專利名稱：蔗糖結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中的碳水化合物代謝，具體地講，涉及蔗糖結(jié)合蛋白(SBP)。本發(fā)明內(nèi)容包括從大豆中分離出來新的SBP基因，以及表現(xiàn)增強(qiáng)的蔗糖攝取活性的修飾的SBP。同時(shí)也提供了具有被改變的蔗糖攝取活性的核酸載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及用于調(diào)控轉(zhuǎn)基因(包括SBP轉(zhuǎn)基因)在植物中表達(dá)的啟動子序列。發(fā)明背景在植物中蔗糖運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)是影響植物生長和生產(chǎn)力的主要因素。通過光和作用，植物將大氣中的二氧化碳固定為磷酸丙糖，然后磷酸丙糖用于生產(chǎn)蔗糖和其它碳水化合物。然后這些碳水化合物被運(yùn)輸?shù)街参锔魈幾鳛槟茉凑崽?、生物合成的碳骨架以及未來生長需要的儲備。蔗糖是被輸送的碳水化合物的主要形式。植物細(xì)胞主動運(yùn)輸蔗糖穿過原生質(zhì)膜的能力，以至于固定在韌皮部的蔗糖能夠被吸收到細(xì)胞中使用，是蔗糖利用的關(guān)鍵步驟。
植物種子的形成涉及碳的累積和氮的儲備，儲備的形式既可以抵御干燥又可以用作在萌發(fā)過程中胚的發(fā)育能源。種子形成過程中碳的累積由特異的原生質(zhì)膜蛋白質(zhì)介導(dǎo)(Overvoorde等，1996；Riesmeier等，1992；Bush，1993)。用可光解蔗糖類似物對從大豆子葉組織分離出來的膜經(jīng)光親和力標(biāo)記鑒定出一種獨(dú)特的62 kD蔗糖結(jié)合蛋白，或稱SBP(Ripp等，1988)。對編碼SBP的cDNA及由其推斷出來的氨基酸序列分析表明，SBP在其N-末端有一個(gè)疏水區(qū)，除此之外，SBP是一個(gè)缺乏普遍存在于運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)中的跨膜疏水片段的親水蛋白質(zhì)(Grimes等，1992)。SBP的拓?fù)鋵W(xué)的生化分析證明它與原生質(zhì)膜的外部小葉密切相關(guān)(Overvorrde和Grimes，1994)。免疫定位試驗(yàn)證實(shí)SBP是細(xì)胞原生質(zhì)膜上涉及蔗糖主動吸收的唯一相關(guān)蛋白質(zhì)，說明SBP可能在蔗糖的攝取過程中發(fā)揮作用(Grimes等，1992)。在酵母系統(tǒng)中由SBP介導(dǎo)的蔗糖攝取的動力學(xué)分析表明，該攝取雖為蔗糖特異性，但是質(zhì)子非依賴性的，且為相對不飽和性的，因此界定了一種新的蔗糖攝取機(jī)制(Overvoorde等，1996)。
種子形成中對蔗糖的攝取影響成熟種子的兩個(gè)典型農(nóng)業(yè)特征所結(jié)籽粒的碳水化合物含量，以及籽粒種植后長出的幼苗的活力。當(dāng)對增加種子中的碳水化合物含量有利時(shí)(例如，種子是收獲的主要植物材料，例如大豆)，在種子形成中增強(qiáng)蔗糖攝取活性應(yīng)該是理想的。相反，當(dāng)收獲的是植物的無性材料時(shí)，降低種子中的蔗糖攝取活性就應(yīng)當(dāng)是理想的。因此，種子形成過程中，蔗糖攝取活性改變的植物將具有顯著的農(nóng)業(yè)重要性，本發(fā)明即是針對這些植物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了編碼植物蔗糖結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，該蔗糖結(jié)合蛋白是種子形成過程中負(fù)責(zé)蔗糖攝取的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了蔗糖結(jié)合蛋白的修飾型，其表現(xiàn)出增強(qiáng)的蔗糖攝取活性。
以前描述的來源于大豆的蔗糖結(jié)合蛋白(Overvoode等，1996)在本文中稱為SBP1。本文提供了一種新的SBP，稱為SBP2。SBP2多肽的長度為489個(gè)氨基酸殘基，在種子形成過程中顯示其表達(dá)水平增強(qiáng)。在異源酵母分析系統(tǒng)中SBP2多肽顯示具有蔗糖攝取活性。
另外，本發(fā)明提供了SBP1和SBP2蛋白質(zhì)的修飾形式，其具有增強(qiáng)的蔗糖攝取活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種形式是去除上述蛋白質(zhì)C-末端氨基酸殘基的缺失突變體。舉例說明，去除SBP1蛋白質(zhì)C-末端的80個(gè)氨基酸殘基，得到的蛋白質(zhì)在酵母分析系統(tǒng)中表現(xiàn)出增強(qiáng)的蔗糖攝取活性。
本發(fā)明還提供了大豆SBP1和SBP2基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)(包括啟動子序列)。這些調(diào)節(jié)區(qū)允許種子形成中的特異性的或增強(qiáng)的表達(dá)，因此可以用于表達(dá)種子形成中的任何轉(zhuǎn)基因。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蔗糖結(jié)合蛋白相比，經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白具有被改變的氨基酸序列，并且與相應(yīng)的野生型蔗糖結(jié)合蛋白相比，經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白在酵母分析系統(tǒng)中的表達(dá)使蔗糖攝取增強(qiáng)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白與野生型蔗糖結(jié)合蛋白相比，在酵母分析系統(tǒng)中使蔗糖攝取增加至少10％，優(yōu)選至少25％。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白與野生型蔗糖結(jié)合蛋白相比，具有改變的氨基酸序列，包括C-末端截短。這種截短典型地在10-100個(gè)氨基酸之間，優(yōu)選約80個(gè)氨基酸。雖然可以從任何已知的蔗糖結(jié)合蛋白中制備該經(jīng)修飾的SBP，然而SBP1和SBP2的修飾形式則是本發(fā)明所舉出的實(shí)例。SBP1和SBP2的修飾形式包括分別具有Seq.I.D.No.2和4所示氨基酸序列的那些形式。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白的核酸分子，以及包括這種核酸分子的載體。本發(fā)明還提供了表達(dá)經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。這種轉(zhuǎn)基因植物可能具有被改變的蔗糖攝取活性，特別是在種子形成過程中。
再一方面，本發(fā)明提供了編碼蔗糖結(jié)合蛋白SBP2或SBP2蛋白變異體的分離的核酸分子。上述蛋白質(zhì)可以包括Seq.I.D.No.3和4所示的氨基酸序列，或者包含與這些序列至少70％、優(yōu)選至少90％的序列相同的序列。本發(fā)明還提供包括上述核酸分子的重組表達(dá)盒序列，以及包含該重組表達(dá)盒序列的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的又一方面是包括啟動子序列的重組核酸分子，該啟動子序列可操作地與核酸序列連接，其中啟動子序列包括SBP1或SBP2啟動子。該啟動子優(yōu)選包括Seq.I.D.No.6和7所示的5’調(diào)節(jié)序列的至少25個(gè)連續(xù)核苷酸。在具體實(shí)施例中，所述核酸序列包括植物蔗糖結(jié)合蛋白編碼序列。包括該重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物也是本發(fā)明的一方面。
本發(fā)明的上述方面和其它方面，將在下面的描述中詳細(xì)討論。附圖簡述


圖1顯示SBP1和SBP2蛋白質(zhì)序列的排列。
圖2是在酵母分析系統(tǒng)中的蔗糖攝取活性圖。序列表序列表中列出的核酸和氨基酸序列是通過核酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫和氨基酸的三字母代碼表示。每個(gè)核酸序列僅列出一條鏈，但是應(yīng)當(dāng)理解通過參考已被展示鏈的互補(bǔ)鏈也包括在內(nèi)。
Seq.I.D.No.1表示SBP1蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
Seq.I.D.No.2表示C-末端80個(gè)氨基酸被去除的截短的SBP1蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
Seq.I.D.No.3表示SBP2蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
Seq.I.D.No.4表示C-末端80個(gè)氨基酸被去除的截短的SBP2蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
Seq.I.D.No.5表示SBP2 cDNA序列。
Seq.I.D.No.6表示SBP2基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)。
Seq.I.D.No.7表示SBP1基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)。
Seq.I.D.No.8-14表示可以用于擴(kuò)增SBP2 cDNA的各區(qū)或5’調(diào)節(jié)區(qū)的寡核苷酸。發(fā)明詳述I.方法本發(fā)明可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法操作。這些方法在一些出版物中已有描述，包括Sambrook等(1989)，Ausubel等(1994)，Innis等(1990)，Weissbach和Weissbach(1989)，Tijssen(1993)。
II.定義除非另有說明，使用的技術(shù)術(shù)語按照常規(guī)的用法應(yīng)用。分子生物學(xué)一般術(shù)語的定義可以在以下出版物中找到Benjamin Lewin，基因V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(編)，分子生物學(xué)大全，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；Robert A.Meyers(編)，分子生物學(xué)和生物技術(shù)案頭參考大全(Comprehensive Desk Rererence)，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。DNA堿基的命名如37 CFR§1.822的規(guī)定，本文使用氨基酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)三字母代碼。
為了便于查閱本發(fā)明的各實(shí)施方案，提供下列術(shù)語的定義蔗糖結(jié)合蛋白(SBP)SBP涉及植物中蔗糖的攝取。可以通過最早由Overvoorde等(1996)描述的酵母蔗糖攝取分析方法方便地確定和檢測該蔗糖攝取活性，下面還將詳細(xì)描述該方法；在這種分析系統(tǒng)中，SBP賦予酵母細(xì)胞以蔗糖攝取能力，否則酵母細(xì)胞不能夠攝取蔗糖。術(shù)語SBP的應(yīng)用通常指任何蔗糖結(jié)合蛋白，包括以前由Grimes等(1992)描述的蔗糖結(jié)合蛋白。本發(fā)明提供了一種編碼以前未曾報(bào)道的蔗糖結(jié)合蛋白的cDNA，該蛋白是來自大豆(Glycine max)的SBP2蛋白。然而本發(fā)明不限于這種特述的SBP其它編碼SBP酶的核苷酸序列也是本發(fā)明的一部分，這些核苷酸序列包括已公開的甘氨酸基因序列的變異體和來自其它植物種的直向同源序列，現(xiàn)在已能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行克隆了。這些序列都具有基本的功能特征編碼能夠在所述酵母分析系統(tǒng)中介導(dǎo)蔗糖攝取的酶。編碼SBP的核酸序列和這些核酸序列編碼的蛋白質(zhì)不僅均具有這種功能特征，而且均具有特異水平的序列相似性(或序列同一性)，如下面將要說明的。序列同一性的概念也可以表示為嚴(yán)謹(jǐn)條件下兩個(gè)序列相互雜交的能力。
