專利名稱：一種無血清培養(yǎng)基添加物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加物及其制備 方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，有望來修復(fù)那些被疾病和創(chuàng)傷所 破壞的各種各樣的細(xì)胞和組織，從而為多種慢性疾病的治療帶來希望。干細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞來 源的不同，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類。胚胎干細(xì)胞具有全能性，可以自我更新 并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。進(jìn)一步說，胚胎干細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞。它具 有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。成體干細(xì)胞是指存 在于組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新并能夠分化形成組成該類組織的細(xì)胞， 包括間充質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。成年動(dòng)物的許多組織和器官，比如表皮和造 血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力，成體干細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。然而與胚胎干細(xì)胞不 同的是，這種干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)生存時(shí)間有限制并且只能分化成有限的幾種細(xì)胞類型。目前干細(xì)胞有幾百種之多，而且它們的培養(yǎng)特性也各異，就重復(fù)性而言，干細(xì)胞培 養(yǎng)領(lǐng)域還面臨著極大的困難。為干細(xì)胞提供一個(gè)最佳的培養(yǎng)條件，尤其是保證細(xì)胞處于未 分化狀態(tài)或者在需要的時(shí)候使細(xì)胞向?qū)Ｒ坏姆较蚍只?，是干?xì)胞研究中最大的挑戰(zhàn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)是干細(xì)胞的一種，因能分化為間質(zhì) 組織而得名，具備干細(xì)胞的兩個(gè)重要特征，即很強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化潛能，在體內(nèi) 外特定環(huán)境下，能夠分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪等間質(zhì)組織，還可以被誘導(dǎo)分化為非間質(zhì)組 織細(xì)胞，如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨髓、骨膜、松 質(zhì)骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中。間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)通常是在有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，血清的成分十分復(fù)雜， 目前尚未完全弄清。血清中的未知物質(zhì)和可變因素往往影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性， 特別是現(xiàn)代應(yīng)用高純度基因重組生長因子進(jìn)行細(xì)胞體外調(diào)控研究時(shí)，需要一個(gè)精確度更高 的細(xì)胞培養(yǎng)體系。間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，以及取材方便、體 內(nèi)植入后不良反應(yīng)較弱等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，將成為細(xì)胞替代治療的理想種子細(xì)胞?，F(xiàn)在的 有血清培養(yǎng)體系，多是采用胎牛血清等動(dòng)物血清，動(dòng)物源血清蛋白進(jìn)入人體后可引發(fā)多種 不良反應(yīng)及疾病，這就為將來間充質(zhì)干細(xì)胞臨床移植埋下隱患。市場上首個(gè)針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基是2008年6月Invitrogen公司推 出一種無血清培養(yǎng)基-STEMPRO MSC SFM，專門用于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或來源于骨髓的干 細(xì)胞的培養(yǎng)。但由于其價(jià)格昂貴且必須配套使用其公司其他試劑，使得廣大干細(xì)胞研究者 及細(xì)胞移植工作者望而卻步。

發(fā)明內(nèi)容
為了制備成本低廉、價(jià)格便宜、原材料豐富的無血清培養(yǎng)基添加物，用于培養(yǎng)干細(xì) 胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案1、干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物的制備1)將血液充分混勻后在380_400g條件下離心13_15分鐘，將上層血漿擠壓到另一 空白收集袋中。2)混勻，取樣檢測血小板密度及紅細(xì)胞密度、白細(xì)胞密度。若紅細(xì)胞密度 < 0. 02XIO1Vl,白細(xì)胞密度< 0. 3X109/L 以及血小板> 250X 109/L，在 800rpm_1000rpm 條件下離心10分鐘，以去除紅細(xì)胞和白細(xì)胞。3)吸取上層血漿層，密封后轉(zhuǎn)入-80°C保存?zhèn)溆谩?)將冰凍的血漿從-80°C冰箱取出迅速置于37°C水浴快速融化，重復(fù)冰凍和融化 步驟2次。
5)在8000g條件下離心30分鐘，去除血小板碎片。吸取上清，得血小板裂解溶液， 用孔徑0. 22um的濾器過濾，即得干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物。置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的配制上述干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物制備完成后，與DMEM培養(yǎng)基(生物學(xué)通用培養(yǎng) 基，非發(fā)明人自配，購自Gibco公司，美國)配制無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基添加物的含量 為(體積比)，配制過程應(yīng)在符合GMP條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。配制好的無血清培 養(yǎng)基在4°C下保存，須在2周內(nèi)使用完。


圖1間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀態(tài)(A、B、C、D分別為培養(yǎng)第1、2、3、4天，10倍鏡下觀察結(jié)果)
圖2間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志檢測結(jié)果
圖3間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化
圖4間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化
技術(shù)效果
1.無血清培養(yǎng)基添加物制備原材料來源于血液，取材及制備方便。
