專利名稱：用于檢測(cè)膜來(lái)源的caspase活性和其調(diào)節(jié)劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及檢測(cè)膜來(lái)源的caspase活性和其調(diào)節(jié)劑的方法，更具體地，涉及一種新的用于鑒定膜來(lái)源caspase活性的抑制劑和增強(qiáng)劑的無(wú)細(xì)胞篩選分析方法。
由于在多種生理過(guò)程，例如胚胎發(fā)育、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)和正常的細(xì)胞更新中，細(xì)胞凋亡起著維持組織穩(wěn)態(tài)的作用，所以受調(diào)控的細(xì)胞凋亡的功能障礙或喪失能夠?qū)е赂鞣N病理疾病狀態(tài)。例如，喪失細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致與許多自身免疫病相關(guān)的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞聚積。細(xì)胞凋亡的不恰當(dāng)喪失或抑制也會(huì)導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞和過(guò)度增殖細(xì)胞如贅生性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的積累。同樣，細(xì)胞凋亡的不當(dāng)激活也會(huì)引起各種病理疾病狀態(tài)，包括例如獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、神經(jīng)變性病和缺血性損傷。
盡管細(xì)胞凋亡由多種信號(hào)和細(xì)胞基因產(chǎn)物的復(fù)雜相互作用介導(dǎo)，但這些相互作用的結(jié)果最終將進(jìn)入在人類和無(wú)脊椎動(dòng)物之間進(jìn)化上保守的細(xì)胞死亡途徑。該途徑本身是類似于凝血級(jí)聯(lián)事件的一系列蛋白水解級(jí)聯(lián)事件。
目前已鑒定了幾個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程的基因家族和產(chǎn)物。一個(gè)家族是天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(“caspase”)。線蟲(C.elegans)中鑒定的caspase Ced-3是線蟲C.elegans發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞程序性死亡所必需的。已經(jīng)對(duì)Ced-3的同系物及其它c(diǎn)aspase進(jìn)行了特性分析。人類caspase家族包括例如Ced-3、人ICE(白介素-1-β轉(zhuǎn)化酶)(caspase-1)、ICH-1(caspase-2)、CPP32(caspase-3)、ICErelII(caspase-4)、ICErelIII(caspase-5)、Mch2(caspase-6)、ICE-LAP3(caspase-7)、Mch5(caspase-8)、ICE-LAP6(caspase-9)、Mch4(caspase-10)、caspase-11、caspase-12、caspase-13、caspase-14等。
半胱氨酸蛋白酶的caspase家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程的必需因子(Yuan等，細(xì)胞(Cell)75641-652，1993；Alnemri等，細(xì)胞87171，1996；Cohen，生物化學(xué)(Biochem.)3261-16，1997；Miller，Semin.Immunol.935-49，1997；Salvesen和Dixit，細(xì)胞91443-446，1997)。caspase是作為無(wú)活性酶原合成的，其通過(guò)蛋白水解加工產(chǎn)生聯(lián)結(jié)形成活性酶的大(約18 kDa)和小(約12 kDa)亞基來(lái)激活(Thornberry等，自然(Nature)396768-774，1992；Nicholson等，自然37637-43，1995；Stennicke和Salvesen，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27225719-25723，1997)。各種細(xì)胞凋亡刺激物可引起特異caspase的激活，然后該激活的caspase通過(guò)蛋白水解加工其它的caspase起始一系列蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Srinivasula等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9314486-14491，1996；Yu等，癌癥研究(Cancer Res.)58402-408，1998)。一旦激活，這些下游(行刑者)caspase通過(guò)切割對(duì)于細(xì)胞的存活必需的特異分子靶標(biāo)或通過(guò)激活促細(xì)胞凋亡因子殺死細(xì)胞(Liu等，細(xì)胞89175-184，1997；Enari等，自然39143-50，1998；Salvesen和Dixit，細(xì)胞91443-446，1997)。盡管caspase一般表現(xiàn)為是胞質(zhì)蛋白質(zhì)(Miller等，生物化學(xué)雜志26818062-18069，1993；Nicholson等，自然37637-43，1995；Li等，生物化學(xué)雜志27230299-30305，1997)，但免疫化學(xué)研究提示在某些情況下caspase也可能與細(xì)胞核或質(zhì)膜相關(guān)(Singer等，J.Exp.Med.1821447-1459，1995；Krajewski等，血液(Blood)893817-3825，1997；Posmantur等，J. Neurochem.682328-2337，1997)。近來(lái)公布的資料也指出某些caspase與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)(Mancini等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)1401485-1495，1998；Chandler等，生物化學(xué)雜志27310815-10818，1998)。
Bcl-2家族構(gòu)成另一組關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡途徑調(diào)節(jié)物。這些蛋白質(zhì)能夠在廣泛多種細(xì)胞系統(tǒng)中起到調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用(Oltvai和Korsmeyer，細(xì)胞79189-192，1994；Reed，自然387773-776，1997)。Bcl-2家族的蛋白質(zhì)含有一至四個(gè)保守域，稱為BH1-BH4，而且大多數(shù)家族成員含有一個(gè)羧基端跨膜錨定序列，從而允許它們與細(xì)胞膜(包括線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))相聯(lián)系(Reed，自然387773-776，1997；Krajewski等，癌癥研究534701-4714，1993；Yang等，細(xì)胞生物學(xué)雜志1281173-1184，1995；Lithgow等，細(xì)胞生長(zhǎng)分化(Cell Growth Differ)3411-417，1994)。已經(jīng)顯示在幾種細(xì)胞系統(tǒng)中Bcl-2的超量表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡刺激后細(xì)胞質(zhì)caspase的激活(Armstrong等，生物化學(xué)雜志27116850-16855，1996；Chinnaiyan等，生物化學(xué)雜志2714573-4576，1996；Boulakia等，癌基因(Oncogene)1229-36，1996；Srinivasan等，神經(jīng)科學(xué)雜志(J.Neurosci.)165654-60，1996)。而且，以前的工作已證明Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的起始，但是一旦細(xì)胞凋亡被啟動(dòng)，則Bcl-2不會(huì)妨礙該過(guò)程(McCarthy等，細(xì)胞生物學(xué)雜志136215-217，1997)。然后，仍然不清楚該膜結(jié)合Bcl-2是如何控制可溶性細(xì)胞質(zhì)caspase的。而且，也不存在適合的方法可以用于以無(wú)細(xì)胞的方式研究膜結(jié)合Bcl-2以及它對(duì)caspase活性的影響。
由于缺乏這樣的方法，阻礙了對(duì)通過(guò)增強(qiáng)或抑制膜來(lái)源的caspase活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑的化合物的鑒定。由于完整細(xì)胞或其細(xì)胞質(zhì)提取物缺乏特異性、有效性和/或?qū)嵱眯?Utilization)，所以對(duì)可獲得的方法造成了限制。例如，可以對(duì)大多數(shù)抗癌藥物殺死細(xì)胞的能力進(jìn)行篩選，然后由此鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞壞死或細(xì)胞凋亡的化合物。此外，有許多其它分析技術(shù)也在集中研究定位于該級(jí)聯(lián)反應(yīng)更內(nèi)部的caspase酶的抑制或增強(qiáng)。因此，在本領(lǐng)域中需要一些方法用于鑒定抑制或促進(jìn)細(xì)胞死亡的化合物以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)起始的化合物。本發(fā)明將滿足這種需求，同時(shí)還提供其它相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
前述特性以及將在下文作更為詳細(xì)描述的其它特性使得本文所描述的方法對(duì)于藥物開發(fā)應(yīng)用尤其具有吸引力。
另一方面，本發(fā)明提供用于鑒定膜來(lái)源caspase活性的抑制劑的方法，包括在至少一種候選抑制劑存在和不存在時(shí)將膜組分與caspase底物接觸；然后比較caspase底物轉(zhuǎn)化的水平，并由此鑒定出膜來(lái)源caspase的活性的抑制劑。
再一方面，本發(fā)明提供用于鑒定膜來(lái)源caspase活性的增強(qiáng)劑的方法，包括在至少一種候選增強(qiáng)劑存在和不存在時(shí)將膜組分與caspase底物接觸；然后比較caspase底物轉(zhuǎn)化的水平，并由此鑒定膜來(lái)源caspase的活性的增強(qiáng)劑。
本發(fā)明的再一方面是用于鑒定膜組分中caspase加工過(guò)程展開(evolution of caspase processing)的抑制劑或增強(qiáng)劑的方法，包括將膜組分與至少一種候選抑制劑或候選增強(qiáng)劑接觸；然后鑒定大caspase亞基和小caspase亞基的存在，并由此確定caspase加工的水平，其中加工水平的降低指示存在caspase加工的抑制劑，而其中加工水平的增加指示存在caspasse加工的增強(qiáng)劑。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定調(diào)節(jié)膜組分來(lái)源caspase活性的化合物的方法，包括在足以允許caspase活性形成的條件和時(shí)間下，在至少一種候選化合物存在和不存在時(shí)，將膜組分、細(xì)胞凋亡抑制劑和caspase底物一起孵育；然后比較caspase底物轉(zhuǎn)化的水平，籍此鑒定調(diào)節(jié)膜來(lái)源caspase活性的化合物。
在其它實(shí)施方案中，提供通過(guò)這些方法鑒定的膜來(lái)源caspase活性的抑制劑和增強(qiáng)劑。
在這些不同的實(shí)施方案中，caspase活性是通過(guò)測(cè)量底物的轉(zhuǎn)化或caspase的加工來(lái)檢測(cè)的。在其它實(shí)施方案中，底物轉(zhuǎn)化通過(guò)時(shí)程或終點(diǎn)分析測(cè)量。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該膜組分含有重膜或核膜。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該膜組分來(lái)源于表達(dá)抗細(xì)胞凋亡多肽的細(xì)胞。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該膜組分來(lái)源于非凋亡細(xì)胞。
參考以下的詳述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將是明了的。此外，以下列出在某些程序或組合物(例如質(zhì)粒等)方面給出了更為詳細(xì)描述的各種參考文獻(xiàn)，由此將它們以參考文獻(xiàn)的方式完整地并入本文。
圖2A-D是亞細(xì)胞組分中caspase底物裂解活性的柱形圖。
圖3A和3B為膜相關(guān)procaspase-3自發(fā)激活圖。圖3A以DEVD-amc轉(zhuǎn)化的函數(shù)形式說(shuō)明了來(lái)自697-neo和697-Bcl-2細(xì)胞的重膜中caspase活性的自發(fā)激活。圖3B以DEVD-amc轉(zhuǎn)化的函數(shù)形式說(shuō)明了可溶性caspase活性自細(xì)胞膜的產(chǎn)生。
圖4是免疫印跡的掃描圖象，代表了用抗caspase-3多克隆抗體對(duì)來(lái)自697-neo和697-Bcl-2細(xì)胞的重膜和胞質(zhì)組分SDS-PAGE進(jìn)行的分析。楔形符號(hào)指示蛋白質(zhì)大小標(biāo)記物(Rainhow Markers，Novex)的遷移；箭頭指示procaspase-3。HM＝重膜組分；S100＝胞質(zhì)組分。
圖5圖示外源caspas-1對(duì)膜相關(guān)DEVD-amc切割活性的激活。
圖6A和6B圖解了在細(xì)胞色素c存在和不存在時(shí)697-neo和697-Bcl-2細(xì)胞中的DEVD-amc切割活性。圖6A說(shuō)明重膜組分中存在的caspase活性。圖6B說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)組分中存在的caspase活性。
圖7A、7B和7C圖解了透化去污劑對(duì)膜相關(guān)caspase活性的影響。圖7A闡明了NP-40對(duì)neo膜中自發(fā)和誘導(dǎo)的caspase活性的影響。圖7B說(shuō)明了NP-40對(duì)Bcl-2和neo膜中自發(fā)caspase活化的影響。圖7C描述了由于粒酶B對(duì)富含線粒體的組分的處理引起的procaspase-3的NP-40依賴性和不依賴性激活。
