一種無血清培養(yǎng)基及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及干細胞的研究領域，特別是涉及一種新型、高效的無血清培養(yǎng)基及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]間充質(zhì)干細胞普遍存在于人體多種組織和器官中，并具有多向分化潛能，具有刺激組織再生、調(diào)節(jié)免疫等功能，在細胞治療領域有著廣闊的應用前景。
[0003]骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)在臨床上得到了廣泛應用，而目前的研究表明，臍帶來源的間充質(zhì)干細胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細胞的理想替代物，而且具有更大的應用潛能。其中，源于人臍帶的人臍帶間充質(zhì)干細胞(human Umbilical Cord mesenchymal stemcells，hUC-MSCs)表達多種胚胎干細胞的特有標志，具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業(yè)化制備等特征，而且研究證實hUC-MSCs在神經(jīng)疾病、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及癌癥、心臟病等疾病的動物模型和臨床研究中有良好治療效果，因此有可能成為最具臨床應用前景的多能干細胞。
[0004]若要將hUC-MSCs進一步應用于臨床，最重要的就是hUC-MSCs的體外大量擴增達到有效的臨床治療劑量，因此hUC-MSCs的體外培養(yǎng)成為了最基礎同時也是最重要的技術之一?，F(xiàn)有的hUC-MSCs培養(yǎng)方法多采用在基礎培養(yǎng)基中添加FBS、青鏈霉素，但非人血清成分復雜，使hUC-MSCs在長期的培養(yǎng)過程中易分化，且存在傳播異種病原體的危險。
[0005]此外，雖然已有科研工作者開發(fā)出多種類型的血清替代物，但目前市場可購買的供hUC-MSCs培養(yǎng)的血清替代物以及完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果仍不理想，尤其對于干細胞的貼壁、增殖、以及細胞長期培養(yǎng)后的穩(wěn)定性的維持等特性均無法達到預期效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述技術問題，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，在hUC-MSCs的培養(yǎng)過程中，細胞會分泌多種對自身生長有利的因子、蛋白等成分，可以利用這些成分在無血清環(huán)境下進行細胞、特別是干細胞的長期擴增培養(yǎng)。
[0007]因此本發(fā)明的目的是提供一種無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有從細胞培養(yǎng)物獲得的濃縮液，特別適合在無血清環(huán)境下培養(yǎng)細胞。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是提供該無血清培養(yǎng)基的制備方法。
[0009]本發(fā)明的又一個目的是提供所述培養(yǎng)基在制備干細胞培養(yǎng)介質(zhì)中的用途。
[0010]本發(fā)明的技術方案如下。
[0011]—方面，本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的培養(yǎng)上清濃縮液。
[0012]優(yōu)選地，所述無血清培養(yǎng)基包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、4-6體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、90-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；
[0013]更優(yōu)選地，所述無血清培養(yǎng)基包含0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、5體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、94體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子。
[0014]所述培養(yǎng)上清濃縮液通過包括以下步驟的方法制得:
[0015]收集人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液，離心，微濾膜過濾，超濾濃縮。
[0016]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)上清濃縮液通過包括以下步驟的方法制得:
[0017](1)將人臍帶間充質(zhì)干細胞以0.5-4X 104個細胞/cm 2的密度接種于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時使得細胞達70% -90%匯合，收集新鮮的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液；
[0018](2)在4°C下以3000-5000g離心15_40min，除去培養(yǎng)上清液中懸浮的細胞以及細胞碎片；
[0019](3)將經(jīng)步驟⑵得到的上清液在4°C下以lOOOOg離心30_60min，除去上清液中的細胞質(zhì)及其他雜質(zhì)；
[0020](4)將經(jīng)步驟(3)得到的上清液過0.22 μ m微濾膜除菌；
[0021 ] (5)將經(jīng)步驟(4)得到的濾過液移入3KD的超濾濃縮管中，在4°C下以3000_4500g離心60-90min，將濾過液濃縮至其體積的1/20至1/50 ；
[0022](6)將經(jīng)步驟(5)得到的濃縮液以PBS緩沖液調(diào)節(jié)終體積為步驟⑴中收集的細胞培養(yǎng)上清液的1/20。
[0023]在步驟⑴中，人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)優(yōu)選為從自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒新鮮臍帶組織分離出的人臍帶間充質(zhì)干細胞。