本發(fā)明還提供了功能特征得到改變的經(jīng)修飾的SBP，以及編碼這種蛋白質(zhì)的核酸序列。從一種未轉(zhuǎn)化(野生型)植物中分離出來的SBP可以認(rèn)為具有野生型氨基酸序列。經(jīng)修飾的SBP的氨基酸序列與野生型氨基酸序列不同。這種不同可以采取氨基酸缺失、增加、取代或截短的形式。氨基酸序列缺失的蛋白質(zhì)沒有了野生型序列中存在的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；上述殘基可以從蛋白質(zhì)的任何部分刪除。相比較而言，截短的蛋白質(zhì)是上述蛋白質(zhì)的N和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除的形式。因此，截短的蛋白質(zhì)是氨基酸缺失蛋白質(zhì)中的小類。
編碼被改變的SBP的核酸序列可以容易地利用標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如位點(diǎn)定向誘變和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。
序列同一性兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)氨基酸之間的相似性用術(shù)語序列間的相似性，或者稱為序列同一性表示。序列同一性通常以等同百分比(或相似百分比或同源百分比)度量；百分?jǐn)?shù)越高，兩個(gè)序列越相似。
氨基酸序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算可以考慮保守氨基酸取代。保守氨基酸取代涉及將一種氨基酸殘基用另一種具有類似化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的殘基取代。這種取代通常不改變蛋白質(zhì)的功能特征，因此可以考慮通過賦予一個(gè)在等同(即，在該氨基酸位置無改變)和非保守殘基變化值之間的值計(jì)算序列同一性。因此，保守氨基酸改變認(rèn)為是部分的而不是全部的錯(cuò)配，從而增加了百分序列同一性。例如，如果相同氨基酸打分為1，非保守取代打分為0，則保守取代應(yīng)該打分為0.5。保守取代的打分按照，例如，Meyers和Miller(1988)的運(yùn)算法則計(jì)算，例如，在PC/GENE程序中(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)執(zhí)行。
用于比較的序列排比方法是本領(lǐng)域公知的。以下出版物描述了各種程序和排序運(yùn)算法則Smith和Waterman(1981)；Needleman和Wunsch(1970)；Pearson和Lipman(1988)；Higgins和Sharp 1988)；Higgins和Sharp(1989)；Corpet等(1988)；Huang等(1992)；和Pearson等(1994)。Altschul等(1994)記載了序列排比方法和同源性計(jì)算的全面周到的考慮。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等，1990)可由以下幾個(gè)來源獲得，包括國家生物信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和Internet，并結(jié)合序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx一起使用?？梢园凑眨糷ttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST＞網(wǎng)址登錄。如何利用這些程序來確定序列同一性的描述可在＜http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html＞上獲得。
已公開的SBP2蛋白類似物的特征在于擁有覆蓋大豆SBP2氨基酸序列的已公開的氨基酸序列全長序列至少80％的序列同一性，其中應(yīng)用NCBI Blast 2.0，設(shè)置blastp為默認(rèn)指標(biāo)。這種同源多肽優(yōu)選擁有至少85％、更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的序列同一性，這些值均通過上述方法確定。如果比較序列同一性時(shí)使用不完整序列，以10-20個(gè)氨基酸序列的短窗(short windows)計(jì)，類似物應(yīng)當(dāng)擁有至少90％、優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少98％的序列同一性。經(jīng)這種短窗確定序列同一性的方法在＜http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_FAQs.html＞有描述。具有上述序列同一性的類似物也擁有在所述酵母分析系統(tǒng)中介導(dǎo)蔗糖攝取的能力。本發(fā)明不僅提供上述多肽類似物，還提供編碼這種類似物的核酸分子。
大豆SBP2基因的類似物具有相似的特征，即擁有與已公開的甘氨SBP2基因序列全長序列有至少70％的序列同一性，該分析使用NCBI Blast 2.0，設(shè)置blastn為默認(rèn)值。這種同源核酸優(yōu)選擁有至少75％的的序列同一性，更優(yōu)選至少80％的等同性，最優(yōu)選至少90％或95％的序列同一性，這些值均通過上述方法確定。如果比較序列同一性時(shí)使用不完整序列，以30個(gè)核苷酸框計(jì)，類似物應(yīng)當(dāng)擁有至少85％，優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的序列同一性。具有上述序列同一性的類似物在某些實(shí)施方案中，在所述酵母分析系統(tǒng)中也編碼具有介導(dǎo)蔗糖攝取能力的多肽。然而，如果上面定義的類似物不編碼功能多肽，它們也用于改變轉(zhuǎn)基因植物中的蔗糖攝取活性(例如，用于構(gòu)建反義鏈)。
兩個(gè)核酸分子基本上同源的另一種表示方法是，當(dāng)一個(gè)分子用作雜交探針，另一個(gè)存在于生物樣品中，例如細(xì)胞的基因組材料中時(shí)，這兩個(gè)分子可以在嚴(yán)謹(jǐn)條件下彼此雜交。特異性雜交意味著兩個(gè)分子基本上僅彼此雜交，而不與基因組材料中可能存在的其它分子雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，其在不同環(huán)境因素下表現(xiàn)不同。嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為在一定離子強(qiáng)度和pH下，比特異序列熱熔點(diǎn)(Tm)低5℃-20℃的溫度。Tm是50％的目標(biāo)序列與最佳匹配探針雜交的溫度(在一定離子強(qiáng)度和pH下)。核酸雜交的條件和嚴(yán)謹(jǐn)度計(jì)算方法可以在Sambrook等(1989)和Tijssen(1993)中找到。雜交條件和嚴(yán)謹(jǐn)度將在下面進(jìn)一步討論。
然而由于遺傳密碼子的間并性，不表現(xiàn)高度等同性的核酸序列同樣可以編碼類似的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解利用這種間并性可以進(jìn)行核酸序列的改變，從而制備基本上都編碼同樣蛋白質(zhì)的多種核酸序列。
探針和引物基于本發(fā)明提供的核酸，可以很容易地制備核酸探針和引物。探針包括分離出的核酸，其與可檢測標(biāo)記物或報(bào)告分子相連。典型的標(biāo)記物包括放射性同位素、配基、化學(xué)發(fā)光試劑、以及酶。標(biāo)記方法和適合各種目的的標(biāo)記物的選擇指導(dǎo)在Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987)中有探討。
引物是短核酸，優(yōu)選長度為15個(gè)核苷酸或更多一點(diǎn)的DNA寡核苷酸。通過核酸雜交形成引物和目標(biāo)DNA鏈的雜合體，可以將引物退火形成互補(bǔ)的目標(biāo)DNA鏈，然后通過DNA聚合酶延伸目標(biāo)DNA鏈。引物對可以用于擴(kuò)增核酸序列，例如，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，或者本領(lǐng)域已知的其它核酸擴(kuò)增方法。
制備和使用探針和引物的方法在，例如Sambrook等(1989)，Ausubel等(1987)和Innis等(1990)中有述。PCR引物對可以來源于已知序列，例如，使用為該目的設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序例如Primer(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，特別探針或引物的特異性隨其長度的增加而增加。因此，例如，含SBP1或SBP2基因5’調(diào)節(jié)區(qū)20個(gè)連續(xù)核苷酸的引物與目標(biāo)序列(例如，來自Faba bean相應(yīng)的SBP調(diào)節(jié)區(qū))的退火比僅有15個(gè)核苷酸的相應(yīng)引物具有更高的特異性。因此，為了獲得較高的特異性，可以選擇含本文公開的核酸序列的20、25、30、35、40、50或更多連續(xù)核苷酸的探針和引物。
轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞是通過分子生物學(xué)技術(shù)將核酸分子導(dǎo)入其中的細(xì)胞。就象本文中用到的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞的所有技術(shù)，包括農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、病毒轉(zhuǎn)染、以及裸DNA通過電穿孔、脂轉(zhuǎn)染和加速粒子槍的導(dǎo)入。
載體是被導(dǎo)入宿主細(xì)胞的核酸分子，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。載體可以包括允許它在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點(diǎn)。載體還可以包括一種或多種可選擇標(biāo)識基因和其它本領(lǐng)域已知的遺傳單元。
分離的一種“分離的”生物成分(例如核酸或蛋白質(zhì))是已經(jīng)從有機(jī)體的細(xì)胞中與其它天然存在的生物成分(即其它染色體和染色體外的DNA和RNA，以及蛋白質(zhì))中基本上分離或純化出來的成分。因此已經(jīng)“分離的”核酸和蛋白質(zhì)包括用標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸。
純化的術(shù)語“純化的”不需要絕對地純凈；實(shí)際上，它傾向于表示一個(gè)相對概念。因此，例如，一種純化的SBP制品是比蛋白質(zhì)在細(xì)胞的自然環(huán)境中更富含SBP的制品。SBP制品優(yōu)選被純化到SBP占該制品總蛋白質(zhì)含量的至少50％。
有效地連接當(dāng)?shù)谝环N核酸序列被置于與第二種核酸序列具有功能關(guān)系的位置時(shí)，稱為第一種核酸序列與第二種核酸序列有效地連接。例如，如果一種啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則可將啟動子有效地連接于編碼序列。通常，有效連接的DNA序列非?？拷渲斜仨殞蓚€(gè)蛋白編碼區(qū)連接在一個(gè)讀碼框中。
重組重組核酸具有非自然發(fā)生序列，或具有將兩個(gè)分開的序列部分進(jìn)行人工組合得到的序列。上述人工組合通常通過化學(xué)合成或更普遍地通過對分離的核酸片段進(jìn)行人工操作，例如通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
