專(zhuān)利名稱(chēng)：一種顯著提高外源基因在植物中轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平以及遺傳穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核基質(zhì)結(jié)合序列(MAR)TM6的功能及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技 術(shù)領(lǐng)域。用MAR序列改造常用的單子葉植物表達(dá)載體PCAMBIA1301及雙子葉植物表達(dá)載體 PBI121，使其攜帶的外源基因在植物中的轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平以及遺傳穩(wěn)定性得到顯著提
尚ο
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)廣泛的應(yīng)用于物種改良和分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，隨著大量轉(zhuǎn)基因植 物的獲得，人們發(fā)現(xiàn)外源基因沉默和外源基因表達(dá)量過(guò)低的問(wèn)題普遍存在(Fagard M, et al. ,Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol,2000,51 167-194)。近年來(lái)研究表明將MAR 序列構(gòu)建到表達(dá)載體外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)可以消除基因沉默的現(xiàn)象，能夠增強(qiáng)基因表達(dá) 或降低轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化個(gè)體間的表達(dá)差異(Spiker S，et al.，Plant Physiol, 1996,110 15-21)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明人同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自身分離的不同類(lèi)型的啟動(dòng)子，如光合組織特異啟動(dòng)子 PNZIP，冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子DREB及C0R15等，我們分析了在MAR調(diào)控下不同類(lèi)型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基 因植物中的表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)表明TM6序列本身并不具有調(diào)控的基因表達(dá)的功能，但其可以 作為一類(lèi)增強(qiáng)子元件來(lái)增強(qiáng)啟動(dòng)子的作用效果，但并不改變啟動(dòng)子的作用模式(Zhang MM, et al.，Physiologia Plantarum，2007，129 :644_651)。與此同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室還證實(shí)我們所 分離的煙草MAR序列在調(diào)控方向上具有雙向性，為表達(dá)載體的構(gòu)建及改造工作帶來(lái)了方便 (Zhang JD, etal. ,Transgenic Res，2008，10 :112_120)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用核基質(zhì)分離法從煙草基因組中分離出具有MAR序列特征的DNA片段 TM6，克隆于pMD 18-T載體。以超聲波處理的大腸桿菌基因組DNA作競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與核基 質(zhì)進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，鑒定MAR序列與核基質(zhì)的特異結(jié)合能力，篩選出結(jié)合能力較強(qiáng)的MAR 序列。將本實(shí)驗(yàn)室自主分離出的一系列啟動(dòng)子，替換掉單/雙子葉植物表達(dá)載體PBI121/ PCAMBIA1301內(nèi)組成型35S/Ubi啟動(dòng)子(圖1)。然后將該TM6序順向插入以上改造以后的 單/雙子葉植物表達(dá)載體pBI121/pCAMBIA1301 gusA報(bào)告基因表達(dá)盒的兩端，構(gòu)建成植物 表達(dá)載體PBI121MARII和pCAMBIA1301MARII (圖2)。通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，用葉 盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草外植體和水稻愈傷，在含有羧芐和卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選抗性植株。 取轉(zhuǎn)基因植株成熟葉片150mg進(jìn)行GUS酶活檢測(cè)，檢測(cè)表明(1) TM6序列能使gusA基因表 達(dá)比對(duì)照增強(qiáng)7-10倍(圖3)。高于外國(guó)文獻(xiàn)報(bào)道的強(qiáng)MAR序列的增強(qiáng)效果(2倍)(Ulker B，etal.，Plant J，1999，18(3) ；253-263) ； (2)TM6序列能有效的提高抗性基因的篩選壓， 從而提高轉(zhuǎn)化頻率(圖4)。對(duì)煙草轉(zhuǎn)基因后代穩(wěn)定性的遺傳檢測(cè)的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)TM6序 列將后代個(gè)體間的遺傳穩(wěn)定性提高了 30% (圖5)。因此TM6序列是一個(gè)顯著增強(qiáng)外源基
