專利名稱：一種致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物防治領(lǐng)域中的一種蟲生真菌選育方法。
背景技術(shù)：
運用昆蟲的真菌天敵研制成真菌制劑以防治蟲害，是害蟲生物防治的重要內(nèi)容。但是始終面臨著兩個難以解決的問題，其中之一就是真菌菌株對害蟲致病力不穩(wěn)定問題。一般一個生產(chǎn)菌株連續(xù)3代后致病力會下降，這是由于在準性重組過程中不同基因型的核易于分離，從而出現(xiàn)所謂“菌種退化”，給生產(chǎn)應用帶來很多麻煩。
從理論上講，理化誘變、異核體合成及準性重組是大多數(shù)半知菌亞門昆蟲病原真菌培育高毒力菌株的三個基本途徑。只是目前的一些工作表明，理化因素誘變的昆蟲病原真菌的形態(tài)或營養(yǎng)缺陷型突變體，其毒力常常降低甚至完全喪失。在昆蟲病原真菌中，不少的間接材料已說明了異核體具有比合成它的親本菌株較高的毒力水平。在生防實踐中采用人工合成異核體“制種”，是一值得探索的途徑。目前僅在金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliea)等為數(shù)不多的種中通過原生質(zhì)體融合實現(xiàn)了準性重組真正育成比親本毒力更高的新菌種。然而，比原生質(zhì)體融合手段更簡便，而又不需要對親本菌株做理化誘變的方法未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述缺點，而提供一種用于生產(chǎn)防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)和牧業(yè)的蟲害的菌劑的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法。。
本發(fā)明的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，包括下述步驟(1)將分離獲得的蟲生真菌的單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上誘發(fā)突變，打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基本培養(yǎng)基(MM)、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上鑒定后獲得硝酸鹽利用缺陷型(nit)突變株；(2)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的nit菌株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)的孢子，培養(yǎng)所形成的菌株作為異核體菌株；(3)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象(heterokaryosis)。
上述的致病力相對穩(wěn)定的選育方法，包括下述步驟(1)將分離獲得的蟲生真菌的單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上誘發(fā)突變；從氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上鑒定；凡是氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上生長良好，而同時在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌落生長只有微弱菌絲的角變就是真正的硝酸鹽利用缺陷型突變株；(2)將選出的硝酸鹽利用缺陷型突變株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上配對培養(yǎng)，間隔3-5cm，25℃，暗培養(yǎng)21天左右，觀察菌株間的親和能力。如果親和，菌落間則形成旺盛生長的配接叢，如果不親和，菌落間沒有特殊生長的配接叢；(3)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的硝酸鹽利用缺陷型突變株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)孢子作為異核體菌株，保存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上；(4)間隔3月重復親和性實驗，檢測篩選出的親本菌株間親和能力的穩(wěn)定性，如此重復3次，從而分離出親和能力最穩(wěn)定的親本菌株和親和后形成的異核體菌株；(5)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象；(6)通過在實驗室進行致病試驗，然后挑選出對蚜蟲具有較高致病力的異核體菌株，同時明確該異核體菌株的親本菌株；(7)最后挑選出具有較高致病力的異核體菌株，明確親和形成該異核體菌株的親本菌株。
其中培養(yǎng)基配方如下氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)土豆200g；瓊脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸餾水補1000ml。
BM培養(yǎng)基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；瓊脂20g；微量元素液0.2ml；蒸餾水補足1000ml。
