用于評價(jià)臨床不育的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】用于評價(jià)臨床不育的方法和系統(tǒng)
[0001]本申請是申請日為2009年1月7日、申請?zhí)枮?200980133799. 9"、發(fā)明名稱為"用 于評價(jià)臨床不育的方法和系統(tǒng)"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[000引交叉引用
[0003] 本申請要求2008年7月1日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/077, 439和2008年7 月17日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/081，596的權(quán)益，運(yùn)些申請通過引用全文并入本文。
[0004]政府權(quán)益
[0005]本發(fā)明在美國國家衛(wèi)生研究院給予的聯(lián)邦政府撥款第R01GM067250和R01 皿057970號的政府支持下進(jìn)行。美國政府對本發(fā)明有某些權(quán)利。
[000引發(fā)明背景
[0007] 生殖失敗是嚴(yán)重的問題，臨床上已通過各種輔助的生殖技術(shù)包括體外受精（IVF) 和胚胎移植巧T)來解決。由于體外受精提供了在形態(tài)學(xué)水平表現(xiàn)正常的胚胎用于移植到 完全易感的接受者，可能預(yù)料運(yùn)些程序產(chǎn)生極其高的受孕率。盡管有運(yùn)些努力，IVF/ET的成 功率低于理想。在1994年美國和加拿大公布的IVF/ET數(shù)據(jù)中，開始了 26,961個(gè)標(biāo)準(zhǔn)IVF 周期。其中，86. 2%達(dá)到采集，其中的90. 2%達(dá)到移植。然而，在臨床妊娠方面，總成功率是 每個(gè)開始的周期22. 7%，每次移植29. 1 %的妊娠率。
[0008] 另外，在體外受精之后似乎有早期妊娠丟失的高發(fā)生率，生化妊娠率是18%，自然 流產(chǎn)率是27%。因此，看起來IVF技術(shù)已被充分優(yōu)化，但植入失敗可能是進(jìn)行ET的大量丟 失的原因，運(yùn)種圍植入丟失是可能改進(jìn)的領(lǐng)域。各種輔助的生殖技術(shù)的成功率的關(guān)鍵因素 是子宮內(nèi)膜容受性，運(yùn)是一種必須與胚胎發(fā)育至植入-感受態(tài)的胚泡協(xié)調(diào)的過渡態(tài)。
[0009]IVF是一種昂貴的程序，對于患者來說在屯、理學(xué)上可能是創(chuàng)傷性的。需要外科手 術(shù)來從IVF的女性收集卵子，在受精之后，需要進(jìn)一步的外科手術(shù)來在子宮中植入受精卵。 然后接受者必須等待一段時(shí)間才能確定是否已建立起妊娠。在一些病例，可能盡管重復(fù)多 次努力而不能實(shí)現(xiàn)妊娠，運(yùn)些病例可能對患者和社會(huì)在財(cái)務(wù)和人力兩方面造成相當(dāng)大的花 費(fèi)。
[0010] 因此，盡管可改進(jìn)IVF的成功率，可能期望的是能夠在治療前鑒定IVF不太可能成 功的接受者，從而使運(yùn)些患者能夠避免W上提到的IVF程序的花費(fèi)和創(chuàng)傷。
[0011] 本發(fā)明解決了運(yùn)些需要。
[001引發(fā)明概述
[0013] 提供了用于便于評價(jià)臨床不育的方法和基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)?？蓪?shí)施所述方法和系 統(tǒng)W，例如，便于為體外受精治療周期評價(jià)受治療者，包括確定活產(chǎn)事件概率?？蓪?shí)施所述 方法和系統(tǒng)W，例如，便于確定胚胎的成功植入、選擇將移植的胚胎的最佳數(shù)目、確定在不 成功的治療周期之后隨后體外受精治療周期的成功。
[0014]本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀W下更完全地描述的本發(fā)明細(xì)節(jié)之后，本發(fā)明的運(yùn)些和其它 目標(biāo)、益處和特征將變得明顯。
[0015] 附圖簡述
