一種α-淀粉酶Amy16及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及淀粉酶，尤其是涉及分離自太平洋火色桿菌（Flammeovirga Pacifica) H2具有熱穩(wěn)定性和強(qiáng)堿耐受性的一種α -淀粉酶Amyl6及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉酶是一類能夠水解淀粉產(chǎn)生糊精以及更小的多糖單位或單糖的酶類總稱。根 據(jù)作用方式的不同，淀粉酶可以分為α -淀粉酶和β -淀粉酶。α -淀粉酶（EC. 3. 2. I. 1) 屬于糖苷水解酶13家族，能夠通過隨機(jī)酶切α-1，4-糖苷鍵來降解長鏈淀粉?；谛蛄泻?底物特異性的不同，還可以將α -淀粉酶進(jìn)一步地分為35個(gè)α -淀粉酶亞家族。α -淀粉 酶廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中，但目前應(yīng)用于工業(yè)的α -淀粉酶大多來自于微生物。
[0003] 對(duì)α -淀粉酶的研宄已經(jīng)有半個(gè)多世紀(jì)，目前，α -淀粉酶已是最重要的工業(yè)酶制 劑之一，已被廣泛應(yīng)用在食品、洗滌劑、發(fā)酵、紡織、造紙和制藥等諸多行業(yè)。α -淀粉酶的 一個(gè)重要工業(yè)應(yīng)用是在食品加工行業(yè)中被用來處理降解淀粉類物質(zhì)。目前在工業(yè)上大量使 用的α-淀粉酶主要來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)、角軍淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉（Aspergillus oryzae)。這些酶大多具有耐高溫甚至耐超高溫的特性， 它們的應(yīng)用可以簡化淀粉加工工藝，降低加工成本；另一方面，高溫發(fā)酵罐的高生產(chǎn)成本 和設(shè)備、發(fā)酵技術(shù)等瓶頸也嚴(yán)重限制了高溫α-淀粉酶的大規(guī)模發(fā)酵以及在淀粉加工行業(yè) 的進(jìn)一步應(yīng)用（Van Der Maarel, Μ. J.，Β. Van Der Veen, et al. (2〇〇2) · "Properties and applications of starch-converting enzymes of the a -amylase family. "Tournal of Biotechnology 94(2) : 137-155)。因此近年來，中溫淀粉酶也受到了越來越多的關(guān)注。雖 然我國上世紀(jì)70年代已有了 α -淀粉酶工業(yè)化生產(chǎn)，相繼開發(fā)出多種中溫淀粉酶，但大部 分淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)仍無法完全滿足現(xiàn)代工業(yè)的需求。
[0004] 中國專利CN 102925420Β公開一種α淀粉酶及表達(dá)α淀粉酶的重組菌株，所述 的α淀粉酶的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。用于表達(dá) α淀粉酶的黑曲霉P15,其保藏編號(hào)為CGMCC No. 6434。該發(fā)明所得到的重組菌種能夠表達(dá) 棒曲霉α淀粉酶AclaP15,其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉 自身表達(dá)的淀粉酶的酶活力。同時(shí)，所得重組α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得， 擴(kuò)大了 AclaP15的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0005] 中國專利CN 102827816B公開一種α -淀粉酶及其應(yīng)用，所述的α -淀粉酶的核 苷酸序列為SEQ ID NO :2,氨基酸序列為SEQ ID NO :1。該發(fā)明篩選出的α-淀粉酶在淀粉 水解為麥芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的過程中發(fā)揮了十分重要的作用，可以用來生產(chǎn)高 麥芽糖漿、作為添加劑用于焙烤制品如面包的生產(chǎn)，以及在啤酒、黃酒和生料酒精行業(yè)等行 業(yè)均有不同程度的應(yīng)用，具有工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。而且篩選出的α-淀粉酶可以用來轉(zhuǎn)化 工程菌，從而獲得具有表達(dá)α-淀粉酶的重組菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的是提供一種能夠應(yīng)用的具有熱穩(wěn)定和堿耐受性強(qiáng)等特性的新 型α -淀粉酶Amy 16。
[0007] 本發(fā)明的第二目的是提供編碼α -淀粉酶的基因 amyl6。
[0008] 本發(fā)明的第三目的是提供包含基因 amyl6的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的第四目的是提供包含基因 amyl6的重組菌株。
[0010] 本發(fā)明的第五目的是提供α -淀粉酶Amyl6的制備方法。
[0011] 本發(fā)明的第六目的是提供α -淀粉酶Amyl6的應(yīng)用。