微量元素液組分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)1000mLBM中加入NaNO33g。
上述方法可應用的殺蟲真菌。指可以自然侵染某種節(jié)肢動物或線蟲，使某種節(jié)肢動物或線蟲致病或死亡的真菌。如白僵菌屬(Beauveria)、綠僵茵屬(Metarhizium)、被毛孢屬(Hirsutella)、擬青霉屬(Paecilomyces)、輪枝霉屬(Verticillium)等具有準性生殖過程的蟲生真菌。因為在準性生殖過程中異核體的形成是一種必然，但是一般異核體又是很容易分解的。所以人為地選擇穩(wěn)定而優(yōu)良的親本配接形成異核體是很好方法。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，由以上技術(shù)可知，使用可以穩(wěn)定地實現(xiàn)親和的兩個親本菌株，親和后形成異核體，該異核體具有兩親優(yōu)良特性，用以發(fā)酵生產(chǎn)菌劑防治蟲害。當異核體菌劑的致病力下降時，可以通過長期保存的親本菌株重新親和配接形成。這樣達到育成具有相對穩(wěn)定高致病力殺蟲真菌之目的。使用該方法獲得的菌株可以用于生產(chǎn)菌劑防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)和牧業(yè)的蟲害。
具體實施例方式
實施例1(1)從采自全國的8個蟬擬青霉[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]菌株上分離獲得32個單孢子菌株，將分離獲得的各蟲生真菌的單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上誘發(fā)突變；(2)從氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上鑒定；(3)凡是氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上生長良好，而同時在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上菌落生長只有微弱菌絲的角變就是真正的硝酸鹽利用缺陷型(nit)突變株；(4)將選出的各個nit菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上配對培養(yǎng)，間隔3-5cm，25℃，暗培養(yǎng)21天左右，觀察菌株間的親和能力。如果親和，菌落間則形成旺盛生長的配接叢，如果不親和，菌落間沒有特殊生長的配接叢(見表1)；(5)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的nit菌株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)孢子作為異核體菌株，保存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上；(6)間隔3月重復親和性實驗，檢測篩選出的親本菌株間親和能力的穩(wěn)定性，如此重復3次，從而分離出親和能力最穩(wěn)定的親本菌株和親和后形成的異核體菌株；(7)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象(heterokaryosis)；表1蟬擬青霉nit突變株間的營養(yǎng)親和反應

注“+”表示營養(yǎng)親和；“-”表示營養(yǎng)不親和；通過以上步驟分離出的具有穩(wěn)定的高親和能力的蟬擬青霉異核體菌株有55-57、56-57、58-57，和其親本菌株55、56、57、58。菌株的培養(yǎng)特性和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)是在查氏培養(yǎng)基上25℃14天菌落直徑16mm，菌絲純白色致密氈狀、粉質(zhì)，具有放射狀溝紋；背面純白色有凹陷。分生孢子梗濃密地分枝，3.5μm寬，由2-5個瓶狀小梗組成的輪生體。瓶狀小梗基部膨大或紡錘形無明顯膨大，9.6-33×3-3.6μm其上端為突然變細大約0.6μm的管狀偏離主軸，分生孢子為長圓至柱形常彎曲，壁光滑，透明6-10×2.4-3.6μm.。在PDA培養(yǎng)基上25℃14天菌落直徑64mm白色粉質(zhì)，背面豆汁黃。
其中培養(yǎng)基配方如下氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)土豆200g；瓊脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸餾水補足1000ml。
BM培養(yǎng)基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；瓊脂20g；微量元素液0.2ml；蒸餾水補足1000ml。
微量元素液組分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)1000mLBM中加入NaNO33g。
固體發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮70％，大米粉20％，黃豆粉10％，幾丁質(zhì)0.5％，水100％，121℃滅菌備用。每500ml三角瓶裝80g。
