采用棒曲霉α-淀粉酶和支鏈淀粉酶由淀粉制備葡萄糖的方法
【專利說明】采用棒曲霉α-淀粉酶和支鏈淀粉酶由淀粉制備葡萄糖的 方法
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求2012年8月16日提交的美國臨時專利申請61/683, 960的權(quán)益， 該臨時專利申請的內(nèi)容據(jù)此以引用方式全文并入。
[0003] 序列表
[0004] 附件是包括SEQ ID NO: 1-13的序列表，其以引用方式整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 將（1)來自棒曲霉（Aspergillus clavatus)的α -淀粉酶（AcAmyl)或其變體和 (2)支鏈淀粉酶用于淀粉的糖化，例如同時糖化和發(fā)酵（SSF)的方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 淀粉由直鏈淀粉（15-30% w/w)和支鏈淀粉（70-85% w/w)的混合物組成。直鏈 淀粉由α -1，4-連接的葡萄糖單元的直鏈組成，分子量（MW)為約60, 000至約800, 000。支 鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有α -1，6分支點的支鏈聚合物；其MW可高達一億。
[0007] 濃縮右旋糖漿形式的得自淀粉的糖目前通過酶催化法制備，所述方法涉及：（1) 用α -淀粉酶將固體淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度為約7-10的糊精，以及（2)用 淀粉葡糖苷酶（也稱為葡糖淀粉酶或GA)將所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得 的糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后通過酶法異構(gòu)化為稱為異糖漿 (isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖漿還可用微生物如酵母發(fā)酵以生產(chǎn)商業(yè)終產(chǎn) 品。終產(chǎn)品可為醇，或者任選乙醇。終產(chǎn)品還可以是有機酸、氨基酸、生物燃料和其他生物 化工品，包括但不限于乙醇、檸檬酸、琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡 糖酸鉀、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-S -內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉、賴氨酸、ω 3脂肪酸、丁醇、異 戊二烯、1，3-丙二醇和生物柴油。可同時進行發(fā)酵和糖化（即SSF工藝）來實現(xiàn)更大的經(jīng) 濟性和效率。
[0008] α -淀粉酶通過隨機裂解內(nèi)部α -1，4-糖苷鍵來水解淀粉、糖原和相關(guān)多糖。特別 是來自桿菌屬（Bacilli)的α-淀粉酶已被用于多種不同的用途，包括淀粉液化和糖化、紡 織物退漿、造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性、釀造、烘焙、食品工業(yè)的糖漿的生產(chǎn)、發(fā)酵工藝的 原料的生產(chǎn)以及用于動物飼料以提高可消化性。這些酶也可用于在盤碟洗滌和衣物洗滌過 程中除去含淀粉污垢和污漬。
[0009] 若干曲霉屬（Aspergillus)物種，包括棒曲霉在內(nèi)，顯示出強效淀粉分解行為，這 種行為在酸性條件下得到保持。參見Nahira et al. (1956) "Taxonomic studies on the genus Aspergillus. VIII. The relation between the morphological characteristics and the amylolytic properties in the Aspergillus，"Hakko Kogaku Zasshi 34:391-99, 423-28, 457-63 (Nahira等人，1956年，"曲霉屬的分類學(xué)研究VIII.:曲霉屬 的形態(tài)特征與淀粉分解特性之間的關(guān)系"，《發(fā)酵工學(xué)雜志》，第34卷，第391-399頁，第 423-428頁，第457-463頁）。例如，棒曲霉分泌淀粉酶活性及其他多糖降解酶，這使得該 真菌能消化其環(huán)境中的復(fù)合碳水化合物。參見Ogundero et al. (1987) "Polysaccharide degrading enzymes of a toxigenic strain of Aspergillus clavatus from Nigerian poultry feeds，"Die Nahrung 10:993-1000 (Ogundero 等人，1987 年，"來自尼日利亞禽飼 料的棒曲霉的產(chǎn)毒株的多糖降解酶"，《食品》，第10卷，第993-1000頁）。