專利名稱：從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備有機(jī)化合物的方法，具體地說(shuō)是一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法。
核酸是DNA和RNA的總稱，是一切生命基因-細(xì)胞的核心物質(zhì)，它決定著生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳，以及人體的衰老和患病都是由于缺乏核酸使基因受損而致，世界衛(wèi)生組織建議成年人每天應(yīng)補(bǔ)充外源核酸1-1.5克，以促進(jìn)正常的新陳代謝，延緩衰老，中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種制取核酸的方法，其專利申請(qǐng)?zhí)枮?4115437.8，名稱為“從天然植物細(xì)胞中提取核酸的生產(chǎn)工藝”，它以脫脂大豆粕為原料，經(jīng)過(guò)溶脹、勻漿制備、細(xì)胞裂解、溶劑抽提、透析處理等生產(chǎn)工藝制得核酸提取液和核酸純化干品，其不足是利用化學(xué)試劑如酚或乙醇抽提，提取液需要進(jìn)行透析處理，通常需要48-72小時(shí)，而且每隔6-8小時(shí)更換一次透析液，其生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高，有害液體的排放還會(huì)污染環(huán)境，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從微生物細(xì)胞中制取高純度核酸原料的方法，其原料來(lái)源廣泛、工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、與人的基因相同緣，宜吸收且無(wú)毒害。
為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明可以通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法，主要包括如下工藝步驟1、基礎(chǔ)原料及初加工選擇以微生物-酵母細(xì)胞為基料，將其加工成為生物活性物，2、培養(yǎng)高核酸細(xì)胞將生物活性物-酵母基料進(jìn)行稀釋，稀釋成稠粥狀稀釋液，對(duì)稀釋液中的酵母細(xì)胞植入動(dòng)物胎體的細(xì)胞基因，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使稀釋液中酵母細(xì)胞核酸的含量增高，得到高核酸基料，3、細(xì)胞的裂解往高核核酸基料中加入含有0.1M-0.25M的氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋，在稀釋液中加入適量的堿調(diào)整PH值，使之PH在8-12之間，然后在90℃-100℃的條件下蒸煮2-4小時(shí)，再以10000轉(zhuǎn)/分-12000轉(zhuǎn)/分的速度在勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)、裂解40分鐘-60分鐘，同時(shí)進(jìn)行高溫滅菌，得到核酸裂解液，3、提取核酸采用分離、濃縮、壓濾的力法從核酸裂解液中提取核酸制品。
本發(fā)明還可以通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)用弱酸調(diào)節(jié)核酸裂解液的PH值，使之PH值在6-8之間，然后輸入離心機(jī)以1000轉(zhuǎn)/分-3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘-30分鐘，所得上部液態(tài)即為核酸提取液，將核酸提取液加入飽和硫酸銨進(jìn)行稀釋，核酸提取液與飽和硫酸銨的比例為1∶8-16，然后離心10分鐘-20分鐘，以除去蛋白質(zhì)，在去除蛋白質(zhì)的液態(tài)核酸中加入助濾液-氯化鈉，使液態(tài)核酸中氯化鈉的含量為3M-6M，再離心10分鐘-20分鐘，在所得沉淀核酸中加蒸餾水稀釋，兩者的比例為1∶1-2，然后用生物膜真空抽濾除去氯化鈉，將去除氯化鈉的核酸液進(jìn)行干燥，所得制品即為純凈核酸原料。