[0012] 所述α -淀粉酶Amy 16分離自太平洋火色桿菌H2 (Flammeovirga Pacifica) H2,該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC N0:M2012229,地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072。
[0013] 所述α -淀粉酶Amyl6的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，SEQ ID NO. 1如下：
[0014] I MEDNESSIPE HEPKANMELQ VTTHDGAPFN KNESSNKRYS GSPGGPVMMQ AFYWDVPAGG 61 TWNTVKGKL NNWSNQGIGS IWLPPASKAQ NGPFSMGYDP MDYFDFGDYN QMGSKETRFG 121 SGTELRSLVG EAHNQNMEVY ADIVINHNSG GQLEANPYTG TDTffTKFNPA SGKFNRTYND 181 FHPNLDANND EGVFGGFPDL SHKKSYVQDW LWKKSNSVGK YYKNDVGFDG WRFDYVKGFG 241 AWVVKDWVNN VGGFAVGELff DGNASTLKW VDNTDRKSSA FDFAAYYAMD RAFDGNNLNE 301 LNGDMLWKKD SQRAVTFVAN HDTDEIWRKN LAYAYILTHE GYPCIFYRDY EDWLDKSMMN 361 NLLffIHKSYA TGNTSILHVD NDEYIARRNG YNGNPGLVVY INNSDNWKER WVPTNWSNKK 421 IKDYTGHSOT EPfTQGGTW KIQCPPRSYS IffTLK
[0015] α-淀粉酶基因編碼455個(gè)氨基酸，該酶基因表達(dá)的Amyl6蛋白分子量約為 52kDa。本發(fā)明的淀粉酶Amyl6同時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性、中溫條件下在中性和堿性范圍內(nèi) 均具有高活性等特征。本發(fā)明篩選到的Amyl6最適溫度為50°C，在60°C下仍具有60 %的 活力，且在60 °C下孵育20min后保有80 %的起始活力，40min之后仍保有65 %的起始活力， 表明本發(fā)明的淀粉酶Amyl6具有良好的熱穩(wěn)定性。Amyl6的最適pH為6. 5,在pH 5. 5?9 之間的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性。此外α-淀粉酶Amyl6在pH 6,7,8條件下孵育Ih 活力基本保持不變，在pH 9條件下孵育Ih保有70%的起始活力，在pH 10條件下孵育Ih 后仍保有40%的起始活力，表明了該酶具有較強(qiáng)的堿耐受性。由于本發(fā)明的淀粉酶具有良 好的熱穩(wěn)定性和堿耐受性，且可有效地與糖化酶協(xié)同作用降解淀粉產(chǎn)生葡萄糖，因此可以 廣泛地用于食品加工、飼料、輕工等領(lǐng)域，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
[0016] 編碼α -淀粉酶Amyl6的基因 amyl6的基因序列如SEQ ID NO. 2所示，SEQ ID NO. 2如下：
[0017] I ATGGAGGACA ATGAGAGTTC TATTCCTGAA CATGAGCCAA AAGCCAATAT GGAGTTGCAA 61 GTAACCACTC ATGATGGTGC TCCTTTTAAT AAGAATGAAT CTTCTAATAA AAGATACTCA 121 GGTAGTCCGG GAGGACCTGT GATGATGCAG GCATTTTACT GGGACGTTCC TGCGGGGGGT 181 ACTTGGTGGA ATACCGTGM AGGAAMTTG AATAATTGGA GTAATCAAGG AATTGGATCC 241 ATTTGGTTAC CTCCTGCTTC AAAAGCTCAA AATGGACCTT TCTCTATGGG GTATGACCCA 301 ATGGATTATT TTGATTTTGG TGATTATAAC CAAATGGGTT CAAAAGAAAC AAGGTTTGGA 361 TCTGGTACAG AATTAAGATC TCTTGTTGGG GAAGCACACA ATCAAAATAT GGAAGTGTAT 421 GCTGATATAG TGATCAACCA TAATAGTGGT GGACAACTAG AAGCAAACCC TTATACAGGT 481 ACAGATACAT GGACAAAGTT TAATCCGGCT TCGGGTAAGT TTAATAGAAC ATATAATGAT 541 TTCCACCCTA ACCTTGATGC AAATAATGAT GAAGGTGTTT TTGGAGGTTT TCCAGACTTA 601 AGCCATAAAA AAAGTTATGT GCAAGATTGG TTATGGAAAA AAAGTAACTC TGTAGGAAAA 661 TACTATAAAA ATGATGTCGG TTTTGATGGA TGGAGATTTG ATTACGTGAA AGGCTTTGGT 721 GCATGGGTGG TCAAAGATTG GGTCAATAAT GTAGGTGGAT TTGCTGTAGG TGAATTATGG 781 GACGGTAATG CCAGCACCTT AAAGTGGTGG