專利名稱：檢測致病真菌生物芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片，特別是涉及一種檢測真菌生物芯片。
背景技術：
目前，病原微生物感染性疾病給人類帶來的危害有增無減，其中由真菌引起的感染也因免疫受損宿主的不斷增多而日漸突出。隨著腫瘤的放射治療、化學治療、廣譜抗生素以及免疫制劑的廣泛應用，系統(tǒng)性、機會性真菌感染日益增加，特別是在血液系統(tǒng)惡性疾病、腫瘤和骨髓移植及器官移植中；例如18％-50％的病人在骨髓移植后發(fā)生侵襲性真菌感染；器官移植受者和惡性腫瘤患者中真菌感染的患病率高達20％～40％；而且真菌感染往往是致命的感染，病死率呈急劇上升的趨勢在真菌感染中，深部真菌感染危害最大，診斷困難、進展迅速、頑固難治、病死率非常高，如念珠菌血癥，若不治療死亡率可以達到45％～76％，侵襲性曲霉病死亡率高達55％～70％；真菌感染已成為艾滋病患者的主要死亡原因。有人調查在過去20年中深部真菌感染增加了40倍，住院患者出現(xiàn)條件致病性真菌感染，病死率高達29％，而無真菌感染患者病死率僅17％，并多為致病真菌的混合感染，但臨床上真菌感染診斷的現(xiàn)狀卻遠遠不能滿足需要，特別是早期特異診斷一直存在困難，因而使很多患者病情延誤導致治療失敗甚或失去了治療的機會。因此，如何提高真菌病的診斷水平已成為國內外臨床工作者們共同關心的熱點問題，真菌感染的實驗室診斷在治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。
此外，致病真菌或條件致病真菌污染中藥材也十分普遍。中藥材是我國對世界所做出的特有貢獻，越來越引起全世界醫(yī)藥衛(wèi)生界的重視，但是中藥材真菌污染問題一直困擾著我國的中草藥業(yè)發(fā)展。從這一點看，也十分需要一種快速的藥材真菌快速檢測技術。
真菌的檢測與鑒定目前包括形態(tài)學檢測，如直接鏡檢和培養(yǎng)方法等。直接鏡檢操作簡便、快速、實用，陽性結果可以確定真菌感染，但檢測陽性率很低，陰性結果不能排除感染，需與培養(yǎng)法結合使用；體外真菌培養(yǎng)可以進一步提高真菌的檢出率，并可鑒定真菌的種屬，但操作復雜，費時費力，一般需要4周時間，個別生長緩慢的真菌需要的時間更長，而且培養(yǎng)法的陽性檢出率也不高，例如侵襲性念珠菌病血培養(yǎng)的陽性率僅為20％。應用免疫學技術診斷臨床真菌感染目前尚有較多問題需要解決，如特異性抗體檢測常遇到的問題是，當檢測常見條件致病真菌時，由于正常人血清中可能有抗體存在，因此無法區(qū)分是真菌在體內定植還是感染；此外，抗體檢測交叉反應較嚴重；特異性抗原檢測同樣存在假陰性和假陽性問題而限制了其應用。
隨著分子生物學技術的發(fā)展，核酸雜交及聚合酶鏈反應(PCR)等技術在臨床真菌檢測與診斷方面得到了長足發(fā)展。人們建立了核酸雜交技術、常規(guī)PCR技術、多種改進的PCR技術，如套式PCR、PCR-RFLP(限制性酶切片段多態(tài)性)技術、熒光定量PCR技術等。這些技術在真菌感染早期檢測與診斷方面顯出了較高的應用價值。然而，由于PCR等分子生物學技術缺乏規(guī)范化或標準化，檢測的特異性與敏感性報道不一，檢測過程中易出現(xiàn)假陽性和假陰性結果，以及不能區(qū)分是感染還是定植等，所以給陽性PCR結果的解釋帶來了困難。重要的是，PCR等技術多為針對不同致病真菌的獨特基因進行檢測，一般一次試驗只能檢測一種真菌，即使采用多重PCR技術，一次試驗檢測的真菌數(shù)目也不超過3個，但由于臨床多為混合真菌感染，而可引起感染的真菌種類又較多，所以PCR技術檢測范圍較有限，而且，一般情況下還要采用核酸雜交、套式PCR或測序等技術對PCR產物進行驗證或確證，增加了操作的復雜性或難度。以PCR為基礎的指紋圖譜法(如PCR-RFLP等)則存在試驗結果不穩(wěn)定的缺陷，如不同的擴增條件、不同的操作者，甚至同一個操作者的不同檢測時間，都會影響擴增結果，或產生不一致的擴增結果。電泳核型分析技術受電泳條件的影響較大，不同脈沖電泳裝置，或同一電泳裝置不同電泳條件會影響試驗結果。rDNA序列分析，對DNA的量和純度要求較高，儀器設備昂貴，操作技術要求高，檢測費用也高。總之，上述的分子生物學方法尚不能很好地滿足臨床或衛(wèi)生領域進行快速、準確、大規(guī)模、高通量檢測與診斷致病真菌的需要。
生物芯片(Biochip，最初的生物芯片即指基因芯片)技術檢測致病性真菌或條件致病真菌卻具有很多優(yōu)越性?；蛐酒夹g由于脫胎于核酸(基因)探針檢測技術，因此具有敏感性高、特異性強等特點；又由于芯片技術具有大規(guī)模、集成化、自動化等特點，因此，操作簡便、快速，而且還具有檢測效率高(一次可檢測成千上萬個目的基因)等優(yōu)點?；蛐酒夹g檢測致病真菌或條件致病真菌屬于臨床檢驗的前沿領域，其科學性在于基因芯片檢測致病真菌實質上是微量、微型化的基因探針雜交檢測，而后者在致病真菌檢測上的科學性已被公認；創(chuàng)新性在于基因芯片技術是20世紀90年代發(fā)明的、2000年后蓬勃發(fā)展的一項新技術，而截止到目前尚未見到有關采用基因芯片技術檢測致病真菌或條件致病真菌的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種檢測致病真菌生物芯片。