發(fā)明詳述正如以上提及的，本發(fā)明一般指向鑒定和調(diào)節(jié)膜來(lái)源caspase活性的方法。本公開發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是鑒定細(xì)胞凋亡的抑制劑或增強(qiáng)劑。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這種新的無(wú)細(xì)胞分析系統(tǒng)的使用提供了一種鑒定在關(guān)鍵起始點(diǎn)(即細(xì)胞膜)上促進(jìn)或抑制細(xì)胞程序性死亡的化合物的手段。本發(fā)明的另一方面在于該公開的分析系統(tǒng)能夠研究來(lái)源于超量表達(dá)細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)(例如bcl-2家族蛋白質(zhì))的細(xì)胞的膜的作用。
正如本文所描述的，優(yōu)選的分析系統(tǒng)利用重膜或核膜在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中檢測(cè)膜來(lái)源的caspase活性，和/或鑒定直接或間接地調(diào)節(jié)caspase活性的化合物。因此，通過(guò)使用這些膜系統(tǒng)，能夠有效地分析細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞凋亡途徑上游的控制點(diǎn)，并且可以鑒定其調(diào)節(jié)物。
部分地借助于高處理量方法學(xué)，本發(fā)明的分析方法將在藥物開發(fā)中尤其有用。因此，通過(guò)利用本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞分析系統(tǒng)，可以快速鑒定影響來(lái)自該膜組分的caspase活性形成的化合物。
在闡明本發(fā)明之前，闡明下文中將用到的某些術(shù)語(yǔ)的定義可能對(duì)于理解本發(fā)明是有幫助的。
本文所用“caspase”是指特異在Asp殘基之后切割蛋白質(zhì)的半胱氨酸蛋白酶。caspase最初表達(dá)成酶原，其中大亞基位于小亞基的N端。一般，caspase通過(guò)在內(nèi)部Asp殘基處切割而被激活。在許多真核生物中已鑒定到這些蛋白質(zhì)，包括C.elegans、果蠅(Drosophila)、小鼠和人。目前，至少有14種已知的caspase基因，命名為caspase-1至caspase-14。表1列舉了10種人caspase和它們的別名。
在本發(fā)明上下文中，應(yīng)當(dāng)理解，caspase包括野生型蛋白質(zhì)序列，以及天然蛋白質(zhì)序列的其它變體(包括等位變體)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些變體可以從天然多態(tài)性產(chǎn)生，或可以通過(guò)重組方法合成，并且與野生型蛋白質(zhì)相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、插入或缺失等。典型地，當(dāng)進(jìn)行改造時(shí)，氨基酸替代將是保守性的，即在極性、非極性、芳香族、帶電荷等氨基酸組內(nèi)進(jìn)行的氨基酸替代。在與天然序列同源的區(qū)域中，變體應(yīng)優(yōu)選具有至少90％的氨基酸序列一致性，而且在某些實(shí)施方案中具有高于92％、95％或97％的一致性。該氨基酸序列一致性可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法確定，這些方法包括利用在www.ncbi.nlm.nih.gov能獲得的國(guó)家生物技術(shù)信息中心BLAST搜索方法。優(yōu)選的一致性方法描述于美國(guó)專利5,691,179和Altschul等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)253389-3402，1997中，所有這些均以參考文獻(xiàn)形式并入本文。如果采用Gapped BLAST 2.0，則使用默認(rèn)設(shè)置。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，由于密碼子的簡(jiǎn)并性、核苷酸的多態(tài)性或氨基酸的差異，編碼caspase或變體的核苷酸序列可以與已知的天然序列不同。在其它實(shí)施方案中，變體應(yīng)優(yōu)選與天然核苷酸序列在正常嚴(yán)緊條件下雜交，所述正常嚴(yán)緊條件是低于天然雙螺旋的Tm值大約25-30℃(例如，5×SSPE、0.5％SDS、5×Denhardt氏溶液、50％甲酰胺、42℃，或等同條件；一般參見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborPress，1987；Ausubel等，當(dāng)代分子生物學(xué)操作指南(Current Protocolsin Molecular Biology)，Greene Publishing，1987)。
“分離的核酸分子”是指至少一度以基本純的形式從其來(lái)源細(xì)胞(包括其通常所位于的染色體)中分離出來(lái)的多核苷酸分子，該分子可以是獨(dú)立的片段形式，或是作為一個(gè)更大核酸結(jié)構(gòu)的成分。核酸分子可以由許多種核苷酸構(gòu)成，這包括DNA、RNA、核苷酸類似物或這些的某種組合。
本文所用“膜組分”是指真核細(xì)胞的含有細(xì)胞膜的亞細(xì)胞組分。具體地，術(shù)語(yǔ)“重膜”在本文中用于指基本不含有核膜和輕膜的亞細(xì)胞組分，其中的主要成分之一是線粒體。
“細(xì)胞凋亡刺激物”或“促細(xì)胞凋亡劑(pro-apoptotic agent)”在本文中用于指增加細(xì)胞的特異細(xì)胞凋亡活性的藥劑。這些刺激的說(shuō)明性例子有生長(zhǎng)因子剝奪、Fas配體、抗Fas抗體、星形孢菌素、紫外輻射、γ輻射、腫瘤壞死因子和本領(lǐng)域熟知的其它物質(zhì)。因此，細(xì)胞凋亡刺激物是一種直接或間接增強(qiáng)caspase分子的分子活性的藥劑。此外，細(xì)胞凋亡刺激物還可以是能夠增強(qiáng)或誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡活性的多肽。這些多肽包括那些直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑的多肽例如Bax、Bad、Bcl-xS、Bak、Bik和活性caspase，以及那些間接調(diào)節(jié)該途徑的多肽。
本文所用“細(xì)胞凋亡抑制劑”或“抗細(xì)胞凋亡劑”是指當(dāng)與對(duì)照藥劑相比時(shí)，降低細(xì)胞的細(xì)胞凋亡活性的藥劑。該抗細(xì)胞凋亡劑的說(shuō)明性例子包括小分子、fmk、p35、crmA、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、腺病毒的E1B-19K、以及促細(xì)胞凋亡劑的拮抗劑(例如反義分子、核酶、抗體等)。因此，細(xì)胞凋亡抑制劑是一種直接或間接地降低caspase分子的分子活性的藥劑。
本文所用“細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)”是指參與細(xì)胞死亡途徑的蛋白質(zhì)。說(shuō)明性的例子包括Bcl-2、Bcl-XS、Bcl-XL、Bik、Bak、Bax、Bad、caspase分子、Apaf-1和細(xì)胞色素c等。
“caspase活性的形成(evolution of caspase activity)”在本文用于指在一段時(shí)間內(nèi)caspase蛋白酶活性水平的可檢測(cè)的增加。該形成可以通過(guò)底物轉(zhuǎn)化(例如熒光底物)可檢測(cè)的增加和/或caspase加工可檢測(cè)的增加來(lái)顯示。
本文所用“膜來(lái)源的caspase活性”是指從重膜或核膜釋放的或與之相關(guān)的caspase活性。A.膜制品在本發(fā)明中，膜制品可以來(lái)源于多種細(xì)胞類型或來(lái)源。典型地，為了便于操作，所用細(xì)胞將是真核細(xì)胞系或其它可培養(yǎng)的細(xì)胞類型。然而，細(xì)胞也可以來(lái)源于組織和其它非培養(yǎng)來(lái)源。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易理解，本發(fā)明的分析方法并不依賴于用于制備膜組分的確切細(xì)胞來(lái)源或類型。
在最近30年里，亞細(xì)胞分級(jí)分離一直是細(xì)胞生物學(xué)中的一項(xiàng)基本研究工具。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)于用于該分級(jí)分離的各種技術(shù)是熟悉的。典型地，亞細(xì)胞分級(jí)分離包括兩個(gè)基本步驟，1)勻漿和2)分離。理想形式的勻漿允許顆粒細(xì)胞器例如細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和過(guò)氧化物酶體保持完整。有多種勻漿技術(shù)是已知的，例如Dounce勻漿器(玻璃/玻璃)、Potter-Elvehjem勻漿器(玻璃/聚四氟乙烯)、反復(fù)抽吸、通過(guò)小規(guī)格的針頭等。技術(shù)的例子詳細(xì)描述于Harms等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊776139-6143，1980；Darter等，J.Exp.Med.1571208-1228，1993；和Balch等，細(xì)胞39405-416，1984。
傳統(tǒng)上，亞細(xì)胞組分的分離采用密度梯度來(lái)完成。盡管蔗糖梯度是最為廣泛使用的，但還可以獲得許多其它的替代方法(例如Ficoll、Percoll、三碘苯甲酰氨基葡萄糖和Nycodenz)(見酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)，第31卷，A部分(Flescher和Packer編)，1974)。此外，還開發(fā)了許多用于分離各種成分的其它方法，包括密度改變、自由流動(dòng)電泳和免疫分離(見膜運(yùn)輸?shù)臒o(wú)細(xì)胞分析(Cell free Analysis ofMembrane Traffic)，第35-127頁(yè)，(Morre等編)(1988))。而且，可以獲得各種詳細(xì)描述多種分級(jí)分離技術(shù)的參考文獻(xiàn)，例如參見酶學(xué)方法，第31卷，A部分(Flescher和Packer編)，1974；細(xì)胞顆粒和大分子的區(qū)分生物分子、細(xì)胞器、膜和細(xì)胞的分離和純化(Partition of CellParticles and MacromolecularSeparation and Purification ofBiomolecules，Cell Organelles，Membrances，and Cells)(Albertsson編)，1986；Martin等，Eur.J.Clin.Inv.1349-56，1983。
一個(gè)細(xì)胞分級(jí)分離方法的例子包括將細(xì)胞懸浮在其中含有各種蛋白酶抑制劑(例如PMSF、亮抑酶肽、抑胃酶肽、抑酶肽、EDTA等)的低滲緩沖液中。將樣品于冰上孵育，然后采用Dounce勻漿器勻漿。勻漿后，勻漿物于500×g離心，分離細(xì)胞核。之后可以洗滌并重懸該細(xì)胞核沉淀。而上清液然后于14,000×g離心30分鐘，沉淀重膜。之后該14,000×g離心后的上清液可以在100,000g離心30分鐘，產(chǎn)生上清液(細(xì)胞質(zhì)組分)和沉淀(輕膜組分)。然后可以在適當(dāng)?shù)木彌_液中洗滌并重懸這些沉淀組分用于分析。B.篩選來(lái)自膜組分的caspase活性形成的抑制劑和增強(qiáng)劑1.膜來(lái)源caspase活性的抑制劑和增強(qiáng)劑可以從多種來(lái)源分離或獲得候選抑制劑和增強(qiáng)劑，這些來(lái)源例如細(xì)菌、真菌、植物、寄生物、化學(xué)制品庫(kù)、肽或肽衍生物等。也可以根據(jù)X射線晶體學(xué)測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，合理地設(shè)計(jì)抑制劑和增強(qiáng)劑(見，Mittl等，生物化學(xué)雜志2726539-6547，1997)。在某些實(shí)施方案中，該抑制劑靶向特定的caspase(例如膜相關(guān)caspase)。在其它實(shí)施方案中，該候選抑制劑或增強(qiáng)劑間接地影響膜來(lái)源caspase活性的釋放和/或形成。
該抑制劑并不拘泥于特定機(jī)制，它可以通過(guò)阻止caspase的加工、抑制caspase的酶活性、其它機(jī)制、或通過(guò)阻止caspase從膜的釋放來(lái)起作用。因此，該抑制劑可以直接地或間接地發(fā)揮作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑干擾caspase蛋白質(zhì)的加工。在其它實(shí)施方案中，該抑制劑是小分子。在又一實(shí)施方案中，抑制劑與Bcl-2相互作用。在其它方面，該抑制劑阻止細(xì)胞凋亡。抑制劑應(yīng)具有最小的副作用并且優(yōu)選無(wú)毒性。優(yōu)選能夠透過(guò)細(xì)胞的抑制劑。
此外，在某些情況中可能期望caspase活性或表達(dá)的增強(qiáng)劑。有時(shí)，增加細(xì)胞凋亡將具有治療效果。例如，腫瘤或介導(dǎo)自身免疫病的細(xì)胞是進(jìn)行破壞的適合細(xì)胞。增強(qiáng)劑可以增加caspase加工的速度或效率、增加轉(zhuǎn)錄或翻譯、增加caspase從膜的釋放/形成、或通過(guò)其它機(jī)制起作用。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的，以上給出的許多原則同樣適用于增強(qiáng)劑的設(shè)計(jì)。
2.篩選分析形式用于抑制劑和增強(qiáng)劑的篩選分析將根據(jù)抑制劑或增強(qiáng)劑的類型和所影響的活性的性質(zhì)而改變。一般地，在本發(fā)明中，分析方法被設(shè)計(jì)成評(píng)價(jià)caspase蛋白的加工，或作為從膜組分形成/來(lái)源的caspase活性結(jié)果的caspase酶活性。在所有這些分析中，與恰當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加或降低意味著增強(qiáng)或抑制。而且，應(yīng)當(dāng)理解，膜來(lái)源的caspase活性可以通過(guò)直接或間接的方式來(lái)檢測(cè)。例如，一種直接方式是檢測(cè)膜caspase底物的轉(zhuǎn)化，而一種間接方式是檢測(cè)由膜來(lái)源caspase激活的caspase的加工或直接活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該分析利用來(lái)自真核細(xì)胞的膜制品。在這點(diǎn)上，根據(jù)分析的目的可以采用任何細(xì)胞類型。在某些實(shí)施方案中，該膜組分含有重膜和/或核膜。一方面，在存在或不存在候選抑制劑或增強(qiáng)劑的情況下接觸或接觸并孵育該膜組分，然后測(cè)量底物的轉(zhuǎn)化或caspasse的加工?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法來(lái)評(píng)價(jià)底物的轉(zhuǎn)化或caspasse的加工(caspase裂解為大、小亞基)，這些方法包括例如熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法(例如UV和可見光譜學(xué))、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、免疫印跡/免疫親和、層析、N端肽測(cè)序等。而且，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道，根據(jù)待研究的動(dòng)力學(xué)，孵育可以在各種溫度下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，該孵育溫度是從20℃至40℃。在其它實(shí)施方案中，該孵育溫度是從25℃至37℃。