本發(fā)明還可以通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)采用壓濾方法過(guò)濾核酸裂解液，提取純核酸，核酸裂解液經(jīng)上述蒸煮步驟后，其粘度比較大，固體顆粒已相當(dāng)小(＜5um=，在壓濾機(jī)過(guò)濾核酸裂解液之前，清洗并裝好濾布，助濾液的每次用量為壓濾機(jī)容積的2-3倍，開(kāi)始泵入裂解液，為了使裂解液粘度變得較小，泵入核酸裂解液的溫度一般控制在50℃-90℃，為了保證濾速和濾量，泵壓一般控制在0.1-0.5Mpa。過(guò)濾結(jié)束時(shí)，在濾板和隔膜之間通入壓縮空氣，壓力為0.3-0.7Mpa，通過(guò)壓縮空氣來(lái)壓榨濾餅，將液體核酸擠壓出來(lái)，關(guān)閉空壓機(jī)，打開(kāi)壓濾機(jī)，卸出濾餅，濾餅的含水量一般為50％左右，濾餅經(jīng)烘干粉碎是含50％以上的蛋白質(zhì)，可進(jìn)一步加工成蛋白粉氨基酸等，壓濾機(jī)將擠壓出來(lái)的液體為液態(tài)核酸，提純核酸在等電點(diǎn)罐沉淀工藝中進(jìn)行，A、核酸在等電點(diǎn)罐沉淀之前，須將液態(tài)核酸進(jìn)行降溫，溫度一般應(yīng)控制在4℃-16℃之間，B、等電點(diǎn)罐是具有隔熱性能的保溫罐，首先緩慢攪拌液態(tài)核酸，按液態(tài)核酸的重量加入0.1-1％的氯化鈣或氯化鈣溶液，使之充分溶解混合，然后緩慢加入硫酸(濃度3-6M)，使分離液的PH值在2-3之間，此時(shí)產(chǎn)生大量絮狀核酸的沉淀物，停止攪拌，保溫靜止，C、排放上清液，等電點(diǎn)罐中液態(tài)核酸，調(diào)節(jié)等電點(diǎn)并靜止6小時(shí)以上，固體和液體自動(dòng)分離，排出上清液，沉淀物即為濕核酸，D、酒精清洗濕核酸，濕核酸中含有大量的水分及雜質(zhì)，此過(guò)程加入2-3倍濕核酸體積的高濃度酒精(酒精度＞80％)，開(kāi)啟攪拌機(jī)，用酒精對(duì)濕核酸進(jìn)行脫水及溶出雜質(zhì)，攪拌20分鐘后停止攪拌，靜止4小時(shí)以上，使酒精與核酸自然分離，E、酒精的回收，待酒精與核酸自然分離后，放出酒精上清，因該酒精已被稀釋，可在酒精回收塔中重新濃縮，使酒精循環(huán)使用，F(xiàn)、核酸干燥粉碎，經(jīng)酒精脫水清洗的核酸放入干燥盤，在干燥室中85℃烘干，冷卻后用粉碎機(jī)粉碎即為成品核酸。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下特點(diǎn)1、采集飲、食品工廠排放的酵母為原料，加工成為生物活性固體狀物；將活性酵母基料稀釋，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使其核酸的含量增高，經(jīng)高溫、高速勻質(zhì)等物理方法進(jìn)行細(xì)胞與核蛋白的裂解，對(duì)核酸大分子進(jìn)行物理與化學(xué)的切割，其原料來(lái)源廣泛、工藝簡(jiǎn)單、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
2、在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，不需添加有害的化學(xué)試劑進(jìn)行抽提、透析，不會(huì)污染環(huán)境，還可保留微生物本身營(yíng)養(yǎng)成分，其基因又與人體生命的基因相同，吸收率可達(dá)99％以上，宜于推廣和使用。
3、在等量原料中提取的純核酸是現(xiàn)有技術(shù)的4-5倍，制得核酸純度高，生產(chǎn)成本低。
4、原料來(lái)源于酒廠和食品生產(chǎn)廠，已經(jīng)進(jìn)行了衛(wèi)生免疫的前處理，經(jīng)過(guò)二次酵母培養(yǎng)和提純，衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)高于現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)品，無(wú)任何直接和間接的毒副作用，并且原料屬二次利用，來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜，設(shè)備投資小，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品成本低。物理離心提取和金屬離子及等電點(diǎn)沉淀兩種方法共用，使核酸的提取率和產(chǎn)品純度大幅度提高；工藝穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)施例1將固體狀物的生物活性酵母基料進(jìn)行稀釋，在稀釋液中對(duì)酵母基料植入從動(dòng)物胎體中精選優(yōu)質(zhì)健壯的種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其核酸的含量增高，將稀釋發(fā)酵生產(chǎn)的高核酸酵母10噸(含干物質(zhì)10％)放入配料池，開(kāi)啟攪拌機(jī)，緩慢加入1噸含有0.1-0.25M的氯化鈉并使之溶解混勻，在攪拌中加入氫氧化鈉調(diào)PH值在9-11之間，采用高溫蒸煮，停止攪拌。用泵泵入蒸煮罐，在圓形蒸煮罐的下方沿切線方向通入蒸汽加熱，待加熱至95℃時(shí)，關(guān)小蒸汽閥門使之保溫4小時(shí)。酵母細(xì)胞的裂解率大于90％，然后以10000-12000轉(zhuǎn)/分的速度在勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)、裂解40-60分鐘，以加速細(xì)胞與核蛋白的裂解并加強(qiáng)了對(duì)核酸大分子的切割，促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解，同時(shí)進(jìn)行高溫滅菌。
