用于生物分子表征的納米孔傳感器的制造方法【專利摘要】本文提供了用于通過含有納米孔的膜表征生物分子參數(shù)的方法和裝置，還提供了用于制造可用于本文提供的方法和裝置中的裝置的方法。所述納米孔膜是導(dǎo)電層和電介質(zhì)層的多層堆疊，其中嵌入的導(dǎo)電層或?qū)щ妼娱T極在所述生物分子移位穿過的納米孔中及其周圍提供了良好控制的且可測(cè)量的電場(chǎng)。在一個(gè)方面，所述導(dǎo)電層為石墨烯?！緦＠f明】用于生物分子表征的納米孔傳感器[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用[0002]本申請(qǐng)要求2011年7月27日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/512，095的權(quán)益。[0003]關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明[0004]本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院頒發(fā)的合同號(hào)為NIH5R21CA155863-02和NIHR25CA154015的政府支持下完成的。美國政府具有本發(fā)明的一定權(quán)利?！?br>背景技術(shù)：
】[0005]提供了用于通過監(jiān)測(cè)生物分子(包括在施加的電場(chǎng)下)經(jīng)過納米孔時(shí)的電參數(shù)來表征所述生物分子的方法和裝置。許多常規(guī)技術(shù)可用于對(duì)生物分子進(jìn)行測(cè)序，包括，如美國專利公開N0.2011/0226623中所論述的，Sanger測(cè)序、通過合成測(cè)序(sequencingbysynthesis)、焦磷酸測(cè)序、雜交測(cè)序、大規(guī)模平行簽名測(cè)序和非酶實(shí)時(shí)單分子測(cè)序。美國專利公開N0.2012/0040343論述了用于表征甲基化水平的技術(shù)，包括涉及免疫共沉淀、通過甲基敏感酶進(jìn)行消化、甲基化敏感的PCR和DNA甲基化結(jié)合柱的方法。美國專利N0.5，795，782論述了基于單體-界面相互作用對(duì)聚合物分子進(jìn)行表征。[0006]本領(lǐng)域需要能夠精確控制納米孔中及其周圍的電性能的系統(tǒng)和方法，以更好地控制生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)和/或所述納米孔中及其周圍的電參數(shù)測(cè)量，尤其是在生物分子經(jīng)過所述納米孔或與其相互作用的過程中。本文公開的方法和裝置被配置用于表征寬范圍的生物分子，包括通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)系統(tǒng)不能容易地實(shí)現(xiàn)的所需生物分子的不同方面?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本文提供了用于通過含有納米孔的膜來表征生物分子參數(shù)的方法和裝置，還提供了用于制造可用于本文提供的方法和裝置中的裝置的方法。含有以堆疊形式配置的多個(gè)層的專門配置的膜，例如導(dǎo)體/電介質(zhì)層(包括石墨烯/電介質(zhì)層，有納米孔穿過所述層)，用以幫助改善對(duì)生物分子經(jīng)過納米孔的控制以及對(duì)在生物分子經(jīng)過納米孔的過程中產(chǎn)生的電參數(shù)的測(cè)量或監(jiān)測(cè)。具體地，作為獨(dú)立于所述裝置的其余部分加偏壓的嵌入式電極門(embeddedelectrodegate)提供的導(dǎo)電層或石墨烯層提供了獨(dú)特地控制生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)和/或生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的電參數(shù)測(cè)量的能力。[0008]在一方面，本文提供了裝置以及那些裝置的用途，所述裝置具有多于兩個(gè)電端子，例如用于提供跨越所述納米孔膜的電位差的一對(duì)電端子，以及用于為整合到所述膜中的電極供電的另外的端子，例如石墨烯電極或其他原子薄的導(dǎo)電層例如摻雜硅、單層硅或硅烯、超薄金屬、MoS2電極。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述電極為石墨烯或MoS2。在一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)電極被供電。