一種體外分析可以通過(guò)檢測(cè)候選化合物對(duì)caspase(例如procaspase或caspase的其它蛋白質(zhì)底物)加工成兩個(gè)亞基的影響來(lái)進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是利用含有膜來(lái)源caspase-3的酶識(shí)別位點(diǎn)的底物(例如肽、蛋白質(zhì)、或肽模擬物(peptide mimetic))(如DEVD)，例如當(dāng)該底物是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，體外翻譯或從細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)純化該底物。在存在或不存在候選抑制劑或增強(qiáng)劑的情況下，將此初級(jí)產(chǎn)物與膜組分接觸或接觸并孵育，然后對(duì)所述兩個(gè)亞基的出現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了利于檢測(cè)，典型地，在翻譯過(guò)程中，或在表達(dá)之前通過(guò)基因融合標(biāo)記該蛋白質(zhì)或肽。如果進(jìn)行放射性標(biāo)記，則可以在凝膠電泳后通過(guò)放射自顯影容易地檢測(cè)到這兩個(gè)亞基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道，也可以采用其它的標(biāo)記和檢測(cè)方法。
另一種體外分析被設(shè)計(jì)來(lái)測(cè)量caspase底物類似物(例如乙酰-DEVD-氨基甲基香豆素(amc)、核纖層蛋白、多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)等，多種這些物質(zhì)可以從商業(yè)途徑獲得)的切割。底物的轉(zhuǎn)化(即底物的水解)可以采用時(shí)程(time course)(即進(jìn)度曲線)分析(例如通過(guò)穩(wěn)態(tài)速率比較進(jìn)行的活性形成和底物水解速率分析)或終點(diǎn)分析(例如最終熒光減去初始熒光)的比較來(lái)確定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在該方法中將該膜組分與候選抑制劑或增強(qiáng)劑以及caspase底物一起孵育。通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任一種檢測(cè)裂解的底物。一般地，對(duì)該底物進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段進(jìn)行示蹤。
在本發(fā)明中所用的典型底物包括其轉(zhuǎn)化直接或間接地測(cè)量了細(xì)胞凋亡途徑，具體是一種或多種caspase分子酶活性的那些藥劑。在這點(diǎn)上，各種底物例如標(biāo)記的caspase分子、核纖層蛋白、PARR和caspase底物類似物是本領(lǐng)域已知的。這些底物還可以從商業(yè)途徑例如OncogeneResearch Products，Cambridge，MA等公司獲得。用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的底物類似物的例子包括ZEVD-amc(芐氧羰基-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)、YVAD-amc(乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp-氨基甲基香豆素)、和DEVD-amc(乙?；?Asp-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)。
而且，可以采用任何已知的酶分析來(lái)確定候選化合物對(duì)膜來(lái)源caspase活性的抑制或增強(qiáng)能力。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了，可以將該候選抑制劑或增強(qiáng)劑在分級(jí)分離之前與細(xì)胞一起孵育，或在分級(jí)分離之后但在檢測(cè)之前與膜組分一起孵育。而且，該候選抑制劑或增強(qiáng)劑可以與膜組分并同時(shí)與caspase底物接觸，或接觸并一起孵育。
可以采用本文中簡(jiǎn)要描述的這些分析鑒定特異影響膜來(lái)源caspase活性的增強(qiáng)劑或抑制劑。有多種可以用來(lái)研究候選化合物作用的方法。這些方法是通常用于分析酶反應(yīng)的那些方法，包括例如SDS-PAGE、分光術(shù)、HPLC分析、放射自顯影、化學(xué)發(fā)光、生色反應(yīng)和免疫化學(xué)(例如印跡、沉淀等)。
而且，在其它分析實(shí)施方案中，可以在用于將誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)的促或抗細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)遞送至膜制品的來(lái)源細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)內(nèi)使用真核啟動(dòng)子。例如，可以轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使它們超量表達(dá)抗細(xì)胞凋亡多肽Bcl-2，籍此提供其膜制品含有更高水平Bcl-2的細(xì)胞，以便僅檢測(cè)能夠克服Bcl-2抑制的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)劑。在這同一點(diǎn)上，可以用細(xì)胞凋亡刺激物處理這些細(xì)胞，以便該細(xì)胞在亞分級(jí)分離之前為細(xì)胞凋亡“做好準(zhǔn)備”。在該方法中，用細(xì)胞凋亡途徑增強(qiáng)劑處理該膜組分，導(dǎo)致比增強(qiáng)劑對(duì)非做好準(zhǔn)備的細(xì)胞的相應(yīng)作用明顯高得多的激活速率。
在其它實(shí)施方案中，在分級(jí)分離之前通過(guò)細(xì)胞凋亡刺激物的遞送而為細(xì)胞死亡“做好準(zhǔn)備”的細(xì)胞，可以通過(guò)處理不超量表達(dá)抗細(xì)胞凋亡多肽的細(xì)胞來(lái)建立，但在細(xì)胞凋亡之前對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離?？梢詫⑦@些細(xì)胞進(jìn)行亞分級(jí)分離，然后利用由此獲得的膜進(jìn)行候選抑制劑和增強(qiáng)劑的分析。
以上描述的用于鑒定細(xì)胞凋亡抑制劑和增強(qiáng)劑的方法提供了另一種用于測(cè)量細(xì)胞凋亡活性的形式，其中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以便細(xì)胞為細(xì)胞程序性死亡“做好準(zhǔn)備”。以此方式，該細(xì)胞合成和/或激活細(xì)胞程序性死亡所需要的所有必要成分。所需要的僅是使細(xì)胞越過(guò)其控制點(diǎn)(holdingpoint)進(jìn)入細(xì)胞凋亡的刺激。因此，在有細(xì)胞凋亡刺激時(shí)，增強(qiáng)劑將使得該細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞程序性死亡，而抑制劑將延緩或抑制該過(guò)程。
阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞程序性死亡的控制點(diǎn)可以是細(xì)胞存活多肽(survival polypeptide)的過(guò)量表達(dá)或用已知細(xì)胞凋亡抑制劑對(duì)細(xì)胞的處理。細(xì)胞存活多肽的特征在于，當(dāng)在被誘導(dǎo)而將經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中表達(dá)或激活時(shí)，它們表現(xiàn)出能夠阻止細(xì)胞凋亡。例如，當(dāng)不存在有功能的細(xì)胞存活多肽時(shí)，用細(xì)胞凋亡增強(qiáng)劑(例如促細(xì)胞凋亡劑)處理細(xì)胞將引起或加速細(xì)胞凋亡。然而，當(dāng)存在細(xì)胞存活多肽時(shí)，用促細(xì)胞凋亡劑/增強(qiáng)劑進(jìn)行處理能夠起始細(xì)胞程序性死亡途徑，但由于該途徑中的一或多個(gè)事件受到抑制，細(xì)胞仍可存活。根據(jù)細(xì)胞存活多肽發(fā)揮作用的點(diǎn)，可以在導(dǎo)致最終細(xì)胞死亡的級(jí)聯(lián)事件的執(zhí)行中或早或相對(duì)晚地抑制該細(xì)胞程序性死亡途徑。細(xì)胞存活多肽和它們的編碼核苷酸是本領(lǐng)域所熟知的，包括例如Bcl-2家族的相關(guān)蛋白質(zhì)Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、E1B-19K，以及caspase活性的抑制劑如p35、crmA和caspase的顯性失活形式。這些形式包括例如在半胱氨酸活性位點(diǎn)帶有失活突變的caspase。
細(xì)胞存活多肽的過(guò)量表達(dá)可以采用例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施該重組表達(dá)方法的常規(guī)程序描述于例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，紐約(1992)，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，紐約(1995)。采用這些方法能夠以足以阻止細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的水平穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞存活多肽。編碼細(xì)胞存活多肽的核酸分子可以由例如來(lái)自相同物種或細(xì)胞類型的同源核苷酸編碼，或者是，該核酸分子可以由來(lái)自不同物種或細(xì)胞類型的異源核酸編碼。該編碼核酸的來(lái)源并不重要，只要所編碼的細(xì)胞存活多肽表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡抑制活性即可。
足以阻止細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞存活多肽表達(dá)水平是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)方法測(cè)定。用于重組多肽表達(dá)的表達(dá)載體和系統(tǒng)是已知的，而且可以從商業(yè)途徑獲得。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，選擇可以在特定宿主細(xì)胞中提供充足表達(dá)水平的載體或系統(tǒng)是一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)?；蛘?，可以通過(guò)表達(dá)該細(xì)胞存活多肽，然后在用促細(xì)胞凋亡劑處理后測(cè)量該細(xì)胞是否存活，常規(guī)地確定足以阻止細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的表達(dá)水平。
除了過(guò)量表達(dá)細(xì)胞存活多肽的重組方法之外，還可以采用天然過(guò)量表達(dá)細(xì)胞存活多肽的細(xì)胞。天然過(guò)量表達(dá)細(xì)胞存活多肽的細(xì)胞的具體例子是Bcl-2最先在其中獲得鑒定的B細(xì)胞淋巴瘤。該白血病具有14號(hào)染色體向18號(hào)染色體的易位，結(jié)果導(dǎo)致Bcl-2的高水平表達(dá)并由此導(dǎo)致細(xì)胞的存活。該白血病表型是細(xì)胞存活增強(qiáng)所導(dǎo)致的。天然過(guò)量表達(dá)細(xì)胞存活多肽的其它細(xì)胞系同樣可以用于本發(fā)明的這些方法中。
由于細(xì)胞存活多肽的過(guò)量表達(dá)所造成的細(xì)胞凋亡阻斷，以及促細(xì)胞凋亡試劑對(duì)這些細(xì)胞的處理，對(duì)這些細(xì)胞產(chǎn)生了對(duì)抗的影響。以此方式，基本上該細(xì)胞為細(xì)胞程序性死亡做好準(zhǔn)備。促細(xì)胞凋亡劑可以是對(duì)細(xì)胞的各種不同損傷，包括分子的、環(huán)境的和物理的刺激。正如之前定義的，這些刺激是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以用激活細(xì)胞凋亡途徑中的分子來(lái)表征。促細(xì)胞凋亡劑的例子包括誘導(dǎo)劑如生長(zhǎng)因子剝奪、Fas配體、抗Fas抗體、星形孢菌素、腫瘤壞死因子、紫外和γ輻射等。因此，用促細(xì)胞凋亡劑處理過(guò)量表達(dá)細(xì)胞存活多肽的細(xì)胞將使細(xì)胞為凋亡做好準(zhǔn)備，因?yàn)檎⒇?fù)信號(hào)提供了平衡作用。該準(zhǔn)備的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，一旦接收到克服該細(xì)胞存活多肽/抗細(xì)胞凋亡劑引起的阻斷的信號(hào)，用于細(xì)胞凋亡的所有細(xì)胞死亡成分即可就緒。這就使得可以快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而能夠用于篩選在Bcl-2或Bcl-XL存在時(shí)具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的化合物。這些細(xì)胞對(duì)于分別篩選Bcl-2或Bcl-XL的抑制劑是尤其有用的。
