專利名稱：一種無糖箱式植物組織的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織的培養(yǎng)技術(shù)，尤其是涉及一種無糖培養(yǎng)技術(shù)。
植物組織的培養(yǎng)技術(shù)，從本世紀(jì)30年代開始研究，已被廣泛地應(yīng)用于植物體的快速繁殖、脫毒和種質(zhì)資源的保存，從而促進(jìn)了生物育種技術(shù)的飛躍發(fā)展。長(zhǎng)期以來傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)方法，是以糖作為植物體的碳源，并補(bǔ)充相應(yīng)的有機(jī)物質(zhì)。常規(guī)的方法存在著培養(yǎng)過程中污染率高，試管苗生根率低，過渡苗成活率低，生產(chǎn)成本高等缺陷。
現(xiàn)有的無糖組織培養(yǎng)技術(shù)(參考文獻(xiàn)1．Kozait,Fujiwarak,Hagashim.Collected papers on Environmaental Control in MicropropagationVolumel.JoPan:Chiba Vniversity press,1991；2．肖玉蘭等。非洲菊無糖組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究。園藝學(xué)報(bào)，1998,25(4))是采用瓶子作培養(yǎng)容器，具有污染率低，植株健壯，過渡苗成活率高的優(yōu)點(diǎn)。但瓶子由于空間太小，氣體循環(huán)不暢，即使補(bǔ)充了CO2，也只有通過封口膜上的透氣孔才能進(jìn)入瓶?jī)?nèi)供植株吸收，CO2的供給量仍然不夠，植株生長(zhǎng)速度緩慢，且操作困難，成本較高。
本發(fā)明的目的是消除現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用培養(yǎng)箱代替瓶子作培養(yǎng)容器，采用無糖培養(yǎng)基，適當(dāng)光照和通入CO2的培養(yǎng)方法，可有效地克服現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，操作簡(jiǎn)便，能促進(jìn)植株快速生長(zhǎng)，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明提供的無糖箱式植物組織培養(yǎng)方法包括下列步驟一、制作培養(yǎng)箱采用有機(jī)玻璃制作培養(yǎng)箱，有機(jī)玻璃的厚度可為3～5毫米，箱體的尺寸長(zhǎng)×高×寬=500～1000毫米×200～250毫米×500毫米。
二、培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控給培養(yǎng)箱配置二氧化碳通氣系統(tǒng)，光照系統(tǒng)，溫控系統(tǒng)和濕控系統(tǒng)，便于調(diào)節(jié)控制培養(yǎng)條件。
三、配制培養(yǎng)基1、配制培養(yǎng)液①本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的MS培養(yǎng)液作了重要的改進(jìn)，采用本發(fā)明特別配制的無糖MS培養(yǎng)液，即配方中不添加糖、有機(jī)物和維生素，保留了其它成份，無糖MS培養(yǎng)液的配方(單位毫克/升)為NH4NO31650KNO31900KH2PO4170MgSO4·7H2O370CaCl·2H2O 440MnSO4·H2O 22.3ZnSO4·7H2O8.6H3BO36.2KI0.83NaMoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O0.025FeSO4·7H2O27.8Na2·EDTA 37.3②本發(fā)明以無糖培養(yǎng)液為基礎(chǔ)配制增殖培養(yǎng)液，其配方(單位毫克/升)為MS(不加糖、有機(jī)物和維生素)+(0～0.5)6-芐基氨基嘌呤③本發(fā)明以無糖培養(yǎng)液為基礎(chǔ)配制生根培養(yǎng)液，其配方為(單位毫克/升)MS(不加糖、有機(jī)物和維生素)+(0～0.1)萘乙酸+(0～5000)活性碳。