直向同源如果兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列具有共同的祖先序列，當(dāng)帶有祖先序列的種分成兩個(gè)種時(shí)這兩個(gè)序列分開，那么這兩個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列是直向同源序列。直向同源序列也是同源序列。
轉(zhuǎn)基因植物就象本文用到的，該術(shù)語指植物中含有在該類型的植物中通常不會存在的重組遺傳材料，而且該種遺傳材料通過人類操作被導(dǎo)入所討論的植物(或者導(dǎo)入該植物的親本)。因此，從通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入重組DNA的植物細(xì)胞生長成的植物是轉(zhuǎn)基因植物，含有被導(dǎo)入DNA的植物的所有子代(無論有性生殖還是無性生殖)也都是轉(zhuǎn)基因植物?？梢詮娜魏慰赊D(zhuǎn)化植物種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括(但不限于)大豆、水稻、小麥、大麥和玉米。
III.SBP2 cDNA和其編碼的SBP2多肽SBP2 cDNA的核酸序列如Seq.I.D.No.5所示，SBP2蛋白質(zhì)的氨基酸序列如Seq.I.D.No.3所示。SBP1和SBP2氨基酸序列的比較如
圖1所示。
i.SBP1和SBP2基因在大豆葉和子葉中的不同表達(dá)離體合成32P-標(biāo)記的SBP1和SBP2 5’-側(cè)翼區(qū)的有義和反義RNA，5.3×105cpm的SBP1有義RNA探針、SBP1反義RNA探針、SBP2有義RNA探針或SBP2反義RNA探針與5μg來自大豆葉和子葉的poly(A+)mRNA雜交。觀察到SBP1和SBP2的轉(zhuǎn)錄物在大豆子葉中有相似水平的累積。相比較而言，4周齡的大豆葉中沒有檢測到SBP1和SBP2的轉(zhuǎn)錄物。
ii.大豆SBP1和SBP2基因的不同表達(dá)用RNase保護(hù)法檢查大豆種子中SBP1和SBP2基因的表達(dá)模式。種子子葉的發(fā)育描述為5個(gè)狀態(tài)(狀態(tài)1＝或＜4mm，狀態(tài)2＝5-6mm，狀態(tài)3＝7mm，狀態(tài)4＝9mm，狀態(tài)5＝11-12mm)。子葉形成過程中，SBP1反義探針保護(hù)三個(gè)主要片段(119，111，和97個(gè)核苷酸)，表明其中用到3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。SBP1mRNA水平在第3狀態(tài)達(dá)到峰值，這種表達(dá)水平一直持續(xù)到第5狀態(tài)。相比較而言，當(dāng)使用SBP2反義探針時(shí)檢測到5種被保護(hù)的片段，SBP2mRNA的水平連續(xù)增長直到種子達(dá)到11-12mm。定量數(shù)據(jù)表明SBP1mRNA的水平比SBP2mRNA的水平高出3倍多。葉尖mRNA的水平非常低。然而，延長照射后，在3mm葉尖中觀察到低水平的SBP1mRNA。這些數(shù)據(jù)表明種子形成過程中SBP1mRNA和SBP2mRNA的轉(zhuǎn)錄均很活躍，但轉(zhuǎn)錄狀況不同。
IV.SBP1和SBP2的5’調(diào)節(jié)區(qū)假定SBP1和SBP2的表達(dá)為組織特異性表達(dá)，則承擔(dān)這種表達(dá)的基因的調(diào)節(jié)區(qū)值得關(guān)注，它們可以用于在相似組織特異性模式中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
SBP1和SBP2的5’調(diào)節(jié)區(qū)分別如Seq.I.D.No.6和7所示。
V.具有增強(qiáng)的蔗糖攝取活性的經(jīng)修飾的SBPOvervoorede等(1996)描述的酵母分析系統(tǒng)用于確定修飾SBP蛋白質(zhì)的氨基酸序列的效能。該分析中使用酵母菌株susy7(Riesmeier等，1992)的衍生物，該衍生物具有穩(wěn)定整合到其基因組中的菠菜蔗糖合成酶的cDNA，該酶介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蔗糖的水解。然而，這種酵母菌株缺乏運(yùn)輸蔗糖的能力，因此不能夠在蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(Riesmeier等，1992)。為了產(chǎn)生能夠選擇被蔗糖結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化的酵母的宿主菌株，通過讓susy7菌株在含5’-氟-4-羧基尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，選擇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型susy7菌株(Overvoorede等，1996)。得到的菌株，susy7/ura3不能夠在缺乏尿嘧啶且只含蔗糖作為單一碳源的培養(yǎng)基上生長。
如Overvoorede等(1996)的描述在酵母載體pMK195中構(gòu)建由酵母乙醇脫氫酶1(ADH1)啟動子、SBP開放讀碼框和ADH1多聚腺苷化信號序列組成的嵌合基因，以制備命名為pYESBP的質(zhì)粒。利用基本上如Gietz等(1992)描述的基于LiOAc的小規(guī)模方法，用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化susy7/ura3酵母菌株。然后將轉(zhuǎn)化的酵母在含2％葡萄糖(CM[GLU])或2％蔗糖(CM[SUC])的排除尿嘧啶的選擇培養(yǎng)基上鋪板(Ausubel等，1994)。
通過下述操作分析蔗糖的攝取讓轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞生長到在YPD中OD600為0.5-1.3，離心收獲細(xì)胞，用25mM Mes-KOH，pH5.5，0.5-2.5μCi14C蔗糖溶液漂洗細(xì)胞兩次，并以終濃度未標(biāo)記蔗糖漂洗兩次。在特定時(shí)間點(diǎn)收集等分量的攝取溶液和細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到5ml冰水中以停止攝取。用玻璃纖維濾器過濾收集細(xì)胞，用5ml冰冷水沖洗5次。通過液體閃爍計(jì)數(shù)確定細(xì)胞吸收的放射性。所有攝取分析均在1mM蔗糖終濃度中進(jìn)行。
構(gòu)建編碼修飾形式的SBP1蛋白質(zhì)的核酸序列，并將其導(dǎo)入上述pYESBP構(gòu)建體。圖2顯示由pMK195載體單獨(dú)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞得到的蔗糖攝取速率(實(shí)心圓)，用表達(dá)全長SBP1蛋白質(zhì)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞得到的蔗糖攝取速率(實(shí)心方框)，以及用表達(dá)失去C-末端80個(gè)氨基酸的截短SBP1蛋白質(zhì)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞得到的蔗糖攝取速率(實(shí)心三角)。這種截短的SBP1蛋白質(zhì)的氨基酸序列如Seq.I.D.No.2所示。截短的蛋白質(zhì)包括全長SBP1的第1-444殘基。
這種出乎意料的結(jié)果表明增強(qiáng)植物中的蔗糖攝取能力可以通過將編碼經(jīng)修飾的SBP的轉(zhuǎn)基因?qū)胫参铽@得。經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的蔗糖攝取活性的SBP包括C-末端刪除的SBP1和SBP2形式。這種刪除包括從C-末端除去約80個(gè)氨基酸，但也可以應(yīng)用多于或少于80個(gè)氨基酸的刪除。任何具有特別刪除的蔗糖攝取活性可以容易地利用上述酵母蔗糖攝取分析系統(tǒng)確定。因此，以舉例說明的方式，C-末端刪除10-100個(gè)氨基酸的SBP蛋白質(zhì)可以作為具有增強(qiáng)的蔗糖攝取活性蛋白質(zhì)的侯選，并且可以利用該系統(tǒng)分析。實(shí)施例下列實(shí)施例作為本發(fā)明各種具體實(shí)施方式
的說明。實(shí)施例1制備SBP核酸的優(yōu)選方法本發(fā)明提供SBP2 cDNA序列和SBP2蛋白質(zhì)的氨基酸序列、經(jīng)修飾的具有增強(qiáng)的蔗糖攝取活性的SBP蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以及SBP1和SBP2基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)。目前在制備編碼本發(fā)明所述的各種SBP蛋白質(zhì)的核酸序列以及SBP基因5’調(diào)節(jié)區(qū)的優(yōu)選方法中可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。編碼本發(fā)明SBP蛋白質(zhì)的cDNA的PCR擴(kuò)增可以通過對植物cDNA文庫進(jìn)行直接PCR實(shí)現(xiàn)，或者利用從植物細(xì)胞中提取出來的RNA作為模版進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)實(shí)現(xiàn)。SBP基因序列和5’調(diào)節(jié)區(qū)的擴(kuò)增可以通過對植物基因組DNA或者對植物基因組文庫進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)。直接PCR和RTPCR的方法和條件是本領(lǐng)域已知的，Innis等(1990)對此有描述。
按照將被擴(kuò)增的cDNA或基因部分選擇PCR引物?？梢赃x擇引物來擴(kuò)增cDNA、開放讀碼框、完整cDNA分子或完整基因序列中的小片段。為適應(yīng)不同長度的引物，需要調(diào)整擴(kuò)增條件；這種考慮是本領(lǐng)域的公知常識，并在Innis等(1990)、Sambrook等(1989)、和Ausubel等(1992)中有探討。僅作為舉例說明的方式，Seq.I.D.No.5所示的完整SBP2 cDNA分子可以利用下列組合引物擴(kuò)增引物15’TGTAAAACGACGGCCAGTGAATT 3’(Seq.I.D.No.8)引物25’GATTACGCCAAGCTCGAAATTAA 3’(Seq.I.D.No.9)SBP2 cDNA的開放讀碼框部分可以用下列引物對擴(kuò)增引物35’ATGGCGACCAGAGCCAAGCTTTCTTTA 3’(Seq.I.D.No.10)引物45’CGCAACAGCGCGACGACCACGCTCGCT 3’(Seq.I.D.No.11)編碼截短的SBP2蛋白質(zhì)(從C-末端除去80個(gè)氨基酸)的cDNA可以用下列引物對擴(kuò)增引物35’ATGGCGACCAGAGCCAAGCTTTCTTTA 3’(Seq.I.D.No.10)引物55’GAAGGGATGACCAGGAGGGACAACAAA 3’(Seq.I.D.No.12)SBP2的5’調(diào)節(jié)序列可以用下列引物對擴(kuò)增引物65’TTGTAAACGACGGCCAGTGAATT 3’(Seq.I.D.No.13)引物75’GGTGAGGTCAGTGAGGAACAACA 3’(Seq.I.D.No.14)這些引物僅作為說明；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解從已經(jīng)提供的核酸序列中可以得到很多不同的引物，從而擴(kuò)增這些分子的特別區(qū)域。推薦對這些擴(kuò)增程序得出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重新測序；它將有利于確定擴(kuò)增序列，并將提供不同生態(tài)型和植物種群中該序列天然變異的信息。
來源于SBP2 cDNA或SBP1和SBP2 5’調(diào)節(jié)區(qū)的寡核苷酸包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種寡核苷酸引物優(yōu)選包括來自SBP2 cDNA或基因序列的至少15-20個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。為了增強(qiáng)擴(kuò)增特異性，可以使用含有這些序列的至少25、30、35、40、45或50個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸引物。