3.高處理量本文描述的方法還適于高處理量操作形式(例如可以對(duì)大量樣品進(jìn)行快速有效篩選的多孔形式分析)。例如，由于可以從商業(yè)途徑獲得適合于操作的96孔板和測(cè)量裝置，96孔格式提供了實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。這些程序可以進(jìn)一步自動(dòng)化，以進(jìn)一步增加該方法的速度和效率。這些性質(zhì)以及該方法的特異性使得可以對(duì)膜來(lái)源caspase活性的候選抑制劑或增強(qiáng)劑進(jìn)行無(wú)細(xì)胞高處理量篩選。例如，可以給大量的膜樣品施用測(cè)試化合物庫(kù)，然后分析它們?cè)鰪?qiáng)或抑制細(xì)胞凋亡的能力。所鑒定的化合物對(duì)于治療和診斷目的是有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兡軌蛟试S對(duì)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病進(jìn)行治療和檢測(cè)。這些化合物在有關(guān)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中也是有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兡軌驇椭茖?dǎo)出進(jìn)一步的分子事件并為其它化合物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供進(jìn)一步的特異性。C.caspase和細(xì)胞凋亡途徑基因正如以上提及的，本發(fā)明提供與caspase和其它細(xì)胞凋亡途徑基因及基因產(chǎn)物有關(guān)的分析方法，以及應(yīng)用這些基因和基因產(chǎn)物的方法。具體地，本發(fā)明提供檢測(cè)膜來(lái)源caspase活性的調(diào)節(jié)的分析方法。考慮到本文所提供的公開，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)，可以從各種細(xì)胞類型分離編碼細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)的基因。
1.細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)編碼基因的分離可以從基因組DNA或優(yōu)選從cDNA分離細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)編碼基因。從基因組DNA或cDNA分離細(xì)胞凋亡途徑基因典型地可以通過(guò)首先產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腄NA文庫(kù)來(lái)進(jìn)行，該適當(dāng)DNA文庫(kù)可以通過(guò)用于構(gòu)建文庫(kù)的本領(lǐng)域已知技術(shù)制備(見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborPress，1989)或從商業(yè)途徑(例如Clontech，Palo Alto，CA)購(gòu)買。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以在噬菌體載體(例如λZAPII)、質(zhì)?；蚱渌m于篩選的載體中構(gòu)建cDNA文庫(kù)，而基因組DNA文庫(kù)可以在染色體載體例如YAC(酵母人工染色體)、噬菌體載體例如λEMBL3、λgt10等、粘粒或質(zhì)粒上構(gòu)建。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以利用已知的細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)基因序列(caspase、Bcl-2、Bcl-XS、Bcl-XL、Bik、Bad、Bax等)，設(shè)計(jì)適用于篩選基因組或cDNA文庫(kù)的寡核苷酸雜交探針。優(yōu)選地，該寡核苷酸探針長(zhǎng)20-30個(gè)堿基。為了利于雜交檢測(cè)，可以方便地用報(bào)道分子例如放射性核素(例如32p)、酶學(xué)標(biāo)記物、蛋白質(zhì)標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物或生物素等，(一般在5’末端)對(duì)該寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。然后取決于所用載體，一般將這些文庫(kù)鋪板形成噬菌體或菌落。隨后，將這些菌落或噬菌體轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍膜上，探測(cè)該膜以鑒定含有細(xì)胞凋亡途徑基因的候選克隆?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法中的任意一種，包括例如DNA序列分析或用第二種非重疊探針進(jìn)行雜交，驗(yàn)證這些候選分子是否含有該目的DNA。
一旦文庫(kù)被鑒定為含有細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)基因，則可以通過(guò)擴(kuò)增分離該基因。簡(jiǎn)單地說(shuō)，以caspase基因作為說(shuō)明，當(dāng)采用cDNA文庫(kù)的DNA作為模板時(shí)，基于已知的caspase基因序列(見GenBank索取號(hào)X65019(caspase-1)、U13021(caspase-2)、U13737(caspase-3)、U25804(caspase-4)、U28015(caspase-5)、U20536(caspase-6)、U37448(caspase-7)、U60520(caspase-8)、U56390(caspase-9)、U60519(caspase-10)、和本領(lǐng)域可以獲得的序列)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。優(yōu)選擴(kuò)增從具有高caspase活性的細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)。為了分離全長(zhǎng)cDNA，用于擴(kuò)增的引物優(yōu)選來(lái)源于5’和3’非翻譯區(qū)中的序列。這些引物優(yōu)選具有大約50％的GC含量，并含有限制性位點(diǎn)以便于進(jìn)行克隆，而且不僅沒(méi)有自我互補(bǔ)序列，在它們的3’末端也不含有互補(bǔ)序列(以防止引物二聚體的形成)。使這些引物與cDNA或基因組DNA退火，然后進(jìn)行足夠的擴(kuò)增循環(huán)以產(chǎn)生易于通過(guò)電泳和染色觀察的產(chǎn)量。純化該擴(kuò)增片段并將其插入載體例如λgt10或pBS(M13+)中，并增殖。通過(guò)DNA序列分析，或間接地通過(guò)所編碼多肽的氨基酸序列測(cè)定，驗(yàn)證該片段的性質(zhì)。
還可以采用其它方法來(lái)獲得編碼細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)的核酸分子。例如，可以用與caspase反應(yīng)的一種抗體或多種抗體進(jìn)行篩選從表達(dá)文庫(kù)中獲得編碼caspase的核酸分子(見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1987；Ausubel等，當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，Greene Publishing Associates andWiley-Interscience，NY，1995)。
可以從天然變體(例如多態(tài)性、剪接變體、突變體)改造、合成或構(gòu)建細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)基因的變體。已經(jīng)開發(fā)了許多用于制備突變體的方法(一般參見，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；和以上的討論)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用于制備幾個(gè)核苷酸替代的優(yōu)選方法利用了橫跨待突變的單個(gè)或多個(gè)堿基并含有該突變的單個(gè)或多個(gè)堿基的寡核苷酸。該寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈核酸雜交，并從該寡核苷酸引發(fā)第二鏈的合成。制備雙鏈核酸，用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，典型的是例如大腸桿菌，但也可以是其它原核生物、酵母或其它真核生物。采用標(biāo)準(zhǔn)的篩選和載體生長(zhǎng)操作步驟鑒定突變序列并獲得高的產(chǎn)量。
同樣地，可以通過(guò)以上討論的各種已知方法中的任意一種構(gòu)建基因的缺失和/或插入。例如，可以用限制性酶消化該基因，然后重新連接以便造成序列缺失，或使序列與額外的序列重新連接在一起從而產(chǎn)生插入或大的替換?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的其它方法制備變體序列，例如那些描述于Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)中的方法。變體序列的驗(yàn)證典型地是通過(guò)限制性酶作圖、序列分析或探針雜交來(lái)進(jìn)行的。D.表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)的載體、宿主細(xì)胞和方法可以在多種宿主生物中表達(dá)細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)在細(xì)菌例如大腸桿菌，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO和COS-7)中制備，對(duì)于這些宿主細(xì)胞已經(jīng)開發(fā)并且可以獲得許多表達(dá)載體。其它適合的宿主生物包括其它細(xì)菌種類，和酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))等真核生物，以及昆蟲細(xì)胞(例如Sf9)。
將編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列引入適于該宿主的表達(dá)載體中。在某些實(shí)施方案中，可以將該蛋白質(zhì)插入載體中，以便產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。正如以上所討論的，對(duì)于有多種密碼子的每種氨基酸，該序列可以含有另外的可替代密碼子?？梢赃x擇對(duì)于宿主物種而言“最佳”的可替代密碼子。典型地將限制性位點(diǎn)摻入引物序列中，而且對(duì)限制性位點(diǎn)的選擇取決于該載體的克隆位點(diǎn)。如果必需的話，可以將翻譯起始和終止密碼子加入該引物序列中。
該載體最少必須含有啟動(dòng)子序列。本文所用“啟動(dòng)子”是指含有指導(dǎo)所連基因轉(zhuǎn)錄的元件并含有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的核酸序列。更典型的是，在真核細(xì)胞中，啟動(dòng)子序列含有控制基因表達(dá)速度和時(shí)間選擇的其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。這些位點(diǎn)包括TATA盒、CAAT盒、POU盒、AP1結(jié)合位點(diǎn)等。啟動(dòng)子區(qū)域還可以含有增強(qiáng)子元件。當(dāng)啟動(dòng)子與基因相連以致能夠使基因獲得轉(zhuǎn)錄時(shí)，即是被“可操作地連接”。
可以包括其它調(diào)節(jié)序列。這些序列包括轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列，分泌信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記等?？梢詫⑦@些調(diào)節(jié)序列操作性地彼此連接在一起以允許轉(zhuǎn)錄或翻譯。
本文所用表達(dá)載體包括設(shè)計(jì)用于在宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌)中表達(dá)所述蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。適合的啟動(dòng)子可以從多種途徑獲得，而且是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。用于細(xì)菌中表達(dá)的該啟動(dòng)子包括來(lái)自T7噬菌體和其它噬菌體例如T3、T5和SP6以及trp、lpp和lac操縱子的啟動(dòng)子。還可以使用雜合啟動(dòng)子(見美國(guó)專利4,551,433)，例如lacVV、tac和trc。用于真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子包括桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的P10或多角體基因啟動(dòng)子(見例如美國(guó)專利5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784)、MMTV LTR、CMV IE啟動(dòng)子、RSVLTR、SV40、金屬硫蛋白啟動(dòng)子(見例如美國(guó)專利4,870,009)等。
控制該細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子本身可以受到阻抑物的控制。在一些系統(tǒng)中，可以通過(guò)改變細(xì)胞的生理狀況，例如通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)與該阻抑物結(jié)合的分子，或通過(guò)改變生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溫度，使該啟動(dòng)子去阻抑。優(yōu)選的阻抑蛋白包括但不限于響應(yīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌lacI阻抑物、溫度敏感性λc1857阻抑物等。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，該載體還包括轉(zhuǎn)錄終止序列?！稗D(zhuǎn)錄終止區(qū)”含有提供信號(hào)使識(shí)別所選啟動(dòng)子的聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的序列和/或聚腺苷酸化信號(hào)序列。
優(yōu)選地，該載體能夠在該宿主細(xì)胞中復(fù)制。因此，當(dāng)該宿主細(xì)胞是細(xì)菌時(shí)，該載體優(yōu)選含有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)包括p15A、pSC101和col E1復(fù)制起點(diǎn)，特別是來(lái)源于pUC質(zhì)粒的ori。在酵母中，可以采用ARS或CEN序列以保證復(fù)制。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常用的系統(tǒng)是SV40 ori。