(8)首先通過在實驗室進行致病試驗，然后挑選出對蚜蟲具有較高致病力的異核體菌株，同時明確該異核體菌株的親本菌株。步驟如下制備孢子懸浮液在培養(yǎng)好的平板菌落上倒入適量的0.05％土溫-80溶液，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，充分震蕩后用滅菌的擦鏡紙過濾入無菌三角瓶中，稀釋到3×108備用。
測定分生孢子的萌發(fā)率取各菌株分生孢子的營養(yǎng)稀釋液一滴，滴在載玻片上，三個重復。采用懸滴法適溫培養(yǎng)，24h和48h后顯微鏡下測定萌發(fā)率。
致病力測試摘取生有兩齡蚜蟲的番茄葉(或蘿卜葉)，葉柄插入浸濕的花泥小塊，然后將葉片(葉柄不浸入)浸入含有試劑懸液的燒杯中3s立即取出，室溫下將蚜蟲和葉片晾干。置于大培養(yǎng)皿內(nèi)。每皿一片葉每片葉上30頭蟲，25℃恒溫培養(yǎng)。每d給花泥加一次無菌水，每日光照10h，每日檢查死亡蟲數(shù)，及時把死蟲取出，放置到一干凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)記數(shù)直到全部蟲死。最后鏡檢死蟲的感染情況，以確證被該擬青霉菌侵染。所測的數(shù)據(jù)繪制曲線，然后統(tǒng)計獲得LT50、LT90值(見表2)。
表2蟬擬青霉各菌株對蚜蟲的致死時間(LT)

注LT50、LT90分別表示致死中量所需時間和致死90％所需時間。
從表中數(shù)據(jù)顯示55-57、56-57、58-57菌株的LT50、LT90較低于親本株，由此可以看出，異核體致病能力相對較高。特別是55-57、56-57菌株的萌發(fā)率特別低的情況下有相對較低的致死時間，說明該實驗中55-57、56-57菌株的致病力最高。
(9)最后挑選出具有較高致病力的異核體菌株是55-57、56-57，明確親和形成該異核體菌株的親本菌株是55、56、57。蟬擬青霉親本菌株在4℃冰箱條件下保存。用蟬擬青霉異核體菌株P(guān).cicadae(GZDXIFR-H).55-57，56-57，58-57進行在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵生產(chǎn)殺蟲菌劑，可以用來防治溫室蚜蟲。
實施例2(1)傾入含0.05％ Toween-80的無菌水，于已形成分生孢子的粉質(zhì)擬青霉[Paecilomyces farinosus(Holm.ex Gray)Brown & Smith]平板菌落上，用玻璃刮輕壓菌落表面洗下孢子。將孢子懸液移入加有數(shù)粒玻璃珠的小三角瓶中，充分振蕩使其分散，然后用無菌玻璃棉過濾除去菌絲。稀釋孢子懸液至每ml含孢子300個左右，吸此液0.1ml于直徑9cm的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)平板上，用玻璃刮均勻涂布，25℃培養(yǎng)，顯微鏡下觀察確定和標記出同心放射生長的單孢子菌落，肉眼可見后，分離培養(yǎng)作為單孢子菌株；(2)從采集的粉質(zhì)擬青霉[Paecilomyces farinosus(Holm.ex Gray)Brown & Smith]菌株上分離獲得26個單孢子菌株，將分離獲得的各單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上誘發(fā)突變；(3)從氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上鑒定；(4)凡是氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上生長良好，而同時在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上菌落生長只有微弱菌絲的角變就是真正的硝酸鹽利用缺陷型(nit)突變株，共篩選出30個nit突變株；(5)將選出的30個nit菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上配對培養(yǎng)，間隔3-5cm，25℃，暗培養(yǎng)21天左右，觀察菌株間的親和能力。如果親和，菌落間則形成旺盛生長的配接叢，如果不親和，菌落間沒有特殊生長的配接叢。結(jié)果來自4個單孢子(A、B、C、D)的5個nit菌株可以相互親和(見表3)，其余來自22個單孢子(E-Z)的25個nit菌株間皆不親和；(6)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的nit菌株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)孢子作為異核體菌株，保存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上；(7)間隔3月重復親和性實驗，檢測篩選出的親本菌株間親和能力的穩(wěn)定性，如此重復3次，從而分離出親和能力最穩(wěn)定的親本菌株和親和后形成的異核體菌株；(8)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象(heterokaryosis)；表3粉質(zhì)擬青霉nit突變株間的營養(yǎng)親和反應


注“+”表示營養(yǎng)親和；“-”表示營養(yǎng)不親和；通過以上步驟分離出的具有穩(wěn)定的高親和能力的粉質(zhì)擬青霉異核體菌株有B-A，C-A，D1-A，和其親本菌株A，B，C，D1。其培養(yǎng)特性和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)是在查氏培養(yǎng)基上25℃14天菌落直徑42mm白色、氈狀、粉質(zhì)，近同心圓形具有鉤狀紋路。背面蛋殼黃具有脊狀輪紋，邊緣整齊。個體形態(tài)瓶狀小梗(產(chǎn)孢細胞)基部柱狀或瓶狀膨大，向上具有細長管狀7.2-9.6×1.2-1.7μm；分生孢子卵形或紡錘形1.8-2.2×1.2-1.8μm。
