一種茖蔥快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茗蔥快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一門新興技術(shù)，是指在無(wú)菌 條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的條件 進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或不定芽等，或者長(zhǎng)成完整植株的過(guò)程。該技術(shù)自20世紀(jì)初 建立以來(lái)，在理論研究和應(yīng)用技術(shù)上不斷發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于植物的快速繁殖、品種改良、 基因工程育種、種質(zhì)資源保存、次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效 益，對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生了深刻影響。
[0003] 茗蔥，又名寒蔥，為百合科蔥屬的植物，多年生草本。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者從茗 蔥中分離出許多化學(xué)成分，主要為含硫化合物、黃酮類化合物、莆體化合物及糖類，并對(duì)這 些化學(xué)成分的藥理方面展開(kāi)了研究。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證了其中一些化學(xué)成分對(duì)預(yù)防血栓、動(dòng)脈硬 化、腦梗塞有良好的作用效果。并且，由于茗蔥蔥香味濃，略帶爽口野味，口感極佳。加之其 內(nèi)含物有顯著的藥理作用，既能作美味見(jiàn)于餐桌，又是沒(méi)有副作用的天然保健食品。在日本 和韓國(guó)的市場(chǎng)上，茗蔥是極受歡迎的蔬菜之一。但是，目前我國(guó)關(guān)于茗蔥的引種馴化還鮮有 報(bào)道。野生茗蔥生長(zhǎng)于海拔1，000米至2, 500米的地區(qū)，常生長(zhǎng)在草地、林下、陰濕山坡或 溝邊。由于對(duì)野生茗蔥的掠奪式采摘，造成這一野生資源正面臨著枯竭，加之野生茗蔥生長(zhǎng) 受氣候等條件的限制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足和市場(chǎng)需要。
[0004] 茗蔥的繁殖較難，同大多數(shù)蔥屬植物相同，其繁殖方式也可分為有性繁殖與無(wú)性 繁殖。研究表明，用鱗莖種植要比用種子繁殖好，因?yàn)橛梅N子繁殖需要3-5年才能采摘食 用，并且種子的生命活力降低很快，發(fā)芽困難、發(fā)芽率較低，而用鱗莖繁殖可以提高鱗莖產(chǎn) 量；目前國(guó)外學(xué)者提出了用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖，并且研究得較為深入，但因其費(fèi)用較 高，還不能在生產(chǎn)上大量應(yīng)用。因此，如何短時(shí)間內(nèi)快速大量繁殖茗蔥成為茗蔥產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 的關(guān)鍵。
[0005] 利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)茗蔥進(jìn)行組培快繁，能夠?qū)崿F(xiàn)茗蔥在短時(shí)間內(nèi)的快速增殖， 但是增殖率的高低是決定茗蔥能否通過(guò)組培快繁途徑進(jìn)行工廠化生產(chǎn)的瓶頸，因此發(fā)明一 種茗蔥快速繁殖的方法是從根本解決上述問(wèn)題的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決茗蔥生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且組培快繁增殖效率不高，難以滿足 大規(guī)模生產(chǎn)的問(wèn)題，而提供一種茗蔥快速繁殖方法。
