參與精子轉(zhuǎn)染外源dna的基因篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CD4分子是一類相對(duì)分子質(zhì)量約為55 000 (單位）的單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫 球蛋白超家族，主要表達(dá)于部分T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、某些B細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞、單 核-巨噬細(xì)胞以及特定區(qū)域的腦細(xì)胞表面。其在T細(xì)胞發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞 免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用。然而，當(dāng)CD4分子的正常免疫學(xué)功能失 調(diào)或遭到破壞時(shí)，即可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。近幾年的研宄表明，HIV-I的包膜糖蛋白gpl20 與T細(xì)胞表面的CD4受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)人細(xì)胞而造成細(xì)胞病變。同時(shí)，CD4分子作為精 子膜蛋白受體，有很多學(xué)者都進(jìn)行了相關(guān)研宄，發(fā)現(xiàn)CD4在精子內(nèi)化外源DNA上發(fā)揮著重要 作用。Lavitrano發(fā)現(xiàn)敲除⑶4基因的小鼠的精子具有與野生型小鼠相同的結(jié)合外源DNA 能力，不同的是CD4基因敲除小鼠精子內(nèi)化外源DNA的能力也隨之消失，而野生型CD4小鼠 仍然有30%?54%的陽性率；野生型CD4小鼠的成熟精子與CD4抗體孵育后，其結(jié)合性能 與⑶4敲除小鼠完全一致，研宄表明⑶4可能參與了外源DNA的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。其他人的 研宄也顯示精子膜上⑶4參與外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)；而且還發(fā)現(xiàn)封閉⑶4分子的精子仍部分具有 轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA的能力。這說明精子結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA不僅有⑶4發(fā)揮作用，而是多個(gè)分子 共同作用的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種篩選參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA基因的方法。按以下步驟進(jìn) 行：
[0004] 一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-mCD4 ;
[0005] 二、cDNA文庫篩選獲得待測(cè)基因；
[0006] 三、待測(cè)基因陽性克隆抽提酵母質(zhì)粒并擴(kuò)增；
[0007] 四、質(zhì)粒pGB-mCD4與待測(cè)基因陽性克隆酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母雙雜交菌株Y190 ;
[0008] 五、進(jìn)行β -galactosidase顯色反應(yīng)，顯色結(jié)果變藍(lán)的為陽性，分析，獲得參與精 子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因。
[0009] 酵母雙雜交菌株Y190的報(bào)告基因?yàn)殡p基因 HIS3和lacZ，可以減少雙雜交的結(jié)果 假陽性。本發(fā)明將誘餌載體pGB-mCD4轉(zhuǎn)入酵母雙雜交菌株Y190中，由于在酵母雙雜交菌 株Y190中CD4沒有與相互作用蛋白作用，誘餌載體的BD端不能和相互作用蛋白的AD相互 靠近進(jìn)行作用，因此不能啟動(dòng)下游報(bào)告基因 HIS3和IacZ的表達(dá)，表現(xiàn)為β -galactosidase 顯色不變藍(lán)。因此，本發(fā)明構(gòu)建的誘餌載體pGB-mCD4在酵母雙雜交菌株Y190中不能自激 活（β -galactosidase顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果為不變藍(lán)，如圖2所示）。
[0010] 利用誘館載體pGB-mCD4和待測(cè)基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母雙雜交菌株Y190,即進(jìn)行酵母 雙雜交，之后再進(jìn)行β-galactosidase顯色反應(yīng)、分析，獲得可與⑶4相互作用的基因，得 到與⑶4共同作用轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA的基因。
[0011] 通過本發(fā)明的方法能夠大量、快速的獲得與CD4共同作用轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA的基因，為 精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移機(jī)理的研宄開辟新的思路，最終為建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效的精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基 因方法學(xué)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0012] 圖1是重組質(zhì)粒pGB-mCD4的凝膠電泳圖。