其中培養(yǎng)基配方如下氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)土豆200g；瓊脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸餾水補足1000ml。
BM培養(yǎng)基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；瓊脂20g；微量元素液0.2ml；蒸餾水補足1000ml。
微量元素液組分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)1000mLBM中加入NaNO33g。
固體發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮70％，大米粉20％，黃豆粉10％，幾丁質(zhì)0.5％，水100％，121℃滅菌備用。每500ml三角瓶裝80克。
(9)首先通過在實驗室進行致病試驗，然后挑選出對蚜蟲具有較高致病力的異核體菌株，同時明確該異核體菌株的親本菌株。步驟如下制備孢子懸浮液往培養(yǎng)好的平板菌落上倒入適量的0.05％土溫-80溶液，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，充分震蕩后用搽鏡紙濾入無菌三角瓶中，稀釋到3×108備用。
測定分生孢子的萌發(fā)率取各菌株分生孢子的營養(yǎng)稀釋液一滴，滴在載玻片上，三個重復。采用懸滴法適溫培養(yǎng)，24h和48h后顯微鏡下測定萌發(fā)率。
致病力測試摘取生有兩齡蚜蟲的番茄葉(或蘿卜葉)，葉柄插入浸濕的花泥小塊，然后將葉片(葉柄不浸入)浸入含有試劑懸液的燒杯中3s立即取出，室溫下將蚜蟲和葉片晾干。置于大培養(yǎng)皿內(nèi)。每皿一片葉每片葉上30頭蟲，25℃恒溫培養(yǎng)。每d給花泥加一次無菌水，每日光照10h，每日檢查死亡蟲數(shù)，及時把死蟲取出，放置到一干凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)記數(shù)直到全部蟲死。最后鏡檢死蟲的感染情況，以確證被該擬青霉菌侵染。所測的數(shù)據(jù)繪制曲線，然后統(tǒng)計獲得LT50、LT90值(見表4)。
表4粉質(zhì)擬青霉(Paecilomyces farinosus)各菌株對蚜蟲的致死時間(LT)


注LT50、LT90分別表示致死中量所需時間和致死90％所需時間。
(10)最后挑選出具有較高致病力的異核體菌株是D1-A，明確親和形成該異核體菌株的親本菌株是D1和A。粉質(zhì)擬青霉親本菌株在4℃冰箱條件下保存。用粉質(zhì)擬青霉異核體D1-A菌株進行在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵生產(chǎn)殺蟲菌劑，可以用來防治溫室蚜蟲。
實施例3(1)傾注含0.05％ Toween-80的無菌水，于已形成分生孢子的玫煙色擬青霉[Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown & Smith]菌落上，用玻璃刮輕壓菌落表面洗下孢子。將孢子懸液移干加有數(shù)粒玻璃珠的小三角瓶中，充分振蕩使其分散，爾后用無菌玻璃棉過濾除去菌絲。稀釋孢子懸液至每ml含孢子300個左右，吸此液0.1ml于直徑9cm的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)平板上，用玻璃刮均勻涂布，25℃培養(yǎng)，顯微鏡下觀察確定和標記出同心放射生長的單孢子菌落，肉眼可見后，分離培養(yǎng)作為單孢子菌株；(2)從采集的玫煙色擬青霉[Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown& Smith]菌株上分離獲得20個單孢子菌株，將分離獲得的各單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上誘發(fā)突變；(3)從氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上鑒定；(4)凡是氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上生長良好，而同時在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上菌落生長只有微弱菌絲的角變就是真正的硝酸鹽利用缺陷型(nit)突變株。每個單孢子菌株選取個nit突變株，共選出40個nit突變株；(5)將選出的40個nit菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上配對培養(yǎng)，間隔3-5cm，25℃，暗培養(yǎng)21天左右，觀察菌株間的親和能力。如果親和，菌落間則形成旺盛生長的配接叢，如果不親和，菌落間沒有特殊生長的配接叢。結(jié)果來自7個單孢子的11個nit菌株具有親和現(xiàn)象(見表5)，其余菌株皆不親和；(6)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的nit菌株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)孢子作為異核體菌株，保存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)上；(7)間隔3月重復親和性實驗，檢測篩選出的親本菌株間親和能力的穩(wěn)定性，如此重復3次，從而分離出親和能力最穩(wěn)定的親本菌株和親和后形成的異核體菌株；(8)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象(heterokaryosis)；表5玫煙色擬青霉nit突變株間的營養(yǎng)親和反應