所述整合的電極被稱為“門”極并可以獨(dú)立地被加偏壓以控制生物分子穿過納米孔的移位速率并實(shí)現(xiàn)P-型或η-型行為，用于包含微米帶或納米帶的實(shí)施方案，所述微米帶或納米帶用于在電學(xué)上表征轉(zhuǎn)運(yùn)的生物分子。所述門極在電學(xué)上與所述系統(tǒng)的其他組件分離，以提供對(duì)所述納米孔中和/或其附近的電場(chǎng)的獨(dú)立控制。在一方面，所述門極被系到(tied)源電極。在一方面，可以例如通過多個(gè)成形并在電學(xué)上連接到電壓源的石墨烯層，來整合任意數(shù)量的獨(dú)立加偏壓的門極。嵌入所述裝置中用于提供門極的所述石墨烯層可被成形為微米帶、納米帶和納米間隙?！凹{米”是指小于約Iμm且大于約0.1nm的尺寸?！拔⒚住笔侵感∮诩sImm且大于約Iμm的尺寸。[0009]在一個(gè)方面，所述納米帶的功能是作為核苷酸讀取器，每個(gè)核苷酸獨(dú)特地調(diào)整橫向電流或電導(dǎo)。具有可與特異性核苷酸相互作用的材料的納米帶邊緣的功能化可以進(jìn)一步增強(qiáng)核苷酸特異性的相互作用，包括特異性結(jié)合個(gè)體核苷酸或氨基酸類型或多核苷酸或氨基酸的短特異性序列的外切核酸酶、聚合酶、蛋白質(zhì)、解旋酶或化學(xué)部分。[0010]本文提供的任何裝置或方法任選地提供了通過電學(xué)方式對(duì)長(zhǎng)生物分子內(nèi)多單元生物分子(例如有機(jī)體的或合成的核苷酸、氨基酸)的單個(gè)單元的檢測(cè)。所述電極，包括嵌入所述裝置中的電極，可以感測(cè)或測(cè)量電參數(shù)，還使得能夠進(jìn)行納米孔的場(chǎng)效應(yīng)選通(gating)以減慢或捕獲生物分子。[0011]本文提供的一個(gè)重要方面是由石墨烯制造的第三納米級(jí)端子，其在夾在絕緣層(例如電介質(zhì)層)之間的孔處。這種夾在中間的導(dǎo)電層或端子還被稱為“埋入”層，例如埋入的石墨烯。所述埋入的石墨烯層可用作薄片，以測(cè)量生物分子在納米孔中或經(jīng)過納米孔的過程中的電流，或可制作成具有納米孔的帶狀物以在生物分子通過所述孔時(shí)測(cè)量橫向電導(dǎo)或阻抗，或測(cè)量跨越兩個(gè)石墨烯電極的隧穿電流?？梢允褂昧硗獾钠矫媸╇姌O來選通所述孔并調(diào)節(jié)移位速率，例如減慢生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)速度，從而增加信噪比。[0012]任選地，在惠斯通電橋體系結(jié)構(gòu)中可以使用三個(gè)或更多的石墨烯電極，例如用于DNA和DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體的靈敏檢測(cè)。涵蓋了水平惠斯通電橋，其中目的樣品通過電極的附近，所述電極放置在納米通道內(nèi)。還涵蓋了垂直惠斯通電橋，其中所述電極包括沿納米通道排列的納米孔并且目的樣品通過所述納米孔。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及在惠斯通電橋配置中連接所述導(dǎo)電層例如石墨烯層，用于測(cè)量所述納米孔中或其周圍的電參數(shù)，其中所述電參數(shù)是如下中的一個(gè)或多個(gè):差分阻抗、隧穿電流、電阻、電容、電流或電壓。[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置和方法涉及DNA測(cè)序；RNA測(cè)序；對(duì)其他多核苷酸例如LNA、PNA或XNA測(cè)序；蛋白質(zhì)或氨基酸測(cè)序；單體型分析；甲基化檢測(cè)和/或作圖；以及相關(guān)應(yīng)用中的任一項(xiàng)。[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于表征生物分子參數(shù)的方法，例如通過提供在包含導(dǎo)體-電介質(zhì)堆疊的膜中的納米孔。所述膜使第一流體區(qū)室與第二流體區(qū)室分開，所述納米孔流體連接所述第一和第二流體區(qū)室。“流體連接”是指流體能夠經(jīng)由所述納米孔在所述區(qū)室之間移動(dòng)，并且所述流體中比所述納米孔小的組分能夠同樣地移動(dòng)。將生物分子放到所述第一流體區(qū)室，跨越所述膜施加電場(chǎng)。以這種方式，在施加的電場(chǎng)下強(qiáng)制或驅(qū)動(dòng)所述生物分子(包括具有電荷的生物分子)以從所述第一流體區(qū)室到第二流體區(qū)室的方向穿過所述納米孔。