[0016] 當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，最佳地從W下詳述理解本發(fā)明。需要強(qiáng)調(diào)的是，根據(jù)一般實(shí) 踐，圖的各個(gè)特征不是按比例的。相反，為了清楚，各個(gè)特征的大小是任意放大或縮小的。附 圖中包括W下各圖。
[0017]圖1顯示數(shù)據(jù)的來源。圖A顯示在2005年進(jìn)行的IVF周期。圖B顯示在665個(gè) 新的、非供體IVF周期中卵母細(xì)胞和胚胎的利用。圖A中的所有數(shù)目表示周期的數(shù)目，圖B 中的數(shù)目表示卵母細(xì)胞或胚胎的數(shù)目。新的周期由在同一周期中進(jìn)行的促性腺素卵巢刺激 和胚胎移植來界定；冷藏周期利用從之前的周期獲得和冷藏的胚胎；"全冷凍"是其中由于 醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)原因，在同一周期中進(jìn)行卵巢刺激，但胚胎被冷藏而不是被移植回的周期。由 于多種醫(yī)學(xué)和非醫(yī)學(xué)原因未達(dá)到新鮮胚胎移植，從分析中去除157個(gè)周期。
[001引圖2顯示根據(jù)在第3天的細(xì)胞數(shù)目，來自665個(gè)新的、非供體IVF病例的所有胚胎 的分布。
[0019] 圖3顯示變量和其在確定A) 8細(xì)胞胚胎數(shù)（圖A)、第3天FSH(圖B)和胚胎總數(shù) (圖C)時(shí)的相對重要性。
[0020] 圖4顯示細(xì)胞周期蛋白A2被Ccna2-M0翻譯阻滯，導(dǎo)致胚胎在2-細(xì)胞期停滯。圖A 顯示通過RT-PCR在1-至2-細(xì)胞胚胎中的Ccna2表達(dá)。圖B顯示核細(xì)胞周期蛋白A2定位 在83. 4 + 6. 0%Ccna2-M0-注射的胚胎中不存在，但在所有未注射胚胎中存在；P< 0. 01)。 圖C顯示~50kD細(xì)胞周期蛋白A2蛋白在Ccna2-M0-注射的胚胎中未檢測到。
[0021] 圖5,圖A顯示與對照相比，Ccna2-M0誘導(dǎo)更高比率的2-細(xì)胞期停滯（P< 0. 01)。 圖B顯示只有1. 8 + 1. 8%Ccna2-M0-注射的胚胎達(dá)到胚泡期（與Ccna2-MM相比P= 0. 06)。 圖C顯示2-細(xì)胞期停滯比率隨著Ccna2-M0濃度減少（0. 5mM的P= 0. 05 ;0. 25mM的P= 0. 01)。圖D顯示在0. 25mM比在0. 75mM胚泡發(fā)育比率更高（p<0. 001)。所有的柱和誤差 棒代表分別來自至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組的平均值±s.e.m.。比例尺是40ym。參見表1使用 的所有M0的祀向序列，表7是在每組實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的胚胎總數(shù)。
[0022] 圖6顯示在最早階段調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的機(jī)制。在野生型（+/-)胚胎中，在 胚胎基因組激活巧GA)之前存在母體轉(zhuǎn)錄物，而在母體-胚胎過渡階段存在母體轉(zhuǎn)錄物和 胚胎轉(zhuǎn)錄物，運(yùn)二者導(dǎo)致產(chǎn)生正?；虍a(chǎn)物（圖A)。在從對無效突變雜合（+/-)的母體產(chǎn) 生的純合無效突變（-/-)胚胎中，持續(xù)的母體轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白可能"捶救"或延遲表型出 現(xiàn)（圖B)。相反，在從純合突變女性或帶有卵母細(xì)胞-特異性基因缺失的女性產(chǎn)生的純合 無效突變胚胎中，觀察到的缺陷可能反映卵母細(xì)胞缺陷，而不是早期胚胎中的特異性基因 需求（圖C)。因此，當(dāng)母體和早期胚胎轉(zhuǎn)錄物二者可能同時(shí)存在時(shí)，運(yùn)些策略不解決特異 性基因在EGA尖點(diǎn)或在EGA期間的精確作用。在EGA時(shí)或EGA之前細(xì)胞質(zhì)微注射反義嗎嘟 代寡核巧酸（M0)到野生型胚胎中導(dǎo)致母體和胚胎基因轉(zhuǎn)錄物二者的特異性翻譯阻滯（圖 D)。因?yàn)镸0持續(xù)至少數(shù)個(gè)細(xì)胞分裂周期，基因-特異性翻譯阻滯可能直到桑甚胚-胚泡期 都有效。在運(yùn)些發(fā)育階段期間基因產(chǎn)物的不存在將掲示關(guān)鍵的基因功能和暴露早期表型， 運(yùn)是在常規(guī)基因-祀向策略中通過同源重組和基因轉(zhuǎn)置可能不可檢測的。盡管在其它物種 中已充分建立此模型，其將示例從考察胚胎基因的功能轉(zhuǎn)化為考察基因產(chǎn)物的功能而不論 其母體或胚胎來源。