3因在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定表達(dá)，能提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平和植物轉(zhuǎn)化效率 的MAR序列，可以作為一個(gè)強(qiáng)的增強(qiáng)子元件用于植物基因工程，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖1 連有不同類(lèi)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體的構(gòu)建，及轉(zhuǎn)基因水稻及煙草植株的酶活 檢測(cè)圖l(a)PNZIP/DREB啟動(dòng)子替換pCAMBIA1301/pBI121表達(dá)載體上組成型35S/Ubi啟動(dòng) 子nptll 卡那霉素抗性基因RB和LB =T-DNA的右邊界序列和左邊界序列Ori 質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)GUS β -D-半乳糖甘酶CaMV35S 花椰菜花葉病毒基因的啟動(dòng)子PNZIP 光合組織特異啟動(dòng)子DREB 冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子圖1 (b)雙子葉植物煙草中GUS酶活性檢測(cè)及染色1 (c)單子葉植物水稻中GUS酶活性檢測(cè)及染色2 植物表達(dá)載體的系列改造圖譜圖3 :TM6驅(qū)動(dòng)不同類(lèi)型啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中的GUS表達(dá)活性的檢測(cè)柱狀圖表示的是不同轉(zhuǎn)基因植株的平均GUS活性。橫坐標(biāo)表示的是檢測(cè)的植物組 織名稱(chēng)；縱坐標(biāo)表示的是每種轉(zhuǎn)基因群體的平均GUS活性。我們從每種轉(zhuǎn)基因群體中選擇 十個(gè)株系進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)重復(fù)三次。gusA Northern blot表示gusA基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。水稻actin基因的表達(dá)在這里作為標(biāo)定RNA點(diǎn)樣量一致的標(biāo)準(zhǔn)。a、b、c...表示不同轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織染色圖片。圖片放大倍數(shù)為2. 5倍。 圖中的‘_，表示⑶S表達(dá)核兩側(cè)未連MAR的轉(zhuǎn)基因株系。而‘ +，表示表達(dá)核兩側(cè)連有MAR 的轉(zhuǎn)基因株系。圖4 轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)化頻率的分析圖4 (a)單子葉植物水稻中轉(zhuǎn)化頻率，Rl指載體pCAMBIA1301，R2指載體 PCAMBIA1301TM6。圖4(b)雙子葉植物煙草中轉(zhuǎn)化頻率，Yl指載體pBI121，Y2指載體pBI121TM6。圖5 :TM6對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草后代遺傳穩(wěn)定性的影響如圖4中分別選取Tl代轉(zhuǎn)有TM6的轉(zhuǎn)基因煙草中高表達(dá)⑶S的三個(gè)株系，低表達(dá) GUS的三個(gè)株系，以及未有TM6的轉(zhuǎn)基因煙草的三個(gè)株系作為非輪回親本與野生型煙草回 交后，對(duì)獲得BCl代煙草植株進(jìn)行的組織化學(xué)染色與PCR鑒定結(jié)果。其中Tl顯示Tl代非 輪回親本GUS染色情況，H代表組織染色結(jié)果，PCR代表轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果。士分別代表 結(jié)果陽(yáng)性與陰性。具體發(fā)明實(shí)施方式實(shí)施例1 植物表達(dá)載體的改造1.設(shè)計(jì)特異引物來(lái)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室特異的啟動(dòng)子序列PNZIP及DREB，所用引物如下所不PNZIP啟動(dòng)子引物5-ACTCAAAGCTTACATGGGGATGAGGCAGG-3
5-CATCAGGATCCGGGTAGAGTGTACTGT-3DREB啟動(dòng)子引物5-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-35-ATAATCTTGAACTACAAAATCCA-32.將擴(kuò)增的啟動(dòng)子片段進(jìn)行HindIII和BamHI雙酶切，替換掉35S啟動(dòng)子，將構(gòu)建 好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化水稻和煙草。實(shí)施例2 連有TM6的表達(dá)載體的構(gòu)建1.限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和EcoRI分別單酶切TM6從克隆載體pMD 18-T上 切下來(lái)，將HindIII和EcoRI處理后的MAR片段分別插入到堿性磷酸酶處理的ρΒΙ121 載體和pCAMBIA1301載體的HindIII和EcoRI位點(diǎn)上(即⑶S報(bào)告基因表達(dá)盒兩端位 點(diǎn))。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci細(xì)胞，然后在含卡那青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn) 行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。