另外，可以利用來源于已公開的cDNA序列的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得SBP2基因序列，以便作為探針對基因組文庫或基因組DNA進(jìn)行篩選，或者通過利用來源于SBP2 cDNA序列的標(biāo)記探針對基因組DNA文庫進(jìn)行篩選。這些研究中可以使用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或雜交方法。實(shí)施例2從其它植物品種分離同源基因序列本文除提供大豆SBP2 cDNA、SBP5’調(diào)節(jié)區(qū)，以及對SBP蛋白質(zhì)、尤其是C-末端截短的SBP蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾導(dǎo)致蔗糖攝取活性增強(qiáng)這一發(fā)現(xiàn)外，本發(fā)明還能夠從其他植物品種得到相應(yīng)分子。因此，本發(fā)明可以從其他植物品種分離SBP2類似物，以及從其他植物品種生產(chǎn)效能增強(qiáng)的SBP蛋白質(zhì)。可以使用常規(guī)雜交和PCR擴(kuò)增方法從其他品種獲得相應(yīng)的cDNA，以及制備編碼活性增強(qiáng)的SBP蛋白質(zhì)的核酸。這兩種技術(shù)的共同之處在于來源于SBP2 cDNA或基因序列的探針或引物與目標(biāo)核苷酸的雜交，在常規(guī)雜交研究中，它們可以是cDNA或基因組文庫；在PCR擴(kuò)增情況下，它們可以是cDNA或基因組文庫或者是mRNA制品。
可以對從需要的植物品種制備的cDNA或基因組文庫進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增，或者利用植物細(xì)胞的mRNA提取物采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行RT-PCR。PCR引物包括SBP2 cDNA的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解大豆SBP2 cDNA和將被擴(kuò)增的目標(biāo)核酸之間的序列差異可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低。為了彌補(bǔ)這一缺陷，在擴(kuò)增循環(huán)中將使用較長的PCR引物或較低的退火溫度。應(yīng)用較低的退火溫度時(shí)，在后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)中需應(yīng)用嵌套引物對來增強(qiáng)特異型。
對于常規(guī)雜交，雜交探針優(yōu)選與可檢測標(biāo)記例如放射性標(biāo)記結(jié)合，并且探針優(yōu)選長度至少為20個(gè)核苷酸。如同本領(lǐng)域已知的，增加雜交探針的長度有助于增強(qiáng)特異性。來源于大豆SBP2 cDNA或基因序列的標(biāo)記探針可以與植物cDNA或基因組文庫進(jìn)行雜交，應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法檢測雜交信號。然后純化雜交克隆或噬菌斑(依賴于使用的文庫的種類)，從克隆或噬菌斑中分離和鑒別其中含有的克隆序列。
或者可以通過免疫篩選表達(dá)文庫來獲得大豆SBP2 cDNA的類似物。按照本文公開的SBP2核酸序列，可以在異源表達(dá)系統(tǒng)(例如，E.coli)中表達(dá)和純化該酶，用于生產(chǎn)對SBP2蛋白質(zhì)特異的抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)。也可以生產(chǎn)抗來源于本文提供的SBP2氨基酸序列的合成多肽的抗體。生產(chǎn)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，Harlow和Lane(1988)曾有描述。然后可以用這種抗體利用上述方法篩選表達(dá)cDNA文庫，該cDNA文庫是由需要從其中克隆SBP2定向進(jìn)化同源物的植物制備的。選擇出來的cDNA可以通過測序和酶活性進(jìn)行確定。
大豆SBP2基因或cDNA、以及其他植物來源的上述序列類似物，可以整合到轉(zhuǎn)化載體中，并導(dǎo)入植物，用以改變這種植物中的SBP活性，如下述實(shí)施例3中所描述。另外，如本文的指教，編碼經(jīng)修飾的SBP蛋白質(zhì)的核酸也可以用于生產(chǎn)蔗糖攝取活性改變的植物?？梢灶A(yù)料，SBP基因自身啟動子特別適用于本發(fā)明的實(shí)踐，因它可以用于驅(qū)動SBP轉(zhuǎn)基因例如反義構(gòu)建物的表達(dá)。通過利用SBP基因自身啟動子，并協(xié)同自身SBP基因(例如，在同樣的時(shí)序或組織特異性表達(dá)模式中)可以調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。實(shí)施例3蔗糖攝取活性改變了的轉(zhuǎn)基因植物一旦分離出編碼涉及決定特定的植物特征的蛋白質(zhì)的基因后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)cDNA，以便改變上述特定的植物特征?；狙芯渴菍DNA克隆到轉(zhuǎn)化載體中，使它有效地與調(diào)控序列(例如，啟動子)連接，從而使cDNA在植物細(xì)胞中表達(dá)。然后從多種方法中選擇一種(例如，電穿孔)，用于將轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，然后篩選含有被導(dǎo)入cDNA的子代植物。優(yōu)選所有或部分轉(zhuǎn)化載體穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞的基因組中。整合到植物細(xì)胞并含有被導(dǎo)入的cDNA和控制表達(dá)的相關(guān)序列(導(dǎo)入的“轉(zhuǎn)基因”)的轉(zhuǎn)化載體部分，可以稱作重組表達(dá)盒序列。
可以通過檢測表現(xiàn)型的改變篩選含有被導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的子代植物。這種表現(xiàn)型可以直接來源于克隆到轉(zhuǎn)化載體中的cDNA，或者可以通過將可選擇標(biāo)識基因整合到轉(zhuǎn)化載體中導(dǎo)致對某種化學(xué)試劑的抗性增強(qiáng)，從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的導(dǎo)入。
調(diào)控序列(a)的選擇和cDNA(或者篩選出的部分cDNA)在轉(zhuǎn)化載體中相對于調(diào)控序列如何排列(b)的選擇，將在一定程度上決定由導(dǎo)入cDNA影響的植物特征如何改變。例如，調(diào)控序列可以是組織特異性的，從而cDNA只能在植物的特殊組織(例如，花粉、種子)中表達(dá)，因此由導(dǎo)入cDNA影響的特征僅在這些組織中有所改變?？梢允筩DNA轉(zhuǎn)錄物得以正常表達(dá)的方式相對于調(diào)控序列安排cDNA序列，或者將cDNA序列安排在反義方向上?？寺DNA對應(yīng)的反義RNA的表達(dá)將導(dǎo)致目標(biāo)基因產(chǎn)物的減少(目標(biāo)基因產(chǎn)物是由提供被導(dǎo)入cDNA的植物基因編碼的蛋白質(zhì))。被導(dǎo)入cDNA的過表達(dá)(是由載體中相對于調(diào)控序列正義方向上的cDNA產(chǎn)生的)可能導(dǎo)致基因產(chǎn)物水平的增加，或者導(dǎo)致該基因產(chǎn)物的共抑制(也稱為“有義抑制”)。
由克隆cDNA序列轉(zhuǎn)化導(dǎo)致植物特征改變的成功例子在技術(shù)和科學(xué)文獻(xiàn)中非常多。選擇用于說明本技術(shù)領(lǐng)域目前知識水平，通過參考引入本文的例子包括U.S.專利No.5451514，Boudet(利用反義RNA和共抑制改變木質(zhì)素的合成)；U.S.專利No.5443974，Hitz(利用反義RNA和共抑制改變飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的水平)；U.S.專利No.5530192，Murase(利用反義RNA改變氨基酸和脂肪酸組成)；U.S.專利No.5455167，Voelker(改變中鏈脂肪酸)；U.S.專利No.5231020，Jorgensen(利用共抑制改變類黃酮)；U.S.專利No.5583021，Dougherty(通過正義不可翻譯RNA的表達(dá)改變病毒抗性)；WO96/13582(利用過表達(dá)、共抑制和反義RNA并協(xié)同ArabidopsisFAE1基因改變種子VLCFA的組成)；WO95/15387(利用西蒙得木臘合成基因的過表達(dá)改變種子VLCFA的組成)。
這些例子包括以下描述轉(zhuǎn)化載體的選擇、轉(zhuǎn)化方法和設(shè)計(jì)用于過表達(dá)被導(dǎo)入cDNA或用于表達(dá)cDNA對應(yīng)的反義RNA的構(gòu)建體的構(gòu)建。根據(jù)以前描述的和本文提供的SBP2基因和關(guān)于編碼具有增強(qiáng)的蔗糖攝取活性的改變SBP蛋白的核酸的指示，因此以下是顯而易見的，即本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)⑦@些核酸或這些分子的同源物或衍生形式(例如，反義形式)導(dǎo)入植物，從而生產(chǎn)在種子或其他組織形成過程中蔗糖攝取活性改變的植物。該結(jié)果可以改變具有農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)重要性的植物。
a.植物種類按照本發(fā)明的核酸分子(例如，SBP2基因、編碼經(jīng)修飾的SBP蛋白質(zhì)的核酸、這些序列的同源物和例如反義形式的衍生物)可以導(dǎo)入任何植物類型，從而改變該植物的蔗糖攝取活性。因此，本發(fā)明的序列可以用于改變?nèi)魏胃叩戎参镏械恼崽菙z取活性，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括(但不限于)玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、大多數(shù)豆類、蕓苔/canola、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、蔓菁、棉花、亞麻、花生、三葉草；蔬菜例如萵苣、番茄、葫蘆、土豆、胡羅卜、小羅卜、豌豆、兵豆、卷心菜、花椰菜、brussel sprouts、辣椒；樹木果實(shí)例如蘋果、梨、桃、杏；花例如康乃馨和玫瑰。
b.載體的構(gòu)建、啟動子的選擇很多適于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或者適于建立轉(zhuǎn)基因植物的重組載體已有描述，包括Pouwels等(1987)；Weissbach和Weissbach(1989)；和Gelvin等(1990)中描述的。典型地，植物轉(zhuǎn)化載體包括，在5’和3’調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的一種或多種克隆植物基因(或cDNA)和顯性可選擇標(biāo)識基因。這種植物轉(zhuǎn)化載體典型地還含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，調(diào)控誘導(dǎo)或組成型的表達(dá)、環(huán)境調(diào)節(jié)或發(fā)育調(diào)節(jié)型的表達(dá)、或者細(xì)胞特異性或組織特異性表達(dá)的調(diào)控區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、和/或多聚腺苷化信號。
可以用于表達(dá)核酸的組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，其在大多數(shù)植物組織中能夠啟動組成型的、高水平表達(dá)(參見例如，Odel等1985；Dekeyser等1990；Terada和Shimamoto，1990；Benfey和Chua.1990)；胭脂堿合成酶啟動子(An等1988)；以及章魚堿合成酶啟動子(Fromm等，1989)。