[0023] 圖7顯示實(shí)驗(yàn)策略。從野生型交配收集在2前核（2PN)或1-細(xì)胞期的胚胎，并注 射設(shè)計(jì)為祀向特定基因的反義嗎嘟代寡聚物（M0)。M0結(jié)合于5'UTR或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并通 過空間位阻阻滯翻譯。體外培養(yǎng)微注射的胚胎和未注射的對照胚胎，觀察發(fā)育表型諸如在 2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、多細(xì)胞或桑甚胚階段碎裂或停滯。如果基因-特異性MO-致地產(chǎn)生相同 表型，而錯(cuò)配對照M0允許正常發(fā)育，則目標(biāo)基因的敲低由免疫細(xì)胞化學(xué)和/或免疫印跡法 驗(yàn)證。基因功能的機(jī)制通過從在mid-2-細(xì)胞期（HCG后43小時(shí)）的注射和對照胚胎獲得 全體基因表達(dá)譜而進(jìn)一步研究。檢驗(yàn)候選下游基因在早期胚胎中的差異表達(dá)和基因功能。
[0024]圖8顯示通過單胚胎RT-PCR在小鼠合子中的0ct4表達(dá)。
[00巧]圖9顯示在形成胚泡之前早期胚胎發(fā)育需要0ct4。圖A顯示0ct4-M0-注射的胚胎 在多細(xì)胞期停滯，而對照達(dá)到胚泡期。圖B顯示0ct4敲低誘導(dǎo)在1-至多細(xì)胞期更高的停滯 比率；P<0. 01。圖C顯示0ct4-M0-注射的胚胎都不發(fā)育為胚泡。圖D顯示隨著0ct4-M0 濃度，在1-至多細(xì)胞期停滯比率減少（P<0. 01)。圖E顯示隨著減少濃度的0ct4-M0,有 更高比率胚泡發(fā)育的非顯著趨勢。
[0026] 圖10顯不在Oct4-M〇-注射的胚胎中在4-細(xì)胞期之前減少的0ct4表達(dá)是明顯 的。0ct4信號在注射0ct4-M0的胚胎中不存在，但其核定位在未注射的對照和錯(cuò)配對照中 存在。比例尺是40ym。
[0027] 圖11，圖A顯示核0ct4表達(dá)在0ct4-M0-注射的胚胎中不存在（上圖），但在 0ct4-MM-注射的胚胎和未注射的胚胎中存在。圖B顯示與沒有共注射或mEYFPmRNA共注射 相比，共注射36或3. 6ng/yL0ct4mRNA通過具體地減少在1-至多細(xì)胞期的停滯比率而導(dǎo) 致部分捶救0ct4-M0誘導(dǎo)的表型，運(yùn)導(dǎo)致更高比率的胚泡發(fā)育（P<0. 01)。圖C顯示過表 達(dá)0ct4mRNAW劑量依賴性方式誘導(dǎo)更高的發(fā)育停滯，W使注射36或90ng/yL0ct4mRNA 后與過表達(dá)mEYFP相比胚泡比率顯著降低（p<0. 01)?；蜻^表達(dá)通過q-PCR或免疫細(xì)胞 化學(xué)驗(yàn)證（數(shù)據(jù)未顯示）。（比例尺是=40ym)。
[002引圖12顯示0ct4-M0-注射的胚胎中在多細(xì)胞期減少的0ct4表達(dá)。只有6. 4 + 3. 2% 0ct4-M0-注射的胚胎顯示核0ct4信號，而88. 9± 11. 1 % 0ct4-MM-注射的胚胎和 82. 7 + 10. 9%未注射的對照胚胎在多細(xì)胞期顯示明確的核0ct4表達(dá)；P< 0. 05。
[0029] 圖13顯示由0ct4E4-M0證實(shí)在早期胚胎發(fā)育中需要0ct4,0ct4E4-M0是祀向0ct4 的外顯子4的剪接位點(diǎn)的反義嗎嘟代。圖A顯示由兩種嗎嘟代0ct4-M0和0ct4E4-M0祀向 的位點(diǎn)。0ct4-M0祀向開始于ATG起始位點(diǎn)的25個(gè)核巧酸，而0ct4E4-M0祀向在第4個(gè)外顯 子巧4)的內(nèi)含子（I)-外顯子似邊界的剪接位點(diǎn)。預(yù)期去除E4會(huì)產(chǎn)生一種缺少DNA-結(jié) 合和活化結(jié)構(gòu)域的蛋白產(chǎn)物。圖B顯示注射0ct4E4-M0的64. 6± 19. 9%的胚胎在2-細(xì)胞 期停滯，而注射錯(cuò)配對照0ct4E4-MM的胚胎都不在2-細(xì)胞期停滯。圖C顯示與錯(cuò)配對照 0ct4E4-MM相比，注射0ct4E4-M0之后胚泡發(fā)育嚴(yán)重受損。