當(dāng)所述生物分子經(jīng)過所述納米孔時(shí)跨越所述膜監(jiān)測(cè)電參數(shù)，從而表征所述生物分子的參數(shù)?；蛘?，跨越所述納米孔或穿過所述納米孔監(jiān)測(cè)電參數(shù)。在一個(gè)方面，所述導(dǎo)電層為一種或多種原子薄的導(dǎo)電層。在一個(gè)方面，原子薄是指層厚度為很少的原子的數(shù)量級(jí)或更小。在一個(gè)方面，原子薄是指小于約Inm厚或小于約0.5nm厚的層厚度。[0015]多層堆疊幾何形狀提供了很多功能上的益處，包括獨(dú)立地以及以在所述孔中及其周圍的多個(gè)方向激活并測(cè)量電場(chǎng)的能力。例如，最外層的石墨烯層可被通電以減慢所述轉(zhuǎn)運(yùn)或使可能通常會(huì)太快地經(jīng)過所述納米孔的生物分子以棘輪方式步進(jìn)，中心的石墨烯層(包括納米帶)是用于基于電參數(shù)例如電導(dǎo)、阻抗、電阻、電流和/或電位的改變來表征生物分子參數(shù)。類似地，所述多層堆疊幾何形狀可被配置以提供門極，包括，通過例如與中心或最外層的石墨烯層(與頂層或底層通信)通信的嵌入式電極，用于場(chǎng)效應(yīng)選通和/或場(chǎng)效應(yīng)傳感。任選用絕緣層覆蓋任何所述多層堆疊，所述絕緣層包括圖案層，使得需要的電極區(qū)域直接暴露于其中懸浮有生物分子的流體。[0016]在一個(gè)方面，所述生物分子參數(shù)選自:多核苷酸序列；修飾的核苷酸(包括標(biāo)記的核苷酸)的存在、多核苷酸甲基化或羥甲基化狀態(tài)、與多核苷酸序列上的一個(gè)或多個(gè)甲基化或羥甲基化位點(diǎn)結(jié)合的甲基或羥甲基依賴的結(jié)合蛋白；蛋白-多核苷酸結(jié)合事件的存在；多肽序列；生物分子二級(jí)結(jié)構(gòu)；以及氨基酸序列。本文提供的方法和裝置與許多生物分子參數(shù)相容，只要所表征的生物分子參數(shù)影響所測(cè)量的電參數(shù)。在多層堆疊中使用導(dǎo)電層例如石墨烯層使得可以進(jìn)行精確且集中的電場(chǎng)操縱和控制，包括使用一個(gè)或多個(gè)門極。[0017]本文提供的方法和裝置與許多天然具有單元重復(fù)結(jié)構(gòu)的聚合的生物分子相容，例如有機(jī)體的或合成的核酸，包括多核苷酸、聚氨基酸、蛋白質(zhì)、生物聚合物及其混合物。在一個(gè)方面，所述多核苷酸為包含DNA、RNA、PNA、LNA或XNA的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA為單鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA為雙鏈。[0018]任何本文提供的方法和裝置涉及包含多個(gè)石墨烯層的石墨烯-電介質(zhì)堆疊，其中相鄰石墨烯層被電介質(zhì)層隔開。在一個(gè)方面，石墨烯層的數(shù)量為2、3、4、5或6。在一個(gè)方面，石墨烯層的數(shù)量為至少3，中間的石墨烯層與電隔離的一個(gè)或多個(gè)微米帶或納米帶通信，用于控制和/或表征由納米孔形成的納米通道中的電場(chǎng)，外層的石墨烯層獨(dú)立提供受控的選通。[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述石墨烯層之一包含石墨烯微米帶、納米帶或納米間隙，納米孔以與所述石墨烯納米帶的縱向橫切的方向貫穿所述微米帶、納米帶或納米間隙。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，所述方法還包括在生物分子經(jīng)過所述納米孔的過程中沿著所述石墨烯微米帶、納米帶或納米間隙測(cè)量電位或橫向電流的時(shí)間-過程,從而表征所述生物分子的序列或長(zhǎng)度?？梢允褂枚鄠€(gè)微米帶或納米帶同時(shí)測(cè)量在不同的生物分子位置或取向的不同參數(shù)或相同參數(shù)，從而使得能夠?qū)σ莆坏纳锓肿油瑫r(shí)進(jìn)行多個(gè)讀取。在一個(gè)實(shí)施方案中，垂直相鄰的帶具有彼此之間偏移的縱向，例如偏角為大于20°，或選自約10°-180°、約30°-130°或約90°的范圍。用這種方式，相鄰的通電納米帶之間的影響被減到最小。在一個(gè)方面，微米帶或納米帶的多個(gè)縱向以平行的結(jié)構(gòu)排列。在一個(gè)方面，一部分所述納米帶或微米帶相對(duì)于彼此平行排列，另外部分具有不同的縱向取向。[0020]所述膜的多層外觀(包括具有多個(gè)石墨烯層的實(shí)施方案)，幫助配置用于獨(dú)立地為所述石墨烯層的至少一個(gè)在電學(xué)上加偏壓，以提供所述納米孔的電選通(包括相對(duì)于所述生物分子)。