[0007] 一種茗蔥快速繁殖方法，它包括： 1)茗蔥鱗莖盤的獲得 取茗蔥鱗莖，去除茗蔥須根，剝除外層鱗片，保留以中心生長(zhǎng)點(diǎn)為中心，直徑為0. 4-lcm 的鱗莖盤及其上部包裹的鱗片，獲得茗蔥的中心部位； 將茗蔥中心部位沖洗，消毒，用濾紙吸干水分； 經(jīng)過(guò)外植體滅菌后，在中心部位距底端3 - 5mm處橫切并去除上部鱗片，沿主生長(zhǎng)點(diǎn)垂 直切線方向，縱向分割成4份，去除主生長(zhǎng)點(diǎn)及主生長(zhǎng)點(diǎn)所在的鱗莖盤，分別培養(yǎng)； 2) 茗蔥鱗莖盤增殖 以 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 6-BA 0. 5-2. O mg/L、NAA 0. 05-0. 5 mg/L，PH 調(diào)節(jié)至 5. 8,誘 導(dǎo)叢生芽； 3) 繼續(xù)培養(yǎng)成種植苗； 所述的切割成4份，是以主生長(zhǎng)點(diǎn)兩條垂直的切線為切口，進(jìn)行切割，切成4份，其中 只有一個(gè)1/4份切塊帶有主生長(zhǎng)點(diǎn)所在的鱗莖盤，剝掉其主生長(zhǎng)點(diǎn)和主生長(zhǎng)點(diǎn)所在的鱗莖 盤； 所述的1/4份鱗莖盤上部的鱗片基部再進(jìn)行切割，至遠(yuǎn)主生長(zhǎng)點(diǎn)端高，近主生長(zhǎng)點(diǎn)端 低的斜面。
[0008] 所述的6-BA和NAA的添加量分別為I. 0 mg/L和0· I mg/L ; 步驟3)所述的繼續(xù)培養(yǎng)成苗，是以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 NAA 0. 1-1 mg/L，PH調(diào)節(jié) 至5. 8 ;將叢生苗接種于生根培養(yǎng)基中，3周后叢生苗生根；將生根后的叢生苗分割成單株， 接種于壯苗培養(yǎng)基中，獲得茗蔥種苗；種苗經(jīng)馴化后，種植； 所述的茗蔥中心部位消毒，用75%酒精浸泡消毒Imin后，隨后用1% NaClO溶液浸泡 消毒 15- 20min。
[0009] 本發(fā)明提供了一種茗蔥快速繁殖方法，將茗蔥中心部位清洗、消毒。經(jīng)過(guò)外植體滅 菌后，在中心部位距底端3 - 5mm處橫切并去除上部鱗片，沿主生長(zhǎng)點(diǎn)垂直切線方向，縱向 分割成4份，去除主生長(zhǎng)點(diǎn)及主生長(zhǎng)點(diǎn)所在的鱗莖盤，誘導(dǎo)叢生芽，并培養(yǎng)成苗，通過(guò)上述 培養(yǎng)過(guò)程的優(yōu)化建立了茗蔥鱗莖盤快速繁殖體系，獲得了大量的茗蔥試管苗，該體系增殖 時(shí)間短，增殖系數(shù)大，遺傳穩(wěn)定性高，通過(guò)該體系能夠?qū)崿F(xiàn)茗蔥的快速繁育，實(shí)現(xiàn)茗蔥產(chǎn)業(yè) 的種植。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1不同激素組合對(duì)分蘗洋蔥莖尖增殖的影響（a :分蘗洋蔥莖尖；b :莖尖在 6-BA、NAA組合中的增殖情況；c :莖尖在6-BA、IAA中的增殖情況）； 圖2分蘗洋蔥鱗莖盤的獲得； 圖3分蘗洋蔥試管微鱗莖盤切割步驟流程； 圖4分蘗洋蔥試管微鱗莖盤切割步驟流程示意圖； 圖5.分蘗洋蔥試管鱗莖盤增殖（a :分蘗洋蔥試管微鱗莖盤；b :第2周顯微鏡下觀察到 的增殖情況；c :第3周叢生芽增殖、生長(zhǎng)情況；d :第4周叢生芽增殖、生長(zhǎng)情況）； 圖6.分蘗洋蔥試管苗壯苗培養(yǎng)（a :分蘗洋蔥試管增殖叢生苗；b :單株分蘗洋蔥試管 苗；c :壯苗培養(yǎng)后的試管苗）； 圖7茗蔥中心部位的獲得； 圖8茗蔥鱗莖盤的獲得； 圖9茗蔥鱗莖盤增殖苗的獲得； 圖10茗蔥增殖苗生根； 圖11大蒜鱗莖盤的獲得； 圖12大蒜鱗莖盤接種； 圖13大蒜鱗莖盤增殖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1分蘗洋蔥莖尖增殖 將分蘗洋蔥莖尖分別接種于不同濃度的6-BA、NAA組合，6-BA、IAA組合培養(yǎng)基中（表 1 )，兩種激素組合均能夠獲得分蘗洋蔥試管增殖苗，但相同濃度的IAA和NAA在進(jìn)行增殖誘 導(dǎo)時(shí)，差異很大。其中在6-BA、NAA激素組合中誘導(dǎo)的增殖苗長(zhǎng)勢(shì)較好，且分化系數(shù)較高，在 培養(yǎng)4周時(shí)，平均增殖系數(shù)可達(dá)3. 87 ;6-BA、IAA激素組合雖然也能夠?qū)崿F(xiàn)莖尖增殖，但所獲 得的增殖苗細(xì)、弱，分化系數(shù)低，且有白化苗出現(xiàn)(如圖1)?？梢?jiàn)，IAA的作用效果不如NAA。 因此確定MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. lmg/L培養(yǎng)基為莖尖增殖最佳培養(yǎng)基。
注：MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0013] 實(shí)施例2分蘗洋蔥鱗莖盤增殖 取分蘗洋蔥一枚，去除分蘗洋蔥鱗莖盤木栓化的部位，保留以中心生長(zhǎng)點(diǎn)為中心，直徑 為0. 4-lcm的鱗莖盤及其上部包裹的鱗莖，得到分蘗洋蔥中心部位。將分蘗洋蔥中心部位 用流水沖洗0. 5 h，用75%酒精浸泡消毒I min后，隨后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20 min，無(wú)菌水沖洗3-5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分備用（如圖2)。