注“+”表示營養(yǎng)親和；“-”表示營養(yǎng)不親和；通過以上步驟分離出的具有穩(wěn)定的高親和能力的玫煙色擬青霉異核體菌株有V-III，V-VI，V-X和其親本菌株III，V，VI，X。分離出的玫煙色擬青霉異核體菌株，其培養(yǎng)特性和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)是在查氏培養(yǎng)基上25度14天菌落直徑62mm，菌絲純白色茸毛狀、致密、隆起具有孢梗束，背面白色。較老的菌落形成分枝的粉紅色孢梗束。個體形態(tài)瓶狀小梗(產(chǎn)孢細胞)基部球形或擬橢圓形膨大，上部為細長管狀5.6-7.8×1.4-2μm；分生孢子短園柱形至梭形3-4×1.5-1.8μm。
其中培養(yǎng)基配方如下氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)土豆200g；瓊脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸餾水補足1000ml。
BM培養(yǎng)基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；瓊脂20g；微量元素液0.2ml；蒸餾水補足1000ml。
微量元素液組分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)1000mLBM中加入NaNO33g。
固體發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮70％，大米粉20％，黃豆粉10％，幾丁質(zhì)0.5％，水100％，121℃滅菌備用。每500ml三角瓶裝80克。
(9)首先通過在實驗室進行致病試驗，然后挑選出對蚜蟲具有較高致病力的異核體菌株，同時明確該異核體菌株的親本菌株。步驟如下制備孢子懸浮液往培養(yǎng)好的平板菌落上倒入適量的0.05％土溫-80溶液，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，充分震蕩后用擦鏡紙濾入無菌三角瓶中，稀釋到3×108備用。
測定分生孢子的萌發(fā)率取各菌株分生孢子的營養(yǎng)稀釋液一滴，滴在載玻片上，三個重復。采用懸滴法適溫培養(yǎng)，24h和48h后顯微鏡下測定萌發(fā)率。
致病力測試摘取生有兩齡蚜蟲的番茄葉(或蘿卜葉)，葉柄插入浸濕的花泥小塊，然后將葉片(葉柄不浸入)浸入含有試劑懸液的燒杯中3s立即取出，室溫下將蚜蟲和葉片晾干。置于大培養(yǎng)皿內(nèi)。每皿一片葉每片葉上30頭蟲，25℃恒溫培養(yǎng)。每d給花泥加一次無菌水，每日光照10h，每日檢查死亡蟲數(shù)，及時把死蟲取出，放置到一干凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)記數(shù)直到全部蟲死。最后鏡檢死蟲的感染情況，以確證被該擬青霉菌侵染。所測的數(shù)據(jù)繪制曲線，然后統(tǒng)計獲得LT50、LT90值(見表6)。
表6玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)各菌株對蚜蟲的致死時間(LT)

注LT50、LT90分別表示致死中量所需時間和致死90％所需時間。
(10)最后挑選出具有較高致病力的異核體菌株是V-III，明確親和形成該異核體菌株的親本菌株是V和III。玫煙色擬青霉各菌株在4℃冰箱條件下保存。用其異核體菌株V-III進行在固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)殺蟲菌劑，可以用來防治溫室蚜蟲。
權(quán)利要求
1.一種致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，包括下述步驟(1)將分離獲得的蟲生真菌的單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上誘發(fā)突變，打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上鑒定后獲得硝酸鹽利用缺陷型突變株；(2)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的硝酸鹽利用缺陷型菌株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)的孢子，培養(yǎng)所形成的菌株作為異核體菌株；(3)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象。