該質(zhì)粒還優(yōu)選包括至少一個(gè)在宿主中有功能的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記基因包括賦予宿主表型以允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞能得以鑒定并選擇性生長(zhǎng)的任何基因。對(duì)于細(xì)菌宿主適合的選擇標(biāo)記基因包括氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。目前優(yōu)選卡那霉素抗性基因。對(duì)于真核生物適合的標(biāo)記物通過(guò)要求在宿主中有互補(bǔ)缺陷(例如tk-宿主中的胸苷激酶(tk))。然而，也可以獲得藥物標(biāo)記(例如G418抗性和潮霉素抗性)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)存在大量的適合載體，而且這些載體可以容易地獲得。載體例如pET系列(Novagen，Madison，WI)、tac和trc系列(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、pTTQ18(AmershamInternational plc，英國(guó))、pACYC 177、pGEX系列等均適合于該蛋白質(zhì)的表達(dá)。桿狀病毒載體例如pBlueBac(見例如美國(guó)專利5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784；可從Invitrogen，San Diego獲得)可以用于昆蟲細(xì)胞例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9細(xì)胞(見美國(guó)專利4,745,051)中的表達(dá)。用于細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)菌宿主的選擇部分地取決于該載體。可從商業(yè)途徑獲得的載體是與適合宿主配對(duì)的。
對(duì)于真核細(xì)胞中的表達(dá)可以獲得大量的適合載體。這些載體包括pCMVLacI、pXT1(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；pCDNA系列、pREP系列、pEBVHis(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在某些實(shí)施方案中，目的基因被克隆在基因?qū)蜉d體中，例如pMClneo、pOG系列載體(Stratagene Cloning Systems)。
細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)分離，例如親和層析、大小排阻層析、金屬離子層析、離子交換層析、HPLC和其它已知的蛋白質(zhì)分離方法(一般參見Ausubel等，同上；Sambrook等，同上)。當(dāng)用考馬斯亮蘭染色時(shí)，分離的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上給出單一的條帶。
細(xì)胞凋亡途徑蛋白質(zhì)可以表達(dá)成六-his(His)6融合蛋白，并通過(guò)含有金屬的層析，例如鎳偶連珠，來(lái)分離。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將編碼His6的序列與編碼期望蛋白質(zhì)的DNA序列連接在一起。盡管該His6序列可以位于該分子中的任何位置上，但優(yōu)選將其連接在緊接終止密碼子之后的3’末端。該融合物可以通過(guò)多種方法中的任意一種構(gòu)建。E.抑制劑或增強(qiáng)劑的用途在本發(fā)明中，抑制劑或增強(qiáng)劑可以用于控制細(xì)胞的死亡過(guò)程或細(xì)胞因子(例如由caspase-1激活的IL-1)的激活。因此，這些抑制劑和增強(qiáng)劑可以應(yīng)用于以細(xì)胞凋亡水平過(guò)度或不足為特征的疾病中。蛋白酶的抑制劑具有治療主要神經(jīng)變性疾病中風(fēng)、帕金森疾病、阿爾茨海默氏病和ALS的潛能。同樣，caspase蛋白酶抑制劑可以用于抑制心肌梗死后心臟中的細(xì)胞凋亡、急性缺血后腎臟中的細(xì)胞凋亡、和肝臟疾病中的細(xì)胞凋亡。caspase活性的增強(qiáng)劑可以用于期望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞因子激活的情況中。例如，可以通過(guò)遞送caspase增強(qiáng)劑誘導(dǎo)或增強(qiáng)癌細(xì)胞或異常增殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。
該抑制劑和增強(qiáng)劑還可以偶聯(lián)與細(xì)胞特異的細(xì)胞表面受體結(jié)合的導(dǎo)向部分。抑制劑或增強(qiáng)劑的施用一般將遵循已確立的操作程序。通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的化合物可以單獨(dú)或作為藥物組合物施用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明的藥物組合物可以含有本文所描述的一種或多種抑制劑或增強(qiáng)劑，以及一種或多種可藥用或生理上可接收的載體、稀釋劑或賦形劑。這些組合物可以含有緩沖液例如中性緩沖鹽水、磷酸緩沖鹽溶液等，糖例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖，甘露糖醇，蛋白質(zhì)，多肽或氨基酸例如甘氨酸，抗氧化物，鏊合劑例如EDTA或谷胱甘肽，佐劑(例如氫氧化鋁)和防腐劑。此外，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有一種或多種其它的活性成分。
可以將通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的組合物配制用于指示的施用方式，這些施用方式包括例如口服、鼻腔、靜脈、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)施用。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本文所述的組合物可以作為持續(xù)釋放植入物的部分來(lái)施用。在其它實(shí)施方案中，可以利用能提供凍干物穩(wěn)定性的適合賦形劑，將本發(fā)明組合物制成凍干物，之后重新水化。
正如以上提及的，本發(fā)明還提供藥物組合物。這些組合物可以含有任何上述抑制劑、增強(qiáng)劑、DNA分子、載體或宿主細(xì)胞，以及可藥用或生理上可接收的載體、賦形劑或稀釋劑。一般地，這些載體在施用的劑量和濃度下對(duì)于接受體應(yīng)是無(wú)毒性的。通常，這些組合物的制劑需要該治療劑與如下物質(zhì)組合，這些物質(zhì)是緩沖液、抗氧化劑(例如抗壞血酸)、低分子量(少于大約10個(gè)殘基的)多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、鏊合劑例如EDTA、谷胱苷肽、和其它穩(wěn)定劑和賦形劑。適合稀釋劑的例子是中性緩沖鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水。
此外，還可以配制本發(fā)明藥物組合物用于各種不同途徑施用，包括例如關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、肝內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下施用或甚至直接施用于腫瘤中。此外，可以將本發(fā)明藥物組合物連同提供該藥物組合物使用有關(guān)說(shuō)明的包裝材料一起放置在容器中。一般地，這些說(shuō)明包括對(duì)該試劑濃度的確實(shí)表述，以及在某些實(shí)施方案中還包括對(duì)于重新組成該藥物組合物可能必須的賦形劑成分或稀釋劑(例如水、鹽水或PBS)的相對(duì)量的確實(shí)表述。藥物組合物對(duì)于診斷或治療目的是有用的。
本發(fā)明的藥物組合物可以以適合于待治療(或預(yù)防)疾病的方式來(lái)施用。施用的量和頻率將取決于患者的情況、及患者疾病的類型和嚴(yán)重性等因素?？梢栽谂R床試驗(yàn)中對(duì)劑量最為精確地確定?？梢酝ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，包括臨床惡化跡象、圖象等，監(jiān)視患者的治療效果。
提供以下實(shí)施例用于說(shuō)明，而不是進(jìn)行限制。
實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)在這些研究中采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了含有Bcl-2 cDNA(697-Bcl-2細(xì)胞)或?qū)φ招旅顾乜剐曰?697-neo細(xì)胞)(Miyashita和Reed，1993)(獲自Dr.John Reed，Burnham Institute)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)結(jié)構(gòu)的697人類類淋巴母細(xì)胞。這些細(xì)胞在補(bǔ)加有10％胎牛血清((FBS)Hyclone，Logan，UT)、0.2mg/ml G-418(Gibco，Gaithersburg，MD)和0.1mg/ml青霉素/鏈霉素(Irvine Scientific，Santa Aha，Ca)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Irvine Scientific)中維持對(duì)數(shù)中期生長(zhǎng)。將鼠多巴胺能MN9D細(xì)胞(獲自芝加哥大學(xué)A.Heller博士)培養(yǎng)在補(bǔ)加了10％FBS、2mM谷氨酰胺和0.1mg/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Irvine Scientific)中。在含有15mM HEPES的Hank氏緩沖鹽溶液(Irvine Scientific)中，制備妊娠E15的小鼠大腦皮層細(xì)胞。用0.1％胰蛋白酶簡(jiǎn)單離解該組織，然后用補(bǔ)加了10％FBS和0.4mg/ml DNase I(Sigma，St.Louis，MO)的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行徹底洗滌，溫和地將其磨碎之后使其快速冷凍。
實(shí)施例2亞細(xì)胞分級(jí)分離將含有≈109個(gè)細(xì)胞的冷凍細(xì)胞團(tuán)融化，然后重懸在補(bǔ)加有1mM PMSF、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A、5μg/ml抑酶肽、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA和5mM DTT(Sigma)的冷低滲緩沖液(10mM Na-HEPES、5mMMgCl2、42mM KCl，pH 7.4)中，密度為≈1.5×108個(gè)細(xì)胞/ml。該樣品在冰上孵育30分鐘，在此期間用Dounce勻漿器以30-40次沖擊裂解細(xì)胞。4℃500×g 10分鐘離心該樣品兩次，分離細(xì)胞核。然后在補(bǔ)加了1.6M蔗糖的相同緩沖液中洗滌該細(xì)胞核沉淀兩次，產(chǎn)生細(xì)胞核組分。然后將以上離心步驟的上清液于14,000×g、4℃離心30分鐘，以沉淀重膜。用1.5ml含有蛋白酶抑制劑和DTT的冷低滲緩沖液洗滌該重膜3次。將洗滌過(guò)的膜重懸在低滲緩沖液中，使總蛋白質(zhì)濃度為大約2mg/ml，從而產(chǎn)生重膜組分，將該組分快速冷凍或不經(jīng)冷凍立即用于酶學(xué)測(cè)試。將該14,000×g離心的上清液在100,000×g、4℃離心30分鐘，產(chǎn)生上清液(細(xì)胞質(zhì)組分)和沉淀(輕膜組分)。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)量采用了BioRad的蛋白質(zhì)分析試劑盒II，其中牛血清白蛋白作為校對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品。在一些實(shí)驗(yàn)中，按上述裂解細(xì)胞沉淀，但沒(méi)有冷凍步驟。為了測(cè)試細(xì)胞色素c對(duì)caspase活性的影響，在整個(gè)分離程序中用10μg/ml牛細(xì)胞色素c(Sigma Chemical，St.Louis，Mo)處理一些樣品。在一些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Mancini和其同事的大鼠肝線粒體方法(Mancini等，1998)從697-neo和697-Bcl-2細(xì)胞制備線粒體組分。
實(shí)施例3免疫印跡通過(guò)SDS-PAGE在12％或16％凝膠(Novex，La Jolla，CA)上分離亞細(xì)胞組分(每個(gè)泳道50μg蛋白質(zhì))，然后將其轉(zhuǎn)移至Immobilon PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。在PBS/0.1％Tween 20(PBST)+0.4％酪蛋白(I-block，Tropix，Bedford，MA)中對(duì)膜進(jìn)行封閉。在用PBST/酪蛋白稀釋的1μg/ml一抗中孵育印跡1小時(shí)。在PBST中洗滌3次之后，在用PBST/酪蛋白1∶15,000稀釋的結(jié)合堿性磷酸酶的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(Tropix)中，孵育印跡1小時(shí)。然后用PBST洗滌印跡兩次，在測(cè)試緩沖液(10mM二乙醇胺，pH10.0，1mM MgCl2)中再洗滌兩次，然后在測(cè)試緩沖液中與250μM化學(xué)發(fā)光底物CSPD(Tropix)一起孵育，并對(duì)Biomax膠片(Kodak，Rochester，NY)過(guò)夜曝光。
在一些情況中，二抗孵育后，用10mM Tris，pH9.5、1mM MgCl2洗滌印跡。然后在溶解于Tris緩沖液的1.25μg/ml DDAO磷酸鹽(Amersham，Arlington Heights，IL)中孵育該印跡30分鐘。采用STORM熒光成像儀(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)掃描這些印跡。所用抗體為抗Bcl-2(Transduction Labs，Lexington，KY)、caspase-3(Srinivasan等，1998)、細(xì)胞色素c(Pharmingen，San Diego，CA)、細(xì)胞色素氧化酶、亞基IV(Molecular Probes，Portland，OR)、D4-GDP解離抑制劑(D4-GDI)(由G.Bokoch博士(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)贈(zèng)送)和多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(Enzyme Systems，Livermore，CA)的抗體。