用ΤΜ6上游引物(atcgaattcttcagagagccaag)和 下游引物(ccgtgttctctccaaatg)檢測(cè)HindIII插入位點(diǎn)TM6的方向和用GUS上游引物 (ggtgattaccgacgaaaacg)和 MAR下游弓丨物(catacgcgtccaaccctaaaagtttac)檢測(cè) EcoRI 插 入位點(diǎn)MAR的方向。篩選出順向插入MAR的PBI121TM6載體和pCAMBIA1301TM6載體(圖 2)。2.將構(gòu)建好的表達(dá)載體PBI-PNZIP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105和LBA4404。實(shí)施例3 雙子葉植物煙草和單子葉植物水稻的轉(zhuǎn)化與GUS表達(dá)活性的檢測(cè)(圖 3)1煙草的轉(zhuǎn)化與鑒定(1).種植組培苗無(wú)菌煙草。(2).挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單菌落于含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C 振蕩培養(yǎng)。(3). 3000rpm離心5min，農(nóng)桿菌沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮。(4).將煙草葉片切成小塊，放入上述懸浮液浸泡lOmin。(5).侵染后的葉片切塊置于分化培養(yǎng)基(1XMS鹽，3%蔗糖，pH5. 8,4. 5g/L卡拉 膠，)上共培養(yǎng)2天，(6).然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(1 XMS鹽，，3%蔗糖，pH5. 8，4. 5g/L卡拉膠，卡那霉素 100mg/L，卡那霉素100mg/L，頭孢青霉素250100mg/L)篩選，得到抗性芽。(8).切去抗性芽，然后將芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1XMS鹽，，3%蔗糖，pH5.8，4.5g/ L卡拉膠，卡那霉素50mg/L，卡那霉素100mg/L，頭孢青霉素250mg/L)，直至長(zhǎng)出小植株。2水稻的轉(zhuǎn)化與鑒定(1)去殼的成熟種子用10%的次氯酸鈉消毒十min，然后用無(wú)菌水沖洗5次。(2)將水稻種子置于N6D2的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，20天后將成熟盾片處長(zhǎng)出的 愈傷組織繼代于N6D2的培養(yǎng)基中。(3)在農(nóng)桿菌侵染前將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的N6D2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。
(4)挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單菌落于含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振 蕩。(5) 3000rpm離心5min，農(nóng)桿菌沉淀用N6D2的液體培養(yǎng)基懸浮。(6)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織用農(nóng)桿菌侵染20min。(7)用無(wú)菌濾紙洗去多余的農(nóng)桿菌液，讓后置于N6D2培養(yǎng)基中，260C，黑暗，共培養(yǎng) 3天。(8)將共培養(yǎng)后的愈傷用含有250mg/L的頭孢霉素的N6D2液體培養(yǎng)基中，洗滌8 次，再用無(wú)菌水洗干。(9)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到N6D2CH固體篩選培養(yǎng)基中，26°C，暗培養(yǎng)，每2周換一次培養(yǎng)基。(10)將反復(fù)篩選獲得的抗性組織轉(zhuǎn)移到N6D2CH+S高滲培養(yǎng)基中，26°C，暗培養(yǎng)2 周。(11)將抗性組織轉(zhuǎn)移到MSR分化培養(yǎng)基中，26°C，暗培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)為26°C，光16 小時(shí)/暗8小時(shí)培養(yǎng)。(12)將再生的芽轉(zhuǎn)到新鮮的MS培養(yǎng)基中，直至長(zhǎng)出小植株。3⑶S表達(dá)活性的定量測(cè)定及染色3. 1.⑶S表達(dá)活性的定量測(cè)定(1)分別稱(chēng)取各類(lèi)轉(zhuǎn)基因植株葉片、根、莖和花各100!1^，加入50(^1^提取緩沖液 (50mmol/L 磷酸鈉 pH 7. 0，IOmmol EDTA，0. 1% Triton X-100，10mmol/L 的 β -巰基乙醇) 在研缽中研成勻漿。(2) 4000 Xg 離心 lOmin，收集上清液。(3)在Iml預(yù)熱的反應(yīng)緩沖液中(提取液中加入lmmol/L MUG)加入20 μ L上清， 混勻，于37°C下反應(yīng)15min后取出100 μ L加入到900 μ L反應(yīng)終止液中終止反應(yīng)。(4)用日立-850型熒光分光光度計(jì)測(cè)定各樣品Ex365/Em455值。(5)取上清20 μ L，用水定容至4ml，加入Iml考馬斯亮藍(lán)溶液，測(cè)定595nm光吸收值。(6)用4-甲基傘形酮(4-MU)的皮摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)含量及時(shí)間的比值(4_MU pmolMU/mg蛋白/min)表示GUS活性。3. 2. GUS活性染色將煙草或水稻的葉片或根系剪成1_2厘米片段，材料沖洗干凈 后置于GUS染色液(0. IM磷酸鈉緩沖液；IOmM EDTA ；0. 5mM鐵氰化鉀；0. 5mM亞鐵氰化鉀； ImMX-gluc ；0. 1% Triton X-100)中染色(抽真空)2-24小時(shí)，用固定液固定。