專利名稱：一種利用超聲波直接轉(zhuǎn)化蘋果屬植物獲得轉(zhuǎn)基因苗木的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“一種利用超聲波直接轉(zhuǎn)化蘋果屬植物獲得轉(zhuǎn)基因苗木的方法”屬于生物工程育種領(lǐng)域，專用于提高蘋果基因工程的外源基因的轉(zhuǎn)化效率。
背景技術(shù)：
1超聲波的特性和發(fā)生原理頻率超過能聽到的聲波范圍(50～2×104次/秒)的聲波被稱為超聲波，其波長短于普通電波，可以在固體內(nèi)部傳播。超聲波包括縱波和橫波兩種振動(dòng)方式，質(zhì)點(diǎn)振動(dòng)方向與波的傳播方向一致的稱為縱波，垂直的稱為橫波，它們同時(shí)對(duì)物體產(chǎn)生影響，并很容易相互交換。
產(chǎn)生超聲波的原理是當(dāng)電壓加至具有伸縮特征的材料上時(shí)，材料就會(huì)按照電壓的正負(fù)和大小進(jìn)行振動(dòng)，產(chǎn)生超聲波。在儀器中超聲波產(chǎn)生的原理是一個(gè)短而持續(xù)時(shí)間的脈沖電壓去激勵(lì)換能器，從而產(chǎn)生短的超聲脈沖。通常用來作脈沖激勵(lì)源的電路是電容放電回路，并由換能器把電能轉(zhuǎn)變成超聲脈沖。
2超聲波的生物學(xué)效用一般認(rèn)為超聲波的生物學(xué)效應(yīng)主要有機(jī)械作用、熱化作用以及空化作用。
由于生物組織大多數(shù)屬于軟組織，因而在超聲波的機(jī)械力作用下，其細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)生形變。這種形變將隨著超聲波強(qiáng)度的增強(qiáng)而增大，當(dāng)增加到一定強(qiáng)度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)被擊穿。生物組織在超聲波機(jī)械能的作用下由于黏滯吸收，將一部分超聲轉(zhuǎn)化為熱能，使生物組織的溫度上升，稱為超聲波的熱化作用。在超聲波作用下，還會(huì)產(chǎn)生空化作用，表現(xiàn)出空泡湮滅過程。小泡內(nèi)部產(chǎn)生高溫高壓，甚至產(chǎn)生電離效應(yīng)及放電，推測這可能是導(dǎo)致空泡周圍細(xì)胞壁和質(zhì)膜破損或可逆的質(zhì)膜透性改變的主要機(jī)理，從而使細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)交換。
超聲波的生物學(xué)效應(yīng)根據(jù)不同的條件而會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。它即可以引起生物大分子甚至細(xì)胞的破壞，也可以促進(jìn)生物大分子的合成和生物體的生長。這些條件包括超聲波處理的頻率、強(qiáng)度、作用時(shí)間和生物體的結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)。
3超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因技術(shù)在植物遺傳轉(zhuǎn)化育種中的應(yīng)用情況超聲波處理植物組織能在植物組織表形成大量的小孔，外源DNA分子可以以此為通道進(jìn)入帶壁的植物細(xì)胞，完成和植物基因組的整合，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。自從1990年，Joersbo和Brunstedt首次應(yīng)用該方法將CAT基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入甜菜基因組后，已經(jīng)在諸多植物的遺傳轉(zhuǎn)化中得到了應(yīng)用，詳見下表
3.3超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因技術(shù)在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用存在的問題和前景展望將超聲波技術(shù)應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化中大大提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，而且超聲波具有價(jià)格便宜，操作簡單，不受宿主范圍限制等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此具有巨大的應(yīng)用潛力。但是超聲波轉(zhuǎn)化技術(shù)中也存在著一些不足之處亟待提高。
首先，諸多報(bào)道中雖然指出了超聲波處理的具體參數(shù)，但是沒有給出合理的指定參數(shù)的依據(jù)。而且在研究中使用的超聲波儀器的型號(hào)均不同，這樣就造成了實(shí)驗(yàn)參數(shù)沒有普遍應(yīng)用的價(jià)值。
其次，目前的研究僅僅限于對(duì)超聲波參數(shù)研究，而很少涉及超聲波參數(shù)和其它影響植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素的互作效應(yīng)的研究。
