本發(fā)明屬于干細(xì)胞保存技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液及其制備方法，本發(fā)明還涉及由該間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液制得的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞[mesenchymalstemcells,msc]是中胚層來源的一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，廣泛分布于人體多種組織，如骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、羊膜、羊水、月經(jīng)血、牙髓和胰腺等。間充質(zhì)干細(xì)胞可以發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有支持造血和免疫調(diào)節(jié)作用，在心血管疾病、肝硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、膝關(guān)節(jié)半月板部分切除損傷修復(fù)、自身免疫性疾病等方面具有長遠(yuǎn)的發(fā)展前景。

間充質(zhì)干細(xì)胞需要在gmp環(huán)境下大規(guī)模制備，之后運(yùn)輸?shù)结t(yī)院用于臨床治療。間充質(zhì)干細(xì)胞在gmp環(huán)境下處理后，并不能即時(shí)輸注，過渡期間必需使用可被臨床輸注的保存液進(jìn)行運(yùn)輸。目前常用的方法為凍存運(yùn)輸，此方法需要使用凍存保護(hù)劑，如二甲基亞砜(dmso)、乙二醇、甲醇、聚合物羥乙基淀粉等。最常用的dmso具有毒性會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、皮疹、腹痛、血壓過低、嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎衰竭和心血管疾病，其他的凍存保護(hù)劑也會(huì)不同程度對(duì)細(xì)胞造成損傷。因此，尋找一種不含凍存保護(hù)劑的方式保存運(yùn)輸細(xì)胞，對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用具有非常重要的意義。

目前，常用的短期儲(chǔ)存干細(xì)胞的保存液為m199、磷酸鹽緩沖液(pbs)、0.9％生理鹽水、5％葡萄糖、含1％人血白蛋白的dmem等。m199和pbs不是臨床批準(zhǔn)的注射用藥品，因此不能作為間充質(zhì)干細(xì)胞的保存液用于臨床治療。dmem為細(xì)胞培養(yǎng)基，但是僅用于科研使用，不作為臨床使用的試劑。盡管0.9％生理鹽水和5％葡萄糖是臨床安全的保存液，這兩種保存液保存的細(xì)胞存活率下降均較快，只適用于間充質(zhì)干細(xì)胞的即時(shí)使用，不能用于較長時(shí)間(如24h)運(yùn)輸后使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液，以解決現(xiàn)有技術(shù)的上述不足；與現(xiàn)有技術(shù)的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液相比，本發(fā)明不使用具有毒副作用和對(duì)細(xì)胞造成損傷的凍存保護(hù)劑，避免了凍存解凍步驟，極大地提高了臨床安全性和簡便性，同時(shí)延長了干細(xì)胞活性維持時(shí)間，保證24h運(yùn)輸后細(xì)胞活性仍能滿足臨床使用要求。因此，具有安全性高、便于運(yùn)輸、細(xì)胞活性高的優(yōu)點(diǎn)，使其為間充質(zhì)干細(xì)胞的短期低溫保存開辟了道路。

復(fù)方電解質(zhì)注射液在臨床上可在輸血前或輸血后輸注，可加入正在輸注的血液組分中，或作為血細(xì)胞的稀釋液。復(fù)方電解質(zhì)注射液可作為水、電解質(zhì)的補(bǔ)充源和堿化劑。人血白蛋白由健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取，臨床上可增加血容量和維持血漿膠體滲透壓、結(jié)合陽離子和陰離子以輸送不同物質(zhì)、在氮代謝障礙時(shí)作為氮源為組織提供營養(yǎng)。在細(xì)胞保存過程中，添加人血白蛋白可以保護(hù)細(xì)胞減少環(huán)境壓力和防止細(xì)胞貼附于管壁。因此，本發(fā)明采取向復(fù)方電解質(zhì)注射液中加入人血白蛋白注射液，作為保存液來保存間充質(zhì)干細(xì)胞，較好地避免了使用凍存保護(hù)劑的毒性問題，避免了凍存解凍步驟，極大地提高了臨床安全性和簡便性，且保證了24h運(yùn)輸后細(xì)胞活性仍滿足臨床使用要求，具有非常好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液，由體積比為1:100～1:5的人血白蛋白注射液和復(fù)方電解質(zhì)注射液組成；所述的人血白蛋白注射液為含人血白蛋白5g/25ml的注射液；所述的復(fù)方電解質(zhì)注射液為每1000ml含氯化鈉5.26g、葡萄糖酸鈉5.02g、醋酸鈉3.68g、氯化鉀0.37g和氯化鎂0.30g組成。

本發(fā)明還公開了上述的間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液的制備方法，將所述的人血白蛋白注射液加入到所述的復(fù)方電解質(zhì)注射液中，混合均勻，即制得所述的低溫保存液。

本發(fā)明還公開了上述的間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液制備的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液中含有濃度為8×10⁵個(gè)/ml～2×10⁷個(gè)/ml的間充質(zhì)干細(xì)胞。