在確定pH對棒 曲霉降解經(jīng)碾磨飼料的能力的作用時，棒曲霉在從3. 2至7. 8的所有受測試pH值下均顯 不出降解飼料的能力。參見 OgunderoQ987) "Toxigenic fungi and the deterioration of Nigerian poultry feeds，" Mycopathologia 100:75-83 (Ogundero, 1987 年，"產(chǎn)毒 真菌與尼日利亞禽飼料的變質(zhì)"，《真菌病理學(xué)》，第100卷，第75-83頁）。隨后的研宄 顯示當(dāng)棒曲霉在玉蜀黍酵母提取物培養(yǎng)基或小麥酵母提取物培養(yǎng)基上生長時，棒曲霉淀 粉酶在 pH 7-8 處具有峰值活性。Adisa(1994) "MycofIora of post-harvest maize and wheat grains and the implications of their contamination by molds，''Die Nahrung38 (3) : 318-26 (Adisa，1994年，"收獲后的玉蜀黍和小麥谷粒的真菌群及所述谷粒 被霉菌污染的含意"，《食品》，第38卷，第3期，第318-326頁）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 來自棒曲霉的α -淀粉酶（AcAmyl)在適當(dāng)溫度和酸性pH下催化糖化較長的時 間。提供了來自棒曲霉NRRLl的已知α-淀粉酶的例子（SEQ ID NO: 1)、所述α-淀粉酶的 變體、編碼核酸以及表達所述多核苷酸的宿主細胞。AcAmyl具有酸性工作范圍，并且在同時 糖化和發(fā)酵（SSF)中有助于高乙醇產(chǎn)率和低殘余淀粉，例如，特別是當(dāng)與葡糖淀粉酶一起 使用時。盡管Adisal994公開了棒曲霉的峰值淀粉酶活性在25-30°C下出現(xiàn)于pH 7-8處， 但AcAmyl在50°C下具有pH最佳值pH 4. 5。AcAmyl在高溫和低pH下表現(xiàn)出高活性，因此 AcAmyl可在真菌葡糖淀粉酶如黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶（AnGA)或者木霉 屬（Trichoderma)葡糖淀粉酶（TrGA)存在下被有效用于糖化工藝。與白曲霉（Aspergillus kawachii) α -淀粉酶（AkAA)催化的糖化產(chǎn)物相比，AcAmyl有利地催化淀粉糖化為顯著富 含DPl和DP2(即，葡萄糖和麥芽糖）的低聚糖組合物。AcAmyl可以比AkAA低的劑量使 用，以生成相當(dāng)水平的乙醇。AcAmyl可以與源自植物（例如，谷物和糧食）的酶結(jié)合使用。 AcAmyl還可以與宿主細胞分泌或宿主細胞內(nèi)源的酶結(jié)合使用。例如，AcAmyl可被添加到發(fā) 酵或SSF工藝，在所述工藝期間一種或多種淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋 白酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或其他酶由生產(chǎn)宿主分泌。AcAmyl也可以 與內(nèi)源性非分泌型生產(chǎn)宿主酶組合在一起工作。在另一個例子中，AcAmyl可在發(fā)酵或SSF 期間由生產(chǎn)宿主細胞單獨分泌或者與其他酶一起分泌。AcAmy 1淀粉酶還可以有效地將淀粉 直接水解為糖漿和/或生物化學(xué)物質(zhì)（例如，醇類、有機酸、氨基酸、其他生物化學(xué)物質(zhì)和生 物材料），其中反應(yīng)溫度低于底物的膠化溫度。AcAmyl可在發(fā)酵或SSF期間由宿主細胞與 其他酶一起分泌。
[0011] 因此，本發(fā)明提供了一種糖化可能包含淀粉的組合物以制備包含葡萄糖的組合物 的方法，其中所述方法可包括（i)使包含淀粉的組合物與支鏈淀粉酶以及分離的AcAmyl或 其變體接觸，所述分離的AcAmyl或其變體具有α-淀粉酶活性并且包含與（a)SEQ ID NO: 1 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%氨基酸序列同一 性的氨基酸序列；以及（ii)糖化該包含淀粉的組合物以產(chǎn)生該包含葡萄糖的組合物；其中 該支鏈淀粉酶和該分離的AcAmyl或其變體單獨地或與其他酶結(jié)合催化該淀粉組合物糖化 成葡萄糖、DP2、DP3、DP4等，或者糖化成其他低聚糖或多糖。