本發(fā)明的技術方案概述如下一種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌attgcttgcg gcggtagcgt ctaccacgta tatcttcaaa40熱帶念珠菌aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat ttatttcata40近平滑念珠菌 ttccactcat tggtacaaac tccaaaactt cttccaaa 38克柔念珠菌gacgcttggc ggccgagagc gagtgttgcg agacaacaaa40光滑念珠菌taggttttac caactcggtg ttgatctagg gagggataag t 41新生隱球菌cctatggggt agtcttcggc ttgctgataa caaccatctc40
煙曲霉 ggccggcgcc agccgacacc caactttatt tttctaa 37黃曲霉 ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttcca 35黑曲霉 tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt 40構巢曲霉acccgctcga ttagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct 40裴氏著色真菌gggactcggt cttctccctc acgggaacac ttttttcta 39疣狀瓶霉tggacggatt ttggtcgtgt aacaacggcc cctcctaaa 39卡氏枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaa38申克孢子絲 ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 40總狀毛霉aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa 40紅色毛癬菌 ccctggcccc aatctttata tatatatata tctttt 36須癬毛癬菌 ctctggcctt cccccaaatc tctctgagat atttt 35絮狀表皮癬菌gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaagg 37犬小孢子菌 gcaggctggc ctaacgcacc atgtattatt 30石膏樣小孢子菌 tagtttccgt cagagatgta tttctctgca attt34真菌共有探針ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa38另一種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌 tctaaccaaa aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtatatcttc aaa 53熱帶念珠菌 ttatccaaaa acgcttattt tgctagtggc caccacaatt tatttcataa ct 52近平滑念珠菌taggtttttt ccactcattg gtacaaactc caaaacttct tccaaat 47克柔念珠菌 tttttttcag ggacgcttgg cggccgagag cgagtgttgc gagacaacaa aaa 53光滑念珠菌 gggttaaact gtattaggtt ttaccaactc ggtgttgatc tagggaggga taagt55新生隱球菌 aataagtttc gctgggccta tggggtagtc ttcggcttgc tgataacaac catctc 56煙曲霉 acctgctctg taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaa 54黃曲霉 tgtaggcccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc cagg44黑曲霉 gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tcttt55構巢曲霉ttgtcccgct cgactagggc cggccgggcg ccagccgacg tctccaa 47裴氏著色真菌atcggatgaa gggtgcccgg gactcggtct tctccctcac gggaacactt ttttcta 57申克孢子絲 cccccaggcg ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 50紅色毛癬菌 aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat atctttt 47須癬毛癬菌 tccaggaccg gccgccctgg cctcaaaatc tgttttatct tatc44疣狀瓶霉gtgttggacg gattttggtc gtgtaacaac ggcccctcct aaa 43卡式枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaaga c 41犬小孢子菌 ccgggccggc aggctggcct aacgcaccat gtattattca 40石膏樣小孢子菌 gctctctggc ctagtttccg tcagagatgt atttctctgc aattt 45
