專利名稱：納米吸附改善酶穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高酶穩(wěn)定性的方法，特別涉及一種以納米顆粒作為酶吸附載體改善酶穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
酶是由蛋白質(zhì)組成，其空間結(jié)構(gòu)對(duì)所處的環(huán)境十分敏感。一般情況下，對(duì)熱、強(qiáng)酸、 強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等均不夠穩(wěn)定，在反應(yīng)中易失活。天然酶的不穩(wěn)定性大大限制了其應(yīng)用領(lǐng)域和應(yīng)用效果，選擇適宜的載體對(duì)酶進(jìn)行固定化可以提高酶的穩(wěn)定性。在酶固定化采用的方法中，吸附法是最簡(jiǎn)單的一種方法。它的最大優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)便、條件溫和，酶分子不會(huì)被破壞，得到的固定化酶穩(wěn)定性好。通過(guò)吸附作用對(duì)酶的穩(wěn)定性進(jìn)行改善，關(guān)鍵的問(wèn)題是選擇合適的載體。在眾多載體中，納米二氧化硅是比較常見(jiàn)的一種無(wú)機(jī)載體，它具有較高的表面能和生物相容性，價(jià)格低廉。此外，還有較高的機(jī)械強(qiáng)度有利于在生物反應(yīng)器中進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。因此，在通過(guò)吸附對(duì)酶進(jìn)行固定化中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。載體粒徑大小、載體和酶吸附的方式直接影響固定化酶的穩(wěn)定性，目前的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，納米載體優(yōu)于微米載體。但是，目前采用正硅酸乙酯與Ν-(β-氨乙基)_氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微膠囊中同步水解的方法，一步法制備了氨基化的二氧化硅顆粒，以此作為載體，通過(guò)戊二醛作為交聯(lián)劑，采用共價(jià)法對(duì)不同酶進(jìn)行固定化。此種方法固定化時(shí)間長(zhǎng)達(dá)幾十小時(shí)，操作復(fù)雜，同時(shí)，由于交聯(lián)劑的存在，不利于保持較高的酶活力，酶穩(wěn)定性改善不顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在最大限度提高酶活保持率情況下，提供一種改善酶穩(wěn)定性的方法。采用納米SiO2作載體，調(diào)整介質(zhì)的ρΗ，利用酶和納米載體所帶電荷不同，自組裝形成酶-載體聚合體，從而達(dá)到提高酶穩(wěn)定性的目的。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)納米吸附改善胰蛋白酶穩(wěn)定性的方法分別用pH4. 0-10. 0的緩沖液配制3. 3mg/ mL，10mg/mL和30mg/mL胰蛋白酶溶液，再用相同ρΗ的緩沖液配制10mg/mL納米SW2溶液。 各取IOmL胰蛋白酶溶液和納米SiO2溶液使酶和載體質(zhì)量比實(shí)現(xiàn)1 3，1 1和3 1三個(gè)比例，在室溫下，用電動(dòng)攪拌器攪拌吸附池。所述胰蛋白酶是一種常用的動(dòng)物蛋白酶，酶活力單位為^5U/mg，酶解最適pH7. 8，最適溫度37°C。所述納米SW2粒徑分布均一，分別為 20nm、100nm、300nm。以吸附后的酶活保持率、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性為指標(biāo)，吸附ρΗ優(yōu)選為7. 8，酶和載體質(zhì)量比優(yōu)選為1 1，載體SiO2粒徑優(yōu)選為20nm。本發(fā)明另一種通過(guò)納米吸附改善木瓜蛋白酶穩(wěn)定性的方法分別用pH4. 0-8. O的緩沖液配制3. 3mg/mL, 10mg/mL和30mg/mL木瓜蛋白酶溶液，再用相同ρΗ的緩沖液配制10mg/mL納米SW2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和納米SW2溶液使酶和載體質(zhì)量比實(shí)現(xiàn)1 3，1 1和3 1三個(gè)比例。在室溫下，用電動(dòng)攪拌器攪拌吸附汕。所述木瓜蛋白酶是一種來(lái)源廣泛的植物蛋白酶，酶活力單位為617U/mg，酶解最適pH6. 0，最適溫度50°C。 所述納米SW2粒徑分布均一，分別為20nm、100nm、300nm。以吸附后的酶活保持率、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性為指標(biāo)，吸附pH優(yōu)選為6. 0，酶和載體質(zhì)量比優(yōu)選為1 1，載體SiO2粒徑優(yōu)選為20nm。本發(fā)明采用以納米顆粒作為酶吸附載體改善酶穩(wěn)定性的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1.通過(guò)調(diào)整pH使納米SW2載體和酶帶有相反電荷，通過(guò)靜電吸附的物理方法完成酶的固定化，避免了現(xiàn)有化學(xué)方法對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)的影響與破壞，使吸附后酶活性保持率較高。2.吸附時(shí)間與傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)法相比明顯縮短。本方法吸附時(shí)間僅需池甚至更短，而傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)法要長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)小時(shí)。3.與化學(xué)交聯(lián)法和微米SW2固定化酶的方法相比，本方法可以更有效提高酶穩(wěn)定性?；瘜W(xué)交聯(lián)法對(duì)木瓜蛋白酶固定化后，80°C時(shí)固定化酶活力較游離酶提高了 53%，常規(guī)微米SiO2吸附后提高了 25%，而本發(fā)明采用的方法提高了 82%。4.本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，酶穩(wěn)定性改善顯著，易于推廣，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。實(shí)施例1分別用0. lmol/L pH7. 8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和lOmg/mL 20nm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和納米SiO2溶液混合使酶和載體質(zhì)量比為1 1，在室溫條件下，用電動(dòng)攪拌器攪拌吸附池。經(jīng)檢測(cè)，吸附后酶活保持率為61 %。在pH7. 8的條件下，吸附在20nmSiA載體的胰蛋白酶在80°C時(shí)酶活力較游離酶提高了 88%;在溫度為37°C、pH3.0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 78%。實(shí)施例2分別用0. lmol/L pH7. 8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和lOmg/mL IOOnm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和納米SiO2溶液混合使酶和載體質(zhì)量比例為1 1，在室溫條件下，用電動(dòng)攪拌器攪拌吸附池。經(jīng)檢測(cè)，吸附后酶活保持率為56%，在pH7. 8的條件下，吸附在IOOnmSiA載體的胰蛋白酶在80°C時(shí)酶活力較游離酶提高了 72%;在溫度為37°C、pH3.0的條件下，固定化酶括力較游離酶提高了 65%。實(shí)施例3分別用0. 05mol/L pH9. 0的硼砂-氫氧化鈉緩沖液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和 10mg/mL 300nm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和300nm SiO2溶液混合使酶和載體質(zhì)量比例為1 3，在室溫條件下，用電動(dòng)攪拌器攪拌吸附池。