各種各樣受調(diào)節(jié)的以對環(huán)境、激素、化學(xué)物質(zhì)、和/或發(fā)育信號進(jìn)行應(yīng)答的植物基因啟動子也可以用于在植物細(xì)胞中表達(dá)cDNA，包括受以下信號調(diào)節(jié)的啟動子(a)熱(Callis等，1988；Ainley，等1993；Gilmartin等1992)；(b)光(例如，豌豆rbcS-3A啟動子，Kuhlemeier等，1993；玉米rbcS啟動子，Schaffner和Sheen，1991)；(c)激素，例如脫落酸(Marcotte等，1989)；(d)受傷(例如wunI，Siebertz等，1989)；以及(e)化學(xué)物質(zhì)例如甲基茉莉醇酯或水楊酸(也參見Gatz等，1997)，它們也能夠用于調(diào)控基因表達(dá)。
或者，可以將組織(例如根、葉、花和種子)特異性啟動子(Carpenter等，1992；Denis等，1993；Opperman等，1993；Stockhause等，1997；Roshal等，1987；Schernthaner等，1988；和Bustos等，1989)融合到編碼序列中，以便獲得在各種器官中的特殊表達(dá)。另外，可以利用例如在衰老過程中(Gan和Amasino，1995)或種子形成后期(Odell等，1994)起作用的啟動子來調(diào)控表達(dá)時(shí)間。
本文公開的SBP1和SBP2基因的啟動子區(qū)賦予大豆在形成種子時(shí)的特異性表達(dá)。因此，這些啟動子可以用于使導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因在正在形成種子中獲得特異性表達(dá)。
植物轉(zhuǎn)化載體還可以包括RNA加工信號，例如，可以定位于轉(zhuǎn)基因中ORF的上游或下游的內(nèi)含子。另外，表達(dá)載體還包括來源于植物基因3’-非翻譯區(qū)例如3’終止子區(qū)的附加調(diào)控序列，以便增加mRNA的穩(wěn)定性，例如土豆mRNA的PI-II終止子區(qū)或章魚堿或胭脂堿合成酶mRNA的3’終止子區(qū)。
最后，如上文的記載，植物轉(zhuǎn)化載體還可以包括顯性可選擇標(biāo)記基因，其使得轉(zhuǎn)化體易于篩選。這類基因包括編碼抗生素抗性的基因(例如，對潮霉素、卡那霉素、博萊霉素、G418、鏈霉素或壯觀霉素抗性)以及除草劑抗性基因(例如，phosphinothricin乙酰基轉(zhuǎn)移酶)。
c.SBP序列在載體中的分布將按照所希望的所述序列的表達(dá)類型來選擇SBP序列在轉(zhuǎn)化載體中的特定排布。
如果需要增強(qiáng)植物的蔗糖攝取活性，SBP ORF可以有效地連接到組成型高水平啟動子例如CaMV 35S啟動子上。也可以通過將含有SBP2基因變異形式的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入植物實(shí)現(xiàn)蔗糖攝取活性的改變，所述SBP2基因的變異形式可以是，例如從SBP2 ORF的準(zhǔn)確核苷酸序列變化得到的形式，但其編碼的蛋白質(zhì)保留了SBP2蛋白質(zhì)的功能特征，即賦予蔗糖攝取活性。以舉例的方式說明，還可以利用編碼上述經(jīng)修飾的SBP的核酸序列得到增強(qiáng)的蔗糖攝取活性。這種經(jīng)修飾的SBP包括C-末端刪除的SBP，通常刪除10-100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選約80個(gè)氨基酸殘基。
相反，可以通過將SBP基因序列的反義構(gòu)建體導(dǎo)入植物實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中蔗糖攝取活性的降低。對于反義抑制，在轉(zhuǎn)化載體中SBP基因定位于相對于啟動子序列的反方向上。這種被導(dǎo)入的序列不必為全長SBP基因，不必完全同源于即將被轉(zhuǎn)化植物類型中存在的SBP基因。然而通常導(dǎo)入序列的長度越短，產(chǎn)生有效反義抑制越需要被導(dǎo)入序列與自身SBP序列同源性程度越高。載體中導(dǎo)入的反義序列長度優(yōu)選至少為30個(gè)核苷酸，同時(shí)普遍觀察到隨著反義序列長度增加，反義抑制作用越強(qiáng)。載體中反義序列的長度優(yōu)選超過100個(gè)核苷酸。所述反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致RNA分子的產(chǎn)生，該RNA分子與植物細(xì)胞SBP基因轉(zhuǎn)錄得到的mRNA分子反向互補(bǔ)。雖然反義RNA分子干擾基因表達(dá)的準(zhǔn)確機(jī)制還未曾闡述，然而可以相信反義RNA分子與mRNA分子結(jié)合，從而抑制內(nèi)源mRNA的翻譯。
還可以利用核酶實(shí)現(xiàn)SBP基因表達(dá)的抑制。核酶是合成的RNA分子，其具有高度特異性核糖核酸內(nèi)切酶活性。核酶的制備和應(yīng)用公開在授權(quán)給Cech的美國專利No.4987071和授權(quán)給Haselhoff的美國專利No.5543508中。核酶序列在反義RNA中的包含可以用于使反義RNA具有RNA裂解活性，使得與反義RNA結(jié)合的內(nèi)源mRNA分子裂解，從而導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)的反義抑制增強(qiáng)。
SBP核酸(或其變異體)過表達(dá)的構(gòu)建體也可以用于實(shí)現(xiàn)內(nèi)源SBP基因的共抑制，作用方式如授權(quán)給Jorgensen的美國專利No.5231021中所述。這種共抑制(也稱為有義抑制)不需要將SBP基因?qū)胫参锛?xì)胞，也不需要被導(dǎo)入序列與內(nèi)源性SBP基因完全等同。然而，與反義抑制同樣，有義抑制效能將隨著以下兩個(gè)因素增強(qiáng)(1)導(dǎo)入序列加長；和(2)導(dǎo)入序列和內(nèi)源SBP基因序列間的序列相似性增加。
表達(dá)SBP mRNA的不可翻譯形式的構(gòu)建體也可以用于抑制內(nèi)源性SBP活性的表達(dá)。制備這種構(gòu)建體的方法如授權(quán)給Dougherty等的美國專利No.5583021所述。優(yōu)選將未成熟終止密碼子導(dǎo)入SBP ORF來制備這種構(gòu)建體。
最后，公開序列的顯性陰性突變體形式可以用于阻斷內(nèi)源性SBP的活性。這種突變體需要制備與蔗糖結(jié)合但不催化蔗糖攝取的SBP蛋白質(zhì)的突變形式。
d.轉(zhuǎn)化和再生方法目前單子葉和雙子葉植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和再生都是常規(guī)技術(shù)，選擇最合適的轉(zhuǎn)化方法將由操作者決定。方法的選擇將隨著將被轉(zhuǎn)化的植物類型而改變；本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠認(rèn)識到用于給定植物類型的特定方法的合適程度。合適的方法可以包括，但不限于植物原生質(zhì)體的電穿孔；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；利用病毒的轉(zhuǎn)化；植物細(xì)胞的微注射；植物細(xì)胞的微發(fā)射轟擊；真空滲透；以及根瘤農(nóng)桿菌(AT)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化和再生植物的典型程序在這部分開始處列出的專利文獻(xiàn)中有所描述。
c.轉(zhuǎn)化植物的篩選用轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化和再生植物后，優(yōu)選利用整合到轉(zhuǎn)化載體中的顯性可選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化植物。通常，這種標(biāo)記將使轉(zhuǎn)化植物的幼苗產(chǎn)生抗生素抗性，通過將幼苗與適當(dāng)濃度的抗生素接觸實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體的篩選。
當(dāng)篩選出轉(zhuǎn)化植物并使之生長成熟后，可以用已知方法對它們進(jìn)行分析，確定SBP活性是否由于導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因而改變。另外，可以通過分析Northern印跡上mRNA的表達(dá)，檢測內(nèi)源性SBP基因的反義或有義抑制。實(shí)施例4序列變異體的制備如同上面的闡述，植物細(xì)胞中蔗糖攝取活性的改變可以通過用SBP2 cDNA或基因、SBP2 cDNA或基因序列的反義構(gòu)建體、或編碼經(jīng)修飾的SBP蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)化植物實(shí)現(xiàn)。對于本文提供的SBP2cDNA和基因序列以及SBP 5’調(diào)節(jié)區(qū)，利用標(biāo)準(zhǔn)誘變方法制備這些序列的變異體在目前是可能的。
變異DNA分子包括由標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)生產(chǎn)的DNA分子，例如，M13引物誘變。這些技術(shù)的細(xì)節(jié)在Sambrook等(1989)，第15章中有提供。使用這種技術(shù)，可以制備與公開序列有較少差異的變異體。由本文特別公開的那些序列衍生而來的，由于核苷酸缺失、添加或取代導(dǎo)致與已公開序列不同但仍然編碼具有SBP蛋白功能特征(即，在酵母分析系統(tǒng)中介導(dǎo)蔗糖攝取)的蛋白質(zhì)的DNA分子和核苷酸序列通過本發(fā)明可以得到理解。來源于已公開的SBP2 cDNA和基因序列的DNA分子和核苷酸序列包括，能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與已公開DNA序列或其片段雜交的DNA序列。
導(dǎo)致特定程度的嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交條件將依賴于所選擇的雜交方法和使用的雜交DNA的組成和長度而改變。通常，雜交溫度和雜交緩沖液中的離子強(qiáng)度(尤其是Na+濃度)將決定雜交嚴(yán)謹(jǐn)度。得到特定程度的嚴(yán)謹(jǐn)度需要的雜交條件的計(jì)算由Sambrook等(1989)，在第9和11章中討論，本文將其作為參考引入。僅僅作為舉例說明的方式，可以通過下述方法進(jìn)行雜交試驗(yàn)將DNA分子(例如，大豆SBP2 cDNA序列)和目標(biāo)DNA分子(例如，番茄中相應(yīng)的SBP2 cDNA序列)雜交，該目標(biāo)DNA分子已經(jīng)進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳，并通過Southern印跡(Southern，1975)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素薄膜上，該技術(shù)是本領(lǐng)域已知技術(shù)，并在Sombrook等(1989)中有描述。如下述，利用[32P]dCTP標(biāo)記目標(biāo)探針的雜交通常在高離子強(qiáng)度例如6×SSC的溶液中進(jìn)行，溫度為熔點(diǎn)溫度(Tm)以下20-25℃。對于這種在Southern印跡中目標(biāo)DNA分子含10ng DNA或更多的Southern雜交試驗(yàn)，利用12ng/ml放射標(biāo)記探針(其比活性等于或高于109CPM/μg)進(jìn)行雜交，典型進(jìn)行68小時(shí)。雜交后，清洗硝基纖維素濾膜，除去背景雜交。清洗條件應(yīng)當(dāng)盡可能嚴(yán)緊，以便除去背景雜交同時(shí)保留特異雜交信號。術(shù)語Tm代表這樣一種溫度，在該溫度以上，在占優(yōu)勢的離子強(qiáng)度條件下，放射標(biāo)記的探針分子將不與其目標(biāo)DNA分子雜交。這種雜交分子Tm的可以從下列等式中推算(Bolton和McCatthy，1962)Tm＝81.5C 16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)(600/l)其中l(wèi)＝雜交的堿基對的長度。