實(shí)施例4活性分析通過(guò)在重復(fù)的Cytoplate孔中將50μl含有酶的組分和200μl ICE緩沖液(20mM HEPES、1mM EDTA、0.1％CHAPS、10％蔗糖、5mM DTT，pH7.5)中的25μM DEVD-amc(Asp-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)底物混合，測(cè)量caspase活性。采用CytoFluor 4000板讀數(shù)器(Perseptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA)，通過(guò)30℃1-2個(gè)小時(shí)內(nèi)熒光的增加(ex＝360nm，em＝460nm)檢測(cè)產(chǎn)物的形成。對(duì)于動(dòng)力學(xué)研究，在1-100μM的范圍內(nèi)改變底物濃度。對(duì)于抑制研究，在加入50μl 50μM的底物溶液之前，用150μl抑制劑室溫預(yù)先處理該酶30分鐘。抑制劑的IC50值采用以下公式確定△FL/△t＝(△FL/△t)0/(1+[I]/IC50)△FL/△t是抑制劑濃度為[I]時(shí)觀察到的初始熒光改變速度，(△FL/△t)0是未受抑制的酶的初始熒光改變速度。
實(shí)施例5激活分析在有或沒(méi)有1％NP-40的含有5mM DTT的低滲緩沖液或0.25M蔗糖、10mM MOPS、2mM EDTA(pH7.4) (Mancini等，1998)中，將重膜樣品稀釋至1mg/ml。通過(guò)加入60-160ng/ml重組鼠caspase-1(細(xì)菌裂解物中)、2μg/ml純化的人粒酶B(Enzyme Systems Products，Livermore，CA)或緩沖液，然后于30℃或37℃孵育該樣品60分鐘，誘導(dǎo)caspase的激活。在激活期之后，通過(guò)14,000×g、4℃離心10分鐘從該樣品中除去該重膜沉淀。用該外源酶的活性修正所獲上清液中的DEVD-amc切割活性。為了檢查膜來(lái)源caspase活性自發(fā)激活的時(shí)程，在96孔Cytofluor板中將含有50-100μg總蛋白的50μl重膜漿液與含有25μM DEVD-amc底物以及6mM DTT的200μl低滲緩沖液混合，然后在一段時(shí)間內(nèi)測(cè)量熒光。在所選擇的時(shí)間點(diǎn)上，從一些孔中取出等分試樣，14,000×g離心10分鐘以去除該重膜，然后將上清液加回該96孔板中以測(cè)量可溶性DEVD-amc裂解活性。在一些實(shí)驗(yàn)中，在測(cè)量caspase活性之前，用1μg/ml牛細(xì)胞色素c(Sigma)和50μM dATP(New England Biolabs，Beverly，MA)(終濃度)處理亞細(xì)胞組分。
實(shí)施例6重組caspase的制備將克隆的人caspase-3 cDNA(Fernandes-Alnemri等，1994)(由Thomas Jefferson大學(xué)的E.Alnemri提供)連接在pET21b(Novagen，Madison，WI)的Bam HI/Xho I位點(diǎn)中構(gòu)建質(zhì)粒，并將含有該質(zhì)粒的BL21(DE3)細(xì)胞于37℃培養(yǎng)在1升含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)物密度達(dá)到A600=1時(shí)，加入IPTG(Sigma)至1mM的濃度，然后25℃孵育該培養(yǎng)物3個(gè)小時(shí)。通過(guò)4℃ 2,000×g離心15分鐘收獲細(xì)胞。在含有0.1mg/ml溶菌酶的100ml結(jié)合緩沖液(20mM TrisCl，500mM NaCl，5mM咪唑，0.1％tritonX-100)中采用一個(gè)凍融周期裂解這些細(xì)胞。通過(guò)4℃ 20,000×g離心30分鐘從樣品中去除細(xì)胞碎片。僅在離心前用MgCl2和DNase I處理這些裂解的細(xì)胞，以降低粘度。上清液通過(guò)一個(gè)0.45μm針頭濾器過(guò)濾，并以1ml/min的流速加載到一個(gè)1ml帶Ni+2的HiTrap鏊合柱(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)上。用10ml結(jié)合緩沖液，之后用含有60mM咪唑的10ml結(jié)合緩沖液以1ml/min的流速洗滌該柱。采用30ml咪唑線性梯度(60-500 mM)從該柱上洗脫該caspase-3蛋白質(zhì)。
采用含有pET3ap30mICEFLAG質(zhì)粒(由H.R.Horvitz和Ding Xue(MIT)博士饋贈(zèng))的BL21(DE3)pLysS細(xì)胞表達(dá)重組鼠caspase-1，其中該質(zhì)粒含有插入pET3a表達(dá)載體(Novagen)的NdeI/BamH I位點(diǎn)中的p30caspase-1 cDNA。在含有0.1mg/ml氨芐青霉素和0.025mg/ml氯霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、6g/l NaCl、3g/l Na2HPO4、1g/l KH2PO4、1mM MgCl2、0.1mM CaCl2，pH7.4)中37℃培養(yǎng)3升培養(yǎng)物。當(dāng)培養(yǎng)物密度達(dá)到A600＝1.0時(shí)，加入IPTG至1mM，并于25℃振搖該培養(yǎng)物3個(gè)小時(shí)。4℃ 2000×g離心15分鐘收集細(xì)胞，然后重懸在含有25mMTrisCl(pH8.0)、25mM KCl、0.1％triton X-100和0.1mg/ml溶菌酶(InovaTech，Abbottsford，B.C.，加拿大)的100ml冷緩沖液中。采用一個(gè)凍融周期裂解細(xì)胞，并通過(guò)用0.02mg/ml DNaseI、0.5mM MgCl2(Sigma)處理樣品60分鐘，然后4℃ 20,000×g離心30分鐘去除細(xì)胞碎片，以澄清裂解物。
實(shí)施例7caspase的體外翻譯采用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)和TNT試劑盒(Promega)，根據(jù)廠家推薦，在存在35S-甲硫氨酸時(shí)通過(guò)體外翻譯獲得35S-標(biāo)記的caspase(野生型)。
實(shí)施例8亞細(xì)胞組分的特性分析從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了表達(dá)Bcl-2cDNA或新霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的697細(xì)胞(分別是697-Bcl-2和697-neo細(xì)胞)(Miyashita和Reed，1993)，制備亞細(xì)胞組分。從這些細(xì)胞分離細(xì)胞核、重膜、輕膜和胞質(zhì)組分，然后采用具有已知獨(dú)特亞細(xì)胞分布的蛋白質(zhì)的特異抗體，按實(shí)施例3所述方法通過(guò)Western印跡分析對(duì)這些膜組分進(jìn)行特性分析。所用抗體是抗線粒體內(nèi)膜所特異的細(xì)胞色素氧化酶(Tzagoloff，1982)、細(xì)胞核所特異的多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(Berger，1985)、細(xì)胞質(zhì)所特異的D4-GDP解離抑制劑(D4-GDI)(Na等，1996)和Bcl-2的抗體。除了細(xì)胞色素氧化酶的免疫印跡通過(guò)化學(xué)熒光觀察外，其余的免疫印跡通過(guò)化學(xué)發(fā)光在膠片上觀察。
正如


圖1所顯示的，幾乎僅在重膜組分中發(fā)現(xiàn)線粒體標(biāo)記物，僅在細(xì)胞核組分中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核標(biāo)記物，而僅在細(xì)胞質(zhì)組分中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物。因此，所用的該分級(jí)分離方法產(chǎn)生了具有期望的標(biāo)記物蛋白質(zhì)亞細(xì)胞分布的組分。重要的是，不能檢測(cè)到細(xì)胞核組分和膜組分中有細(xì)胞質(zhì)污染，而且細(xì)胞核組分中僅檢測(cè)到最小的線粒體污染(
圖1所顯示的細(xì)胞核組分中的彌散D4-GDI反應(yīng)條帶是非特異的)。用抗人Bcl-2的抗體對(duì)來(lái)自697-neo細(xì)胞的組分進(jìn)行Western分析(
圖1)，結(jié)果說(shuō)明在細(xì)胞核和重膜組分中有強(qiáng)反應(yīng)性，在輕膜組分中有較弱的反應(yīng)性，而在細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有可檢測(cè)的信號(hào)，這與前人的結(jié)果(Krajewski等，1993；Yang等，1995；Lithgow等，1994)是相符的。對(duì)來(lái)自697-Bcl-2細(xì)胞的組分進(jìn)行的相似分析表現(xiàn)出顯著的過(guò)表達(dá)。
實(shí)施例9切割活性的亞細(xì)胞分布預(yù)實(shí)驗(yàn)提示caspase活性與來(lái)源于未經(jīng)刺激細(xì)胞的膜有關(guān)。為了確定這些caspase的亞細(xì)胞分布，將來(lái)自697-neo細(xì)胞的亞細(xì)胞組分與DEVD-amc底物一起孵育，然后測(cè)量隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)熒光的增加，對(duì)這些亞細(xì)胞組分中的caspase活性進(jìn)行定量。除了caspase-2外，對(duì)于目前所分析過(guò)的所有caspase而言，DEVD-amc都是一個(gè)有用的底物(Talanian等，1997；以及未顯示的資料)。盡管大多數(shù)DEVD-amc切割活性(約75％)存在于細(xì)胞質(zhì)組分中，但在細(xì)胞核、重膜和輕膜組分中也發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)量的切割活性(圖2A和2C)。對(duì)用neo對(duì)照或Bcl-2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的697細(xì)胞的亞細(xì)胞組分中DEVD-amc切割活性進(jìn)行分級(jí)分離，并分析每種亞細(xì)胞組分的caspase活性。柱狀圖中裂解活性的觀察值是對(duì)于恒定細(xì)胞數(shù)目(圖2A-2B)或mg蛋白質(zhì)(圖2C-2D)的標(biāo)準(zhǔn)化值。A和B中每個(gè)柱所標(biāo)出的值指示了每種組分中存在的總切割活性的百分?jǐn)?shù)。圖2A-2D中的誤差線指示兩個(gè)獨(dú)立679細(xì)胞制品的觀察值范圍。
每種組分中的主要DEVD-amc裂解活性實(shí)際上就是caspase的活性，因?yàn)樘禺惖腸aspase抑制劑可以有效地阻斷該活性(實(shí)施例13表1第1欄，以及未顯示的資料)。
實(shí)施例10Bcl-2對(duì)膜來(lái)源caspase活性的抑制我們接著測(cè)試了多種亞細(xì)胞組分中Bcl-2對(duì)caspase活性的影響。當(dāng)從697-Bcl-2細(xì)胞制備亞細(xì)胞組分，并將其與DEVD-amc底物一起孵育時(shí)，觀察到與697-neo細(xì)胞相比細(xì)胞核和重膜組分中的caspase活性有實(shí)質(zhì)性的降低(圖2B)。當(dāng)在每個(gè)細(xì)胞或每mg蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上測(cè)量該caspase活性時(shí)，該Bcl-2影響是明顯的，并且導(dǎo)致這些組分中caspase活性的80-90％降低(圖2B和2D)。Bcl-2表達(dá)對(duì)這些組分中caspase活性的影響是特異的，因?yàn)?，在所觀察到的細(xì)胞質(zhì)或輕膜組分的caspase活性中，即使有抑制，這種抑制也是極為微弱的(圖2A-2D)。這些觀察提示，在697-neo培養(yǎng)物中該膜相關(guān)caspase活性并不單純來(lái)源于在697-Bcl-2培養(yǎng)物中受到抑制的數(shù)目的少數(shù)比例凋亡細(xì)胞。如果這是事實(shí)的話，那么也應(yīng)期望在來(lái)源于697-neo和697-Bcl-2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)組分之間觀察到capase活性的較大差異。事實(shí)上，對(duì)照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，當(dāng)通過(guò)星形孢菌素處理誘導(dǎo)697-neo細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)caspase活性有大的增加(資料未顯示)。
Bcl-2抑制膜相關(guān)caspase活性的能力并不限制于697類淋巴母細(xì)胞，因?yàn)樵贘urkat T細(xì)胞和FL5.12細(xì)胞中也觀察到類似的影響(資料未顯示)。由于本發(fā)明的數(shù)據(jù)和其它公開的研究均說(shuō)明Bcl-2蛋白質(zhì)主要存在于核被膜和重膜組分中(
圖1；Krajewski等，1993；Yang等，1995)，所以本發(fā)明的結(jié)果與如下可能性相符，即Bcl-2可能局部地起著調(diào)節(jié)該膜來(lái)源caspase活性的作用。在致力于開始分析這些機(jī)制時(shí)，我們進(jìn)一步分析了該Bcl-2可抑制的膜來(lái)源caspase活性，并將我們的工作集中在重膜組分上。
實(shí)施例11膜來(lái)源caspase活性的自發(fā)激活和膜釋放膜相關(guān)caspase活性可能是由于活性膜結(jié)合酶，或者是自發(fā)激活以及可溶性活性酶的釋放造成的。因此，設(shè)計(jì)了一組實(shí)驗(yàn)以區(qū)別這兩種可能性。首先，向從697-neo細(xì)胞新鮮制備的重膜(neo膜)中，室溫下立即加入低滲緩沖液和DEVD-amc底物，然后測(cè)量90分鐘內(nèi)amc熒光的出現(xiàn)(圖3A)。通過(guò)向含有20μM DEVD-amc(終濃度)的低滲緩沖液中加入20μg新鮮制備的膜，測(cè)量該DEVD-amc切割活性。室溫下通過(guò)熒光的改變(ex＝360nm，em＝460nm)測(cè)量amc產(chǎn)物的形成。數(shù)據(jù)顯示，在孵育的頭15分鐘內(nèi)幾乎沒(méi)有可檢測(cè)的熒光改變，但該延滯期后，amc產(chǎn)生的速度顯著地增加(圖3A)。這些結(jié)果說(shuō)明，該新鮮制備的膜不含有活性caspase，但在孵育期間發(fā)生自發(fā)激活。為了評(píng)價(jià)該新激活的caspase是可溶性的還是膜結(jié)合的，在不同長(zhǎng)度的時(shí)間期限(0-90分鐘)內(nèi)孵育膜，之后于10℃14,000×g離心樣品10分鐘，并采用DEVD-amc底物測(cè)定所獲上清液的caspase活性。這些數(shù)據(jù)顯示，最初上清液中幾乎沒(méi)有caspase活性，但之后出現(xiàn)可溶性caspase活性(圖3B)。這些數(shù)據(jù)的定量分析說(shuō)明，對(duì)于每份上清液，熒光呈線性增加，這提示一旦從膜中釋放后就不再發(fā)生激活。而且，這些曲線的斜率(圖3B)接近重膜漿液的進(jìn)度曲線中相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上的瞬時(shí)斜率(圖3A)。因此，在該上清液組分中能夠占有所有的caspase-3活性，這暗示所有的活性酶均已從膜中釋放出來(lái)。與neo膜相反，來(lái)源于697-Bcl-2細(xì)胞的膜(Bcl-2膜)不能產(chǎn)生明顯的DEVD-amc切割活性(圖3A)。
