)基為刀比科氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s media，縮寫DMEM)溶液，不加碳酸氫鈉，但加入抗菌素和1％去脂牛血清白蛋白)；(5)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，縮寫Cat)溶液的配制將市售的過(guò)氧化氫酶粉末用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基直接溶解，配成1mg/ml貯存液，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(6)、將上述五種溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基稀釋為500ml-1000ml/瓶，五種成份的終濃度為戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基配方中的濃度，即得成品。
本發(fā)明的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的濃縮液的制備方法為將上述五種溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基稀釋成50-100ml/瓶，五種成份的終濃度為戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的濃縮液配方中的濃度，即得成品。
本發(fā)明是以牛血清白蛋白粉末、胰島素粉末、純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白粉末、膽固醇粉末、過(guò)氧化氫酶粉末為原料，通過(guò)一定工藝制備而成。這些原料均為市售，且均呈粉末狀，可以稱量，不含多肽因子和激素物質(zhì)，因而既可避免因血清批號(hào)不同所帶來(lái)的不穩(wěn)定性，又不至于影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基是在排除血清干擾的情況下使細(xì)胞維持正常生長(zhǎng)，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)和準(zhǔn)確，并有較好的重復(fù)性。它還有如下特點(diǎn)(1)配方中加有過(guò)氧化氫酶溶液在戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基中加入過(guò)氧化氫酶溶液可以促進(jìn)細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)和克隆，而且可以取代牛血清白蛋白和酪氨酸。研究證明，過(guò)氧化氫是細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆的主要毒性物質(zhì)。培養(yǎng)基中的酪氨酸、色氨酸、核黃素、抗壞血酸鹽等均能導(dǎo)致過(guò)氧化氫的形成，過(guò)氧化氫可由細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的氧化、細(xì)胞蛋白質(zhì)的氧化和/或DNA的損傷而引起細(xì)胞的死亡，而過(guò)氧化氫酶則可以分解過(guò)氧化氫；(2)配方中各種成分的濃度和類似產(chǎn)品不同如牛血清白蛋白在1倍無(wú)血清培養(yǎng)基中為5--10mg/ml，而國(guó)外同類產(chǎn)品多數(shù)僅為0.4mg/ml。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5--10mg/ml的牛血清白蛋白在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)方面遠(yuǎn)優(yōu)于0.4mg/ml；。
(3)兩種劑型和包裝A、1倍無(wú)血清培養(yǎng)基為500--1000ml/瓶；B、5--10倍無(wú)血清培養(yǎng)基濃縮液為50--100ml/瓶，易于運(yùn)輸和貯存，且使用方便，使用時(shí)只需將此濃縮液按10％--20％比例加入任何一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基即可成為1倍戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基；(4)本發(fā)明適用于多種類型的組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)本發(fā)明已應(yīng)用于如造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、皮膚角朊細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、猴腎細(xì)胞、免疫活性細(xì)胞(LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞)的體外培養(yǎng)。申請(qǐng)人還用本發(fā)明研究了腫瘤細(xì)胞的凋亡，由于排除了血清本身存在的可誘導(dǎo)凋亡物質(zhì)的干擾，可較真實(shí)地反映細(xì)胞凋亡情況。
權(quán)利要求
1.一種戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于配方為牛血清白蛋白溶液5--10mg/ml 胰島素溶液 8--20μg/ml純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液 1--30μg/ml膽固醇溶液 20--60μg/ml過(guò)氧化氫酶溶液 20--50μg/ml
2.如權(quán)利要求1所述的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的濃縮液，其特征在于5-10倍濃縮液的配方為牛血清白蛋白溶液25--100mg/ml胰島素溶液 40--200μg/ml純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液 5--300μg/ml膽固醇溶液 100--600μg/ml過(guò)氧化氫酶溶液 100--500μg/ml