該等式對于Na+濃度在0.01M到0.4M范圍內(nèi)有效，在更高[Na+]溶液中，計(jì)算Tm的準(zhǔn)確性較低。該等式對于G+C含量在30％-75％范圍內(nèi)的DNA也基本上有效，它應(yīng)用于長度超過100個(gè)核苷酸的雜交體(寡核苷酸探針的行為在Sambrook等，1989，第11章中有詳細(xì)描述)。
因此，以舉例的方式，對于來源于大豆SBP2 cDNA開放讀碼框的前150個(gè)堿基對的150個(gè)堿基對DNA探針(假設(shè)％GC＝45％)，可以如下計(jì)算需要給出特定嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交條件例如，假設(shè)濾膜在0.3×SSC溶液中漂洗，隨后雜交，由此[Na+]＝0.045M；％GC＝45％；甲酰胺濃度＝0；l＝150個(gè)堿基對；Tm＝81.516(log10[Na+])+(0.41×45)(600/150)，因此Tm＝74.4 C。
對于雙鏈DNA，隨著同源性每降低1％，Tm則降低1-1.5℃(Bonner等，1973)。因此，對于這個(gè)假設(shè)的例子，雜交濾膜于59.4-64.4℃之間在0.3×SSC溶液中漂洗，將產(chǎn)生相當(dāng)于90％的雜交嚴(yán)謹(jǐn)度?；蛘撸s交濾膜于65.4-68.4℃的溫度之間，在0.3×SSC溶液中漂洗，將產(chǎn)生94％的雜交嚴(yán)謹(jǐn)度。上述例子是完全以理論說明的方式給出的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解，其它雜交技術(shù)也可以使用，試驗(yàn)條件的改變將需要改變嚴(yán)謹(jǐn)度的計(jì)算。
來源于植物，編碼具有SBP活性，并在嚴(yán)謹(jǐn)度至少為75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、還更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％的雜交條件下與已公開的SBP2序列雜交的DNA序列包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
遺傳密碼的間并性進(jìn)一步拓寬了本發(fā)明的范圍，因?yàn)樗试S在保留被編碼蛋白的氨基酸序列的同時(shí)，使DNA分子的核苷酸序列中存在大量的變異。例如，大豆SBP2蛋白的第二個(gè)氨基酸殘基是丙氨酸。它在大豆SBP2開放讀碼框內(nèi)由核苷酸密碼三聯(lián)體GCG編碼。由于遺傳密碼的間并性，其它三種核苷酸密碼三聯(lián)體-GCA、GCC和GCT也編碼丙氨酸。因此，大豆SBP2 ORF的核苷酸序列在該位置可以為這些三聯(lián)體密碼子的任意一個(gè)，而不影響編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成或者蛋白質(zhì)的特征?；谶z傳密碼的間并性，可以利用上述標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)，或者通過合成DNA序列，從本文公開的cDNA和基因序列衍生出變異DNA分子。因此，本發(fā)明還包括編碼SBP蛋白的核酸序列，但該核酸序列是依據(jù)遺傳密碼的間并性從已公開的核酸序列得到的。
本發(fā)明指出可以通過修飾植物SBP序列，例如刪除C-末端80個(gè)氨基酸，實(shí)現(xiàn)蔗糖攝取活性的增加。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠認(rèn)識到DNA誘變技術(shù)不僅可以用于制備變異DNA分子，還將促進(jìn)這種經(jīng)修飾的SBP蛋白的產(chǎn)生。另外，也可以進(jìn)行氨基酸序列的其它改變，包括缺失、添加和取代。
引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先確定的，而突變本身不需要預(yù)先確定。例如，為了優(yōu)化對給定位點(diǎn)的突變，可以在目標(biāo)密碼子或區(qū)域?qū)嵤╇S機(jī)誘變，然后篩選具有所需活性的優(yōu)化組合的表達(dá)蛋白質(zhì)變異體。如上述在已知序列的DNA的預(yù)定位點(diǎn)進(jìn)行替代突變的技術(shù)是公知的。
氨基酸取代典型為單殘基取代；插入通常為1到10個(gè)氨基酸殘基；刪除的范圍約為1到多于100個(gè)殘基。取代、刪除、插入或它們的任意組合可以混合使用，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。顯然，在編碼蛋白質(zhì)的DNA中進(jìn)行的突變必須不在讀碼框序列內(nèi)，并且最好不產(chǎn)生能夠生產(chǎn)二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。
取代變異體是氨基酸序列中至少一個(gè)殘基被除去，同時(shí)一個(gè)不同的殘基插入該位置的氨基酸序列。如果需要精確調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的特征，通常按照下表1進(jìn)行這種取代。表1顯示蛋白質(zhì)中的原始氨基酸被取代的氨基酸，認(rèn)為它是保守取代。
表1原始?xì)埢? 保守取代AlaSerArgLysAsngln；hisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisasn；glnIleleu；valLeuile；valLysarg；gln；gluMetleu；ilePhemet；leu；tyrSerthrThrserTrptyrTyrtrp；pheValile；leu通過選擇低于表1所列保守性的取代實(shí)現(xiàn)酶功能或其它特征的基本改變，即選擇在維持以下方面具有顯著不同作用的殘基(a)取代區(qū)的多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如，片層構(gòu)型或螺旋構(gòu)型；(b)分子在目標(biāo)位點(diǎn)的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈的空間體積。通常預(yù)期產(chǎn)生最大蛋白質(zhì)性質(zhì)改變的取代將是以下幾種情況的取代(a)親水殘基例如絲氨?；蛱K氨酰被(或由)疏水殘基例如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?；虮滨Ｈ〈?；(b)半胱氨酸或脯氨酸被(或由)任何其它殘基取代；(c)具有正電荷的殘基例如賴氨酰、精氨?；蚪M氨酰被(或由)負(fù)電荷殘基例如谷氨酰或天冬氨酰取代；或(d)具有大空間體積側(cè)鏈的殘基例如苯丙氨酸被(或由)無側(cè)鏈的殘基例如甘氨酸取代。
可以通過分析衍生蛋白質(zhì)在上述酵母分析系統(tǒng)中催化蔗糖攝取的能力，評價(jià)這些氨基酸取代或缺失或添加對SBP蛋白衍生物的作用。實(shí)施例5SBP 5’調(diào)節(jié)區(qū)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的應(yīng)用甘氨酸SBP1和SBP2基因的啟動子賦予種子形成中特異性表達(dá)。因此，Seq.I.D.Nos.7(SBP2)和8(SBP1)所示的啟動子序列可以用于制備在正在形成的種子中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠認(rèn)識到，可以用比Seq.I.D.Nos.7和8所示的完全5’調(diào)節(jié)區(qū)更少的調(diào)節(jié)序列實(shí)現(xiàn)在正在形成的種子中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，例如，種子形成中的特異性表達(dá)可以通過應(yīng)用已公開啟動子序列的50個(gè)堿基對或100個(gè)堿基對實(shí)現(xiàn)。利用已知方法將能夠確定已公開序列的特定小片段是否能夠在特定系統(tǒng)中(考慮構(gòu)建體將被導(dǎo)入其中的植物品種，所需的表達(dá)水平等)操縱有效的種子特異性表達(dá)，例如將小片段啟動子與標(biāo)識基因(例如GUS)有效地連接起來，將這種構(gòu)建體導(dǎo)入植物，然后確定在正在形成的種子和其它植物組織中標(biāo)識基因的表達(dá)水平。
因此本發(fā)明有利于通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備含有有效地與核酸序列例如開放讀碼框連接的SBP1或SBP2啟動子序列的核酸分子。合適的開放讀碼框包括編碼任何期望在正在形成的種子中表達(dá)的蛋白質(zhì)的開放讀碼框。在已公開的SBP啟動子的調(diào)控下，適于以種子特異性方式表達(dá)的基因的例子包括，但不限于(1)增強(qiáng)種子的營養(yǎng)質(zhì)量的基因，例如通過增加包括賴氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸在內(nèi)的限制性氨基酸的含量。這可以通過在種子中表達(dá)含高水平的這類氨基酸的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。這樣的例子包括來自巴西堅(jiān)果(Saalbach等，1996)和向日葵(Molvig等，1997)的高蛋氨酸儲備蛋白。
(2)增加小麥中麥麩的基因，從而提高該種小麥粉制作的面包的質(zhì)量(Shewry等1995)。
(3)增強(qiáng)種子中昆蟲抗性(例如，象鼻蟲抗性)的基因。適當(dāng)?shù)幕虬⑺老蟊窍x卵的α-淀粉酶抑制劑基因(Schmidt，1994)。
參考文獻(xiàn)Ainley等(1993)植物分子生物學(xué)2213-23Altschul和Gish.(1996)酶學(xué)方法266460-80Altschul等(1990)基本定位排列的檢索工具，分子生物學(xué)雜志215403-410Altschul等(1994)自然遺傳(Nature Genet.)，6119-29An等(1988)植物生理88547Ausubel等(1987)當(dāng)前分子生物學(xué)方法，Greene出版學(xué)會和Wiley-IntersciencesAusubel等編，當(dāng)前分子生物學(xué)方法，John Wiley和Sons，New York，1994Benfey和Chua(1990)科學(xué)250959-966Birch等(1997)植物生理和植物分子生物學(xué)年度綜述48297-326Bolton和McCarthy(1962)美國國家科學(xué)院進(jìn)展481390Bonner等(1973)分子生物學(xué)雜志81123Bush(1993)植物生理和植物分子生物學(xué)年度綜述44513-542Bustos等(1989)植物細(xì)胞1839Callis等(1988)植物生理88965Carpenter等(1992)植物細(xì)胞4557-571Corpet等(1988)核酸研究1610881-90Dekeyser等(1990)植物細(xì)胞2591Denis等(1993)植物生理1011295-1304Fromm等(1989)植物細(xì)胞1977Gan和Amansino(1995)科學(xué)2701986-1988Gatz等(1977)植物生理和植物分子生物學(xué)年度綜述4889-108