實(shí)施例12存在于重膜中的procaspase-3Bcl-2膜中DEVD-amc切割活性的缺乏可能是由于沒(méi)有可被激活的procaspase或是procaspase的激活受到抑制而引起的。由于所測(cè)量到的DEVD-amc切割活性實(shí)際上是由于caspase-3產(chǎn)生的(見下文)，所以為了區(qū)別這兩者，首先用caspase-3的特異抗體(實(shí)施例3)對(duì)膜和胞質(zhì)組分進(jìn)行Western印跡分析。結(jié)果(圖4)顯示在neo膜和Bcl-2膜中存在強(qiáng)度相似的caspase-3活性條帶，而且該條帶具有近似于該procaspase酶原的期望大小。有趣的是，該膜來(lái)源條帶的電泳遷移率比細(xì)胞質(zhì)procaspase-3的電泳遷移率稍慢。
由于能夠通過(guò)在大小亞基之間天冬氨酸殘基位的蛋白水解切割激活procaspase(Srinivasula等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊9314486-14491，1996；Stennicke和Salvesen，生物化學(xué)雜志27225719-25723，1997；Salvesen和Dixit，細(xì)胞91443-446，1997)，所以為了進(jìn)一步闡明neo膜和Bcl-2膜中procaspase-3的存在，我們嘗試通過(guò)用外源caspase-1處理來(lái)激活這些組分。正如我們?cè)谏厦骘@示的，當(dāng)在我們的標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)量時(shí)，來(lái)源于Bcl-2細(xì)胞的膜幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出caspase活性。然而，用caspase-1處理Bcl-2膜引起酶活性的強(qiáng)誘導(dǎo)(圖5)。在該實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自697-Bcl-2細(xì)胞和697-neo細(xì)胞的重膜組分(含有50μg總蛋白)被重新懸浮起來(lái)，并用鼠caspase-1室溫處理1小時(shí)。離心后，測(cè)量所獲上清液中的DEVD-amc切割活性。通過(guò)從觀察到的熒光中減去僅含有caspase-1的對(duì)照樣品的熒光，用外源caspase-1活性修正caspase-1處理樣品的DEVD-amc切割活性。圖5中的誤差線代表了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的觀察值的標(biāo)準(zhǔn)差。neo膜也被外源caspase-1激活。但重要的是，激活后，從Bcl-2和neo膜產(chǎn)生的caspase活性總是相似的，處于兩倍的范圍內(nèi)(圖5)。連同該procaspase-3的免疫印跡數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)支持如下結(jié)論，即在neo膜和Bcl-2膜中存在類似水平的procaspase-3。
用caspase-1處理膜不僅激活內(nèi)源性的caspase活性，而且將其從膜中釋放出來(lái)，因?yàn)楫?dāng)通過(guò)離心除去該膜后該活性仍保留在上清液中(圖5)。由于該caspase-1激活可以被200nM acYVAD-醛完全阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)，在該濃度時(shí)acYVAD-醛抑制caspase-1而非膜caspase，所以該誘導(dǎo)和釋放是由于caspase-1的蛋白水解活性造成的。這些結(jié)果說(shuō)明，neo表達(dá)細(xì)胞和Bcl表達(dá)細(xì)胞含有相似量的能夠被caspase-1激活的膜相關(guān)無(wú)活性procaspase。然而，沒(méi)有外源caspase的處理，僅有來(lái)源于neo表達(dá)細(xì)胞的膜表現(xiàn)出自發(fā)的caspase激活。
實(shí)施例13對(duì)誘導(dǎo)的和自發(fā)的caspase活性的特性分析通過(guò)測(cè)量幾種肽醛抑制劑對(duì)DEVD-amc切割的抑制，進(jìn)一步定性該膜來(lái)源的caspase活性(表1)。來(lái)源于激活Bcl-2膜的DEVD-amc活性抑制IC50值與來(lái)源于neo膜的活性抑制IC50值十分相似，這提示caspase-1在兩種膜制品中激活了相同的procaspase。而且，這些IC50值與來(lái)源于neo膜的自發(fā)激活DEVD-amc活性的IC50值相似，這提示該自發(fā)的和caspase-1誘導(dǎo)的活性來(lái)源于相同caspase。在所有情況下，該抑制數(shù)據(jù)與簡(jiǎn)單競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線很好地吻合，這提示所有的DEVD-amc活性都是從單一caspase而非酶混合物產(chǎn)生的。膜相關(guān)caspase的IC50觀察值與純化的經(jīng)完全加工過(guò)的重組人caspase-3的IC50觀察值極為相似。動(dòng)力學(xué)測(cè)量也說(shuō)明，膜來(lái)源caspase(10μM)解DEVD-amc的Km值與用經(jīng)完全加工過(guò)的caspase-3所觀察到的相似(Nicholson等，自然37637-43，1995)。親和純化的激活重膜caspase的N端微量序列分析證實(shí)，該酶的確是人caspase-3。
表1來(lái)自各種細(xì)胞類型的重膜(HM)來(lái)源caspase和重組人caspase-3通過(guò)肽醛進(jìn)行的抑制IC50(nM)697-neo697-neo HM 697 Bcl-2HM 皮層細(xì)胞HM MN9D HM r-抑制劑HM(自發(fā)(caspase- (caspase-1 (caspase-1 (caspase-1處 caspase-3活性) 1處理的)處理的) 處理的) 理的) (His)6DEVD-醛 2.32.8 1.3 1.0 0.72 1.0DFLD-醛 3.44.5 3.6 2.3 2.5 1.5YVAD-醛 ＞10,000 ＞10,000＞10,000＞10,000＞10,000 ＞10,000為了確定膜相關(guān)caspase活性的存在是否是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一般性質(zhì)，測(cè)定來(lái)自另外兩種細(xì)胞來(lái)源的重膜中DEVD-amc切割活性小鼠E15初生大腦皮層細(xì)胞和小鼠多巴胺能MN9D細(xì)胞系(Choi等，神經(jīng)生物學(xué)(Neurobiology)898943-8947，1992)。采用用于697細(xì)胞的相同程序制備重膜組分，并用caspase-1激活。這些組分含有與697細(xì)胞中觀察到的每mg蛋白質(zhì)切割活性相似的膜相關(guān)caspase活性(資料未顯示)，而且caspase抑制劑阻斷該活性的效力與使用697細(xì)胞來(lái)源的組分或重組caspase-3所觀察到的類似(表1)。因此，膜來(lái)源的caspase活性并非特異存在于697細(xì)胞中，而似乎是一種更為普遍的現(xiàn)象。
實(shí)施例14外源細(xì)胞色素c和膜相關(guān)procaspase-3幾個(gè)最近的報(bào)道顯示，細(xì)胞色素c自線粒體的釋放能夠引起細(xì)胞質(zhì)caspase-3的激活(Liu等，細(xì)胞86147-157，1996；Li等，細(xì)胞91479-489，1997)。其它報(bào)道顯示，細(xì)胞色素c在細(xì)胞凋亡損傷后自線粒體中被釋放出來(lái)，而Bcl-2能夠抑制該釋放(Kluck等，科學(xué)(Science)2751132-1136，1997；Yang等，科學(xué)2751129-1132，1997)。因此，在來(lái)自Bcl-2表達(dá)細(xì)胞和neo表達(dá)細(xì)胞的重膜之間所觀察到的caspase活性差異可能僅反應(yīng)了在重膜組分的制備期間或在這些組分隨后的孵育期間Bcl-2對(duì)細(xì)胞色素c釋放的抑制。為了研究此可能性，在存在外源細(xì)胞色素c的情況下進(jìn)行細(xì)胞的分級(jí)分離，然后測(cè)量這是否影響了caspase的激活。如果Bcl-2膜由于Bcl-2對(duì)細(xì)胞色素c的隔離影響而具有低的caspase活性，那么在膜分級(jí)分離期間加入外源細(xì)胞色素c應(yīng)使這些膜來(lái)源的caspase活性增加至在neo細(xì)胞來(lái)源的膜中所觀察到的水平。因此，在從neo和Bcl-2表達(dá)細(xì)胞分級(jí)分離重膜的過(guò)程中，在Dounce勻漿后，將樣品分成兩份。一份用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液加工，而另一份中加入10μg/ml牛細(xì)胞色素c，并用含有10μg/ml牛細(xì)胞色素c的該緩沖液懸浮和洗滌重膜。選擇該細(xì)胞色素c濃度是因?yàn)樗浅跏技?xì)胞沉淀物中存在的細(xì)胞色素c的估計(jì)總量(Li等，生物化學(xué)雜志27230299-30305，1997)。最后，將這些膜重新懸浮在加有50μM dATP的1μg/ml細(xì)胞色素c中，孵育并之后檢測(cè)DEVD-amc切割活性。于30℃將經(jīng)細(xì)胞色素c處理過(guò)的重膜以及細(xì)胞質(zhì)組分等分試樣與含有50μM dATP/1μg/ml細(xì)胞色素c的低滲緩沖液一起孵育40分鐘，而未經(jīng)細(xì)胞色素c處理的該膜和細(xì)胞質(zhì)樣品僅與緩沖液一起孵育。將每個(gè)樣品離心，并測(cè)量上清液中DEVD-amc切割活性。圖6中的數(shù)據(jù)代表了3次相同的實(shí)驗(yàn)(圖6A)。將來(lái)自我們通常的未用細(xì)胞色素c制備的膜制品、且沒(méi)有用細(xì)胞色素c和dATP進(jìn)行孵育而產(chǎn)生的活性與該活性進(jìn)行比較。
數(shù)據(jù)顯示，在膜分級(jí)分離和孵育期間包含細(xì)胞色素c并不影響膜來(lái)源的caspase活性；在來(lái)自Bcl-2表達(dá)細(xì)胞的膜中該活性仍比neo膜中的該活性低，而且細(xì)胞色素c對(duì)neo膜來(lái)源的該caspase活性也沒(méi)有影響(圖6A)。盡管該細(xì)胞色素c處理沒(méi)有激活該膜來(lái)源的caspase，但用外源caspase-1進(jìn)行的隨后處理仍能夠激活該酶(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)胞色素c沒(méi)有影響該膜caspase的激活，并非是由于制備的細(xì)胞色素c沒(méi)有活性造成的，因?yàn)樵诜旨?jí)分離和分析過(guò)程中來(lái)自neo和Bcl-2細(xì)胞的該細(xì)胞質(zhì)組分的DEVD-amc切割活性受到所加入的細(xì)胞色素c的強(qiáng)烈激活(圖6B)。因此，Bcl-2的表達(dá)抑制了膜相關(guān)procaspase-3的激活，但該作用不被外源細(xì)胞色素c的加入消除。而且，Bcl-2超量表達(dá)并不影響細(xì)胞色素c激活細(xì)胞質(zhì)組分中caspase-3的能力。
實(shí)施例15
膜來(lái)源caspase的釋放并非由細(xì)胞器的簡(jiǎn)單滲漏引起近來(lái)的一個(gè)報(bào)道描述了在線粒體膜間間隙中存在procaspase-3(Mancini等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)1401485-1495，1998)。因此，可能該物質(zhì)能夠說(shuō)明在含有線粒體的重膜組分中測(cè)量到的可激活caspase活性。而且，可能在697-neo細(xì)胞的膜組分中測(cè)量到的自發(fā)活性是由于從線粒體滲漏的活性caspase造成的，而從697-Bcl-2細(xì)胞分離的線粒體僅有較小的滲漏(Yang等，科學(xué)2751129-1132，1997)。然而，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明，所測(cè)量到的活性并非由線粒體滲漏造成的，而且該活性與Mancini等(同上)所描述的不同。
首先，檢測(cè)在neo膜中加入1％ND-40是否影響自發(fā)活性水平或caspase-1或粒酶B誘導(dǎo)的活性水平。如果procaspase和/或活性caspase被隔離在細(xì)胞器中，那么可以合理地推測(cè)當(dāng)存在NP-40時(shí)將測(cè)量到活性的增加。用1％NP-40處理已足以將存在于重膜制品中的幾乎所有細(xì)胞色素c釋放出來(lái)(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，Mancini和其同事顯示，用1％NP-40處理他們的線粒體制品使得粒酶B可以裂解procaspase-3，而在沒(méi)有去污劑時(shí)沒(méi)有觀察到裂解(Mancini等，細(xì)胞生物學(xué)雜志1401485-1495，1998)。然而，本發(fā)明結(jié)果顯示，1％NP-40對(duì)自發(fā)活性或用caspase-1或粒酶B處理所誘導(dǎo)的活性均幾乎沒(méi)有影響(圖6A)。在該實(shí)驗(yàn)中，用180μl低滲溶液稀釋160μl neo膜，然后用40μl 10％NP-40去污劑或dH2O處理(終體積＝380μl)。通過(guò)加入20μl粒酶B或caspase-1裂解物或緩沖液，然后在30℃孵育60分鐘，激活該稀釋膜。激活后，通過(guò)離心去除重膜，并通過(guò)在各50μl的每個(gè)上清液中加入200μl在ICE緩沖液中的25μM DEVD-amc底物，測(cè)量每個(gè)樣品的DEVD-amc切割活性(圖7A)。