絮狀表皮癬菌 ggccggctct ctggccctaa tttccgtcgg gaggacgaaa gggggcgacc cct 53總狀毛霉 aaaggaaagc tcttgtaatt gactttgatg gggcctccca aataaatctt tt 52第三種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌 aaaaacattg cttgcggcgg tagcgtctac cacgtatatc ttcaaa46熱帶念珠菌 atccaaaaac gcttattttg ctagtggcca ccacaattta tttcat46近平滑念珠菌ctcattggta caaactccaa aacttcttcc aaat 34克柔念珠菌 tcagggacgc ttggcggccg agagcgagtg ttgcgagaca acaaaaa 47光滑念珠菌 actgtattag gttttaccaa ctcggtgttg atctagggag ggataagt 48新生隱球菌 cgctgggcct atggggtagt cttcggcttg ctgataacaa ccatctc 47煙曲霉 gtaggcccgg ccggcgccag ccgacaccca actttatttt tctaa 45黃曲霉 ttgccgaacg caaatcaatc tttttcca28黑曲霉 atgctctgta ggattggccg gcgcctgccg acgttttcca accattcttt50構巢曲霉Cccgctcgac tagggccggc cgggcgccag ccgacgtctc caa 43裴氏著色真菌tgaagggtgc ccgggactcg gtcttctccc tcacgggaac acttttttct a 51申克孢子絲 aggcgccctg ccgtgaaaac gcgcatgacg cgcagctctt tttac 45紅色毛癬菌 ggccgccctg gccccaatct ttatatatat atatatcttt t 41須癬毛癬菌 ccggccgctc tggccttccc ccaaatctct ctgagatatt ttttt 45疣狀瓶霉cgtgcttggt gttggacgga ttttggtcgt gtaacaacgg c 41卡式枝孢霉 tgtgcttggt gttggacggt tttggtcgag tggtctcgac 40犬小孢子菌 ggccggcagg ctggcctaac gcaccatgta ttattca 37石膏樣小孢子菌 tggcctagtt tccgtcagag atgtatttct ctgcaattt39絮狀表皮癬菌gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaaggggg cgacccct 48總狀毛霉aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa atctttt 47本發(fā)明的檢測致病真菌生物芯片在檢測致病真菌具有實時、靈敏、快速、準確和高效等特點。本發(fā)明可以快速地檢測多種真菌，同一芯片可以同時檢測白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、裴氏著色真菌、疣狀瓶霉、卡氏枝孢霉、申克孢子絲、總狀毛霉、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌。


圖1為本發(fā)明的探針矩陣排列示意圖。
圖2為真菌細胞核糖體DNA操縱元結構示意圖。
圖3為采用genePix4000B芯片掃描儀對第一種檢測致病真菌生物芯片結果進行觀察分析。
具體實施例方式
生物芯片技術是隨著人類基因組計劃發(fā)展起來的。它是指在固相基質上集成各種可以作為受體的生物信息，包括寡核苷酸、cDNA、蛋白質/酶、抗原/抗體、細胞等，利用受體與連接物間的反應(包括核酸雜交反應、抗原-抗體親和識別反應等)來進行生物學檢測的方法。生物芯片技術綜合運用了分子生物學技術、集成電路制造技術、計算機技術、半導體技術、共聚焦激光掃描技術、熒光標記技術，使樣品的制備、化學反應和分析檢測等在生命科學和醫(yī)學研究中不連續(xù)的過程連續(xù)化、集成化、微型化、自動化?；蛐酒侵笇⒋罅抗押塑账峁潭ㄔ诤苄∶娣e(一般幾平方厘米)的玻璃等固相基質上，成為高密度寡核苷酸微陣列探針，樣品中的DNA或RNA經熒光標記后與探針雜交，通過檢測雜交信號的強弱達到分析樣品中核酸的目的。目前生物芯片，尤其是基因芯片技術主要應用于基因測序研究和生物制藥研究。該技術不但具有基因探針技術的高靈敏度和高特異性，而且可以同時檢測大量的目的基因。
