一種鯽魚腦組織細胞系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本申請涉及鯽魚細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種鯽魚腦組織細胞系及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鯽魚在分類上屬鯉科、鯉亞科、鯽屬。鯽魚在我國各地均有分布。有兩個亞種及多個變種:鯽亞種(Carassius auratus L)和銀鯽(Carassius auratus gibel1 Bloch)亞種；以及紅鯽、白鯽、金魚等多個變種。在我國淡水魚養(yǎng)殖業(yè)以及觀賞魚養(yǎng)殖業(yè)中，鯽魚占有十分重要的地位。因此，從細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、遺傳育種學(xué)等多方面展開對鯽魚的研究，意義重大。
[0003]鯽魚(Carassius auratus Linnaeus)的腦位于頂骨的下方，由端腦、間腦、視葉、小腦和延腦五部分構(gòu)成，全長約20mm，面積約160mm2，控制著鯽魚的嗅覺、視覺、味覺和運動系統(tǒng)，是鯽魚的最高中樞神經(jīng)系統(tǒng)。同時，鯽魚的腦組織也是多種病毒的靶器官，比如錦鯉皰疹病毒CyHV-1型、CyHV-2型、CyHV-3型均可感染鯽魚，造成腦組織的病變。
[0004]目前從鯽魚組織分離的細胞系僅有鯽魚囊胚胚胎細胞(CAB)、鯽魚鰭條細胞系，尚沒有鯽魚腦組織細胞系的相關(guān)研究和報道。但是，如前面提到的，感染鯽魚的多種病毒都是以鯽魚的腦組織為靶器官的；鯽魚腦組織細胞系相關(guān)研究和報道的缺乏，極大的限制了鯽魚病毒病癥的深入研究和疫病防治。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本申請的目的是提供一種鯽魚腦組織細胞系及其應(yīng)用。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案:
[0007]本申請一方面公開了一種鯽魚腦組織細胞系，該鯽魚腦組織細胞系為鯽魚腦組織中分離的鯽魚腦組織細胞，鯽魚腦組織細胞系的保藏號為CCTCC N0.C2015159。
[0008]本申請的鯽魚腦組織細胞系中，鯽魚腦組織細胞為上皮樣的星形膠質(zhì)細胞。
[0009]本申請的鯽魚腦組織細胞系能穩(wěn)定連續(xù)傳代至少80代。
[0010]本申請的另一面公開了本申請的鯽魚腦組織細胞系在鯽魚病毒的培養(yǎng)和/或檢測中的應(yīng)用。
[0011]需要說明的是，本申請的鯽魚腦組織細胞系，能夠穩(wěn)定傳代，可以作為鯽魚病毒的培養(yǎng)、檢測的宿主細胞，以便深入的研究鯽魚病毒，例如對鯽魚病毒進行培養(yǎng)，以便后續(xù)研究，或者培養(yǎng)后進行檢測等。本申請中，鯽魚病毒是指感染鯽魚的病毒，尤其包括以鯽魚腦組織為靶器官的病毒。
[0012]本申請的還公開了本申請的鯽魚腦組織細胞系作為研究水產(chǎn)動物病毒的宿主細胞的應(yīng)用。以及本申請的鯽魚腦組織細胞系在水產(chǎn)動物病毒的分離中的應(yīng)用。
[0013]可以理解，本申請的鯽魚腦組織細胞系雖然是主要針對鯽魚病毒而研究的，但是，其并不僅限于作為鯽魚病毒的宿主細胞，也可以作為其它水產(chǎn)動物病毒的宿主細胞，用于對水產(chǎn)動物病毒進行深入研究，或者培養(yǎng)后分離相關(guān)病毒或副產(chǎn)物。本申請中水產(chǎn)動物病毒是指對水產(chǎn)動物進行感染的病毒，包括但不僅限于鯽魚病毒。
[0014]由于采用以上技術(shù)方案，本申請的有益效果在于:
[0015]本申請的鯽魚腦組織細胞系，填補了鯽魚腦組織細胞系研究的空白，為感染鯽魚的病毒提供了一種新的研究工具，特別是為以鯽魚腦組織為靶器官的病毒的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
[0016]本申請的鯽魚腦組織細胞系命名為鯽魚腦星形膠質(zhì)細胞系CAA，英文全稱Carassius Auratus Astrocyte，簡稱CAA。本申請的鯽魚腦組織細胞系的保藏號為:CCTCCN0.C2015159;分類為:動物細胞系;保藏時間為:2015年9月23日；保藏單位是:中國典型培養(yǎng)物保藏中心;保藏地址是:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。
【附圖說明】
[0017]圖1是本申請實施例中培養(yǎng)的鯽魚腦組織細胞系的倒置相差顯微鏡的觀察結(jié)果圖；
[0018]圖2是本申請實施例中鯽魚腦組織細胞系在不同溫度下的生長曲線圖，圖中右手邊曲線末端由上到下的曲線為28°C下的生長曲線、25°C下的生長曲線、20°C下的生長曲線、15°C下的生長曲線；
[0019]圖3是本申請實施例中鯽魚腦組織細胞系的GFAP蛋白免疫熒光檢測結(jié)果圖；
[0020]圖4是本申請實施例中鯽魚腦組織細胞系的第80代細胞周期分布圖；