在一個(gè)方面，所述加偏壓通過將嵌入所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊的電極與單個(gè)的石墨烯層在電學(xué)上連接來進(jìn)行，并且所述加偏壓改變了所述納米孔中由施加的跨越所述膜的電場(chǎng)生成的電場(chǎng)。[0021]本文提供的方法和裝置與一系列電介質(zhì)材料相容。在一個(gè)方面，任何所述方法和裝置涉及包含氧化鋁、氧化鉭、氧化鈦、二氧化硅、氧化鉿、氧化鋯、氮化硼、氮化硅、它們的納米薄片或其任意組合的電介質(zhì)層。[0022]具體的目的電參數(shù)取決于采用所述方法或裝置所處的情形以及所述裝置配置。相關(guān)電參數(shù)的實(shí)例包括:穿過所述納米孔的電流或電流阻斷；跨越所述納米孔的隧穿電流；電導(dǎo)；穿過橫向電極的電化電流；電阻；阻抗；電位；以及所述生物分子穿過所述納米孔的移位時(shí)間或轉(zhuǎn)運(yùn)速度。能夠精確限定所述多層中以及相對(duì)于所述納米孔的嵌入式電極，可幫助跨越所述納米孔軸向(例如與其垂直)或沿著所述納米孔軸向的電參數(shù)測(cè)量。[0023]任何本文提供的方法和裝置任選地還通過將化學(xué)部分連接到暴露的納米孔石墨烯邊緣，而在納米孔中包含功能化的暴露石墨烯邊緣。所述化學(xué)部分對(duì)所述生物分子的一部分具有親和力，包括可周期性地減慢轉(zhuǎn)運(yùn)速度的結(jié)合親和力，并且當(dāng)生物分子經(jīng)過納米孔時(shí)，與所述生物分子的一部分相互作用的化學(xué)部分改變了被監(jiān)測(cè)的電參數(shù)。化學(xué)部分的實(shí)例包括針對(duì)生物分子的特異核苷酸、氨基酸和/或核苷酸或氨基酸序列的識(shí)別分子，包括多核苷酸、多肽、聚氨基酸、抗體、受體和對(duì)靶分子具有高親和力的人工構(gòu)建的化學(xué)品以及化學(xué)基團(tuán)。[0024]在一個(gè)方面，所述化學(xué)部分選自:具有可與目的生物分子中的序列結(jié)合的序列的合成分子、蛋白質(zhì)和多核苷酸；以及對(duì)多核苷酸生物分子中的特異核苷酸具有結(jié)合親和力的化學(xué)構(gòu)建體，例如A、G、C或T核苷酸結(jié)合蛋白或化學(xué)構(gòu)建體。任選地，為進(jìn)一步增強(qiáng)所述化學(xué)部分與特異核苷酸的結(jié)合親和力，將生物分子中與所述化學(xué)部分結(jié)合的特異核苷酸用重原子、化學(xué)官能團(tuán)或可增強(qiáng)與所述化學(xué)部分的親和力的標(biāo)記物標(biāo)記。[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將具有多核苷酸序列的生物分子消化為多個(gè)較小序列的步驟，該步驟通過使所述生物分子與錨定在所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊的外切核酸酶接觸，從而通過消化進(jìn)行測(cè)序。在一個(gè)方面，所述多個(gè)較小序列的至少一部分對(duì)應(yīng)于所述多核苷酸序列的個(gè)體堿基或核苷酸。[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括通過向正在經(jīng)過所述納米孔的生物分子添加核苷酸來合成多核苷酸序列，從而通過合成進(jìn)行測(cè)序的步驟。在一個(gè)方面，所述通過合成測(cè)序是使用錨定到所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊的聚合酶進(jìn)行的，所添加的核苷酸來自所述第一流體區(qū)室中的核苷酸源。任選地，所述通過合成測(cè)序還包括在向經(jīng)過所述孔的生物分子添加核苷酸的過程中檢測(cè)釋放的H+或焦磷酸鹽的步驟，例如通過測(cè)量納米孔電流的改變。以這種方式，所監(jiān)測(cè)的電參數(shù)反映了添加到所述生物分子上的核苷酸類型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將解旋酶錨定到所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊以展開DNA并使單鏈DNA通過所述孔，幫助鏈測(cè)序。[0027]任何本文提供的方法和裝置涉及的納米孔為生物納米孔。生物納米孔是指還包含蛋白質(zhì)構(gòu)建體的納米孔，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有為所述納米孔的孔。