[0014] 然后去除上部鱗莖，保留包含主生長(zhǎng)點(diǎn)在內(nèi)的鱗莖盤，將鱗莖盤切割成4份后去 除主生長(zhǎng)點(diǎn)及主生長(zhǎng)點(diǎn)鱗莖盤，分別接種于以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 6-BA (0. 2-0. 8 mg/ L)、NAA (0. 1-2. Omg/L)，PH調(diào)節(jié)至5. 8的增值培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽。在25°C、光照 時(shí)間為16h、光照強(qiáng)度為25001ux條件下，經(jīng)過(guò)4周的誘導(dǎo)，以6-BA、NAA組合誘導(dǎo)效果最好； 6-BA、IAA組合也能誘導(dǎo)出叢生芽，但增殖系數(shù)低，再生苗存在畸形苗。其中鱗莖盤在添加 6-BAO. 6mg/L、NAAO. lmg/L的培養(yǎng)基中，4周后，分化數(shù)達(dá)到最大值，每個(gè)鱗莖盤最大增殖系 數(shù)(增殖系數(shù)=分化芽總數(shù)/接種數(shù))可達(dá)20 (見(jiàn)表2)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，鱗莖盤分化 數(shù)增加，但在誘導(dǎo)第4周后鱗莖盤分化數(shù)不再增加，鱗莖盤的分化率達(dá)最大值(見(jiàn)表3)。
注：MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0017] 實(shí)施例3分蘗洋蔥脫毒苗試管結(jié)球 取分蘗洋蔥莖尖部位，流水沖洗半小時(shí)，用75%酒精浸泡消毒Imin后，隨后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20min，無(wú)菌水沖洗3-5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分 備用，顯微鏡下剝離分蘗洋蔥莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)〈0. 3mm部分，在以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 6-BA、 IAA的啟動(dòng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成苗。
[0018] 莖尖成苗后，分別以蔗糖為基礎(chǔ)碳源設(shè)置30mg/L、45mg/L、60mg/L、75mg/L、90mg/ L共5個(gè)碳源糖濃度，探討不同糖濃度對(duì)分蘗洋蔥試管苗結(jié)球的影響，篩選最佳結(jié)球培養(yǎng)基 中糖濃度，通過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度的增加鱗莖結(jié)球直徑、鮮重增加。當(dāng)糖濃度高于75 mg/L時(shí)，結(jié)球速度加快但影響根的生長(zhǎng)，導(dǎo)致最終鱗莖平均直徑、鮮重降低(見(jiàn)表4)。
[0019] 在脫毒苗結(jié)球培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)晝夜溫差的調(diào)控，調(diào)節(jié)試管苗的結(jié)球速度， 針對(duì)分蘗洋蔥生長(zhǎng)的適宜溫度分別設(shè)置25°C /25°C、25°C /20°C、25°C /15°C共3組晝夜溫 度處理，篩選最佳培養(yǎng)溫度。在晝夜溫差為KTC時(shí)鱗莖直徑和鱗莖鮮重要優(yōu)于其他處理。 由此確定在分蘗洋蔥脫毒苗結(jié)球過(guò)程中，最佳培養(yǎng)溫度為白天25°C，夜間15°C (見(jiàn)表5)。
[0020] 在脫毒苗結(jié)球培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的光照強(qiáng)度、光周期的調(diào)控，調(diào)節(jié) 試管苗的結(jié)球速度，針對(duì)分蘗洋蔥生長(zhǎng)條件分別設(shè)置3組光照強(qiáng)度、光周期處理。結(jié)果表 明，隨光照強(qiáng)度和光照時(shí)間的延長(zhǎng)，試管球的平均直徑和鱗莖鮮重逐步增加，在光照強(qiáng)度為 25001u X，16h光照、8h黑暗條件時(shí)有利于分蘗洋蔥脫毒試管苗結(jié)球，其試管球鱗莖平均直 徑、鱗莖