[0030] 圖14和15顯示0ct4的基因調(diào)節(jié)。圖14,圖A顯示3種0ct4敲低、3種Ccna2 敲低和6種未注射的（NI)匯集的胚胎樣品的無監(jiān)督聚類（unsupervisedclustering)，W 及增加（紅色）和減少的（藍(lán)色）基因表達(dá)。標(biāo)尺是標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14,圖B顯示差異表達(dá) 的基因在0ct4和Ccna2敲低胚胎中的交叉。圖14,圖C和圖15顯示通過單胚胎q-PCR的 0ct4敲低相對表達(dá)，圖14,圖C是過表達(dá)的基因（對化巧P< 0. 05)，圖15是下調(diào)的基因 (*p<< 0. 001，林口< 0. 05,***p< 0. 1)。TR是翻譯阻遏。誤差棒表示S.e.m.。
[0031] 圖16顯示0ct4功能在1-至2-細(xì)胞期的模型。圖A顯示絕對（ACt)(紅色）大于 其S.e.m.(藍(lán)色）的基因，基于遞增的S.e.m.順時(shí)針地排列（對數(shù)標(biāo)尺）。圖B顯示0ct4 經(jīng)由轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制對各模塊提議的調(diào)節(jié)。
[0032] 圖17顯示活產(chǎn)分析的數(shù)據(jù)來源概述?？蛑械臄?shù)目表示在Stan化rdIVF中屯、經(jīng) 2003-06進(jìn)行的新周期的數(shù)目。未包括的周期是關(guān)于：代孕母親（gestationalcarriers)、 冷凍ET或冷藏胚胎移植（利用冷凍胚胎的周期，不論周期是在Stan化rd還是外面進(jìn)行）、 供體卵母細(xì)胞（非自身卵母細(xì)胞）、接受者周期和其中不注射促性腺素的周期。因?yàn)橹貜?fù)的 條目和未知結(jié)果，從分析排除9個(gè)周期。取決于患者為了新的IVF周期返回的次數(shù)，分析的 周期進(jìn)一步分為周期1、2、3或超過。
[0033] 圖18顯示活產(chǎn)結(jié)果的概述。不同的框代表C1(第一-IVF周期）、C2(第二-IVF 周期）和C3(第S-IVF周期）。每個(gè)框顯示具有活產(chǎn)（LB+)或無活產(chǎn)（LB-)結(jié)果的周期數(shù) 目、分析的周期總數(shù)目（腳的百分比W及退出并沒有返回的患者數(shù)目。
[0034] 圖19是顯示胚胎關(guān)于發(fā)育階段的分布的圖。來自所有=個(gè)周期的2969個(gè)新的、非 供體IVF病例根據(jù)在體外培養(yǎng)第3天的細(xì)胞數(shù)目的分布。每個(gè)胚胎的細(xì)胞數(shù)目和具有8個(gè) 細(xì)胞的胚胎的最大數(shù)目（~40%)在周期C1 (無填充圖案）、C2(水平填充圖案）和C3(垂 直填充圖案）之間相似。
[003引圖20顯示預(yù)測模型和它們與典型IVF周期的時(shí)間關(guān)系。IVF周期包括利用口服 避孕藥（0C巧下調(diào)內(nèi)源促性腺素和月經(jīng)周期、定期F甜注射、和W帶有或不帶有血清雌二醇 的超聲波監(jiān)控周期、然后是hCG注射W模擬內(nèi)源LH波動(dòng)、卵母細(xì)胞采集、由IVF或ICSI受 精、體外胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、和低溫儲(chǔ)存多余胚胎。=個(gè)黑色星形代表患者可獲取關(guān)于進(jìn) 一步治療選擇和是否繼續(xù)治療的知情決定的時(shí)間點(diǎn)。Pre-IVF模型繼續(xù)直到治療開始日。 Pre-OR(卵母細(xì)胞采集）模型繼續(xù)直到hCG注射?；痵t-IVF模型包括直到胚胎移植的所有 變量。
[0036] 圖214、218和21(：顯示^個(gè)分析組的樹模型：？'6-1￥。(214)、？的-01?(218)和 化st-IVF(21C)。餅圖顯示活產(chǎn)（LB)在分析的周期總數(shù)目（腳中的百分比。最終人群標(biāo)為 群1(Pop1)等等，并標(biāo)出其活產(chǎn)率。