優(yōu)選為，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明還公開了上述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法，至細(xì)胞濃度為8×10⁵個(gè)/ml～2×10⁷個(gè)/ml，向所述的間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液加入間充質(zhì)干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，即制得所述的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞注射液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

由本發(fā)明的一種間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液制得的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，通過使用人血白蛋白注射液和復(fù)方電解質(zhì)注射液制得的低溫保存液保存人間充質(zhì)干細(xì)胞，避免了使用具有毒副作用和對(duì)細(xì)胞造成損傷的凍存保護(hù)劑，且避免了凍存解凍步驟，極大地提高了臨床安全性和簡便性，同時(shí)延長了干細(xì)胞活性維持時(shí)間，保證24h運(yùn)輸后細(xì)胞活性仍能滿足臨床使用要求，具有安全性高、便于運(yùn)輸、細(xì)胞活性高、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為不同保存液低溫保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的細(xì)胞活率對(duì)比圖；

圖2為不同保存液低溫保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的貼壁對(duì)比圖；

圖3為不同保存液低溫保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的克隆形成對(duì)比圖；

圖4為本發(fā)明的低溫保存液保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的增殖能力趨勢圖；

圖5為本發(fā)明的低溫保存液保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的細(xì)胞成骨分化能力圖；

圖6為本發(fā)明的低溫保存液保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的細(xì)胞成脂分化能力圖；

圖7為本發(fā)明的低溫保存液保存運(yùn)輸人間充質(zhì)干細(xì)胞24h后的表面hla-dr、cd34、cd45、cd73、cd90和cd105檢測結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實(shí)際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一、主要儀器及試劑：

儀器：co2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、倒置相差顯微鏡、酶標(biāo)儀、熒光定量pcr儀、高效液相均是實(shí)驗(yàn)室所具備和使用的常規(guī)儀器，可在市場上購買。；

試劑：復(fù)方電解質(zhì)注射液購買于四川科倫藥業(yè)股份有限公司，人血白蛋白購買于上海生物制品研究所有限公司，胎牛血清、α-mem培養(yǎng)基、消化用tryple、臺(tái)盼藍(lán)、凋亡試劑盒、alamarblue試劑盒、成骨分化試劑盒、成脂分化試劑盒、茜素紅、油紅o和表面標(biāo)記抗體也均直接在市場上購買。

二、實(shí)施例

實(shí)施例1：由本發(fā)明的一種間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液制得的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液與其他配方制得的注射液進(jìn)行細(xì)胞活率、貼壁情況和克隆形成情況的比較

1.1制備本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液和他配方注射液

各不同保存液的配方、保存溫度和保存時(shí)間，如表1所示。

unstored組為對(duì)照組，即10％胎牛血清(fbs)加入到α-mem中制得保存液，然后將新鮮消化的細(xì)胞懸浮于該保存液，至細(xì)胞密度1×106cells/ml，不進(jìn)行保存操作，直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

復(fù)方電解質(zhì)注射液(me)+人血清白蛋白(hsa)組為本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，即5％hsa加入到復(fù)方電解質(zhì)注射液中制得保存液，然后將新鮮消化的細(xì)胞懸浮于該保存液，至細(xì)胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

生理鹽水注射液(ns)+hsa組為由5％hsa加入到生理鹽水中制得的保存液，然后將新鮮消化的細(xì)胞懸浮于該保存液，至細(xì)胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

葡萄糖(glucose)組為購得的5％葡萄糖作為保存液，將新鮮消化的細(xì)胞懸浮于該保存液，至細(xì)胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

gm組為將10％fbs加入到α-mem中制得保存液，然后將新鮮消化的細(xì)胞懸浮于該保存液，至細(xì)胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液與其他配方注射液

1.2本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液與其他配方注射液的各項(xiàng)性能檢測方法

(1)細(xì)胞活率檢測

取上述不同配方的注射液，測試細(xì)胞活率，檢測方法為臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)典染色法。

(2)貼壁測試

取上述不同配方的注射液，接種細(xì)胞在100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，細(xì)胞接種密度為1×10⁶個(gè)/皿。接種24h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

(3)克隆形成實(shí)驗(yàn)

取上述不同配方的注射液，接種細(xì)胞在60mm皿上，細(xì)胞接種密度為250個(gè)/皿。每3天更換新鮮培養(yǎng)基。接種10～14天后，至顯微鏡下出現(xiàn)較多明顯克隆，結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下數(shù)克隆數(shù)。每個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于50個(gè)。克隆形成率％＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％。

1.3本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液與其他配方注射液的各項(xiàng)性能檢測結(jié)果

(1)細(xì)胞活率結(jié)果

如圖1所示，me+hsa組，ns+hsa組細(xì)胞活率明顯高于葡萄糖組。由于葡萄糖組細(xì)胞死亡較多，不適合作為保存液。gm組結(jié)團(tuán)率很高，顯著大于其他組。gm組結(jié)團(tuán)率太高，臨床使用會(huì)給病人帶來嚴(yán)重不良反應(yīng)，不適合作為保存液。