實施例1真菌培養(yǎng)條件的建立1.酵母菌(念珠菌屬與隱球菌屬)應用沙堡固體或液體培養(yǎng)基 30℃培養(yǎng)2天配方葡萄糖 40g蛋白胨10g瓊脂 20g蒸餾水1000ml將上述成分混合，加熱至完全溶解，調PH至5.6左右于115℃蒸汽滅菌30分鐘備用注液體培養(yǎng)基不加瓊脂2.絲狀真菌與淺部皮膚真菌應用馬鈴薯固體或液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng) 30℃培養(yǎng)5-7天配方將去皮切碎的馬鈴薯200個加水700ml煮沸20分鐘，用紗布過濾，保留濾液加葡萄糖 20g瓊脂 15g加水至1000ml，實施例2真菌DNA提取方法的建立應用氯化芐提取真菌DNA1.原理
ROH代表細胞壁中的幾丁質，以上為PhcH2cL于各種多糖的反應式2.方法(1)刮取0.1-0.3g約100ul體積的菌落于1.5ml離心管中
(2)加入600μl DNA提取液，振蕩混勻(3)加入10％SDS 50ul振蕩混勻(4)加入氯化芐300ul振蕩混勻(5)50-55℃水浴1小時每10分鐘混勻一次(6)每管加入3M的醋酸鈉60ul冰浴20分鐘(7)4℃離心，13000rpm 10分鐘(8)取上清，加等體積的酚氯仿，4℃離心13000rpm 10分鐘(9)取上清加1/10醋酸鈉及等體積的異丙醇，-20℃ 1小時(10)4℃離心12000rpm 10分鐘(11)棄上清加入40ul 75％乙醇清洗管壁(12)4℃離心10000rpm 10分鐘(13)棄上清，干燥，加入Tris/EDTA-20℃注絲狀真菌應用液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取一個菌絲球到1.5ml管中進行DNA提取，提取液的pH對提取結果很重要，pH太低，破壁反應受抑制，作用不完全，DNA產率低；PH太高，導致DNa變性與降解，所以采用弱堿性。提取液應與菌體充分混合，再加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，否則導致抽提物混合困難，充分混合對于DNA的產量和質量均有重要影響。
實施例3靶基因的選擇無論是真菌還是細菌，細胞核糖體核糖核酸(rRNA)基因是常用的分子分析靶點。核糖體核糖核酸(rRNA)基因及其相鄰的間隔區(qū)合稱為rDNA。真菌細胞rDNA有幾十甚至數(shù)百個拷貝，真菌核糖體DNA(rRNA基因)操縱元包括三個功能基因，即18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA，它們在染色體上頭尾相連，串聯(lián)排列，相互之間由內轉錄間區(qū)(internaltranscribedspacer)分割。包括18S rDNA與5.8S rDNA間的內轉錄間區(qū)1(internaltranscribedspacer-1，ITS-1)，5.8S rDNA與28S rDNA間的內轉錄2(internaltranscribedspacer-1，ITS-2)。(見圖2)真核生物的核內rDNA是一個多基因蔟，以串聯(lián)重復單位排列，一個典型的rDNA重復單位約為8-12kb。它們位于核仁組織者區(qū)域(NORs)，往往存在于多個染色體位置。不同的選擇壓力作用于rDNA區(qū)域，造成單個重復單位序列的不同保守性。
一般編碼區(qū)的序列(18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA)在不同的屬及種間較保守，而內轉錄間區(qū)(ITS)不僅在不同屬間而且在同一屬內不同種間變異均較大。并且rRNA基因在真菌中的拷貝數(shù)可以達到幾十至幾百，其多拷貝的特性有助于提高檢測的靈敏性。
由于用于擴增間區(qū)的引物擴增跨度最好在200-500bp之間，所以我們選擇在5.8SrDNA設計上游引物，在28SrDNA設計下游引物，擴增ITS-2序列，在ITS-2區(qū)域設計種特異性探針，進行真菌菌種的鑒別。
實施例4
通用引物設計通用引物序列編號 序列(5′--3′) 所在區(qū)域ITS3 gcatcgatgaagaacgcagc5.8S rDNAITS4 tcctccgcttattgatatgc28S rDNA實施例5探針的設計基因芯片技術是一種反相固相雜交技術，其檢測功能依賴于芯片商所固定的探針來實現(xiàn)，所以確定探針的種類、序列是制備基因芯片的關鍵。
(1)登錄GenBanK(http//ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索相關真菌的目的基因序列，逐個核對后篩選出測序質量較好的序列。
(2)應用vector NTI SUITE 6.0軟件中的alignment將篩選出的序列進行多序列比對，得到堿基對齊圖。
(3)根據(jù)堿基對齊圖，在ITS2區(qū)域設計種特異性探針(4)探針設計要遵循以下原則a、長度一般為15-50bp，常用的是18-40bp。
b、堿基成分中G+C含量40％-60％，超過此范圍會增加非特異性的雜交。
C、盡量選擇真菌間差異大的序列D、避免選擇能夠形成二級結構和自身二聚體的序列E、所有探針應具有相似的Tm值(5)根據(jù)以上的探針設計原則，找出適于作為探針的所有序列，將候選序列遞交到GenBanK進行BLAST比較，篩選出特異性最好的進行合成，合成的探針進行3′端的氨基化修飾。