[0037] 圖22顯示2007年數(shù)據(jù)集的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。
[0038] 圖23顯示Pre-IVF、Pre-OR和化st-IVF模型鑒定具有不同活產(chǎn)率的不同群。
[0039]圖 24A、24B和 24C顯示Pre-IVF(圖 23A)、Pre-OR-(圖 23B)、化st-IVF模型和基 于年齡的對照模型之間活產(chǎn)率的比較。
[0040] 圖25顯示化st-IVF模型C1群分配預(yù)測在C2中的不同活產(chǎn)率和在隨后周期（C2 和C3)中的累計(jì)活產(chǎn)率。
[0041] 圖26顯示在1-細(xì)胞期進(jìn)行的基因忍片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0042] 圖27顯示在4-細(xì)胞期進(jìn)行的基因忍片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0043] 圖28顯示在8-細(xì)胞期進(jìn)行的基因忍片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0044] 圖29顯示兩個(gè)基因忍片實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)，顯示一組基因在不同細(xì)胞期的表達(dá)。
[0045] 圖30顯示兩個(gè)基因忍片實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)，顯示一組基因在不同細(xì)胞期的表達(dá)。
[0046] 在描述本發(fā)明的實(shí)施方案之前，要理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體實(shí)施方 案，因?yàn)檫\(yùn)些當(dāng)然可W變化。還需要理解的是，在本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案 的目的，不意為限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由附隨的權(quán)利要求書限定。
[0047] 當(dāng)提供數(shù)值的范圍時(shí)，要理解的是，除非上下文明確地相反說明，否則在所述范圍 的上限和下限之間的每個(gè)中間值，直到所述下限的單位的十分之一，也具體地公開了。在提 及的范圍內(nèi)任何提及的值或中間值與在提及的范圍內(nèi)任何其它提及的值或中間值之間的 每個(gè)更小的范圍包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。運(yùn)些更小的范圍的上限和下限可W獨(dú)立地包括或 排除在所述更小的范圍之內(nèi)，且上限和下限的之一、無一或二者包括在所述更小的范圍之 內(nèi)時(shí)的范圍也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)，并受在所提及的范圍內(nèi)特別排除任何值的限制。當(dāng) 提及的范圍包括兩個(gè)限值之一或二者時(shí)，排除了所包括的限值之一或兩者的范圍也包括在 本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0048] 除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。盡管類似于或等同于在本文描述的任何方法和材料 可W用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但現(xiàn)在描述了一些可能的和優(yōu)選的方法和材料。在本文中 提及的所有出版物在此通過引用并入本發(fā)明，來公開和描述與所述出版物所引用的相關(guān)的 方法和/或材料。應(yīng)理解的是，當(dāng)本發(fā)明公開與并入的出版物的任何公開存在矛盾時(shí)，W本 發(fā)明公開為準(zhǔn)。