2、培養(yǎng)基基質(zhì)種類根據(jù)所培養(yǎng)植物的生物學(xué)特性，可分別選擇下列物質(zhì)作為基質(zhì)①瓊脂②珍珠巖③砂④蛭石；3、培養(yǎng)基的制作程序①按配方將培養(yǎng)液配制好；②如選擇瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì)，可將瓊脂溶解后加入培養(yǎng)液，經(jīng)消毒后，放入培養(yǎng)箱內(nèi)待用；③如選擇珍珠巖或砂或蛭石作基質(zhì)時(shí)，則需要分別消毒，再把培養(yǎng)液加入基質(zhì)中待用。
四、消毒
1、培養(yǎng)室消毒稱量6克高錳酸鉀放入一個(gè)容器內(nèi)，再加10毫升甲醛進(jìn)行熏蒸，紫外燈照射；2、培養(yǎng)箱消毒先把培養(yǎng)箱清洗干凈后，用75％的乙醇進(jìn)行箱體內(nèi)壁擦拭消毒，然后再使用6克高錳酸鉀和10毫升甲醛進(jìn)行熏蒸消毒；3、培養(yǎng)基消毒①培養(yǎng)液+瓊脂經(jīng)120℃,20分鐘高壓滅菌消毒或在有蓋的容器中煮沸消毒；②培養(yǎng)液+珍珠巖或砂或蛭石的消毒培養(yǎng)液經(jīng)120℃,20分鐘高壓消毒或在有蓋的容器中煮沸20分鐘；珍珠巖、砂、蛭石用一容器裝好經(jīng)120℃,30分鐘的高壓滅菌。
五、無糖箱式培養(yǎng)1、在無菌條件下，將試管苗分段或分株轉(zhuǎn)接到已裝好培養(yǎng)基的培養(yǎng)箱內(nèi)；2、弱光照時(shí)期為7～10天(時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)植物種類或生長(zhǎng)情況確定)，其照度為2500～2700勒克斯，每天光照時(shí)間10～12小時(shí)，培養(yǎng)溫度為22～25℃；3、強(qiáng)光照時(shí)期從第8～11天開始，其照度調(diào)整為6000～8000勒克斯，每天光照14～16小時(shí)；4、第8天輸入CO2，輸入CO2的時(shí)間和光照同步進(jìn)行，其濃度為2000～3500PPm5、濕度控制0～3天或0～5天培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度為100％以后逐漸降為75～85％,20天后為70％；20～25天則可出苗，可直接移栽到苗床和營(yíng)養(yǎng)袋中，18～25天便可成為商品苗。
本發(fā)明利用無糖培養(yǎng)污染率低的優(yōu)勢(shì)，采用大的箱式培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，以利于植株對(duì)CO2的充分吸收和氣體交換，可有效地促進(jìn)植株的快速生長(zhǎng)，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，經(jīng)對(duì)彩星，康乃馨，馬鈴薯，非洲菊，玫瑰和綠巨人等多種植物進(jìn)行了多次試驗(yàn)，重現(xiàn)性好，具有良好的推廣應(yīng)用前景。
實(shí)施例及對(duì)比試驗(yàn)供試材料彩星(Limonium latifolium)、馬鈴薯(Potato)試管苗培養(yǎng)容器①瓶子(容積250毫升)②培養(yǎng)箱(1000毫米×500毫米×250毫米)
試驗(yàn)處理1號(hào)樣 無糖+瓶子+CO22號(hào)樣 無糖+培養(yǎng)箱+CO2具體操作在轉(zhuǎn)苗之前，首先對(duì)培養(yǎng)箱和培養(yǎng)室進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，然后把配制好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)箱內(nèi)，待培養(yǎng)基冷卻后進(jìn)行接苗。彩星每箱插苗1500株，馬鈴薯剪成一葉一個(gè)莖段，每箱插3000苗，不論是彩星還是馬鈴薯都挑均勻一致的苗進(jìn)行轉(zhuǎn)接。采用瓶子培養(yǎng)，每種植物接種100瓶，彩星每瓶插10苗，馬鈴薯插18苗。瓶子培養(yǎng)均采用透氣封口膜，透氣孔面積為157mm2。
無糖培養(yǎng)10天內(nèi)，光照量2700勒克斯，時(shí)間每天12小時(shí)；10天后光照量增加為8000勒克斯；光照時(shí)間為彩星每天14小時(shí)，馬鈴薯每天16小時(shí)；補(bǔ)充CO2的農(nóng)度3920毫克/mm3，補(bǔ)充CO2的時(shí)間和光照同步進(jìn)行。無糖箱式培養(yǎng)直接把CO2輸入到培養(yǎng)箱中。無糖瓶子培養(yǎng)10天內(nèi)放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)，10天后把瓶子放入培養(yǎng)箱內(nèi)，再輸入CO2。馬鈴薯培養(yǎng)20天后出苗，彩星培養(yǎng)28天后出苗。出苗后直接把苗栽到營(yíng)養(yǎng)土上，進(jìn)行過渡煉苗，20天后調(diào)查成活率。