第三，超聲波的應(yīng)用范圍還很窄，轉(zhuǎn)化的植物大多是模式植物，轉(zhuǎn)化的外源基因大多是報(bào)告基因。從超聲波技術(shù)在果樹遺傳育種中的應(yīng)用情況來看，目前只在番木瓜的遺傳轉(zhuǎn)化中得到了應(yīng)用，而且所轉(zhuǎn)化的外植體還是有性的胚，而不是可以可以使性狀得到保持的無性外植體。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前在蘋果等木本植物基因工程育種中存在遺傳轉(zhuǎn)化效率較低的現(xiàn)狀，提供利用超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因獲得轉(zhuǎn)基因株系的育種新方法。此種方法可作為商業(yè)用途的蘋果外源基因轉(zhuǎn)化在生產(chǎn)上直接使用。
技術(shù)方案一種利用超聲波直接轉(zhuǎn)化蘋果屬植物獲得轉(zhuǎn)基因苗木的方法，其特征在于1)將蘋果屬八棱海棠葉片繼代培養(yǎng)一個(gè)月左右的繼代培養(yǎng)苗從上數(shù)第二或第三片展開葉的葉片取下，無菌條件下把葉片切成4×8mm八棱海棠葉片的小塊放在50ml的三角瓶中，在含有體積比為5％二甲基亞砜、20μl·ml-1包含目的基因rolC質(zhì)粒DNA、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉的超聲波緩沖液中用功率為80w的超聲波處理20分鐘，用無菌水沖洗3次后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26℃條件下暗培養(yǎng)3天后，在篩選培養(yǎng)基繼續(xù)在培養(yǎng)溫度為26℃黑暗條件下進(jìn)行抗性篩選，并獲得50mg·L-1卡那霉素抗性條件下能夠正常生長的抗性苗；2)通過GUS染色、PCR及Southern blotting分子檢測，獲得整合了完整的外源rolC基因的轉(zhuǎn)基因八棱海棠抗性苗。
有益效果本發(fā)明針對(duì)超聲波技術(shù)目前在植物遺傳轉(zhuǎn)化中存在的問題，在前人研究的基礎(chǔ)上，首次將超聲波技術(shù)應(yīng)用到重要的經(jīng)濟(jì)作物蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化上。
在發(fā)明中首次給出了制定合理的超聲波處理參數(shù)的依據(jù)，并將超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法首次應(yīng)用在對(duì)蘋果葉片的遺傳轉(zhuǎn)化上。
該發(fā)明大大提高了蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化效率，具有重要的科研和生產(chǎn)意義。
本發(fā)明首次將超聲波技術(shù)應(yīng)用在蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化上，大大提高了蘋果轉(zhuǎn)基因的效率。應(yīng)用超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)導(dǎo)rolC基因轉(zhuǎn)化蘋果砧木八棱海棠，獲得了1.85％的轉(zhuǎn)化效率，大大高于普通農(nóng)桿菌介導(dǎo)法0.1～0.8％的轉(zhuǎn)化效率。


圖1prolC1質(zhì)粒圖譜圖2超聲波處理對(duì)質(zhì)粒完整性的影響圖3轉(zhuǎn)基因八棱海棠植株圖4gus染色結(jié)果圖5轉(zhuǎn)基因八棱海棠的PCR檢測C陰性對(duì)照，Z陽性對(duì)照，1-8轉(zhuǎn)化株系1-8圖6轉(zhuǎn)基因八棱海棠的Southern雜交檢測C陰性對(duì)照，Z陽性對(duì)照，1-8轉(zhuǎn)化株系1-8(五)具體實(shí)施方法1超聲波直接轉(zhuǎn)化法1)超聲波處理功率和時(shí)間對(duì)蘋果葉片再生情況影響將蘋果屬八棱海棠葉片切成小塊放在含有MS液體培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，選擇不同的超聲波功率和時(shí)間組合進(jìn)行超聲波處理。將處理后的葉片轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上觀察葉片生長情況和再生率。選擇對(duì)葉片的生長和再生率影響較小的超聲波時(shí)間和功率處理組合作為基因轉(zhuǎn)化的參數(shù)。
確定超聲波處理時(shí)間的上限之后，將超聲波的處理功率和時(shí)間進(jìn)行不同組合，研究其對(duì)八棱海棠葉片再生的影響。結(jié)果表明不同的超聲波處理組合對(duì)葉片再生率有顯著的區(qū)別。(表1)遺傳轉(zhuǎn)化需要再生率較高的葉片再生系統(tǒng)，因此我們選擇八棱海棠葉片平均再生率在95％以上的14個(gè)處理組合進(jìn)行后繼的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(T1，T5，T6，T9，T10，T11，T13，T14，T15，T16，T17，T18，T19，T20)。
表1不同超聲波處理對(duì)八棱海棠葉片再生率的影響