[0049] 必須注意的是，在本文使用的和在附隨的權(quán)利要求書中，除非上下文中有明確的 相反說明，否則單數(shù)形式"一（a)"、"一（an)"和"該（the)"包括了復(fù)數(shù)的指稱對象。因此， 例如，提及"一個(gè)細(xì)胞"包括多個(gè)運(yùn)樣的細(xì)胞，提及"該化合物"包括提及一種或多種化合物 和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物，等等。
[0050] 進(jìn)一步注意，權(quán)利要求可W撰寫成排除任何任選的元素。因而，運(yùn)一聲明旨在充當(dāng) 先行的基礎(chǔ)，用于與權(quán)利要求元素的敘述一起來使用排他性術(shù)語如"單獨(dú)地"、"僅"等等，或 用于"否定的"限制。
[0051] 本文討論的出版物僅為了其在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_而被提供。此處不應(yīng)解釋 為一種承認(rèn)，即承認(rèn)本發(fā)明沒有權(quán)利憑借在先發(fā)明而先于上述出版物。進(jìn)一步的，所提供的 出版物的日期可能不同于實(shí)際的出版日期，其可能需要被獨(dú)立地確認(rèn)。
[005引定義
[0053] 術(shù)語"受治療者"、"個(gè)體"和"患者"在本文可互換地使用，指被評價(jià)治療和/或正 被治療的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類，諸如女人。因此，術(shù)語"受治療 者"、"個(gè)體"和"患者"涵蓋需要評價(jià)臨床不育的個(gè)體，包括已經(jīng)經(jīng)歷體外受精周期或正候選 體外受精周期的個(gè)體。
[0054] 本文所用的術(shù)語"相關(guān)"或"與...相關(guān)"和類似術(shù)語是指兩次事件的實(shí)例之間統(tǒng) 計(jì)相聯(lián)，其中事件包括數(shù)目、數(shù)據(jù)集等等。例如，當(dāng)事件包括數(shù)目時(shí)，正相關(guān)（在本文還稱為 "直接相關(guān)"）表示當(dāng)一個(gè)增加時(shí)，另一個(gè)也增加。負(fù)相關(guān)（在本文還稱為"逆相關(guān)"）表示 當(dāng)一個(gè)增加時(shí)，另一個(gè)減少。
[00巧]"生物樣品"涵蓋從個(gè)體獲得的多種樣品類型。該定義涵蓋血液和生物來源的其它 液體樣品、實(shí)體組織樣品諸如活檢樣本或來源于其的組織培養(yǎng)物或細(xì)胞及其后代。該定義 還包括在取得后已通過任何方式操縱的樣品，諸如通過試劑處理；洗涂；或富集某些細(xì)胞 群諸如癌細(xì)胞。該定義還包括已經(jīng)富集特定類型分子如核酸、多膚等等的樣品。術(shù)語"生物 樣品"涵蓋臨床樣品，并還包括通過外科切除獲得的組織、由活檢獲得的組織、培養(yǎng)的細(xì)胞、 細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、組織樣品、器官、骨髓、血液、血漿、血清等等。"生物樣品"包括從 患者子宮獲得的樣品，包括胚胎培養(yǎng)物。
[0056] 術(shù)語"基因產(chǎn)物"和"表達(dá)產(chǎn)物"在本文提及基因時(shí)可互換地使用，是指基因的RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄物），包括mRNA和運(yùn)種RNA轉(zhuǎn)錄物的多膚翻譯產(chǎn)物，無論所述產(chǎn)物是否在翻 譯后被修飾。術(shù)語"基因產(chǎn)物"和"表達(dá)產(chǎn)物"在本文提及RNA，特別是mRNA時(shí)可互換地使 用，是指運(yùn)種RNA的多膚翻譯產(chǎn)物，無論所述產(chǎn)物是否在翻譯后被修飾?；虍a(chǎn)物可W是， 例如，未剪接的RNA、mRNA、剪接變體mRNA、多膚、翻譯后修飾多膚、剪接變體多膚等等。
[0057]本文所用的術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)水平"是指響應(yīng)指示基因相對于參考基因的表達(dá) 產(chǎn)物水平的表達(dá)水平。