2.用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，使用濃度低，成本低。
3.適用范圍廣，可用于其他成體干細(xì)胞的培養(yǎng)。
4.不含動(dòng)物血清，所培養(yǎng)的干細(xì)胞用于臨床治療時(shí)可以避免異種蛋白引起的不良反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式1、干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物的制備①將血液充分混勻后留取血樣檢測血小板密度，計(jì)算血小板數(shù)量I。②在380g條件下離心13分鐘，上層為富含血小板血漿。用血漿分漿夾手工分離 富含血小板血漿，將上層血漿擠壓到另一空白收集袋中。③混勻，記錄血漿體積數(shù)，取樣檢測血小板密度及紅細(xì)胞密度、白細(xì)胞密度。若紅細(xì)胞密度< 0. 02 X1012/L,白細(xì)胞密度< 0. 3X109/L，血小板> 250X 109/L，血漿在 800rpm-1000rpm條件下離心10分鐘，以去除紅細(xì)胞和白細(xì)胞。④吸取上層血漿層，取樣檢測血小板密度，計(jì)算血小板數(shù)量II。根據(jù)血小板數(shù)量 I、血小板數(shù)量II計(jì)算血小板回收率(回收率=血小板數(shù)量11/血小板數(shù)量IX100%)。留 取少量血漿用于病毒檢測。⑤標(biāo)記樣本，封口膜封口后，轉(zhuǎn)入-80°c保存?zhèn)溆?。共收集樣?5份。⑥將冰凍的血漿(血小板懸液)從-80°C冰箱取出迅速置于37°C水浴快速融化， 重復(fù)冰凍和融化步驟2次。⑦在SOOOg條件下離心30分鐘，去除血小板碎片。吸取上清，得血小板裂解溶液， 轉(zhuǎn)入容量為IOOOml的無菌瓶中，將獲得的10-20份樣本進(jìn)行混合。⑧將上述獲得的血小板裂解溶液用孔徑0. 22um的濾器過濾(Millipore公司，一 次性濾器)，即得到更加純凈的血小板裂解溶液終產(chǎn)品_干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物。置 于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。⑨每一批產(chǎn)品均取少量樣本，用于需氧菌、厭氧菌及真菌檢測。2間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的配制上述干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物制備完成后，與DMEM培養(yǎng)基(生物學(xué)通用培養(yǎng) 基，非發(fā)明人自配，購自Gibco公司，美國)配制無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基添加物的含量 為(體積比)，配制過程應(yīng)在符合GMP條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。配制好的無血清培 養(yǎng)基在4°C下保存，須在2周內(nèi)使用完。3間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)及特征將無菌取得的臍帶充分洗滌去血漬后，剪碎成約Imm3大小的組織塊后在干細(xì)胞 無血清培養(yǎng)基中種植培養(yǎng)，原代細(xì)胞在種植5d (天)后換液，去除未貼壁細(xì)胞，細(xì)胞已形成 散在的細(xì)胞集落。細(xì)胞呈長的、扁平的梭形，大約7d出現(xiàn)較大的克隆，IOd左右細(xì)胞生長達(dá) 80% -90%融合。每IOOml培養(yǎng)瓶單層融合的間充質(zhì)干細(xì)胞用胰蛋白酶消化后平均可獲得 10X 105-20X 105個(gè)細(xì)胞。傳代培養(yǎng)后，24h (小時(shí))即可貼壁，細(xì)胞呈較均一的長梭形，3d 左右細(xì)胞可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面，可繼續(xù)傳代擴(kuò)增。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn) 定，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表達(dá)⑶44，⑶105，⑶29，⑶90 等細(xì)胞黏附分子，而陰性表達(dá)造血細(xì)胞CD45，CD34等標(biāo)志物。結(jié)果表明從臍帶來源的間充 質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相同的細(xì)胞表面標(biāo)志，見圖2。脂肪誘導(dǎo)7d，倒置顯微鏡下即可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成，第14d(天)油紅ο染色呈 強(qiáng)陽性(見圖3)。成骨誘導(dǎo)第14d (天)，茜素紅染色可見細(xì)胞間布滿黑色顆粒，顆粒大小不均一，提 示有礦化基質(zhì)沉積(見圖4)。這證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中具有多向分化能力。
權(quán)利要求
一種干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物的制備方法，其特征包括以下步驟1)將血液充分混勻后在380 400g條件下離心13 15分鐘，將上層血漿擠壓到另一空白收集袋中；2)混勻，取樣檢測血小板密度及紅細(xì)胞密度、白細(xì)胞密度，若紅細(xì)胞密度＜0.02×1012/L，白細(xì)胞密度＜0.3×109/L以及血小板＞250×109/L，則在800rpm 1000rpm條件下離心10分鐘；3)吸取上層血漿層，密封后轉(zhuǎn)入 80℃保存；4)將冰凍的血漿從 80℃冰箱取出迅速置于37℃水浴快速融化，重復(fù)冰凍和融化步驟2次；5)在8000g條件下離心30分鐘，吸取上清，得血小板裂解溶液，用孔徑0.22um的濾器過濾，即得干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的方法制備的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物。
3.—種干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于將權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞無 血清培養(yǎng)基添加物與DMEM培養(yǎng)基混合配制干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基添加物的 含量為體積比_10%。
4.一種如權(quán)利要求3所述的方法制備的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加物的用途，其特征在于用于間充質(zhì)干細(xì) 胞的培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求4所述的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的用途，其特征在于用于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加物及其制備方法。該添加物制備成本低廉、價(jià)格便宜、原材料豐富，可作為無血清培養(yǎng)基添加物，用于培養(yǎng)干細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101948801SQ20101024637
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者張學(xué)峰, 張美榮, 王麗, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申請(qǐng)人:青島奧克生物開發(fā)有限公司