試驗(yàn)結(jié)果1、培養(yǎng)容器的大小對(duì)植株生長(zhǎng)的影響極為明顯。就培養(yǎng)箱和瓶子而言，瓶子由于空間太小，氣體循環(huán)不暢，即使補(bǔ)充了CO2，但只有通過封口膜上的透氣孔才能進(jìn)入瓶?jī)?nèi)供植株吸收，CO2的供給量仍然不夠，植株生長(zhǎng)緩慢。從表1可以看出同是無糖培養(yǎng)并通入CO2，用培養(yǎng)箱培養(yǎng)的植株的高明顯高于用瓶子培養(yǎng)的。彩星平均高出1.97厘米，馬鈴薯平均高出9.03厘米，而且植株健壯，各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均優(yōu)于用瓶子培養(yǎng)的。其中馬鈴薯的差別尤為明顯。原因在于培養(yǎng)箱空間大，便于氣體交換，CO2吸收充分。但培養(yǎng)箱只能用于無糖培養(yǎng)，有糖培養(yǎng)只能用于瓶子，因?yàn)橛刑桥囵B(yǎng)隨著培養(yǎng)容器的增大，污染率逐漸增高。只有無糖培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)容器體積的大小適應(yīng)性廣。
2、CO2是影響植株生長(zhǎng)的重要因素。碳素營(yíng)養(yǎng)是植物的生命基礎(chǔ)，植株要吸收CO2進(jìn)行光合作用，有糖培養(yǎng)靠糖作為植株的碳源，無糖培養(yǎng)必須補(bǔ)充CO2和增強(qiáng)光照，使植株自身進(jìn)行光合作用制造有機(jī)物。所以CO2的供給是至關(guān)重要的。如果只靠空氣中的CO2補(bǔ)充遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植株的需要。從表1可以看出，即使在大型的培養(yǎng)容器中，在8000LX的強(qiáng)光照射下，如果不補(bǔ)充CO2，植物仍然生長(zhǎng)不好。在同樣的培養(yǎng)條件下，補(bǔ)充CO2可使彩星重量增加35％，株高增加14％，葉片數(shù)增加31％，葉面積增加66％，馬鈴薯生長(zhǎng)量增加更多，重量增加303％，株高增加147％，葉片數(shù)增加82％，葉面積增加11.91倍?？梢奀O2對(duì)植株生長(zhǎng)的重要性。
3、有糖培養(yǎng)和無糖培養(yǎng)成本分析表2表明采用本發(fā)明的無糖培養(yǎng)成本分析，彩星平均每株成本降低0.038元，馬鈴薯降低0.028元，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。處理 Trea tment 鮮重 株高 葉片數(shù) 葉面積移栽苗數(shù) 成活數(shù) 移栽成活率試材 培養(yǎng)基糖 培養(yǎng)容器 CO2FreshShoot Leaf number leaf areatransplant live numbertransplantplantlets diumSucrocseVesselweight length numberlive percent(％) (mg/m3)(mg/Pant) (cm) (leaf/plant) (cm3/plant) (Plants) (Plants) (％)彩星MS3 瓶子 559 5.6811.10 17.65 950 831 87.5％(Limonium MS0 (bottle) 3920 561 5.71 9.83 18.35 978 881 90.1latifolum) MS0培養(yǎng)箱 563 7.54 9.77 18.101418 1270 89.6MS0 box3920 758 8.57 12.8 30.081497 1424 95.1馬鈴薯 MS3 瓶子 135 6.76 6.15 0.731600 1450 90.6Poaoto MS0 (bottle) 3920 113 6.11 6.01 0.711358 1153 84.90MS0培養(yǎng)箱 127 6.12 5.92 0.712245 2018 89.8MS0 box 3920 512 15.1410.81 8.462972 2970 99.9*轉(zhuǎn)苗時(shí)調(diào)查植物重量 株高 葉片數(shù)葉面積(mg/株) (cm) (葉/株) (cm2/株)彩星237 5.527.144.67馬鈴薯22 1.101.000.12表1．不同的培養(yǎng)方式對(duì)植株生長(zhǎng)的影響