[0058]本文所用的術(shù)語"標(biāo)記"和"檢測標(biāo)記"是指能夠被檢測的分子，其中所述分子包 括但不限于，放射性同位素、巧光劑（巧光團(tuán)）、化學(xué)發(fā)光劑、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因子、 酶抑制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體（如，生物素、親和素、鏈霉親和素或半 抗原）、嵌入染料及類似物。術(shù)語"巧光劑"或"巧光團(tuán)"是指能夠在可檢測的范圍表現(xiàn)巧光 的物質(zhì)或其部分。
[0059]本文所用的術(shù)語"祀核酸區(qū)"或"祀核酸"是指帶有將被檢測（如，在包括核酸雜交 和/或擴(kuò)增的方法中）的"祀序列"的核酸。祀核酸可W是單鏈或雙鏈的，可W包括或不包 括祀序列W外的其它序列（如，祀核酸可W包括或不包括上游的核酸序列或5'側(cè)翼序列， 可W包括或不包括下游或3'側(cè)翼序列。當(dāng)檢測是通過擴(kuò)增時(shí)，祀序列W外的運(yùn)些其它序列 可與祀序列一起擴(kuò)增或不與祀序列一起擴(kuò)增。
[0060]本文所用的術(shù)語"引物"或"寡核巧酸引物"是指當(dāng)放置在其中誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物 合成的條件下時(shí)，作用為起始互補(bǔ)核酸鏈合成的寡核巧酸，如，在存在核巧酸和聚合誘導(dǎo)劑 諸如DNA或RNA聚合酶并在合適溫度、pH、金屬離子濃度和鹽濃度時(shí)。引物通常為與其在合 成引物延伸產(chǎn)物中的用途相適合的長度，長度可W在約8個(gè)核巧酸至約100個(gè)核巧酸（nt) 的范圍，諸如約lOnt至約75nt、約15nt至約60nt、約15nt至約40nt、約18nt至約30nt、 約20nt至約40nt、約21nt至約50nt、約22nt至約45nt、約25nt至約40nt、等等，如，長度 在約18nt至約40nt、約20nt至約35nt、約21至約30nt的范圍（包含性）、和在所提出范 圍之間的任何長度。引物可W在長約10-50個(gè)核巧酸的范圍，諸如約15-45、約18-40、約 20-30、約21-25nt、等等、和在所提出范圍之間的任何長度。在一些實(shí)施方案中，引物長度不 超過約 10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65 或 70 個(gè)核 巧酸。在運(yùn)樣的上下文中，術(shù)語"約"可W解釋為表示從5'或3'任一端或從兩端多1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)核巧酸。
[0061]在許多實(shí)施方案中，為了擴(kuò)增的最大效率，引物是單鏈的，但可選地可W是雙鏈 的。如果是雙鏈，在許多實(shí)施方案中，在被用于制備延伸產(chǎn)物之前，引物首先被處理W分開 其各鏈。運(yùn)一變性步驟通常通過加熱實(shí)現(xiàn)，但可選地可W利用堿，隨后中和來實(shí)現(xiàn)。從而， "引物"與模板互補(bǔ)，通過氨鍵合或雜交與模板復(fù)合，獲得引物/模板復(fù)合體W起始由聚合酶 的合成，通過在其3'端共價(jià)加入堿基來延伸。
[0062]本文所用的"引物對"是指具有適于基于核酸擴(kuò)增祀核酸的核酸序列的第一引物 和第二引物。運(yùn)樣的引物對通常包括具有與祀核酸第一部分相同或相似的序列的第一引 物、和具有與祀核酸第二部分互補(bǔ)的序列的第二引物，W提供祀核酸或其片段的擴(kuò)增。除非 另外特別指明，否則本文提及"第一"和"第二"引物是隨機(jī)的。例如，第一引物可設(shè)計(jì)為"正 向引物"（起始從祀核酸5'端的核酸合成）或?yàn)?反向引物"（起始從正向引物起始的合成 產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物5'端的核酸合成）。類似地，第二引物可設(shè)計(jì)為正向引物或反向引物。
[0063] 本文所用的術(shù)語"探針"或"寡核巧酸探針"在本文可交換使用，是指包括如上定義 的多核巧酸的結(jié)構(gòu)，含有與祀核酸分析物（如，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物）中存在的核酸序列互補(bǔ)的核 酸序列。探針的多核巧酸區(qū)域可包括DNA、和/或RNA、和/或合成的核巧酸類似物