(2)貼壁測試

如圖2所示，me+hsa的細(xì)胞貼壁形態(tài)較好，較接近于對(duì)照組unstored組，ns+hsa的貼壁細(xì)胞明顯減少，說明經(jīng)過ns+hsa運(yùn)輸后細(xì)胞貼壁性能下降明顯。

(3)克隆形成實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，所有組都能形成克隆，但是me+hsa組的克隆形成能力明顯高于ns+hsa，所以，ns+hsa不適合用作保存液。

通過以上結(jié)果看出，本發(fā)明的低溫保存液me+hsa適合用于間充質(zhì)干細(xì)胞的低溫保存。

實(shí)施例2：由本發(fā)明的一種間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液制得的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液進(jìn)行增殖能力檢測、細(xì)胞成骨分化能力測試、細(xì)胞成脂分化能力測試和細(xì)胞表面標(biāo)記檢測。

2.1制備本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液

將5％hsa加入到復(fù)方電解質(zhì)注射液中制得保存液，然后將新鮮消化的細(xì)胞懸浮于該保存液中，至細(xì)胞密度5×10⁶個(gè)/ml，保存24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

unstored組即為上述的unstored組，是細(xì)胞制備結(jié)束后，消化得到的新鮮細(xì)胞，不經(jīng)歷低溫保存。unstored組為對(duì)照組，象征細(xì)胞最佳的狀態(tài)。設(shè)置該組是為了檢驗(yàn)經(jīng)過我們低溫保存后，細(xì)胞的狀態(tài)是否發(fā)生顯著性改變，如細(xì)胞活率是否顯著降低等。

本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的各項(xiàng)性能檢測方法

(1)增殖能力檢測

取本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，接種細(xì)胞在24孔板上，細(xì)胞接種密度為2×10⁴個(gè)/孔。接種24h后，將培養(yǎng)基更換為含10％alamarblue的培養(yǎng)基，37℃的co2培養(yǎng)箱中孵育3h后，測定熒光值，波長為570nm和590nm。

(2)細(xì)胞成骨分化能力測試

取本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，接種細(xì)胞在12孔板上，細(xì)胞接種密度為5×10³個(gè)/孔。每3天更換新鮮培養(yǎng)基。至細(xì)胞長至約80％融合時(shí)，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，21天時(shí)用茜素紅染色，顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)照組為正常培養(yǎng)基組，不添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

(3)細(xì)胞成脂分化能力測試

取本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，接種細(xì)胞在12孔板上，細(xì)胞接種密度為1×10⁴個(gè)/孔。每3天更換新鮮培養(yǎng)基。至細(xì)胞長至約80％融合時(shí)，更換培養(yǎng)基為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，21天時(shí)用油紅o染色，顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)照組為正常培養(yǎng)基組，不添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

(4)細(xì)胞表面標(biāo)記檢測

取本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，1000rpm離心5min后，用pbs清洗兩次，用含2％胎牛血清的pbs重懸細(xì)胞，加入抗體孵育30min后，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.3本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的各項(xiàng)性能檢測結(jié)果

(1)增殖檢測結(jié)果

如圖4所示，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液低溫保存24h后，細(xì)胞經(jīng)過短暫的停滯后迅速增殖，于第9天達(dá)到峰值。

(2)成骨分化結(jié)果

如圖5所示，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液低溫保存24h后，細(xì)胞依然具有成骨分化能力，和不誘導(dǎo)的對(duì)照組相比，有明顯的鈣結(jié)節(jié)。

(3)成脂分化結(jié)果

如圖6所示，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液低溫保存24h后，細(xì)胞仍然具有成脂分化的能力，和不誘導(dǎo)的對(duì)照組相比，有明顯的油滴。

(4)細(xì)胞表面標(biāo)記檢測結(jié)果

如圖7所示，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液低溫保存24h后，細(xì)胞表面標(biāo)記hla-dr、cd34、cd45依然為陰性表達(dá)(＜2％)，cd73、cd90、cd105依然為陽性表達(dá)(＞95％)，保存后表面標(biāo)記未發(fā)生明顯改變。

以上結(jié)果表明，經(jīng)過本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液低溫保存24h后的間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞仍然具有較高的增殖潛能、成骨和成脂分化能力，及細(xì)胞表面標(biāo)記未發(fā)生顯著性改變。

綜上，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液可以在24h內(nèi)維持較高的細(xì)胞活率、較好的貼壁能力、較好的克隆形成能力。同時(shí)，保存后的間充質(zhì)干細(xì)胞仍然具有較高的增殖潛能、成骨成脂分化能力，細(xì)胞表面標(biāo)記未明顯降低。本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存液不含有毒副作用和對(duì)細(xì)胞造成損傷的凍存保護(hù)劑，不需要凍存解凍步驟，使用臨床安全可靠的保存液，方便快捷、安全可靠、成本低廉、細(xì)胞活率高、細(xì)胞免疫功能高，具有非常好的應(yīng)用前景。

以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實(shí)施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。