[0021]圖5是本申請實施例中鯽魚腦組織細胞系表達外源基因的熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0022]感染鯽魚的病毒中，有多種都是以鯽魚的腦組織為靶器官的；但是，現(xiàn)有技術(shù)中并沒有鯽魚腦組織細胞系的相關(guān)研究和報道;這極大的限制了以鯽魚腦組織為靶器官的病毒的研究。本申請的發(fā)明人在長期的研究和實踐中，提出了該問題，并率先研究出了分離自鯽魚腦組織中的鯽魚腦組織細胞系，從而提出了本申請。
[0023]本申請的鯽魚腦組織細胞系填補了鯽魚病毒研究的空白，尤其是方便了以鯽魚腦組織為靶器官的病毒的深入研究，為相關(guān)病毒的檢測、疫病防治等奠定了基礎(chǔ)。
[0024]此外，本申請的鯽魚腦組織細胞系為上皮樣的星形膠質(zhì)細胞，具有很強的增殖能力和活性，正常的二倍體核型，對外源基因有高效率的表達，為感染鯽魚的病毒性病原分離提供了一種新型的、穩(wěn)定的、高敏感性的細胞模型，為進一步研究鯽魚病毒的感染發(fā)病機理，提供了一種新的分子細胞水平理論研究的平臺。特別是目前對鯽魚造成極大危害的CyHV-2型病毒。
[0025]下面通過具體實施例和附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例和附圖僅對本申請進行進一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。
[0026]實施例
[0027 ] 一、鯽魚腦組織細胞系的構(gòu)建與保藏
[0028]1.組織分離
[0029]1.1培養(yǎng)基配置
[0030]全功能培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基L-15中，依次加入20 %胎牛血清、25ng/mL的人表皮生長因子、2mmol/L的L-谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100yg/mL的鏈霉素、1%的虹鱒魚血清。以上濃度均為各組份在全功能培養(yǎng)基中的終濃度，百分比為體積百分比。
[0031 ] PBS 緩沖液:取 8.0Og NaCl, 0.20g KCl，2.03g Na2HPO4.12H20，0.10g KH2PO4 溶于三蒸水定容為100mL，115°C高壓滅菌20min，置于-4°C冰箱備用。
[0032]消化液:用于細胞消化傳代的胰蛋白酶購自美國Sigma公司，將0.25g胰酶溶于I OOmL的PBS，過濾除菌，置于-20°C冰箱備用。
[0033]D-Hank ’ s液:取8.0Og NaCl, 0.40g KCl，0.13g Na2HPO4.12H20，0.06g KH2PO4,
0.35g恥!10)3，0.1(^酚紅溶入三蒸水配制成10001^，115°(3高壓滅菌201^11，置于-4°(3冰箱備用。
[0034]本例的基礎(chǔ)培養(yǎng)基L-15和胎牛血清購自GIBCO公司，人表皮生長因子、青霉素和鏈霉素購自Sigma公司，L-谷氨酰胺購自Merk公司，虹鱒魚血清購自美國caisson labs。
[0035]1.2動物和組織來源
[0036]本例采用的鯽魚為4-5cm的幼年健康鯽魚。先用冰塊使鯽魚進入無知覺狀態(tài)，然后在75 %的乙醇中浸泡I Omin，準(zhǔn)備采取組織。
[0037]1.3組織分離
[0038]在無菌狀態(tài)下用剪刀剪開鯽魚頂骨，打開腦腔，用鑷子小心的分離出腦組織，迅速放入事先準(zhǔn)備好的含有1000IU/mL的青霉素和1000yg/mL的鏈霉素冰冷的PBS中，清洗干凈；剝離脂肪組織，然后將腦組織在含有1000IU/mL的青霉素和1000yg/mL的鏈霉素冰冷的PBS中剪成2mm的小塊，用含有1000IU/mL的青霉素和lOOOyg/mL的鏈霉素冰冷的PBS充分清洗后，放置于含有0.1 % XIV型鏈酶蛋白酶的消化液中，37°C振蕩消化15min;消化完全的組織懸液用400目的網(wǎng)篩進行過濾，收集濾液，緩緩的將濾液放入無菌的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)瓶購自美國BD公司，添加配置好的全功能培養(yǎng)基，定容至5mL，顯微鏡下觀察細胞密度和狀態(tài)，判斷細胞的活力以及密度能否第二天鋪滿細胞瓶，一般采用活細胞計數(shù)法統(tǒng)計細胞數(shù)量，達到I X 16個/mL即可，隨后放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，無需CO2。
[0039]2.原代培養(yǎng)
[0040]每天觀察細胞生長情況，待生長大約2?3天，可見細胞鋪滿細胞瓶底部，形態(tài)似鋪路石狀，即獲得原代的鯽魚腦組織細胞。
[0041]3.傳代培養(yǎng)
[0042]原代細胞在大約5天左右，進入生長平臺期，此時棄去舊的培養(yǎng)基，用2mL緩沖液D-Hank ’ s液(PH = 7.0)，清洗細胞，清洗完后，再加入0.25 %胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到貼壁細胞變圓，細