Gelvin等(1990)植物分子生物學(xué)手冊，Kluwer AcademicPublishers出版Gietz等(1992)核酸研究201425Gilmartin等(1992)植物細(xì)胞4839-949Grimes等(1992)植物細(xì)胞41561-1574Harlow和Lane(1988)抗體，試驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約Higgins和Sharp(1988)基因73237-244Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5151-153Huang等(1992)計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用8155-65Innis等(1990)PCR草案，方法和應(yīng)用指南Innis等(編)，AcademicPress，Inc.，San Diego，CaliforniaKawasaki等(1990)PCR草案，方法和應(yīng)用指南，Innis等(編)，2127，Academic Press，Inc.，San Diego，CaliforniaKuhlemeier等(1989)植物細(xì)胞1471Meyer和Horgan(1996)植物生理和植物分子生物學(xué)年度綜述4723-48Meyers和Miller(1988)計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用411-17Molvig等(1997)美國國家科學(xué)院進(jìn)展948393-8398Needleman和Wunsch(1970)分子生物學(xué)雜志48443Odel等(1985)自然313810Odell等(1994)植物生理106447-458Opperman等(1993)科學(xué)263221-223Overvoorde和Grimes(1994)生物化學(xué)雜志26915154-15161Overvoorde等(1996)植物細(xì)胞8271-280Pearson和Lipman(1988)美國國家科學(xué)院進(jìn)展852444Pearson等(1994)分子生物學(xué)方法24307-31Pouwels等(1987)克隆載體實(shí)驗(yàn)室手冊1985，增刊Riesmeier等(1992)EMBO雜志114705-4713Ripp等(1988)植物生理881435-1445Roshal等(1987)EMBO雜志61155
Saalbach等(1996)植物生理112975-985Sambrook等(1989)分子克隆試驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約Schaffner和Sheen(1991)植物細(xì)胞3997Schernthaner等(1988)EMBO雜志71249Schmidt(1994)科學(xué)265739Shewry等(1995)植物細(xì)胞7945-956Siebertz等(1989)植物細(xì)胞1961Smith和Waterman(1981)應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2482Southern(1975)分子生物學(xué)雜志98Southern等(1982)分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Mol.Appl.Genet.)1327-341Stockhause等(1997)植物細(xì)胞9479-489Terada和Shimamoto(1990)分子和基因遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)220389Tijssen(1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)--與核酸探針的雜交，第1部分第2章“雜交原理概述和核酸探針的分析方法”，Elsevier，New York.
Weissbach和Weissbach(1989)植物分子生物學(xué)方法，AcademicPress
序列表(1)一般資料(i)申請人Grimes(ii)發(fā)明題目蔗糖結(jié)合蛋白(iii)序列數(shù)15(iv)通訊地址(A)收件人Klarquist Sparkman Campbell Leigh &Whinston，LLP(B)街道One World Trade Center121 S.W.Salmon StreetSuite 1600(C)城市Portland(D)州Oregon(E)國家美國(F)郵政編碼97204-2988(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤，3-1/2英寸(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)Windows NT(D)軟件Word 97 & ASCII(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?0/047568(B)申請日1997.5.22(C)分類號(viii)代理人/代理資料(A)姓名David J.Earp
(B)登記號41401(C)資料/文檔號4630-50206/KJE(ix)通訊資料(A)電話(503)226-7391(B)傳真(503)228-9446(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度524(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Gly Met Arg Thr Lys Leu Ser Leu Ala Ile Phe Phe Phe Phe1 5 10 15Leu Leu Ala Leu Phe Ser Asn Leu Ala Phe Gly Lys Cys Lys Glu20 25 30Thr Glu Val Glu Glu Glu Asp Pro Glu Leu Val Thr Cys Lys His35 40 45Gln Cys Gln Gln Gln Gln Gln Tyr Thr Glu Gly Asp Lys Arg Val50 55 60Cys Leu Gln Ser Cys Asp Arg Tyr His Arg Met Lys Gln Glu Arg65 70 75Glu Lys Gln Ile Gln Glu Glu Thr Arg Glu Lys Lys Glu Glu Glu80 85 90Ser Arg Glu Arg Glu Glu Glu Gln Gln Glu Gln His Glu Glu Gln95 100 105Asp Glu Asn Pro Tyr Ile Phe Glu Glu Asp Lys Asp Phe Glu Thr110 115 120Arg Val Glu Thr Glu Gly Gly Arg Ile Arg Val Leu Lys Lys Phe125 130 135Thr Glu Lys Ser Lys Leu Leu Gln Gly Ile Glu Asn Phe Arg Leu140 145 150Ala Ile Leu Glu Ala Arg Ala His Thr Phe Val Ser Pro Arg His155 160 165Phe Asp Ser Glu Val Val Phe Phe Asn Ile Lys Gly Arg Ala Val170 175 180Leu Gly Leu 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GCTTGATTAC 100TATAGGGCAC GCGTGGTCGA CGGCCCGGGC TGGTACTTTT GACTCCCTAA 150TTGACAACTA CTGCATTGTA TCGATATTAA TATGGAATTT GGAATCATGG 200TCCATGCTTC ATGTATTGTG TACCTCATAT TCAACAGCTA GTGAACACAA 250AATCTTACAT ACTTTTGTAT TTCTATCAGT TTATACCTTC CCAAATAAAT 300GGCTTATATT GCATTGAGTT ACATATTATT GTTTAGTTGG ATTGTAATTT 350ACGAGTAGTT TGTCACGACT GAAGAAATTA ATAAGGTATA AGACACGTCC 400TGCTCCCGCG AAATTCATTT TCTGTTTATT CTCTGTCTCT GTCTCTATTC 450AATTCAACCT TCCATTTGTT TTCGCCAGCA TCCAGATTTG TGCTTTCTCT 500ATCATTTCAT TTAATTAATG TGATGTATGT ATGGCTGAAT AAAAGATGGA 550TTCCTCTTTT TTGTGGGGTG GAAGCTTAAT CTATGGGGCT AGATAAAAAA 600ATTCATCTGT TTGTTGCACA GAATAAAATA TAAATTAATA ATTAATTAAA 650CTTCAAACAT GGACAGGGCA CCTCCAAGTT ATTTTAAAAC CGACCATGGC 700CATTTTTGCT TTCTGTTGGT GTTCTTGGCT CAGCTTTTGT AATTTTAGAC 750TGCAGAAACA TCCTGTATGG GTTGGAAAGC AGCTGAGAAA CTCATTAGGC 800GCTGGAAAAT TCTAAGAGGG GATAATGTAT GTGAGTCAAT TCAAACCCAC 850CATATGTTTG TCTCTGTGCT CTTTATTAAT TTCACTTTTT TATTTTATAA 900TTTTAGTCTC ACAGTCACAG AGTCACTTAT GTATTCATCT AACAGGTTAT 950GATAACAAGG GGCAAAGATA AGGGTGAGAC CGGGATTATA AAGCGTGTCA 1000TTTGCTCTCA AAATCGTGTC ATTGTAGAGG GTAAAAATCT GGTGAGATAT 1050TATAATCACT ATTTGGTCCT TCTGTTTTTC TAATGCCCTA TCTTCTGTAG 1100CTTTTGTTTT CAATTCCACT GTCAGTGTGT CTTGCATCAG AATATTAATC 1150GGTTGTCAGT GACATTGAGC ATTTAATTGT GTAAATTTTC CTGTTAGATT 1200TCTCACTCCA ATGCCTTTTG CCGTCCTCTT TATAGGTAAA GAAGCATATC 1250AAGCAAGGGC AAGGTCATAA AGGGGGAATC TTTACAGTGG AAGCCCCACT 1300GCATGCCTCC AATGTGCAAG TTCTTGACCC AGTGACAGGG TATGTACATG 1350TTAGATATTG AACTGGTGAT TGCTTCTCCA AATGGGATAA CATGTATGTA 1400AGTAAGAGTA ACCTACTTTT ACTTGTGCAG CAAGCCTTGC AAGGTTAGAG 1450TTAAAATATC TTGAAGATGG TACTAAAGTC AGAGTGTCCA GAGGAATAGG 1500AGCATCAGGG TTCATAGTCC CTCGTCCCAA GATCTTAAAG ATAAGAACTA 1550CCCCAAGACC TACAGTCCGT AAGTATCTAA CAAGCTTATG TTTTTTCCTT 1600GTATGAGTTG TTGATAAAAC ATGGCCAGAG CCAATAGAGA ATTGAGAAAA 1650GGTGAGAAAC AGAAAATGAA CTTGAATTAT GAGAAAGGTG TGGGAAACAA 1700ACAAGCCAAT AATGTGGCTT ATATAATATA TAGATATAGA CTAGAGTGAG 1750TAACGAATCA CTAACTAATT ACATGTGCAT ATCTACCTAA TTAGATGATT 1800CGTCAAACGA AGCAAAGTAT TGTGATAGAT AGTTGATTTT TCTCAAATAA 1850TTCTAAGATG TAATACTTAT ATTCTTTGCT ACATGTCTGT TGACATACAT 1900TGTTATCCAT AACCTTGTTA TTATACTTGG TGTTAAAAAA GGAGAGTCTC 1950CTTGCACTTT AGAGACATTC TTTAAACTGA CTTGACCTTA TTGAAATACA 2000TAATTCTAGT TACCAACTTA GCACCACACC ATAAAAGGAA AGATTTTTAA 2050ACGGTAGATT GATTGTTGAA TGTTGTTAAT CATCAAAGGT TTAAGATTTA 2100TTAAGTGCTT TCCATTGTCT TAAAATATTG CTTCTAGGAC TAGGATGTGT 2150ATATTGGTTA CATGATTTCC CCGCCTTCGT ATCAACTTAA GCATGTTGGA 2200CTTGCACCCA TATGCAGAAA CTCAAATAAA AAACTTCATT TGTAAGGTAT 2250AATAAGTGTA TATATAACAT TGTAAGTTGT CAATCAGAGT AATTTGGATT 2300GATGGATATT TAAGTCTTCT ATAATATTTC ATTTAGAGCC AGAAGCCAGG 2350TTCAAAGGAA