實施例6第一種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為探針名稱 探針序列5′-3′白色念珠菌attgcttgcg gcggtagcgt ctaccacgta tatcttcaaa40熱帶念珠菌aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat ttatttcata40近平滑念珠菌 ttccactcat tggtacaaac tccaaaactt cttccaaa 38克柔念珠菌gacgcttggc ggccgagagc gagtgttgcg agacaacaaa40光滑念珠菌taggttttac caactcggtg ttgatctagg gagggataag t 41新生隱球菌cctatggggt agtcttcggc ttgctgataa caaccatctc40煙曲霉ggccggcgcc agccgacacc caactttatt tttctaa 37
黃曲霉 ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttcca 35黑曲霉 tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt 40構巢曲霉acccgctcga ttagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct 40裴氏著色真菌gggactcggt cttctccctc acgggaacac ttttttcta 39疣狀瓶霉tggacggatt ttggtcgtgt aacaacggcc cctcctaaa 39卡氏枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaa38申克孢子絲 ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 40總狀毛霉aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa 40紅色毛癬菌 ccctggcccc aatctttata tatatatata tctttt 36須癬毛癬菌 ctctggcctt cccccaaatc tctctgagat atttt 35絮狀表皮癬菌gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaagg 37犬小孢子菌 gcaggctggc ctaacgcacc atgtattatt 30石膏樣小孢子菌 tagtttccgt cagagatgta tttctctgca attt34真菌共有探針ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa38第二種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌 tctaaccaaa aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtatatcttc aaa 53熱帶念珠菌 ttatccaaaa acgcttattt tgctagtggc caccacaatt tatttcataa ct 52近平滑念珠菌taggtttttt ccactcattg gtacaaactc caaaacttct tccaaat 47克柔念珠菌 tttttttcag ggacgcttgg cggccgagag cgagtgttgc gagacaacaa aaa 53光滑念珠菌 gggttaaact gtattaggtt ttaccaactc ggtgttgatc tagggaggga taagt55新生隱球菌 aataagtttc gctgggccta tggggtagtc ttcggcttgc tgataacaac catctc 56煙曲霉 acctgctctg taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaa 54黃曲霉 tgtaggcccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc cagg44黑曲霉 gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tcttt55構巢曲霉ttgtcccgct cgactagggc cggccgggcg ccagccgacg tctccaa 47裴氏著色真菌atcggatgaa gggtgcccgg gactcggtct tctccctcac gggaacactt ttttcta 57申克孢子絲 cccccaggcg ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac 50紅色毛癬菌 aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat atctttt 47須癬毛癬菌 tccaggaccg gccgccctgg cctcaaaatc tgttttatct tatc44疣狀瓶霉gtgttggacg gattttggtc gtgtaacaac ggcccctcct aaa 43卡式枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaaga c 41犬小孢子菌 ccgggccggc aggctggcct aacgcaccat gtattattca 40石膏樣小孢子菌 gctctctggc ctagtttccg tcagagatgt atttctctgc aattt 45絮狀表皮癬菌ggccggctct ctggccctaa tttccgtcgg gaggacgaaa gggggcgacc cct 53