經(jīng)檢測(cè)，吸附后酶活保持率為47% ；在pH7. 8的條件下，吸附在300nmSiA載體的胰蛋白酶在80°C時(shí)酶活力較游離酶提高了在溫度為37°C、pH3.0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 48%。實(shí)施例4分別用0. lmol/L pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL 20nm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和20nm SiO2溶液混合使酶和載體質(zhì)量比為1 1，在室溫條件下，用電動(dòng)攪拌器攪拌吸附池。經(jīng)檢測(cè)，吸附后酶活保持率為53%，在pH6. 0的條件下，吸附在20nmSiA載體的木瓜蛋白酶在80°C時(shí)酶活力較游離酶提高了 82%;在溫度為50°C、pH3.0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 49%。實(shí)施例5分別用0. lmol/L pH5. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL IOOnm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和IOOnmSiO2溶液混合使酶和載體質(zhì)量比為1 1，在室溫條件下，在電動(dòng)攪拌器作用下攪拌吸附池。經(jīng)檢測(cè)，吸附后酶活保持率為42%，在pH6. 0的條件下，吸附在IOOnmSiA載體的木瓜蛋白酶在80 0C時(shí)酶活力較游離酶提高了 61 % ；在溫度為50 0C、pH3. 0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了四％。實(shí)施例6分別用0. lmol/L pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL 300nm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和300nmSi02溶液混合使酶和載體質(zhì)量比為1 1，在室溫條件下，在電動(dòng)攪拌器作用下攪拌吸附池。經(jīng)檢測(cè)，吸附后酶活保持率為39%，在pH6. 0的條件下，吸附在300nmSiA載體的木瓜蛋白酶在80 0C時(shí)酶活力較游離酶提高了 60 % ；在溫度為50 0C、pH3. 0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 25%。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種通過(guò)納米顆粒作為吸附載體改善酶穩(wěn)定性的方法，其特征在于選擇不同粒徑納米顆粒為載體，將酶通過(guò)物理吸附作用固定在該載體上。
2.權(quán)利要求1中所提到的酶主要有兩種胰蛋白酶(最適溫度37°C，最適pH7.8，等電點(diǎn)川^，最適條件下的酶活力為觀日"!^)和木瓜蛋白酶(最適溫度50°C，最適pH6.0，等電點(diǎn)8. 75，最適條件下的酶活力為617U/mg)
3.權(quán)利要求1中所提到的納米顆粒是二氧化硅顆粒，粒徑有20nm、100nm和300nm三種。
4.權(quán)利要求1所提到改善酶穩(wěn)定性的方法，具體步驟如下用不同PH的緩沖液配制一定濃度的酶溶液和納米S^2溶液。取酶溶液和納米S^2溶液按一定比例混合，于室溫下在電動(dòng)攪拌器作用下攪拌吸附一定時(shí)間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其特征在于對(duì)于胰蛋白酶，配制酶和載體緩沖溶液的PH范圍在4. 0-10. 0 ；對(duì)于木瓜蛋白酶，配制酶和載體緩沖溶液的pH范圍在4. 0-8. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其特征在于納米SiO2溶液的濃度10mg/mL；酶溶液的濃度為3. 3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL，使酶和載體的質(zhì)量比實(shí)現(xiàn)1 3，1 1和3 1 三個(gè)比例。
7.權(quán)利根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其特征在于納米S^2和酶的吸附時(shí)間是池。
8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于pH在4.0-8. 0的緩沖液是0. lmol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；PH范圍在8. 1-8. 9的緩沖液是0. 05mol/L的Tris-鹽酸緩沖液；PH范圍在9. 0-10. 0的緩沖液是0. 05mol/L的硼砂-氫氧化鈉緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)納米顆粒作為吸附載體提高酶穩(wěn)定性的方法，該方法采用不同納米粒徑的SiO2作載體，選用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為模型酶，分別在pH4.0-10.0和pH4.0-8.0范圍內(nèi)，使載體-酶質(zhì)量比實(shí)現(xiàn)3∶1，1∶1和1∶3三個(gè)不同的比例，室溫下攪拌3h，使二者通過(guò)靜電作用相互吸附。本方法可以大大提高酶穩(wěn)定性，以20nmSiO2為載體的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，在80℃時(shí)酶活力較天然酶分別提高了88％和82％，同時(shí)，本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，酶穩(wěn)定性改善顯著，易于推廣，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102344918SQ201010245800
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者于國(guó)萍, 姜毓君, 徐紅華, 李麗 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)