2.如權(quán)利要求1所述的致病力相對穩(wěn)定的選育方法，包括下述步驟(1)將分離獲得的蟲生真菌的單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上誘發(fā)突變；從氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上鑒定；凡是氯酸鹽土豆培養(yǎng)基上生長良好，而同時在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌落生長只有微弱菌絲的角變就是真正的硝酸鹽利用缺陷型突變株；(2)將選出的硝酸鹽利用缺陷型突變株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上配對培養(yǎng)，間隔3-5cm，25℃，暗培養(yǎng)20-25天，觀察菌株間的親和能力；如果親和，菌落間則形成旺盛生長的配接叢，如果不親和，菌落間沒有特殊生長的配接叢；(3)通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的硝酸鹽利用缺陷型突變株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)孢子作為異核體菌株，保存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上；(4)間隔3月重復親和性實驗，檢測篩選出的親本菌株間親和能力的穩(wěn)定性，如此重復3次，從而分離出親和能力最穩(wěn)定的親本菌株和親和后形成的異核體菌株；(5)對異核體菌株的菌絲用Hoechest 33258進行熒光染色后觀察認定其細胞存在異核現(xiàn)象；(6)通過在實驗室進行致病試驗，然后挑選出對蚜蟲具有較高致病力的異核體菌株，同時明確該異核體菌株的親本菌株；(7)最后挑選出具有較高致病力的異核體菌株，明確親和形成該異核體菌株的親本菌株。
3.如權(quán)利要求1或2所述的致病力相對穩(wěn)定的選育方法，其中氯酸鹽土豆培養(yǎng)基土豆200g；瓊脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸餾水補足1000ml。
4.如權(quán)利要求1或2所述的致病力相對穩(wěn)定的選育方法，其中BM培養(yǎng)基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；瓊脂20g；微量元素液0.2ml；蒸餾水補足1000ml。微量元素液組分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。
5.如權(quán)利要求1或2所述的致病力相對穩(wěn)定的選育方法，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基1000mLBM中加入NaNO33g。
6.如權(quán)利要求3所述的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，其中殺蟲真菌指可以自然侵染節(jié)肢動物或線蟲，使節(jié)肢動物或線蟲致病或死亡的真菌。
7.如權(quán)利要求4所述的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，其中殺蟲真菌指可以自然侵染節(jié)肢動物或線蟲，使節(jié)肢動物或線蟲致病或死亡的真菌。
8.如權(quán)利要求5所述的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，其中殺蟲真菌指可以自然侵染節(jié)肢動物或線蟲，使節(jié)肢動物或線蟲致病或死亡的真菌。
9.如權(quán)利要求6-8之一所述的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，其中殺蟲真菌是具有準性生殖過程的蟲生真菌。
10.如權(quán)利要求9所述的致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，其中殺蟲真菌包括白僵菌屬、綠僵菌屬、被毛孢屬、擬青霉屬或輪枝霉屬。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使致病力相對穩(wěn)定的殺蟲真菌選育方法，包括下述步驟將分離獲得的各蟲生真菌的單孢子在氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上誘發(fā)突變，打孔分離出抗氯酸鹽角變，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)、氯酸鹽土豆培養(yǎng)基(KPS)上鑒定后獲得硝酸鹽利用缺陷型(nit)突變株；通過營養(yǎng)親和性實驗將親和能力高的nit菌株作親本，挑取各親本菌株親和配接區(qū)孢子，培養(yǎng)所形成的菌株作為異核體菌株；對異核體菌株的菌絲用Hoechest33258進行熒光染色后觀察，確定其細胞存在異核現(xiàn)象(heterokaryosis)。本方法用于生產(chǎn)具有相對穩(wěn)定高致病力菌劑防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)和牧業(yè)的蟲害。
文檔編號A01N53/04GK101050429SQ20071007769
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者劉愛英, 趙杰宏, 鄒曉, 趙德剛, 韓潔, 文庭池 申請人:貴州大學