總狀毛霉aaaggaaagc tcttgtaatt gactttgatg gggcctccca aataaatctt tt 52第三種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為1.白色念珠菌aaaaacattgcttgcggcggtagcgtctaccacgtatatcttcaaa2熱帶念珠菌atccaaaaacgcttattttgctagtggccaccacaatttatttcat3近平滑念珠菌ctcattggtacaaactccaaaacttcttccaaat4克柔念珠菌tcagggacgcttggcggccgagagcgagtgttgcgagacaacaaaaa5光滑念珠菌actgtattaggttttaccaactcggtgttgatctagggagggataagt6新生隱球菌cgctgggcctatggggtagtcttcggcttgctgataacaaccatctc7煙曲霉gtaggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttctaa8黃曲霉ttgccgaacgcaaatcaatctttttcca9黑曲霉atgctctgtaggattggccggcgcctgccgacgttttccaaccattcttt10構巢曲霉Cccgctcgactagggccggccgggcgccagccgacgtctccaa11裴氏著色真菌tgaagggtgcccgggactcggtcttctccctcacgggaacacttttttcta12申克孢子絲aggcgccctgccgtgaaaacgcgcatgacgcgcagctctttttac13紅色毛癬菌ggccgccctggccccaatctttatatatatatatatctttt14須癬毛癬菌ccggccgctctggccttcccccaaatctctctgagatattttttt15疣狀瓶霉cgtgcttggtgttggacggattttggtcgtgtaacaacggc16卡式枝孢霉tgtgcttggtgttggacggttttggtcgagtggtctcgac
17犬小孢子菌ggccggcaggctggcctaacgcaccatgtattattca18石膏樣小孢子菌tggcctagtttccgtcagagatgtatttctctgcaattt19絮狀表皮癬菌gctctctggccctaatttccgtcgggaggacgaaagggggcgacccct20總狀毛霉aaagctcttgtaattgactttgatggggcctcccaaataaatctttt實施例7探針矩陣排列見圖1在圖1中，1為陽性探針 2為真菌共有探針 3為陰性探針 4為白色念珠菌探針5為熱帶念珠菌探針 6為近平滑念珠菌探針 7為克柔念珠菌探針8為光滑念珠菌探針 9為新生隱球菌探針 10為煙曲霉探針 11為黃曲霉探針12為黑曲霉探針 13為構巢曲霉探針 14為裴氏著色真菌探針 15為疣狀瓶霉探針 16為卡式枝孢霉探針 17為申克孢子絲菌探針 18為總狀毛霉探針 19為紅色毛癬菌探針 20為須癬毛癬菌探針 21為絮狀表皮癬菌探針 22為犬小孢子菌探針 23為石膏樣小孢子菌探針實施例8雜交實驗1.點樣配置終濃度為100umol/L的探針溶液，取每個探針溶液5ul分別溶于5ul點樣液中，將其轉移到96孔板中，并將其置于基因芯片點樣儀(cartesian technologies)樣品臺上，啟動PixSys5500 Workstation點樣控制程序，通過一支羽毛筆式點樣針頭完成全部點樣。點好的玻片放置48小時后使用。
2.玻片的處理在0.2％SDS中浸泡5分鐘，純水中浸泡5分鐘，玻片自然干燥，立即投入使用。
3.熒光標記待測樣品的制備應用不對稱PCR進行樣品的標記第一輪PCR10*PCR緩沖液 5uldNTP混和液 4ulITS3引物 1ulITS4(CY3標記引物)1ul
Taq酶 0.5ulDNA模板3ul水 補足到50ul94℃預變性5min，94℃變性1min，50℃退火1min，72伸1min，72延伸5min，30個循環(huán)。
第二輪PCR10*PCR緩沖液 5uldNTP Mixture 4ulITS4(CY3標記) 1ulTaq酶 0.5ul第一輪擴增產物1ul水補足到50ul94℃預變性5min，94℃變性1min，50℃退火1min，72伸1min，72延伸5min，30個循環(huán)。
