本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種適于離體保存過程中蕨類孢子滅菌方法及接種，

背景技術：

我國的蕨類資源十分豐富，約有2600種，占全世界的1/5，其中很多是中國特有。蕨類植物不僅在生物進化和植物系統(tǒng)發(fā)育的研究中起著重要作用，也與人類生活聯系密切，許多蕨類植物在藥用、觀賞等眾多方面具有重要價值。可見，關于蕨類的商品化生產和栽培育種的開發(fā)具有廣闊前景。蕨類植物組織培養(yǎng)過程中，以孢子作為外植體進行組織培養(yǎng)具有不損害母株、繁殖系數大等優(yōu)點，是蕨類植物生產上使用最廣泛的繁殖途徑。蕨類孢子非常微小，呈粉塵狀，在進行無菌播種時，常用的方法有濾紙包裹或置于離心管等器皿中，再用次氯酸鈉或氯化汞消毒，無菌水多次沖洗后接種。由于蕨類孢子過于微小，在多個物種同時接種時，包裹法容易將孢子漏出造成混種，而多層的濾紙包裹又可能導致滅菌不充分；而離心滅菌法的操作過程中，其廢液去除困難，容易將孢子吸走，或因消毒液殘留而潛在延長滅菌時間，進而導致孢子失活。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對現有技術存在的缺陷，借助當前普遍可得的DNA純化柱(包含吸附柱和收集管)提供一種操作簡便，效率高，適于離體保存過程中的蕨類孢子滅菌及接種方法。

為實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案：

收集孢子，把蕨類孢子葉裝入硫酸紙袋中，標記代號后置于通風干燥處，待孢子自由脫落；把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；用對折過的硫酸紙收集脫落在紙袋中的孢子，簡單的去除碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質后沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，并做好標記，放置于離心管架上；在無菌條件下，加入600μl 75％乙醇，倒立純化柱1-2次，之后200-1200rpm離心20s。從加乙醇開始，直到完成離心，整個操作過程控制在30s左右；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl無菌水，反復吸打溶液使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，重復1-2次，洗脫乙醇；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl無菌水，反復吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，此操作重復3-4次，使消毒液徹底洗脫；再向離心之后的吸附柱中添加600μl無菌水，反復吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上，實現接種。

一種蕨類孢子的消毒及接種方法，該方法包括下述步驟：

步驟1：收集孢子，把蕨類孢子葉片裝入硫酸紙袋中，標記代號后置于通風干燥處，等孢子自由脫落；

步驟2：把DNA純化柱，規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；

步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質會留在擦鏡紙上達到簡單過濾的目的，然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標記，放置于離心管架上；

步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s，加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內；

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，重復1-2次；

步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架，在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s；

步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上，在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s；

步驟8：重復步驟7，3-4次；

步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上；

步驟10：把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，再移至光照條件培養(yǎng)2周后孢子萌發(fā)。

所述的一種蕨類孢子的消毒及接種方法在蕨類離體保存過程中的應用。

與現有技術相比，本發(fā)明所具備的優(yōu)益性在于：

1.本發(fā)明對蕨類植物生物進化和植物系統(tǒng)發(fā)育的研究中起著重要作用，也與人類生活聯系密切，許多蕨類植物在藥用、觀賞等眾多方面具有重要價值。本發(fā)明對蕨類的商品化生產和栽培育種的開發(fā)的提供了科學性強的可操作的消毒及接種方法。

2.蕨類植物組織培養(yǎng)過程中，以孢子作為外植體進行組織培養(yǎng)具有不損害母株、繁殖系數大等優(yōu)點，是蕨類植物生產上使用最廣泛的繁殖途徑。蕨類孢子非常微小，呈粉塵狀，在進行無菌播種時，常用的方法有濾紙包裹或置于離心管等器皿中，再用次氯酸鈉或氯化汞消毒，無菌水多次沖洗后接種。由于蕨類孢子過于微小，在多個物種同時接種時，包裹法容易將孢子漏出造成混種，而多層的濾紙包裹又可能導致滅菌不充分；而離心滅菌法的操作過程中，其廢液去除困難，容易將孢子吸走，或因消毒液殘留而潛在延長滅菌時間，進而導致孢子失活。本發(fā)明克服了蕨類植物包裹法和離心滅菌法存在的不足。

3.本發(fā)明克服了蕨類植物孢子在消毒過程中易出現的滅菌不充分、混種及消毒液殘留的問題，可有效降低污染率，提高接種效率。

4.本發(fā)明能高效地進行微量的蕨類孢子的消毒和接種，實驗器材易得、成本低廉、操作方便、接種效率高。

具體實施方式

下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實施例1：

1、材料：金毛狗Cibotiumbarometz(Linnaeus)J.Smith。

2、實驗器材：超凈臺、離心機、離心管架、DNA純化柱、移液槍、1ml槍頭、滅菌鍋

3、操作步驟：

步驟1：收集孢子，把金毛狗長有孢子的葉片裝入硫酸紙袋中，標記代號后置于通風干燥處，等孢子自由脫落。

步驟2：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用。

步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質會留在擦鏡紙上達到簡單過濾的目的。然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標記，放置于離心管架上。

步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s。加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內。

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。重復1-2次。

步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min，反復吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s。

步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。

步驟8：重復步驟7，3-4次。

步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上。

步驟10：把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，再移至光照條件培養(yǎng)一周后孢子萌發(fā)。

實施例2：

1、材料：三色鳳尾蕨Pterisaspericaulis var.tricolor(Linden)T.Moore ex E.J.Lowe。

2、實驗器材：超凈臺、離心機、離心管架、DNA純化柱、移液槍、1ml槍頭、滅菌鍋

3、操作步驟：

步驟1：收集孢子，把三色鳳尾蕨的孢子葉片裝入硫酸紙袋中，標記代號后置于通風干燥處，等孢子自由脫落。

步驟2：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用。

步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質會留在擦鏡紙上達到簡單過濾的目的。然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標記，放置于離心管架上。

步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s。加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內。

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。重復1-2次。

步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s。

步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。

步驟8：重復步驟7，3-4次。

步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上。

步驟10：把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，再移至光照條件培養(yǎng)2周后孢子萌發(fā)。