所得裂解液用鹽酸調(diào)PH值至7，然后輸入離心機(jī)并以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，所得上部液態(tài)即為食用核酸提取液；取液態(tài)核酸以1∶10的比例飽和硫酸銨混合稀釋，然后離心10-20分鐘，在去除蛋白質(zhì)的液態(tài)核酸中加入氯化鈉為助濾液，使液態(tài)核酸中氯化鈉的含量為4.5M，離心10-20分鐘，在所得沉淀核酸中加蒸餾水稀釋，兩者的比例為1∶1.2，然后用生物膜真空抽濾除去氯化鈉，將去除氯化鈉的核酸液進(jìn)行干燥，所得制品即為純凈核酸原料，經(jīng)測(cè)定計(jì)算，核酸的收率為干酵母重的5.2％，對(duì)核酸的總提取率為81.7％，核酸純度84％。純凈核酸原料中含核酸可達(dá)95％以上。
實(shí)施例2將發(fā)酵生產(chǎn)的高核酸酵母10噸(含干物質(zhì)10％)放入配料池，開(kāi)啟攪拌機(jī)，緩慢加入1噸食鹽并使之溶解混勻，停止攪拌，用泵泵入蒸煮罐，在圓形蒸煮罐的下方沿切線方向通入蒸汽加熱，待加熱至95℃時(shí)，關(guān)小蒸汽閥門使之保溫4小時(shí)。
在溶積為1立方米的雙面充氣板框式壓濾機(jī)上裝好隔膜、隔板、濾布(濾布型號(hào)為610)并連接好充氣管線。在助濾液勾兌池中加入2立方米清水，攪拌混合均勻，一邊攪拌，一邊泵入壓濾機(jī)，此時(shí)從壓濾機(jī)中流出清水，泵完2立力米助濾液為止。將蒸煮液預(yù)冷至80℃左右，在泵完助濾液后泵入蒸煮液，泵入壓力開(kāi)始時(shí)要低，控制在0.2MPa左右，壓力的控制是由節(jié)流閥控制液體的回流與進(jìn)入壓濾機(jī)的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)，隨著壓濾機(jī)內(nèi)濾餅的形成，壓力會(huì)逐漸增大，控制節(jié)流閥使之不要超過(guò)0.5MPa。泵入8-10立方米蒸煮液后(時(shí)節(jié)間為3小時(shí))，停止泵液，開(kāi)啟空氣壓縮機(jī)，向橡膠隔膜中泵入空氣，空氣壓力控制在0.6MPa待壓濾機(jī)沒(méi)有液體流出后(沖氣時(shí)間約為20分鐘)，關(guān)閉空壓機(jī)，打開(kāi)壓濾機(jī)，卸出濾餅，濾餅的含水量一般為50％左右。濾餅經(jīng)烘干粉碎是富含50％以上的蛋白質(zhì)，可進(jìn)一步加工成蛋白粉氨基酸等。
從壓濾機(jī)過(guò)濾出的分離液流入預(yù)貯藏，在預(yù)貯罐中冷卻至自然氣溫，然后開(kāi)啟制冷機(jī)組及換熱器，分離液的冷卻溫度通過(guò)調(diào)節(jié)換熱器中的冷卻液和分離液的節(jié)流閥的節(jié)流閥來(lái)實(shí)現(xiàn)，分離液在換熱器中出口溫度為8℃然后流入等電點(diǎn)罐。分離液冷卻注入等電點(diǎn)罐的體積是9.2立方米，開(kāi)啟等電點(diǎn)罐的攪拌機(jī)，加入含氯化鈣20％的氯化鈣溶液300公斤，測(cè)定等電點(diǎn)罐中的PH值，緩慢慢加入30％的H2SO4使PH值逐漸降低，直至PH值為2.2時(shí)停止加入H2SO4，此時(shí)產(chǎn)生大量的絮狀核酸，停止攪拌，保溫靜止8小時(shí)，使絮拜謝核酸自然沉淀。打開(kāi)等電點(diǎn)罐上清液放出閥放出上清液，上清液放出閥直通等電點(diǎn)罐內(nèi)部并具有彎形導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)彎形導(dǎo)管的角度達(dá)到控制放出上清液的液位，直至上清液基本排出。關(guān)閉上清液放出閥，向等電點(diǎn)罐注入2立方米的95％的工業(yè)酒精，再次開(kāi)啟攪拌機(jī)，攪拌20分鐘，關(guān)閉攪點(diǎn)注入2立方米的95％的工業(yè)酒精，再次開(kāi)啟攪拌機(jī)，攪拌20分鐘，關(guān)閉攪拌機(jī)，靜止4小時(shí)，打開(kāi)上清液放出閥放出酒精上清。將等電點(diǎn)罐中經(jīng)酒精脫水清洗的核酸沉淀裝入干燥盤。干燥盤放入干燥室，85％拱干10小時(shí)，將干燥盤搬出預(yù)冷并將核酸掰至塊狀。塊狀核酸經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后包裝即為成品核酸粉。經(jīng)測(cè)定計(jì)算，核酸的收率為干酵母重的8.2％，對(duì)核酸的總提取率為92％，核酸純度95％。
權(quán)利要求