4.雜交取第二輪擴增產物2ul與8ul雜交液(UnihybtMTelechem公司)混合，加熱到98℃變性5min，后迅速放在冰上，5分鐘后，取出10ul點在陣列區(qū)域，放入雜交盒中50℃雜交1個小時，然后將玻片放入洗脫液WBA洗滌1min，WBB洗滌1min，WBC洗滌min。
5.雜交結果的檢測采用genePix4000B芯片掃描儀對第一種檢測致病真菌生物芯片結果進行觀察分析。見圖3。
圖3中3-4為白色念珠菌3-5為熱帶念珠菌 3-6為近平滑念珠菌 3-7為克柔念珠菌3-8為光滑念珠菌 3-9為新生隱球菌 3-10為煙曲霉 3-11為黃曲霉3-12為黑曲霉 3-13為構巢曲霉 3-14為裴氏著色真菌 3-15疣狀瓶霉3-16卡式枝孢霉 3-17為申克孢子絲菌 3-18為總狀毛霉 3-19為紅色毛癬菌3-20須癬毛癬菌 3-21為絮狀表皮癬菌 3-22犬小孢子菌 3-23為石膏樣小孢子菌采用上述相同的方法，應用第二套和第三套探針對臨床常見致病真菌亦進行了檢測，得到和第一套探針基本相似的雜交圖譜(圖略)，第二套和第三套探針也可用于臨床常見致病真菌的檢測鑒定。
權利要求
1.一種檢測致病真菌生物芯片，其特征是在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌attgcttgcg gcggtagcgt ctaccacgta tatcttcaaa熱帶念珠菌aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat ttatttcata近平滑念珠菌 ttccactcat tggtacaaac tccaaaactt cttccaaa克柔念珠菌gacgcttggc ggccgagagc gagtgttgcg agacaacaaa光滑念珠菌taggttttac caactcggtg ttgatctagg gagggataag t新生隱球菌cctatggggt agtcttcggc ttgctgataa caaccatctc煙曲霉ggccggcgcc agccgacacc caactttatt tttctaa黃曲霉ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt ttcca黑曲霉tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt構巢曲霉 acccgctcga ttagggccgg ccgggcgcca gccgacgtct裴氏著色真菌 gggactcggt cttctccctc acgggaacac ttttttcta疣狀瓶霉 tggacggatt ttggtcgtgt aacaacggcc cctcctaaa卡氏枝孢霉tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaa申克孢子絲ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac總狀毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa紅色毛癬菌ccctggcccc aatctttata tatatatata tctttt須癬毛癬菌ctctggcctt cccccaaatc tctctgagat atttt絮狀表皮癬菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaagg犬小孢子菌gcaggctggc ctaacgcacc atgtattatt石膏樣小孢子菌tagtttccgt cagagatgta tttctctgca attt真菌共有探針 ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa
2.一種檢測致病真菌生物芯片，其特征是在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌tctaaccaaa aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtatatcttc aaa熱帶念珠菌ttatccaaaa acgcttattt tgctagtggc caccacaatt tatttcataa ct近平滑念珠菌 taggtttttt ccactcattg gtacaaactc caaaacttct tccaaat克柔念珠菌tttttttcag ggacgcttgg cggccgagag cgagtgttgc gagacaacaa aaa光滑念珠菌gggttaaact gtattaggtt ttaccaactc ggtgttgatc tagggaggga taagt新生隱球菌aataagtttc gctgggccta tggggtagtc ttcggcttgc tgataacaac catctc煙曲霉acctgctctg taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaa黃曲霉tgtaggcccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc cagg黑曲霉 gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tcttt構巢曲霉 