根據(jù)要表征的生物分子和生物分子參數(shù)來選擇所述蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)為聚合酶、核酸酶、組蛋白、解旋酶、轉(zhuǎn)錄因子、ct溶血素或恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白A或GP10。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于要檢測(cè)的靶生物分子來選擇所述蛋白質(zhì)，例如對(duì)所述靶生物分子有高結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)納米孔，包括本文稱之為生物分子與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)域的生物分子的特異部分。[0028]在一個(gè)方面，任何本文提供的方法和裝置可以以層(例如與所述第一流體區(qū)室有流體接觸和電接觸的最上石墨烯層)的布局和定位的方式來表征。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述電參數(shù)來自通過與所述第一流體區(qū)室中的流體有流體接觸和電接觸的石墨烯層的電阻測(cè)量結(jié)果。[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，任何本文提供的方法通過與所述流體區(qū)室和納米孔中的流體電絕緣的石墨烯層通過場(chǎng)效應(yīng)選通或場(chǎng)效應(yīng)傳感來測(cè)量電參數(shù)。在該實(shí)施方案中，所述石墨烯層可以為所述堆疊的內(nèi)層并可被塑形以在開孔上施加局部的AC或DC電位以提供精確的選通或傳感(例如通過一個(gè)或多個(gè)納米帶)。[0030]任何本文提供的方法可涉及為雙鏈多核苷酸序列的生物分子，其中所述方法還包括對(duì)所述雙鏈多核苷酸序列進(jìn)行解鏈并驅(qū)動(dòng)所述雙鏈多核苷酸序列的單鏈穿過所述納米孔，從而進(jìn)行所述生物分子的測(cè)序的步驟。在一個(gè)方面，所述解鏈?zhǔn)峭ㄟ^錨定到所述多層堆疊(例如石墨烯-電介質(zhì)堆疊)的解旋酶進(jìn)行的。[0031]在一個(gè)方面，提供了多個(gè)導(dǎo)電層，例如三個(gè)或四個(gè)層，埋入的石墨烯層可測(cè)量穿過另外的石墨烯層的電化電流。[0032]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為裝置，包括用于實(shí)施任何本文提供的方法的裝置，例如用于表征生物分子參數(shù)。在一個(gè)方面，所述裝置包含膜。所述膜具有第一表面和與所述第一表面相對(duì)的第二表面，其中所述膜使第一流體區(qū)室與第二流體區(qū)室分開。在一個(gè)方面，所述膜第一和第二表面分別形成所述第一流體區(qū)室和第二流體區(qū)室的表面。在一個(gè)方面，所述膜包含石墨烯/電介質(zhì)/石墨烯/電介質(zhì)堆疊，例如石墨烯/Al2O3/石墨烯/Al2O3堆疊，其位于所述膜第一表面和第二表面之間，具有穿過所述膜且流體連接所述第一區(qū)室和第二區(qū)室的納米孔。在一個(gè)方面，所述石墨烯/電介質(zhì)多層堆疊的最外層形成了所述第一和第二表面?；蛘撸鍪?電介質(zhì)多層堆疊的最外層之一或其兩者以包覆層包覆，所述包覆層至少部分地使所述石墨烯/電介質(zhì)多層堆疊的最外層與所述流體區(qū)室分開。在一個(gè)方面，所述最外石墨烯層至少部分地以電絕緣層或電介質(zhì)層(包括電介質(zhì)或Al2O3包覆層)包覆。所述裝置還可包含可提供受控的且集中的電場(chǎng)以及相應(yīng)的檢測(cè)電參數(shù)的組件，所述電參數(shù)用于表征經(jīng)過所述納米孔或與所述納米孔相互作用的生物分子的生物分子參數(shù)。這種組件的實(shí)例包括用于在所述第一流體區(qū)室和第二流體區(qū)室之間提供電位差的電力或電壓供應(yīng)、當(dāng)生物分子在施加的所述第一和第二流體區(qū)室之間的電位差下經(jīng)過所述納米孔時(shí)用于檢測(cè)與所述生物分子經(jīng)過所述納米孔有關(guān)的電參數(shù)(包括穿過所述納米孔的電流、穿過石墨烯層或跨越橫向電極的電化電流)的檢測(cè)器，以及電極例如門極、傳感電極、源極和漏極。[0033]在一個(gè)方面，所述裝置還包括一個(gè)或多個(gè)門極，其中所述一個(gè)或多個(gè)門極中的每個(gè)為所述多層堆疊中的石墨烯層。