TAGGTAATTC ACATGAATTC ATTCTCTTGT TTCTATACAG 2400TTATTATTTT TTCCATCTTA GTGTTGCAGG AAACTACCTC AGTTGTTGTA 2450GATGTGCAAA ACTTGTATGG ATATATATAC TGTTCAGTGT TGGGAAACCC 2500ATGCTTTCTT AATTCACAGA GATACATTTA AACTTTTTTT AGAAACTTGC 2550TTAGTATCTT ATCCTGTTAT TCATTTTTGG CAGTTGGTCC TAAAGATACT 2600CCTATGAATC TTGTGCTAGA GAAGACTTAC GATGCTAAAA CAGGACGGGG 2650CATGCCTGAA CTTTAAGGAG ACGTTGCCCT GTTCCACTTC CAATTAGGTA 2700ACTGCTATCG TGATGAACAA AAATTTGGTG TGAGTTTATC ACCTTGTCCT 2750TTGCCATGAT TCAATTAAAA GCGTGTTTGG ACTTTGGAAC CTCATTCTAA 2800CACCACCCTA TGATGGGTTA GACGCAAAAT CTAGACTGGG TAGTGTTTAA 2850CGTGTATCTG TGTGAACACA GTTACAAACG CATTCCATGT TTAATGCTAC 2900CATGCCTAGG AGTTGAATCA TTTGTAACTT TACCAATTTA GTCATTACTA 2950CTAGCATTCT TTTCCCTATT CAAGTTGATG TTAGCTCCAG TTAGGGATGG 3000TCATTTCACT CCATAAACTT TAATTGTTAG GTGAGTGGAA GAGGAACCCG 3050TTTGATTGTT ATGGTTCTAG TTCTAGTGAT TTTTATTAAT TGGGTTCGAC 3100CATATTAGTG TTTGATTTGA GCTATAGATA GTTTTTTCCC CAAAAGATCA 3150GTTTTCTCAC ATGTCAGATT CATGGGTTGG TACTCTTTTC ATCCAGTTCC 3200AACAAACTTG CTGTTCGAAC TACGAAGTCA GTCTTACTTA TTGGGTAACA 3250TGTGGGTTTT GGTGTTTAAT GGATCTAGAA TACTGTTTGT AGCTAAACCT 3300ATCTTATCAT ATAGGGCCTA AAAAGTAAAA TTGGTTATTA CATTTGGAAA3350AAAAGAAATA ATCTAGGCCC ACTGGCACAC TGAAAAACGT TTTCAATGAA3400TAATTTAATA GTTTTTTTTT TATAAAAAAA TTTTAATAAA AAATAATGGA3450GTTTTTAAAA ATATTACAAC AATCTGTTTC TCTAAGGTTT TTTAATAGTT3500CAGATAATTC ATAGCTTAGA GCAATACGAC ATGGTTAGGA AGCATAAAAA3550AAATATACGA CATGGTTAGG AATTTTTTTT TAGTATGTCT GACATAATTT3600TTTAAATGTT TTGGCTTCAT ATGAATTTAA CAGTGCGTCA TATGAACTTA3650CACACTCATT ATATTTTTTA ACCTTTTAAA TGATTTTTAA AAAATATGAC3650AGATGCAATC TTATTCTCAC TTTTTATACT TTCACTACTG CTTCATATGA3700CCTAAAGTCA GAGAAATATT TTAAAAAGAT AAATACGATA AAGAATACGA3750TGAGAAAGAA ACCTCACACA ATGAATAGAC CAAATTAGAC CTATTTATTT3800TCCTTAGAAA TAAAGAAAAT AATTATTTTT TATTTTTTCA CATTACATTT3850ATATTTTTCT ATCACTTTCT CTATTTAGGT ATTGATTGAC ATATGAGTGT3900ACATGAACTT TTTTTAAAAA AAAAGCGTAA ATATTAATTA TATTCATGCA3950TTTGTTTTCT GTCTTTCATT TTCTATTTAA TCTTACGTTA TCAATAATCT4000ATTATTAAAT TTTATAGTTG ATGATGAATA TATAAGAGAT ATAAATAAAA4050AAATAATTAA TTTTATAATA AAAATTAAAA AATAATTAAT TATTTTGAGA4100TAAATTTTTT TTAAGAGAAC AATTATAAAC GGAGAGTATT ATATTTAGTT4150TTATGTGTAC CGGGTACGTG TCTACTAACA TGGTGTCTCT CCATCATTTT4200CGTAGGAAAA AACATTATAG GAGTATGAAA AAAGCAAAAG TTTTGTCTGT4250TTATGGTTTT GTATATACCC AGCTCTACTT GGCAGCAATT ACCCGTCTTG4300CTTGCTACTT ACGAGACACG TACATTAACA CTTGTCCTAG CTAGTGCATG4350CAATTGCCAC CCCATTCCTC ACTCCTCCCT TTTCCTTCTC TTTATATTTA4400TATATATAAA TAAACAAACA CAATGCATCA TCTCAAAGAA ATTAAGAGAG4450TTTTTTTGTT CCTCACTGAC CAAGCC 4476(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO8TGTAAAACGA CGGCCAGTGA ATT 23(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO9GATTACGCCA AGCTCGAAAT TAA 23(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度27(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO10ATGGCGACCA GAGCCAAGCT TTCTTTA 27(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度27(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO11CGCAACAGCG CGACGACCAC GCTCGCT27(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度27(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGGCGACCA GAGCCAAGCT TTCTTTA27(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度27(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO13GAAGGGATGA CCAGGAGGGA CAACAAA27(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO14TTGTAAACGA CGGCCAGTGA ATT23(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO15GGTGAGGTCA GTGAGGAACA ACA2權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白與相應(yīng)的野生型蔗糖結(jié)合蛋白相比，其氨基酸序列有所改變，并且與相應(yīng)的野生型蔗糖結(jié)合蛋白相比，經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白在酵母分析系統(tǒng)中的表達(dá)使蔗糖增強(qiáng)。
2.按照權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白比野生型蔗糖結(jié)合蛋白在酵母分析系統(tǒng)中增強(qiáng)蔗糖攝取至少達(dá)10％。
3.按照權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白比野生型蔗糖結(jié)合蛋白在酵母分析系統(tǒng)中增強(qiáng)蔗糖攝取至少達(dá)25％。
4.按照權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中所述有所改變的氨基酸序列包括比野生型蔗糖結(jié)合蛋白的C-末端截短。
5.按照權(quán)利要求4的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中所述C-末端截短導(dǎo)致除去10到100個(gè)范圍之間的氨基酸。
6.一種經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中相應(yīng)的野生型蔗糖結(jié)合蛋白選自SBP1和SBP2。
7.按照權(quán)利要求6的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白，其中所述蛋白具有選自Seq.I.D.Nos.2和4的氨基酸序列。
8.編碼權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白的核酸分子。
9.含有權(quán)利要求8的核酸分子的載體。
10.表達(dá)權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。
11.編碼權(quán)利要求6的經(jīng)修飾的蔗糖結(jié)合蛋白的核酸分子。
12.表達(dá)權(quán)利要求6的經(jīng)修飾的植物蔗糖結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。
13.一種編碼植物蔗糖結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述蛋白質(zhì)含有選自下列組中的氨基酸序列(a)Seq.I.D.No.3所示的氨基酸序列；(b)Seq.I.D.No.4所示的氨基酸序列；(c)與(a)或(b)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和(d)與(a)或(b)的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
14.含有與權(quán)利要求13的核酸分子有效連接的啟動子序列的重組表達(dá)盒序列。
15.含有權(quán)利要求14的重組表達(dá)盒序列的轉(zhuǎn)基因植物。
16.含有與核酸序列有效連接的啟動子序列的重組核酸分子，其中所述啟動子序列包括SBP1或SBP2啟動子。
17.按照權(quán)利要求16的重組核酸分子，其中所述啟動子序列包括選自以下組中序列的至少25個(gè)連續(xù)核苷酸(a)Seq.I.D.No.7；和(b)Seq.I.D.No.8。
18.按照權(quán)利要求17的重組核酸分子，其中所述核酸序列編碼植物蔗糖結(jié)合蛋白。
19.含有權(quán)利要求17的重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物。
20.含有權(quán)利要求18的重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種編碼植物蔗糖結(jié)合蛋白(SBP)的cDNA,以及在酶母分析系統(tǒng)中表現(xiàn)增強(qiáng)的蔗糖攝取活性的修飾SBP。同時(shí)也提供了具有改變的蔗糖攝取活性的核酸載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及用于調(diào)控轉(zhuǎn)基因(包括SBP轉(zhuǎn)基因)在植物中表達(dá)的啟動子序列。
文檔編號A01H5/00GK1257547SQ98805333
公開日2000年6月21日 申請日期1998年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月22日
發(fā)明者霍華德·D·格里姆斯, 趙少武 申請人:華盛頓州立大學(xué)研究基金會