3.制備如權(quán)利要求1所述的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的方法，其特征在于(1)、牛血清白蛋白溶液的配制將市售牛血清白蛋白粉末按下法去毒稱取市售的牛血清白蛋白粉末100g，使之溶于182ml三蒸水(或去離子水)中，在4℃冰箱內(nèi)靜置24小時(shí)，然后將其與10g樹(shù)脂珠混合，置4℃冰箱內(nèi)2小時(shí)，每15分鐘攪拌一次，去樹(shù)脂珠，再與10g樹(shù)脂珠混合，再將其在4℃冰箱內(nèi)和室溫下分別靜置1小時(shí)，去樹(shù)脂珠，測(cè)牛血清白蛋白的容量，每15ml牛血清白蛋白加1.1ml刀比科氏磷酸緩沖鹽水(--Mg2+、--Ca2+)10倍濃縮液，再用刀比科氏磷酸緩沖鹽水工作液稀釋為20％牛血清白蛋白溶液，過(guò)濾除菌，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(2)、胰島素溶液的配制將市售胰島素粉末用少量磷酸緩沖液溶解，滴加0.01M鹽酸，使之完全溶解，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基將其稀釋至配方中濃度的10倍貯存液，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(3)、純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液的配制將市售的純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白粉末溶于90mg/ml的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基中，每mg轉(zhuǎn)鐵蛋白加7.4×10-9M三價(jià)鐵離子Fe3+，使1/3Fe2+飽和，稀釋10倍，得到貯存液，再將貯存液過(guò)濾除菌后置-20℃冰箱內(nèi)保存；(4)、膽固醇溶液的配制將50mg市售的膽固醇粉末加在50ml酸性培養(yǎng)基中，用帶2cm直徑肽探頭的超聲波粉碎器粉碎，在0℃冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時(shí)，使之完全分散，然后將懸液先后通過(guò)1.2μm和0.45μm的濾膜過(guò)濾，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(5)、過(guò)氧化氫酶溶液的配制將市售的過(guò)氧化氫酶粉末用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基直接溶解，配成lmg/ml貯存液，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(6)、將上述五種溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基稀釋為500ml-1000ml/瓶，五種成份的終濃度為戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基配方中的濃度，即得成品。
4.制備如權(quán)利要求2所述的戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的濃縮液的方法為(1)、牛血清白蛋白溶液的配制將市售牛血清白蛋白粉末按下法去毒稱取市售的牛血清白蛋白粉末100g，使之溶于182ml三蒸水(或去離子水)中，在4℃冰箱內(nèi)靜置24小時(shí)，然后將其與10g樹(shù)脂珠混合，置4℃冰箱內(nèi)2小時(shí)，每15分鐘攪拌一次，去樹(shù)脂珠，再與10g樹(shù)脂珠混合，再將其在4℃冰箱內(nèi)和室溫下分別靜置1小時(shí)，去樹(shù)脂珠，測(cè)牛血清白蛋白的容量，每15ml牛血清白蛋白加1.1ml刀比科氏磷酸緩沖鹽水(--Mg2+、--Ca2+)10倍濃縮液，再用刀比科氏磷酸緩沖鹽水工作液稀釋為20％牛血清白蛋白溶液，過(guò)濾除菌，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(2)、胰島素溶液的配制將市售胰島素粉末用少量磷酸緩沖液溶解，滴加0.01M鹽酸，使之完全溶解，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基將其稀釋至配方中濃度的10倍貯存液，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(3)、純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液的配制將市售的純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白粉末溶于90mg/ml的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基中，每mg轉(zhuǎn)鐵蛋白加7.4×10-9M三價(jià)鐵離子Fe3+，使1/3Fe2+飽和，稀釋10倍，得到貯存液，再將貯存液過(guò)濾除菌后置-20℃冰箱內(nèi)保存；(4)、膽固醇溶液的配制將50mg市售的膽固醇粉末加在50ml酸性培養(yǎng)基中，用帶2cm直徑肽探頭的超聲波粉碎器粉碎，在0℃冰箱內(nèi)以最大振幅振蕩1小時(shí)，使之完全分散，然后將懸液先后通過(guò)1.2μm和0.45μm的濾膜過(guò)濾，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(5)、過(guò)氧化氫酶溶液的配制將市售的過(guò)氧化氫酶粉末用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基直接溶解，配成1mg/ml貯存液，置-20℃冰箱內(nèi)保存；(6)、將上述五種溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基稀釋為50ml-100ml/瓶，五種成份的終濃度為戴氏無(wú)血清培養(yǎng)基的濃縮液配方中的濃度，即得成品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)血清培養(yǎng)基與濃縮液及其制備方法，它是以牛血清白蛋白溶液、胰島素溶液、純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、膽固醇溶液、過(guò)氧化氫酶溶液為原料，通過(guò)一定工藝制備而成。本發(fā)明中的五種成份的主要原料均呈粉末狀，可以稱量，不含多肽因子和激素物質(zhì)，因而既可避免因血清批號(hào)不同所帶來(lái)的不穩(wěn)定性，又不致于影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此無(wú)血清培養(yǎng)基是在排除血清干擾的情況下使細(xì)胞維持正常生長(zhǎng)，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)和準(zhǔn)確，并有較好的重復(fù)性。它還有如下特點(diǎn)(1)配方中加有過(guò)氧化氫酶溶液；(2)配方中各種成分的濃度和類似產(chǎn)品不同；(3)兩種劑型和包裝500－1000ml/瓶或50－100ml/瓶；(4)本發(fā)明適用于多種類型的組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1431297SQ02157709
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2002年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月17日
發(fā)明者戴育成 申請(qǐng)人:戴育成