用50%， 60%，70%，80%，90%乙醇分別脫水301^11后，在100%乙醇中放置1小時(shí)?？梢灾苯佑^測(cè) 到染色結(jié)果。將反應(yīng)緩沖液于37°C預(yù)熱。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)化頻率的分析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草和水稻后不斷觀察葉圓盤(pán)的生長(zhǎng)狀況發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化有TM6載體的外 植體比不含RB7的外植體較早地產(chǎn)生抗性芽點(diǎn)，而且產(chǎn)生較多的抗性苗，長(zhǎng)勢(shì)均一(圖4)。 轉(zhuǎn)化TM6載體的外植體在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)首先長(zhǎng)出抗性芽點(diǎn)或愈傷，較對(duì)照早；含有TM6 對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草外植體轉(zhuǎn)化頻率的影響表格如下表1所示。含有TM6對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 水稻愈傷與外植體轉(zhuǎn)化頻率的影響表格如下表2所示。
6
表TM6對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化頻率的影響
權(quán)利要求
一種顯著提高外源基因在植物中轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平以及遺傳穩(wěn)定性的方法，其特征在于核基質(zhì)結(jié)合序列TM6具有下述所示的核苷酸序列tttaccgtag accaagttaa ggagttttag aagcactttg catgggagca ttagtgtatg60ttatggcttt atcaaatata ggttttgaag attcagagag ccaagaaaag ctagaaccca120agaactagga agttagagta attcacaata ccataacgtg atataaaact ttttattgta180actcaaatcg gtaatatttt ttgctttagt cttaatcgat aaattatttt tttatattga240ttagttatag gaggctcaca aagttgggaa taattaaaat atcatatttt gtatttgaac300aatttatgaa atagtaattg gtaaaaaatc actttaaatt tttatcctat atccagaagg360attatggtgt ctggcatagt tgtttggaag atttgaatca gggtaaaagt atgttgtaat420ttttattttg ttataggcat tttttgtgct tgattgtttt gttgtcatta tattttatta480tttggaagtg tatatatatg tttgattaaa atatagataa tcaattttat aagaaatttg540caacaattac acaaggataa agtctacaat atgcgagtaa aatttgattg aacctaggat600gtcatattta atgcatattt tatttcaatg tgtttattat acatctattg tattatatg 659
2. 一種顯著提高外源基因在植物中轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平以及遺傳穩(wěn)定性的方法，其特 征在于將該煙草核基質(zhì)結(jié)合序列TM6序列構(gòu)建于外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)，能夠顯著提高外 源基因的轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)基因在后代中的遺傳穩(wěn)定性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種顯著提高外源基因在植物中轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平以及遺傳穩(wěn)定性的方法。利用核基質(zhì)分離法，從煙草中分離的一段核基質(zhì)結(jié)合序列(MAR)TM6構(gòu)建到不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的單/雙子葉植物表達(dá)載體報(bào)告基因表達(dá)盒的兩端，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入植株。獲得轉(zhuǎn)基因植物中，攜帶有TM6的外源基因的表達(dá)量比未攜帶TM6的高10倍，其轉(zhuǎn)化效率提高了40％，同時(shí)轉(zhuǎn)有MAR的轉(zhuǎn)基因植物將外源基因在后代個(gè)體間的遺傳穩(wěn)定性提高了30％。同時(shí)TM6可以作為增強(qiáng)子元件顯著提高啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，但并不改變啟動(dòng)子的表達(dá)模式。因此，TM6可以用于植物基因工程，能有效的提高外源基因在植物中得轉(zhuǎn)化效率，表達(dá)水平及轉(zhuǎn)基因后代遺傳穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101974525SQ20101026850
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者冀蘆沙, 盧龍濤, 吳長(zhǎng)艾, 楊國(guó)棟, 許瑞, 鄭成超, 黃金光 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)