接著，為了分析來(lái)自697-Bcl-2細(xì)胞的膜制品是否可能是由于caspase隔離的增強(qiáng)而具有低的自發(fā)活性，我們將DEVD-amc加入Bcl-2和neo膜制品中，在單純的緩沖液中或在加有1％NP-40的緩沖液中進(jìn)行孵育，然后測(cè)量熒光的出現(xiàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將含有或不含1％NP-40去污劑的200μl在pH 7.5低滲緩沖液(含有4mM DTT)中的25μM DEVD-amc加入50μl新鮮制備的neo或Bcl-2膜中，測(cè)量NP-40對(duì)重膜催化的DEVD-amc水解進(jìn)度曲線的影響。該結(jié)果顯示，1％NP-40對(duì)熒光增加的數(shù)量或速度僅有微弱影響。無(wú)論是否存在1％NP-40，來(lái)源于697-Bcl-2細(xì)胞的制品都具有低的活性，這說(shuō)明該低水平的活性并非是由于活性caspase的隔離引起的。
最后，我們采用Mancini等(1998)所描述的方法從697-neo和697-Bcl-2細(xì)胞制備了線粒體組分，以便更為直接地評(píng)價(jià)我們的結(jié)果和他們公開的數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)加入粒酶B或緩沖液激活含有或不含1％NP-40的稀釋膜60分鐘，離心并分析DEVD-amc切割活性，該活性描述在圖7A中。正如圖7C所顯示的，通過(guò)這些方法從697-neo和697-Bcl-2制備的組分在沒(méi)有NP-40時(shí)具有能夠被粒酶激活的caspase活性。然而，在1％NP-40存在時(shí)，粒酶B導(dǎo)致caspase活性的增強(qiáng)。因此，在這些情況下，粒酶B可以以獨(dú)立于NP-40的方式和NP-40依賴性方式產(chǎn)生caspase活性。
從前文所述，應(yīng)該理解，盡管本文為了說(shuō)明的目的描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，仍然可以進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.用于鑒定膜來(lái)源的caspase活性的方法，包括在足以允許caspase活性形成的條件和時(shí)間下孵育含有重膜或核膜的膜組分，以及隨后檢測(cè)caspase的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中caspase活性通過(guò)測(cè)量caspase底物的轉(zhuǎn)化來(lái)檢測(cè)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中底物的轉(zhuǎn)化通過(guò)時(shí)程分析測(cè)量。
4.權(quán)利要求2的方法，其中底物的轉(zhuǎn)化通過(guò)終點(diǎn)分析測(cè)量。
5.權(quán)利要求2的方法，其中底物的轉(zhuǎn)化通過(guò)選自熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、層析和N端肽測(cè)序的方法來(lái)檢測(cè)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中caspase活性通過(guò)確定caspase的加工來(lái)檢測(cè)，所述加工導(dǎo)致產(chǎn)生大caspase亞基和小caspase亞基。
7.權(quán)利要求6的方法，其中大、小caspase亞基通過(guò)選自熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、層析和N端肽測(cè)序的方法檢測(cè)。
8.權(quán)利要求1-7之任意一項(xiàng)的方法，其中該膜組分來(lái)源于非凋亡細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-7之任意一項(xiàng)的方法，其中該膜組分來(lái)源于經(jīng)細(xì)胞凋亡刺激物處理過(guò)的細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該細(xì)胞凋亡刺激物選自生長(zhǎng)因子剝奪、星形孢菌素、抗fas抗體、紫外輻射、γ輻射和腫瘤壞死因子。
11.用于鑒定膜來(lái)源caspase活性的抑制劑的方法，包括在至少一種候選抑制劑存在和不存在時(shí)，將膜組分與caspase底物接觸；然后比較caspase底物轉(zhuǎn)化的水平，并由此鑒定膜來(lái)源的caspase活性的抑制劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該caspase底物含有可被caspase切割的位點(diǎn)，且該底物選自蛋白質(zhì)、多肽、寡肽、肽模擬物和肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該底物含有肽DEVD。
14.權(quán)利要求11的方法，其中該膜組分是從未經(jīng)刺激的選自下組的組織培養(yǎng)細(xì)胞制備的697類淋巴母細(xì)胞、E15初生大腦皮層細(xì)胞、MN9D細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和FL5.12細(xì)胞。
15.權(quán)利要求11的方法，其中該膜組分含有選自重膜和核膜的膜。
16.權(quán)利要求11的方法，其中該膜組分含有重膜。
17.權(quán)利要求11的方法，其中底物轉(zhuǎn)化通過(guò)時(shí)程分析來(lái)檢測(cè)。
18.權(quán)利要求11的方法，其中底物轉(zhuǎn)化通過(guò)終點(diǎn)分析來(lái)檢測(cè)。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中通過(guò)選自熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、層析和N端肽測(cè)序的方法檢測(cè)caspase底物的轉(zhuǎn)化。
20.權(quán)利要求11的方法，其中該膜組分來(lái)源于表達(dá)促細(xì)胞凋亡多肽的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求11的方法，還包括在加入所述caspase底物之前或同時(shí)將該膜組分與caspase的激活物一起孵育。
22.權(quán)利要求11的方法，其中該膜組分來(lái)源于非凋亡細(xì)胞。
23.權(quán)利要求11的方法，其中該膜組分來(lái)源于經(jīng)細(xì)胞凋亡刺激物處理過(guò)的細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中該細(xì)胞凋亡刺激物選自生長(zhǎng)因子剝奪、星形孢菌素、抗fas抗體、紫外輻射、γ輻射和腫瘤壞死因子。
25.用于鑒定膜來(lái)源caspase活性的增強(qiáng)劑的方法，包括在至少一種候選增強(qiáng)劑存在和不存在時(shí)用caspase底物接觸膜組分，然后比較caspase底物轉(zhuǎn)化的水平，由此鑒定膜來(lái)源的caspase活性的增強(qiáng)劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中該caspase底物含有可被caspase切割的位點(diǎn)，且該底物選自蛋白質(zhì)、多肽、寡肽、肽模擬物和肽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中該底物含有肽DEVD。
28.權(quán)利要求25的方法，其中該膜組分是從未經(jīng)刺激的選自下組的組織培養(yǎng)細(xì)胞制備的697類淋巴母細(xì)胞、E15初生大腦皮層細(xì)胞、MN9D細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和FL5.12細(xì)胞。
29.權(quán)利要求25的方法，其中該膜組分含有選自重膜和核膜的膜。
30.權(quán)利要求25的方法，其中該膜組分含有重膜。
31.權(quán)利要求25的方法，其中底物轉(zhuǎn)化通過(guò)時(shí)程分析來(lái)檢測(cè)。
32.權(quán)利要求25的方法，其中底物轉(zhuǎn)化通過(guò)終點(diǎn)分析來(lái)檢測(cè)。
33.權(quán)利要求31或32的方法，其中通過(guò)選自熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、層析和N端肽測(cè)序的方法檢測(cè)caspase底物的轉(zhuǎn)化。
34.權(quán)利要求25的方法，其中該膜組分來(lái)源于表達(dá)抗細(xì)胞凋亡多肽的細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中該抗細(xì)胞凋亡多肽是Bcl-2 。
36.權(quán)利要求34的方法，還包括在加入所述caspase底物之前或同時(shí)將該膜組分與caspase的激活物一起孵育。
37.權(quán)利要求25的方法，其中該膜組分來(lái)源于非凋亡細(xì)胞。
38.權(quán)利要求25的方法，其中該膜組分來(lái)源于經(jīng)細(xì)胞凋亡刺激物處理過(guò)的細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該細(xì)胞凋亡刺激物選自生長(zhǎng)因子剝奪、星形孢菌素、抗fas抗體、紫外輻射、γ輻射和腫瘤壞死因子。
40.權(quán)利要求25的方法，其中在加入該caspase底物之前或同時(shí)加入外源抗細(xì)胞凋亡多肽。
41.用于鑒定膜組分中caspase加工過(guò)程展開的抑制劑或增強(qiáng)劑的方法，包括用至少一種候選抑制劑或候選增強(qiáng)劑接觸膜組分；和檢測(cè)大、小caspase亞基的存在，并由此確定caspase加工的水平，其中加工水平的降低指示存在caspase加工抑制劑，而加工水平的增加則指示存在caspase加工增強(qiáng)劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中該膜組分是從未經(jīng)刺激的選自下組的組織培養(yǎng)細(xì)胞制備的697類淋巴母細(xì)胞、E15初生大腦皮層細(xì)胞、MN9D細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和FL5.12細(xì)胞。
43.權(quán)利要求41的方法，其中該膜組分含有選自重膜和核膜的膜。
44.權(quán)利要求41的方法，其中該膜組分含有重膜。
45.權(quán)利要求41的方法，其中通過(guò)選自熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、層析和N端肽測(cè)序的方法檢測(cè)大、小caspase亞基。
46.權(quán)利要求41的方法，其中該膜組分來(lái)源于表達(dá)抗細(xì)胞凋亡多肽的細(xì)胞。
47.權(quán)利要求46的方法，其中該抗細(xì)胞凋亡多肽是Bcl-2。
48.權(quán)利要求41的方法，其中該膜組分來(lái)源于非凋亡細(xì)胞。
49.權(quán)利要求41的方法，其中該膜組分來(lái)源于經(jīng)細(xì)胞凋亡刺激物處理過(guò)的細(xì)胞。
50.權(quán)利要求49的方法，其中該細(xì)胞凋亡刺激物選自生長(zhǎng)因子剝奪、星形孢菌素、抗fas抗體、紫外輻射、γ輻射和腫瘤壞死因子。
51.鑒定調(diào)節(jié)膜組分來(lái)源的caspase活性的化合物的方法，包括在足以允許caspase活性形成的條件和時(shí)間下，在至少一種候選化合物存在和不存在時(shí)，將膜組分、細(xì)胞凋亡抑制劑和caspase底物一起孵育；和比較caspase底物轉(zhuǎn)化的水平，由此鑒定調(diào)節(jié)膜來(lái)源caspase活性的化合物。
52.權(quán)利要求51的方法，其中該caspase底物含有可被caspase切割的位點(diǎn)，且該底物選自蛋白質(zhì)、多肽、寡肽、肽模擬物和肽。
53.權(quán)利要求52的方法，其中該底物含有肽DEVD-amc。
54.權(quán)利要求51的方法，其中該膜組分是從未經(jīng)刺激的選自下組的組織培養(yǎng)細(xì)胞制備的697類淋巴母細(xì)胞、E15初生大腦皮層細(xì)胞、MN9D細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和FL5.12細(xì)胞。
55.權(quán)利要求51的方法，其中該膜組分含有選自重膜和核膜的膜。
56.權(quán)利要求51的方法，其中該膜組分含有重膜。
57.權(quán)利要求51的方法，其中底物轉(zhuǎn)化通過(guò)時(shí)程分析來(lái)檢測(cè)。
58.權(quán)利要求51的方法，其中底物轉(zhuǎn)化通過(guò)終點(diǎn)分析來(lái)檢測(cè)。
59.權(quán)利要求57或58的方法，其中通過(guò)選自熒光光譜學(xué)、質(zhì)譜分析、HPLC、比色法、熒光自顯影、放射顯影、凝膠電泳、層析和N端肽測(cè)序的方法檢測(cè)caspase底物的轉(zhuǎn)化。
60.權(quán)利要求51的方法，其中該膜組分含有細(xì)胞凋亡的抑制劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中該膜組分來(lái)源于表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞。
62.權(quán)利要求51的方法，其中該細(xì)胞凋亡抑制劑是Bcl-2多肽或其功能性片段。
63.權(quán)利要求51的方法，還包括在加入caspase底物之前或同時(shí)將該膜組分與caspase激活物一起孵育。
64.權(quán)利要求51的方法，其中該膜組分來(lái)源于非凋亡細(xì)胞。
65.權(quán)利要求51的方法，其中該膜組分來(lái)源于經(jīng)細(xì)胞凋亡刺激物處理過(guò)的細(xì)胞。
66.權(quán)利要求65的方法，其中該細(xì)胞凋亡刺激物選自生長(zhǎng)因子剝奪、星形孢菌素、抗fas抗體、紫外輻射、γ輻射和腫瘤壞死因子。
67.通過(guò)方法11和41之任意一種鑒定的膜來(lái)源caspase活性的抑制劑。
68.通過(guò)方法25和41之任意一種鑒定的膜來(lái)源caspase活性的增強(qiáng)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測(cè)膜來(lái)源的細(xì)胞凋亡活性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供鑒定膜來(lái)源的caspase活性的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中,提供藥物發(fā)現(xiàn)方法用于篩選抑制或增強(qiáng)膜來(lái)源caspase活性的化合物。在這些不同的實(shí)施方案中,重膜組分被用于本文所述的篩選方法中。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK1345378SQ00805719
公開日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2000年3月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月5日
發(fā)明者L·C·福里茨, J·F·克雷博斯 申請(qǐng)人:伊鄧藥品公司