在一個(gè)方面，所述門極獨(dú)立地在電學(xué)上連接到所述堆疊中的一個(gè)或多個(gè)石墨烯層。在一個(gè)方面，所述門極由所述石墨烯層的至少一部分形成，例如為納米帶或具有尖頭末端幾何形狀以使電場(chǎng)生成和/或電參數(shù)檢測(cè)集中的電極。[0034]在一個(gè)方面，任何的導(dǎo)電層、石墨烯層或電介質(zhì)層以厚度的方式描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述導(dǎo)電層或石墨烯層在所述納米孔處具有小于或等于3nm的厚度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述電觸點(diǎn)包含與所述導(dǎo)電層或石墨烯層電接觸的金屬板，例如Ti/Au板，以及與所述金屬板有電接觸的電傳導(dǎo)性的導(dǎo)線，其中所述金屬板與任何的所述第一和第二流體區(qū)室電隔離。[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述門極與由電力供應(yīng)供電的源極在電學(xué)上連接。[0036]本文提供的任何石墨烯層可以包含納米帶，所述納米孔以與所述納米帶縱軸橫切的方向穿過所述納米帶。所述納米帶任選地包含電觸點(diǎn)，用于在生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔過程中測(cè)量沿著所述納米帶的橫向電流，另外的石墨烯層與門極連接以在電學(xué)上為所述石墨烯層加偏壓。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的任何納米孔的直徑大于所述納米帶寬度的5%,或選自所述納米帶寬度的5%至95%的范圍內(nèi)。以這種方式,所述納米帶可以通過圓周區(qū)域圓周地包圍所述納米孔，取決于目的應(yīng)用，所述圓周區(qū)域相對(duì)窄或相對(duì)寬。所述門極在電學(xué)上連接到所述納米帶，然后可提供獨(dú)立地在電學(xué)上為所述納米帶加偏壓的能力，以提供對(duì)所述系統(tǒng)的額外控制。[0037]在一個(gè)方面，所述檢測(cè)器為隧道檢測(cè)器，其包含一對(duì)彼此相對(duì)的電極并以與生物分子在納米孔中的轉(zhuǎn)運(yùn)方向橫切的方向位于所述納米孔的中心，其中所述生物分子在所述電極對(duì)之間轉(zhuǎn)運(yùn)。[0038]在一個(gè)替代實(shí)施方案中，本文提供了一種制造包含用于表征生物分子參數(shù)的納米孔的膜的方法。在一個(gè)方面，所述方法包括如下步驟:在獨(dú)立式的電介質(zhì)膜(包括Al2O3膜)上形成通道；經(jīng)化學(xué)氣相沉積生長(zhǎng)石墨烯層；包覆所述石墨烯層的至少一部分或使其轉(zhuǎn)移到所述獨(dú)立式的電介質(zhì)膜上；在所述石墨烯層上形成電介質(zhì)層；重復(fù)所述石墨烯層步驟以生成第二石墨烯層；重復(fù)所述電介質(zhì)沉積步驟以生成第二電介質(zhì)層；形成從所述膜的第一表面延伸至所述膜的第二表面的納米孔，其中所述納米孔橫貫每個(gè)所述石墨烯層和電介質(zhì)層，從而制造在石墨烯/電介質(zhì)/石墨烯/電介質(zhì)堆疊中包含納米孔的膜。在所述轉(zhuǎn)移的石墨烯層上形成電介質(zhì)層以及其重復(fù)步驟可以有或沒有金屬種子層。[0039]在一個(gè)方面，所述方法還包括在電學(xué)上使所述第一石墨烯層、第二石墨烯層或第一石墨烯層和第二石墨烯層兩者與電觸點(diǎn)接觸以提供獨(dú)立的電選通的納米孔。[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)所述重復(fù)步驟以生成三個(gè)或更多的石墨烯層，相鄰石墨烯層被電介質(zhì)層隔開。以這種方式，所述堆疊可以包含任意數(shù)量的石墨烯層，包括其中最頂層和最底層都不包含石墨烯層、最頂層和最底層之一包含石墨烯層或者最頂層和最底層都包含石墨烯層的堆疊。在一個(gè)方面，所述石墨烯層的任意一個(gè)或多個(gè)在電學(xué)上接觸，以提供獨(dú)立的電選通的納米孔。[0041]在一個(gè)方面，任何的所述方法還包括將門極嵌入所述納米孔膜中，以改變所述納米孔中及其附近的局部電場(chǎng)。以這種方式，本文提供的任何裝置具有被配置用于改變所述納米孔中及其附近的局部電場(chǎng)的嵌入的門極。在一個(gè)方面，所述嵌入的門極包含所述膜的任意的石墨烯層。[0042]在一個(gè)方面，所述電介質(zhì)層包含通過原子層沉積而沉積的電介質(zhì)。