[0013] 圖2是重組質(zhì)粒pGB_mCD4的β -galactosidase顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0014] 圖3是質(zhì)粒pGB-mCD4與待測(cè)基因陽性克隆酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母雙雜交菌株Y190 后β-galactosidase顯色實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0015] 一：本實(shí)施方式參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因篩選方法，按以下步 驟進(jìn)行基因篩選：
[0016] -、構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-mCD4 ;
[0017] 二、cDNA文庫篩選獲得待測(cè)基因；
[0018] 三、待測(cè)基因陽性克隆抽提酵母質(zhì)粒并擴(kuò)增；
[0019] 四、質(zhì)粒pGB-mCD4與待測(cè)基因陽性克隆酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母雙雜交菌株Y190 ;
[0020] 五、進(jìn)行β -galactosidase顯色反應(yīng)，顯色結(jié)果變藍(lán)的為陽性，分析，獲得參與精 子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因。
[0021] 重組質(zhì)粒pGB_mCD4的β -galactosidase顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果未變藍(lán)，為陰性，如 圖2所示。利用誘館載體pGB-mCD4和待測(cè)基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母雙雜交菌株Y190再進(jìn)行 β -galactosidase顯色反應(yīng)，β -galactosidase顯色結(jié)果變藍(lán)的為陽性（如圖3所示）， 說明BD與AD接近激活下游啟動(dòng)子的報(bào)告基因表達(dá)，證明該基因與CD4共同作用轉(zhuǎn)運(yùn)外源 DNA，參與了精子轉(zhuǎn)染外源DNA。
[0022] 重組質(zhì)粒pGB_mCD4的β-galactosidase顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果未變藍(lán)，為陰性，如圖2所 不O
【具體實(shí)施方式】 [0023] 二：本實(shí)施方式與一的不同點(diǎn)是：步驟一中的重組質(zhì) 粒pGB_mCD4可按以下步驟構(gòu)建：
[0024] ①目的片段的獲得：
[0025] SPF級(jí)昆明小鼠睪丸組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng) 體系如表1所示，PCR反應(yīng)條件如表2所示；PCR引物為forward primer和reverse primer，
[0026] forward primer 序列為 5' -GGCCAATCCGGCC-3'，
[0027] reverse primer 序列為 5' -GGCCTCTAAGGCC-3' ；
[0028] 表 I
[0029]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行基因篩選： 一、 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB_mCD4 ; 二、cDNA文庫篩選獲得待測(cè)基因； 三、 待測(cè)基因陽性克隆抽提酵母質(zhì)粒并擴(kuò)增； 四、 質(zhì)粒pGB-mCD4與待測(cè)基因陽性克隆酵母質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母雙雜交菌株Y190 ; 五、 進(jìn)行0-galactosidase顯色反應(yīng)，顯色結(jié)果變藍(lán)的為陽性，分析，獲得參與精子轉(zhuǎn) 染外源DNA的基因。
2. 權(quán)利要求1所述的參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于步驟一中的 重組質(zhì)粒pGB-mCD4按以下步驟構(gòu)建： ①目的片段的獲得： SPF級(jí)昆明小鼠睪丸組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體 系如下所示：
PCR反應(yīng)條件如下所示：
PCR弓丨物為forwardprimer和reverseprimer,forwardprimer序列為 5' -GGCCAATCCGGCC-3'，reverseprimer序列為 5' -GGCCTCTAAGGCC-3' ； ② 回收目的片段mCD4; ③mCD4與pGB質(zhì)粒載體連接 連接體系：連接1UL10XT4buffer、lyL濃度為50ng/yL的PGEM-T、1yL濃度為 150ng/yL的mCD4、0. 5yLT4連接酶和6. 5yL蒸餾水組成；16°C連接過夜或室溫lh以上； 即得到重組質(zhì)粒pGB-mCD4。
3. 權(quán)利要求1所述的參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于步驟二中利 用MouseTestisMATCHMAKERcDNA文庫進(jìn)行篩選。
4. 權(quán)利要求3所述的參與精子轉(zhuǎn)染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于步驟二中按 以下步驟進(jìn)行篩選： (1) 挑10個(gè)2mm克隆接種于lmLSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，混勻后轉(zhuǎn)入150mLSD/-Trp振蕩培養(yǎng)20h(過夜），至0D6QQ= 1. 2 ; (2) 150mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入 2000mLYPDA(YPD+Adenine)中混勻，此時(shí) 0D_