[0024]并且優(yōu)選地，步驟(1)中的無血清培養(yǎng)基含有a-MEM/DMEM_F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和任選的人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)上清濃縮液；優(yōu)選包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、任選的4-6體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、90-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優(yōu)選包含
0.1體積份的β -巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、任選的5體積份的培養(yǎng)上清濃縮液、94體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子。
[0025]另一方面，本發(fā)明提供所述無血清培養(yǎng)基的制備方法，所述制備方法包括:
[0026]收集人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液，離心，微濾膜過濾，超濾濃縮，得到培養(yǎng)上清濃縮液；
[0027]采用β -巰基乙醇、非必需氨基酸和a-MEM/DMEM_F12配制預混液；
[0028]將培養(yǎng)上清濃縮液、預混液和重組人堿性成纖維生長因子混合。
[0029]其中，所述培養(yǎng)上清濃縮液優(yōu)選通過包括以下步驟的方法制得:
[0030](1)將人臍帶間充質(zhì)干細胞以0.5-4X 104個細胞/cm 2的密度接種于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時使得細胞達70% -90%匯合，收集新鮮的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液；
[0031](2)在4°C下以3000-4500g離心15_40min，除去培養(yǎng)上清液中懸浮的細胞以及細胞碎片；
[0032](3)將經(jīng)步驟⑵得到的上清液在4°C下以lOOOOg離心30_60min，除去上清液中的細胞質(zhì)及其他雜質(zhì)；
[0033](4)將經(jīng)步驟(3)得到的上清液過0.22 μ m微濾膜除菌；
[0034](5)將經(jīng)步驟(4)得到的濾過液移入3KD的超濾濃縮管中，在4°C下以3000_4500g離心60-90min，將濾過液濃縮至其體積的1/20至1/50 ；
[0035](6)將經(jīng)步驟(5)得到的濃縮液以PBS緩沖液調(diào)節(jié)終體積為步驟⑴中收集的細胞培養(yǎng)上清液的1/20。
[0036]又一方面，本發(fā)明提供所述無血清培養(yǎng)基在制備干細胞培養(yǎng)介質(zhì)中的用途。
[0037]其中，所述干細胞從哺乳動物、例如人的組織或器官中分離得到，所述組織或器官為骨髓、臍帶和脂肪中的一種或多種；優(yōu)選地，所述干細胞為哺乳動物來源的臍帶間充質(zhì)干細胞，更優(yōu)選為人來源的臍帶間充質(zhì)干細胞；進一步優(yōu)選地，所述干細胞是從自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒新鮮臍帶組織分離出的人臍帶間充質(zhì)干細胞。
[0038]發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)過程中會分泌多種對細胞自身生長有利的因子、蛋白等成分?；诖?，本發(fā)明利用人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)濃縮得到的濃縮液提供了一種新型的無血清培養(yǎng)基。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基可在無血清環(huán)境下進行干細胞的長期擴增培養(yǎng)，同時該干細胞依然保持多潛能性及較強的增殖能力，該干細胞可以是來自哺乳動物(例如人)的骨髓、臍帶和脂肪中的一種或多種，特別是從新生兒臍帶中分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞。
[0039]具體而言，本發(fā)明提供的新型無血清培養(yǎng)基不含血清成分，避免了在細胞培養(yǎng)過程中因血清批次差異導致細胞生長過程不穩(wěn)定的情況，也排除了傳播異種病原體危險的可能；并且，該無血清培養(yǎng)基的使用解決了常規(guī)無血清培養(yǎng)中細胞貼壁能力差，增殖緩慢的缺點，且在長期培養(yǎng)過程中，仍能保持良好的增殖能力和多向分化潛能，為動物細胞的體外培養(yǎng)提供了一種高效的解決方案；此外，培養(yǎng)上清液本身是細胞培養(yǎng)的廢棄物，其回收利用降低了細胞培養(yǎng)的成本。
【附圖說明】
[0040]以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中:
[0041]圖1是在培養(yǎng)基組成篩選過程中的細胞圖，其中圖1A為高濃度巰基乙醇培養(yǎng)基在細胞接種4小時后細胞形態(tài)，圖1Β為低濃度bFGF培養(yǎng)基接種24小時后細胞形態(tài)，圖1C為高濃度bFGF培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞在傳代后細胞形態(tài)，圖1D為低濃度培養(yǎng)上清濃縮液培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞形態(tài)，圖1E為高濃度培養(yǎng)上清濃縮液培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞形態(tài)。
[0042]圖2是使用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞的圖片，其中圖2A為接種2小時后的細胞形態(tài)，圖2B為接種24小時后的細胞形態(tài)，圖2C為接種48小時后的細胞形態(tài)。
[0043]圖3為利用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基進行hUC-MSC持續(xù)傳代的倍增曲線研究結(jié)果，表明利用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hUC-MSC在長期培養(yǎng)中仍能保持較高增殖速度。圖中的SCL-M1和SCL-M2為本發(fā)明無血清培養(yǎng)基組，F(xiàn)BS-1和FBS-2為血清添加組，SR-1和SR-2為市售血清替代物添加組。
[0044]圖4為V1-Cell細胞活力分析儀對獲得的臍帶間充質(zhì)干細