在一個(gè)方面，所述電介質(zhì)層包含A1203、Ta2O5,SiO2,Si3N4、氧化鋁、氧化鉭、氧化鉿、氧化鋯、二氧化硅或氮化硅或其組合。[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的任何方法和裝置具有以惠斯通電橋配置的電路布局。因此，任何所述方法還可以包括以惠斯通電橋配置在電學(xué)上連接三個(gè)或更多的石墨烯層，用于測(cè)量所述納米孔中的電參數(shù)。這種惠斯通電橋提供了通過平衡所述橋電路的不同支路來測(cè)量未知電參數(shù)的能力。在一個(gè)方面，所述電參數(shù)是如下的一個(gè)或多個(gè):差分阻抗、隧穿電流、電阻、電容、電流或電壓。[0044]在一個(gè)方面，所述方法還包括相對(duì)于所述三個(gè)或更多的石墨烯層的兩個(gè)外層石墨烯層，用AC偏壓為所述三個(gè)或更多的石墨烯層的中心石墨烯層在電學(xué)上加偏壓。以這種方式，所述方法還可包括監(jiān)測(cè)所述中心石墨烯層和外層石墨烯層之間的阻抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括用AC電壓信號(hào)為一個(gè)或多個(gè)石墨烯層加偏壓。[0045]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種通過在隔開第一流體區(qū)室與第二流體區(qū)室的懸浮膜中提供納米孔來鑒定、表征或定量生物分子的甲基化或羥甲基化狀態(tài)的方法。所述膜可以包含氧化鋁、氧化鉭、氧化鈦、二氧化硅、氧化鉿、氧化鋯、氮化硼、氮化硅、石墨烯或它們的納米薄片，或其任意組合。在一個(gè)方面，所述膜為包含電學(xué)上的導(dǎo)電層和電介質(zhì)層的多層堆疊，其包括多個(gè)電學(xué)上的導(dǎo)電層例如被電介質(zhì)層隔開的石墨烯，或本文提供的任何堆疊。使特異的蛋白質(zhì)、寡核苷酸或化學(xué)標(biāo)記物與靶生物分子上的甲基化或羥甲基化位點(diǎn)結(jié)合?？缭剿瞿乃龅谝涣黧w區(qū)室到第二流體區(qū)室施加電場(chǎng)，以驅(qū)動(dòng)所述生物分子穿過所述納米孔。通過在生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔過程中監(jiān)測(cè)離子電流、隧穿電流、電壓、電導(dǎo)或阻抗的變化來檢測(cè)所述生物分子上的所述結(jié)合的蛋白質(zhì)或標(biāo)記物。[0046]在一個(gè)方面，所述方法還包括在生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔時(shí)相繼地從所述生物分子剪切結(jié)合的蛋白質(zhì)或標(biāo)記物的步驟。[0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的裝置和方法涉及納米級(jí)pH傳感器，其用于以單分子水平或從分子的集合或聚集體中檢測(cè)由生物化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的焦磷酸鹽生成和PH變化。[0048]不希望囿于任何具體理論，應(yīng)相信或理解本文的論述涉及本發(fā)明實(shí)施方案的基礎(chǔ)原理或機(jī)制。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，不管任何解釋或假說的最終正確性如何，而本發(fā)明的實(shí)施方案都是可行且有用的?！緦＠綀D】【附圖說明】[0049]圖1.石墨烯-Al2O3納米孔的制造:(a)首先使用聚焦離子束(FIB)工具在獨(dú)立式的Al2O3膜中形成300nm直徑的孔，(b)將用CVD生長(zhǎng)的石墨烯轉(zhuǎn)移到基片上，(c)蒸發(fā)1.5nmAl作為種子層，然后在所述基片上沉積6.5nm的ALDAl2O3(dl)。轉(zhuǎn)移延伸到所述基片邊緣的另外的石墨烯層，用于使用金板接觸g2，并重復(fù)AVAl2O3沉積(d2)。(d)FEGTEM納米孔形成。[0050]圖2.石墨烯-Al2O3納米孔的電學(xué)表征。(a)不同尺寸的石墨烯-Al2O3納米孔的IV特征顯示出線性響應(yīng)。注意所述膜具有近于忽略不計(jì)的電導(dǎo)。以數(shù)字計(jì)算擬合的數(shù)據(jù)。(插圖)石墨烯-Al2O3納米孔的Ι/f噪音與Al2O3納米孔相當(dāng)或者比Al2O3納米孔更好。(b)如所示出的那樣，這些膜和納米孔給出了穩(wěn)定的電導(dǎo)值，所述電導(dǎo)值取決于納米孔直徑。