1.一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法，其特征在于采用如下工藝步驟(1)基礎(chǔ)原料及初加工選擇以微生物-酵母細(xì)胞為基料，將其加工成生物活性物，(2)培養(yǎng)高核酸細(xì)胞將生物活性物-酵母基料進(jìn)行稀釋，并對(duì)稀釋液中的酵母進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使稀釋液中酵母細(xì)胞的核酸含量增高，得到高核酸基料，(3)細(xì)胞的裂解往高核酸基料中加入含有0.1M-0.25M的氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋，在稀釋液中加入適量的堿調(diào)整PH值，使之PH在8-12之間，然后在90℃-100℃的條件下蒸煮2-4小時(shí)，再以10000轉(zhuǎn)/分-12000轉(zhuǎn)/分的速度在勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)、裂解40-60分鐘，同時(shí)進(jìn)行高溫滅菌，得到核酸裂解液，(4)提取核酸采用分離、濃縮、壓濾的方法從核酸裂解液中提取核酸制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法，其特征在于所說(shuō)的提取核酸的方法是用弱酸調(diào)核酸裂解液的PH值，使PH值在6-8之間，然后輸入離心機(jī)以1000-3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10-30分鐘，所得上部液態(tài)即為食用核酸提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法，其特征在于所說(shuō)的提取核酸的方法是將核酸提取液加入飽和硫酸銨進(jìn)行稀釋，核酸提取液與飽和硫酸銨的比例為1∶8-16，然后離心10-20分鐘，以除去蛋白質(zhì)，在去除蛋白質(zhì)的液態(tài)核酸中加入助濾液-氯化鈉，使液態(tài)核酸中氯化鈉的含量為3M-6M，再離心10-20分鐘，得到沉淀核酸，在沉淀核酸中加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，兩者的比例為1∶1-2，然后用生物膜真空抽濾除去氯化鈉，將去除氯化鈉的核酸液進(jìn)行干燥，得到核酸制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法，其特征在于所說(shuō)的提取核酸方法是用壓濾方法過(guò)濾核酸裂解液，核酸裂解液的溫度為50℃-90℃，過(guò)濾核酸裂解液過(guò)程中采用清水為助濾液，過(guò)濾后將液體核酸擠壓出來(lái)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的力法，其特征在于所說(shuō)的提取核酸方法是將壓濾出來(lái)的液態(tài)核酸進(jìn)行提純，提純核酸在等電點(diǎn)罐沉淀中進(jìn)行，核酸在等電點(diǎn)罐沉淀之前，須將液態(tài)核酸降溫，溫度應(yīng)控制在4-16℃之間，并攪拌液態(tài)核酸，然后加入濃度為3M-6M的硫酸，得到分離液，使分離液的PH值在2-3之間，當(dāng)產(chǎn)生大量絮狀核酸的沉淀物時(shí)，應(yīng)停止攪拌，保溫靜止，等電點(diǎn)罐中液態(tài)核酸，經(jīng)調(diào)等電點(diǎn)靜止6小時(shí)以上，固體和液體自動(dòng)分離，排出上清液，沉淀物即為濕核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5所述的一種從微生物細(xì)胞中制取核酸的方法，其特征在于所說(shuō)的提取核酸方法是采用酒精清洗濕核酸，加入2-3倍濕核酸體積的高濃度酒精，攪拌15-25分鐘，再靜止4小時(shí)以上，待酒精與核酸自然分離后，放出酒精上清液，并進(jìn)行干燥制成純核酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從微生物細(xì)胞中制取核酸原料的方法,其工藝步驟分別是基礎(chǔ)原料及初加工;培養(yǎng)高核酸細(xì)胞;細(xì)胞的裂解;提取核酸,本發(fā)明具有原料來(lái)源廣泛,其基因又與人體生命的基因相同,吸收率可達(dá)99%以上,宜于推廣和使用,制得核酸純度高,生產(chǎn)成本低,無(wú)任何毒副作用,設(shè)備投資小,生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,工藝穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)單,適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1308130SQ0012944
公開(kāi)日2001年8月15日 申請(qǐng)日期2000年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月26日
發(fā)明者李永武 申請(qǐng)人:李永武