ttgtcccgct cgactagggc cggccgggcg ccagccgacg tctccaa裴氏著色真菌 atcggatgaa gggtgcccgg gactcggtct tctccctcac gggaacactt ttttcta申克孢子絲 cccccaggcg ccctgccgtg aaaacgcgca tgacgcgcag ctctttttac紅色毛癬菌 aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat atctttt須癬毛癬菌 tccaggaccg gccgccctgg cctcaaaatc tgttttatct tatc疣狀瓶霉 gtgttggacg gattttggtc gtgtaacaac ggcccctcct aaa卡式枝孢霉 tggacggttt tggtcgagtg gtctcgaccc ctcctaaaga c犬小孢子菌 ccgggccggc aggctggcct aacgcaccat gtattattca石膏樣小孢子菌 gctctctggc ctagtttccg tcagagatgt atttctctgc aattt絮狀表皮癬菌 ggccggctct ctggccctaa tttccgtcgg gaggacgaaa gggggcgacc cct總狀毛霉 aaaggaaagc tcttgtaatt gactttgatg gggcctccca aataaatctt tt
3.一種檢測致病真菌生物芯片，其特征是在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，所述探針為白色念珠菌 aaaaacattg cttgcggcgg tagcgtctac cacgtatatc ttcaaa熱帶念珠菌 atccaaaaac gcttattttg ctagtggcca ccacaattta tttcat近平滑念珠菌 ctcattggta caaactccaa aacttcttcc aaat克柔念珠菌 tcagggacgc ttggcggccg agagcgagtg ttgcgagaca acaaaaa光滑念珠菌 actgtattag gttttaccaa ctcggtgttg atctagggag ggataagt新生隱球菌 cgctgggcct atggggtagt cttcggcttg ctgataacaa ccatctc煙曲霉 gtaggcccgg ccggcgccag ccgacaccca actttatttt tctaa黃曲霉 ttgccgaacg caaatcaatc tttttcca黑曲霉 atgctctgta ggattggccg gcgcctgccg acgttttcca accattcttt構巢曲霉 Cccgctcgac tagggccggc cgggcgccag ccgacgtctc caa裴氏著色真菌 tgaagggtgc ccgggactcg gtcttctccc tcacgggaac acttttttct a申克孢子 aggcgccctg ccgtgaaaac gcgcatgacg cgcagctctt tttac紅色毛癬菌 ggccgccctg gccccaatct ttatatatat atatatcttt t須癬毛癬菌 ccggccgctc tggccttccc ccaaatctct ctgagatatt ttttt疣狀瓶霉 cgtgcttggt gttggacgga ttttggtcgt gtaacaacgg c卡式枝孢霉 tgtgcttggt gttggacggt tttggtcgag tggtctcgac犬小孢子菌 ggccggcagg ctggcctaac gcaccatgta ttattca石膏樣小孢子菌 tggcctagtt tccgtcagag atgtatttct ctgcaattt絮狀表皮癬菌 gctctctggc cctaatttcc gtcgggagga cgaaaggggg cgacccct總狀毛霉 aaagctcttg taattgactt tgatggggcc tcccaaataa atctttt
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測致病真菌生物芯片，在玻片或硅片或高分子材料上固定檢測真菌的DNA探針，檢測真菌的DNA探針有檢測白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、裴氏著色真菌、疣狀瓶霉、卡氏枝孢霉、申克孢子絲、總狀毛霉、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌及石膏樣小孢子菌的探針，本發(fā)明可以快速地檢測多種真菌，同一芯片可以同時檢測，并具有實時、靈敏、準確和高效等特點。
文檔編號C12Q1/68GK1696311SQ20051001334
公開日2005年11月16日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權日2005年4月22日
發(fā)明者李君文, 黃愛華, 王新為, 諶志強, 金敏 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所