2)超波處理功率和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒完整性的影響選擇不同的超聲波功率和時(shí)間的組合對(duì)將用于轉(zhuǎn)化的含有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行處理。將處理后的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察質(zhì)粒的完整性。選擇對(duì)質(zhì)粒的完整性沒有影響的超聲波功率和時(shí)間組合作為基因轉(zhuǎn)化的參數(shù)。
在超聲波處理功率為100w的條件下，分別處理質(zhì)粒DNA 5，10，20，30，40min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA在30min之內(nèi)均能保持完整，而處理40min后發(fā)生降解(圖2)。用超聲波進(jìn)行外源基因的直接遺傳轉(zhuǎn)化需要質(zhì)粒的完整性，因此處理時(shí)間只能維持在30min之內(nèi)。
3)確定超聲波處理最佳參數(shù)選擇第1)部分和第2)部分所確定的參數(shù)組合的交集，對(duì)蘋果葉片進(jìn)行超聲波直接轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的葉片轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上預(yù)表達(dá)后，用GUS染色法對(duì)轉(zhuǎn)化葉片進(jìn)行染色，計(jì)算外源基因的瞬間表達(dá)率，選擇瞬間表達(dá)率最高的超聲波功率和時(shí)間處理組合為最佳處理組合。
表2不同超聲波處理時(shí)間和處理功率對(duì)gus基因瞬間表達(dá)的影響
14個(gè)超聲波處理組合均能保持質(zhì)粒的完整性，并能使八棱海棠的葉片再生率在95％以上，但是對(duì)gus基因瞬間表達(dá)的研究卻發(fā)現(xiàn)，不同的超聲波處理組合之間該基因的瞬間表達(dá)存在顯著差異(表2)。
處理功率為60w的組合T17，T18，T19，T20的葉片gus染色陽性比率顯著低于其它8個(gè)處理組合；處理時(shí)間為5min的組合T1，T5，T9，T13，T17的葉片gus染色陽性比率顯著低于其它處理功率相同但處理時(shí)間較長的組合；處理組合T11和T16的葉片gus染色陽性比率顯著高于其它的處理組合，即在保持質(zhì)粒的完整性和葉片較高再生率的前提下，較長的處理時(shí)間和較高的處理功率有利于gus基因的瞬間表達(dá)。
4)確定最佳的DMSO(二甲基亞砜)濃度選擇超聲波處理最佳組合對(duì)蘋果葉片進(jìn)行超聲波處理，在超聲波緩沖液(5％二甲基亞砜、20μl·ml-1包含目的基因rolC質(zhì)粒DNA、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉)中加入不同濃度的DMSO，對(duì)蘋果葉片進(jìn)行超聲波直接轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的葉片轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上預(yù)表達(dá)后，用GUS染色法對(duì)轉(zhuǎn)化葉片進(jìn)行染色，計(jì)算外源基因的瞬間表達(dá)率，選擇瞬間表達(dá)率最高的DMSO濃度處理作為最佳的DMSO處理濃度。
選擇最佳處理功率和處理時(shí)間組合T11和T16，結(jié)合不同DMSO濃度處理，以篩選出最佳的超聲波處理?xiàng)l件(表3)。
當(dāng)DMSO濃度為5％時(shí)，處理T11和T16的gus基因瞬間表達(dá)率均得到顯著的提高；但是當(dāng)DMSO濃度提高到10％以上時(shí)，gus基因瞬間表達(dá)率反而顯著降低。因表3不同DMSO濃度對(duì)gus基因瞬間表達(dá)的影響
此5％為最佳的DMSO處理濃度。此外，DMSO濃度均為5％時(shí)，處理T11的gus基因瞬間表達(dá)率顯著高于處理T16。
綜合以上結(jié)果，可以得出處理功率80w，處理時(shí)間20min，DMSO濃度為5％是超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)prolC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化八棱海棠的最佳處理組合。
5)超聲波直接轉(zhuǎn)化外源基因并獲得轉(zhuǎn)化苗1)按超聲波最佳參數(shù)處理組合以及最佳的DMSO濃度對(duì)蘋果葉片進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的葉片轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，使抗性基因得到表達(dá)后，再轉(zhuǎn)移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上從而獲得抗性苗(圖3)。
將蘋果屬八棱海棠葉片繼代培養(yǎng)(QU Shen-Chun，HUANG Xiao-De，ZHANG Zhen，YAO Quan-HONG，TAO Jian-Min，QIAO Yu-Shan，ZHANG Jun-Yi.
Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transportergene[J]，Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31(3)235-240)一個(gè)月左右的繼代培養(yǎng)苗從上數(shù)第二或第三片展開葉的葉片取下，無菌條件下把葉片切成4×8mm八棱海棠葉片的小塊放在50ml的三角瓶中，在含有5％(體積比)DMSO、20μl·ml-1包含目的基因rolC的質(zhì)粒DNA((圖1)見文獻(xiàn)孫愛君，房經(jīng)貴，盛炳成。農(nóng)桿菌介導(dǎo)rolC基因轉(zhuǎn)化煙草植株的研究章鎮(zhèn)，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24(1)25～29)、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉、其余為水的超聲波緩沖液中用功率為80w的超聲波處理20分鐘，用無菌水沖洗3次后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(MS+6-BA(6-芐氨基嘌呤)8.0mg·L-1+NAA(萘乙酸)0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1)上，培養(yǎng)溫度為26℃條件下暗培養(yǎng)3天后，在篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 8.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+Km(卡那霉素)50mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1)上繼續(xù)在培養(yǎng)溫度為26℃黑暗條件下進(jìn)行抗性篩選，并獲得在該抗性條件下能夠正常生長的抗性苗；通過GUS染色、PCR及Southern blotting等分子檢測，獲得整合了完整的外源rolC基因的轉(zhuǎn)基因八棱海棠抗性苗。
在上述條件下，對(duì)486片八棱海棠葉片進(jìn)行外源rolC基因的直接轉(zhuǎn)化，共得到237個(gè)抗性愈傷組織和9株抗性芽，轉(zhuǎn)化率為1.85％；對(duì)轉(zhuǎn)化抗性苗的分子檢測結(jié)果GUS染色對(duì)得到的9株抗性芽葉片進(jìn)行GUS染色，染色結(jié)果均呈陽性(圖4)。
PCR檢測對(duì)9個(gè)GUS染色陽性芽進(jìn)行PCR檢測，其中8株的擴(kuò)增結(jié)果呈陽性(圖5)。
Southern blotting雜交對(duì)8個(gè)PCR陽性轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠株系的基因組用內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，與含有rolC基因的探針雜交后，均顯示出特異的雜交帶，而對(duì)照植株無雜交條帶出現(xiàn)，證明rolC基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入八棱海棠基因組中(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種利用超聲波直接轉(zhuǎn)化蘋果屬植物獲得轉(zhuǎn)基因苗木的方法，其特征在于1)將蘋果屬八棱海棠葉片繼代培養(yǎng)一個(gè)月左右的繼代培養(yǎng)苗從上數(shù)第二或第三片展開葉的葉片取下，無菌條件下把葉片切成4×8mm八棱海棠葉片的小塊放在50ml的三角瓶中，在含有體積比為5％二甲基亞砜、20μl·ml-1包含目的基因rolC的質(zhì)粒DNA、15mmg·L-1NaCl和1.5mmg·L-1檸檬酸鈉的超聲波緩沖液中用功率為80w的超聲波處理20分鐘，用無菌水沖洗3次后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26℃條件下暗培養(yǎng)3天后，在篩選培養(yǎng)基繼續(xù)在培養(yǎng)溫度為26℃黑暗條件下進(jìn)行抗性篩選，并獲得50mg·L-1卡那霉素抗性條件下能夠正常生長的抗性苗；2)通過GUS染色、PCR及Southern blotting分子檢測，獲得整合了完整的外源rolC基因的轉(zhuǎn)基因八棱海棠抗性苗。
全文摘要
本發(fā)明“一種利用超聲波直接轉(zhuǎn)化蘋果屬植物獲得轉(zhuǎn)基因苗木的方法”屬于生物工程育種領(lǐng)域。超聲波直接轉(zhuǎn)化法是將蘋果屬八棱海棠葉片切成小塊在含有5％DMSO和20μl·ml
文檔編號(hào)C12N15/87GK1944656SQ20061008539
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月13日
發(fā)明者陶建敏, 章鎮(zhèn), 王三紅, 喬玉山, 徐長寶, 王紅霞 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)