表2．生產(chǎn)成本對(duì)照
權(quán)利要求
1．一種無糖箱式植物組織的培養(yǎng)方法，包括①制作培養(yǎng)容器；②培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控；③配制培養(yǎng)基；④消毒；⑤無糖培養(yǎng)，其特征在于①培養(yǎng)容器為箱體式；②配制培養(yǎng)基所用的MS培養(yǎng)液不添加糖、有機(jī)物和維生素；③將二氧化碳輸入培養(yǎng)箱。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)容器是采用有機(jī)玻璃制作培養(yǎng)箱，有機(jī)玻璃的厚度可為3～5毫米，箱體的尺寸長(zhǎng)×高×寬=500～1000毫米×200～250毫米×500毫米。
3．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的無糖MS培養(yǎng)液進(jìn)一步配制成增殖培養(yǎng)液，其配方(單位毫克/升)為MS(不加糖、有機(jī)物和維生素)+(0～0.5)6-芐基氨基嘌呤；進(jìn)一步配制生根培養(yǎng)液，其配方為(單位毫克/升)MS(不加糖、有機(jī)物和維生素)+(0～0.1)萘乙酸+(0～5000)活性碳。
4．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)基的基質(zhì)可為瓊脂或珍珠巖或砂或蛭石。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中所述的培養(yǎng)基的制作程序?yàn)棰侔磁浞綄⑴囵B(yǎng)液配制好；②如選擇瓊脂作為培養(yǎng)基質(zhì)，可將瓊脂溶解后加入培養(yǎng)液，經(jīng)消毒后，放入培養(yǎng)箱內(nèi)待用；③如選擇珍珠巖或砂或蛭石作基質(zhì)時(shí)，則需要分別消毒，再把培養(yǎng)液加入基質(zhì)中待用。
6．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的消毒包括①培養(yǎng)室消毒稱量6克高錳酸鉀放入一個(gè)容器內(nèi)，再加10毫升甲醛進(jìn)行熏蒸，紫外燈照射；②培養(yǎng)箱消毒先把培養(yǎng)箱清洗干凈后，用75％的乙醇進(jìn)行箱體內(nèi)壁擦拭消毒，然后再使用6克高錳酸鉀和10毫升甲醛進(jìn)行熏蒸消毒；③培養(yǎng)基消毒培養(yǎng)液十瓊脂經(jīng)120℃,20分鐘高壓滅菌消毒或在有蓋的容器中煮沸消毒；培養(yǎng)液十珍珠巖或砂或蛭石的消毒培養(yǎng)液經(jīng)120℃,20分鐘高壓消毒或在有蓋的容器中煮沸20分鐘；珍珠巖、砂、蛭石用一容器裝好經(jīng)120℃,30分鐘的高壓滅菌。
7．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的無糖培養(yǎng)工序包括①在無菌條件下，將試管苗分段或分株轉(zhuǎn)接到已裝好培養(yǎng)基的培養(yǎng)箱內(nèi)；②弱光照時(shí)期為7～10天，其照度為2500～2700勒克斯，每天光照時(shí)間10～12小時(shí)，培養(yǎng)溫度為22～25℃；③強(qiáng)光照時(shí)期從第8～11天開始，其照度調(diào)整為6000～8000勒克斯，每天光照14～16小時(shí)；④第8天輸入CO2，輸入CO2的時(shí)間和光照同步進(jìn)行，其濃度為2000～3500PPm；⑤濕度控制0～3天或0～5天培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度為100％以后逐漸降為75～85％，20天后為70％；20～25天則可出苗，可直接移栽到苗床和營(yíng)養(yǎng)袋中，18～25天便可成為商品苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物組織的培養(yǎng)方法。用培養(yǎng)箱代替瓶子作培養(yǎng)容器,以利于植株對(duì)CO
文檔編號(hào)A01H4/00GK1214858SQ9812186
公開日1999年4月28日 申請(qǐng)日期1998年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月20日
發(fā)明者肖玉蘭, 趙家聰, 朱云霞, 韓亞平 申請(qǐng)人:昆明市環(huán)境科學(xué)研究所