[0012] 為了在相同的條件下減少相同數(shù)量的殘余淀粉，AcAmyl或其變體的劑量可以為 AkAA劑量的約17% -50%，或任選地約17% -34%。為了在相同的條件下減少相同數(shù)量的 DP3+，AcAmy 1或其變體的劑量也可以為AkAA劑量的約17 % -50 %，或任選地約17 % -34%。
[0013] 在一些實施例中，該AcAmyl或其變體的劑量為約1.7至約IOyg蛋白質(zhì)/g固形 物。在另外的實施例中，該AcAmyl或其變體的劑量為約1. 7至約6. 6 μ g蛋白質(zhì)/g固形物。 在另外的實施例中，該AcAmyl或其變體的劑量為約3. 3 μ g蛋白質(zhì)/g固形物。
[0014] 該包含葡萄糖的組合物與由AkAA及支鏈淀粉酶在相同條件下制備的包含葡萄糖 的第二組合物相比，可富含DPI、DP2或（DP1+DP2)。
[0015] 在一些實施例中，在存在支鏈淀粉酶的情況下，AcAmyl或其變體的劑量是在不存 在支鏈淀粉酶的情況下在相同條件下減少相同數(shù)量的殘余淀粉所需要的AcAmyl劑量的約 50%，并且任選地，其中該支鏈淀粉酶的劑量為在不存在支鏈淀粉酶的情況下在相同條件 下減少相同數(shù)量的殘余淀粉所需要的AcAmyl劑量的約20%。在另外的實施例中，在存在支 鏈淀粉酶的情況下，AcAmyl或其變體的劑量是在不存在支鏈淀粉酶的情況下在相同條件下 減少相同數(shù)量的DP3+所需要的AcAmyl劑量的約50%，并且任選地，其中該支鏈淀粉酶的劑 量為在不存在支鏈淀粉酶的情況下在相同條件下減少相同數(shù)量的DP3+所需要的AcAmyl劑 量的約20%。在另外的實施例中，在存在支鏈淀粉酶的情況下，AcAmyl或其變體的劑量是 在不存在支鏈淀粉酶的情況下在相同條件下生產(chǎn)相同的乙醇產(chǎn)率所需要的AcAmyl劑量的 約50%，并且任選地，其中該支鏈淀粉酶的劑量為在不存在支鏈淀粉酶的情況下在相同條 件下生產(chǎn)相同的乙醇產(chǎn)率所需要的AcAmyl劑量的約20%。
[0016] AcAmyl或其變體可包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1 的第20-497位殘基具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。AcAmyl 或其變體還可包含（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位 殘基。AcAmyl或其變體可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的 第20-497位殘基具有至少80%、90%、95 %或99 %氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。 AcAmyl或其變體還可由（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQID NO: 1的第20-497 位殘基組成。
[0017] 該淀粉組合物可包含液化淀粉、膠化淀粉或顆粒淀粉。糖化可在約30°C至約75°C 的溫度范圍內(nèi)進行。所述溫度范圍還可為47°C-74°C。糖化可在pH 2.0-pH 7. 5的pH范 圍內(nèi)進行。所述pH范圍還可為pH 3.5-pH5. 5。所述pH范圍還可為pH 4. 〇-pH 5.0。
[0018] 所述方法還可包括發(fā)酵葡萄糖組合物以制備發(fā)酵最終（EOF)產(chǎn)物。發(fā)酵可以是同 時糖化和發(fā)酵（SSF)反應(yīng)。發(fā)酵可在pH 2-8下并且在25°C_70°C的溫度范圍內(nèi)進行24-70 小時。EOF產(chǎn)物可包含8%-18% (v/v)的乙醇。EOF產(chǎn)物可包含代謝物。終產(chǎn)品可為醇， 或者任選乙醇。終產(chǎn)品還可以是有機酸、氨基酸、生物燃料和其他生物化工品，包括但不限 于乙醇、檸檬酸、琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、衣康酸和其 他羧酸、葡糖酸-δ -內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉、賴氨酸、ω3脂肪酸、丁醇、異戊二烯、1，3-丙二醇 和生物柴油。
[0019] 本發(fā)明還提供AcAmyl或其變體與支鏈淀粉酶在發(fā)酵飲料的生產(chǎn)中的用途，以及 制備發(fā)酵飲料的方法，該方法可包括：使麥芽漿和/或麥芽汁與AcAmyl或其變體以及支鏈 淀粉酶接觸。一種制備發(fā)酵飲料的方法，其可包括：(a)制備麥芽漿；(b)過濾所述麥芽漿以 得到麥芽汁；以及（c)將麥芽汁進行發(fā)酵以獲得發(fā)酵飲料，其中AcAmyl或其變體以及支鏈 淀粉酶被添加至：（i)步驟（a)的麥芽漿和/或（ii)步驟（b)的麥芽汁和/或（iii)步驟 (c)的麥芽汁。還提供了由所公開的方法生產(chǎn)的發(fā)酵飲料。
[0020] 發(fā)酵