具有代謝蔗糖能力的重組細菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了能夠代謝蔗糖的重組細菌。所述重組細菌在其基因組中或在至少一種重組構(gòu)建體上包含：來自熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorescens)Pf5(BAA-477)的編碼具有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽的核苷酸序列，和來自熒光假單胞菌Pf5(BAA-477)的編碼具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列。這些核苷酸序列各自可操作地連接至相同的或不同的啟動子。還描述了能夠代謝蔗糖以產(chǎn)生甘油和/或甘油衍生的產(chǎn)物如1，3-丙二醇和3-羥基丙酸的重組細菌。
【專利說明】具有代謝蔗糖能力的重組細菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學和分子生物學領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了具有利用蔗糖作為碳源的能力的重組細菌和利用此類重組細菌來生產(chǎn)如甘油和甘油衍生產(chǎn)物的產(chǎn)物的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]許多在商業(yè)上有用的微生物可利用葡萄糖作為其主要碳水化合物來源。然而，所開發(fā)的用于產(chǎn)生商業(yè)上所需的產(chǎn)物的微生物利用葡萄糖的缺點是葡萄糖的高費用。使用蔗糖和含有蔗糖和其他糖類的混合原料作為微生物生產(chǎn)系統(tǒng)的碳水化合物來源在商業(yè)上是可取的，因為這些材料通常易于以較低成本獲得。
[0003]當生產(chǎn)微生物可利用混合原料中存在的任何蔗糖時，其可更高效地運行。因而，當生產(chǎn)微生物不具有高效利用蔗糖作為主要碳源的能力時，其不能如此有效地工作。例如，細菌細胞通常顯示出偏好的糖利用，以葡萄糖為最優(yōu)選的。在含有的糖混合物的人造培養(yǎng)基中，葡萄糖通常先于其他糖類被完全代謝。此外，許多細菌缺少利用蔗糖的能力。例如，不到50%的大腸桿菌(Escherichia coli) (E.coli)菌株具有利用鹿糖的能力。因而，當生產(chǎn)微生物不能利用蔗糖作為碳水化合物來源時，希望對該微生物進行工程改造而使得其可利用蔗糖。
[0004]通過整合利用蔗糖的基因?qū)衫谜崽堑闹亟M細菌進行工程改造已有報道。例如，Livshits等人(美國專利N0.6，960，455)描述了利用大腸桿菌菌株來產(chǎn)生氨基酸，所述菌株含有編碼利用蔗糖的代謝途徑的基因。此外，Olson等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.74:1031-1040，2007)描述了攜帶負責蔗糖降解的基因的大腸桿菌菌株，其可利用蔗糖作為碳源來產(chǎn)生L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。然而，存在對以下細菌菌株的需求，所述菌株被新的蔗糖利用基因工程化以利用蔗糖并且具有改善的蔗糖利用能力。此外，存在著對能利用蔗糖作為碳源而產(chǎn)生甘油和甘油衍生產(chǎn)物的細菌菌株的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在一個實施例中，本發(fā)明提供了重組細菌，所述重組細菌在其基因組中或在至少一種重組構(gòu)建體上包含:
[0006](a)編碼具有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽基于Clustal V比對方法，在與如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列比較時，具有至少95%的序列同一性；以及
[0007](b)編碼具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽基于Clustal V比對方法，在與如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列比較時，具有至少95%的序列同一性；
[0008]其中(a)和(b)各自可操作地連接至相同的或不同的啟動子，進一步地，其中所述重組細菌能夠代謝蔗糖。
[0009]在一個實施例中，所述重組細菌產(chǎn)生1，3-丙二醇、甘油、和/或3-羥基丙酸。[0010]在另一個實施例中，本發(fā)明提供用于從蔗糖制備甘油、1，3-丙二醇和/或3-羥基丙酸的方法，所述方法包括:
[0011]a)在蔗糖的存在下，培養(yǎng)本文所公開的產(chǎn)生1，3-丙二醇、甘油、和/或3-羥基丙酸的重組細菌；以及
[0012]b)任選地，回收所產(chǎn)生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羥基丙酸。
[0013]簡單的序列i兌明
[0014]下列序列符合37C.F.R.1.821 1.825 (“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求-序列規(guī)則”)，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標準ST.25(2009)和EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5.2和49.5 (a bis)，以及行政指令的208節(jié)和附錄C)。核苷酸的符號和格式以及氨基酸序列數(shù)據(jù)符合如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)則。
[0015]轟I
[0016]某閔和蛋白質(zhì) SEQ ID號匯總
[0017]
【權(quán)利要求】
1.重組細菌，在其基因組中或在至少一種重組構(gòu)建體上包含: (a)編碼具有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽的核苷酸序列，基于ClustalV比對方法，在與如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列進行比較時，所述多肽具有至少95%的序列同一性；以及 (b)編碼具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列，基于ClustalV比對方法，在與如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列進行比較時，所述多肽具有至少95%的序列同一性； 其中(a)和(b)各自可操作地連接至相同的或不同的啟動子，進一步地，其中所述重組細菌能夠代謝蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細菌，其中基于BLASTN比對方法，在與如SEQID NO:23所示的核苷酸序列進行比較時，所述編碼具有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽的核苷酸序列具有至少95%的序列同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細菌，其中基于BLASTN比對方法，在與如SEQID NO:25所示的核苷酸序列進行比較時，所述編碼具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列具有至少95%的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細菌，在其基因組中或在至少一種重組構(gòu)建體上還包含編碼具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細菌，其中基于ClustalV比對方法，所述具有果糖激酶活性的多肽與如 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 34, SEQ IDNO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42, SEQ IDNO:44、或SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少95%的序列同一'I"生。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細菌，其中所述具有果糖激酶活性的多肽具有如SEQIDNO:40所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細菌，其中所述細菌選自下列屬:埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、和氣桿菌屬(Aerobacter)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組細菌,其中所述細菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細菌，其中所述重組細菌產(chǎn)生1，3-丙二醇、甘油、和/或3-羥基丙酸。
10.用于從蔗糖制備甘油、I，3-丙二醇和/或3-羥基丙酸的方法，包括: a)在蔗糖存在下培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的重組細菌；以及 b)任選地，回收所產(chǎn)生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羥基丙酸。
【文檔編號】C12P7/18GK103620026SQ201180058211
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月6日
【發(fā)明者】T.K.范迪克 申請人:納幕爾杜邦公司