[0051]圖3.λ-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過石墨烯-Al2O3納米孔。(a)示意圖示出了λ-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過納米孔。如所示出的那樣，λ-DNA具有約1.33μm的回轉(zhuǎn)半徑并因此在電解質(zhì)溶液中形成大的超螺旋球。(ii)DNA在納米孔中的穿過過程。(b)λ-DNA穿過11.3nm的石墨烯-Al2O3納米孔的特征移位事件。觀察到了清晰的向下的阻斷。(c)從在400mV記錄的562個(gè)移位事件構(gòu)建的事件電流直方圖。觀察到了兩個(gè)不同的電流峰；1，代表線性dsDNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔，2，代表折疊的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔。在(d)中以及在(e)的概括性直方圖中更詳細(xì)地解釋了該現(xiàn)象。[0052]圖4.DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合:ERa/ERE轉(zhuǎn)運(yùn)穿過石墨烯/Al2O3納米孔(a)ERa與含有單個(gè)ERE的DNA結(jié)合的示意圖。(b)ERE序列，(c)凝膠遷移測(cè)定確認(rèn)了在低鹽濃度下形成ERa/ERE復(fù)合體體。在鹽濃度>320mMKCl時(shí)，沒有看見蛋白質(zhì)-DNA帶。(d)示意圖示出了dsDNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過納米孔。(e)將所述ERa/ERE復(fù)合體引入到14nm直徑的孔中導(dǎo)致電流增加(向上的峰)，(f)ERa/ERE的移位時(shí)間相對(duì)于電流增加的散點(diǎn)圖，(插圖)電流增加直方圖示出了峰值在0.4nA的高斯分布。(g)在IMKClUOmMTris、ImMEDTA和pH為8的電解質(zhì)中在500mV施加的電壓下穿過23nm直徑的石墨烯Al2O3納米孔的RecA-包覆的DNA移位樣品電流跡線(trace)。Ib1j為基線電流，向下的峰對(duì)應(yīng)于游離的RecA蛋白或單個(gè)/多個(gè)RecA-包覆的DNA分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔。插圖為所述納米孔的TEM圖像，比例尺為10nm。(h)由1368個(gè)移位事件構(gòu)建的事件密度圖，示出了在500mV施加的偏壓下的電流阻斷相對(duì)于移位時(shí)間(tD)的變化。圖例棒(legendbar)代表事件數(shù)。(i)500mV下的電流阻斷直方圖。用高斯擬合觀察到三個(gè)不同的峰，代表未結(jié)合的RecA蛋白、單個(gè)RecA-包覆的DNA分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及多個(gè)RecA-包覆的DNA分子的同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)。(j)高時(shí)間分辨的電流跡線，示出了RecA包覆的dsDNA的轉(zhuǎn)運(yùn):.1.游離的RecA蛋白移位。事件是迅速且低幅度的。i1.單個(gè)RecADNA移位。事件比使用游離RecA觀察到的事件有更深的幅度，更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間。ii1.多個(gè)RecA包覆的DNA分子的同時(shí)移位。移位事件比在單個(gè)RecADNA情形中觀察到的事件有更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間和更高的幅度。[0053]圖5.(a)以酶甲基化的DNA片段起始。(b)向甲基化的DNA樣品中加入甲基化的DNA結(jié)合蛋白。(c)用于形成穩(wěn)定的MBD蛋白結(jié)合的DNA復(fù)合體的孵育步驟。(d)將MBD蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體引入到納米孔流體性裝置的順側(cè)區(qū)室。[0054]圖6.(a)未甲基化的DNA的通過；觀察到了淺的電流阻斷。(b)具有與單個(gè)甲基化的CpG二核苷酸結(jié)合的MBD例如MBD2(還可以使用MBD1、MeCP)的DNA的通過。觀察到了兩種阻斷水平:淺的阻斷是由于DNA，深的阻斷是由于MBD。(c)具有多個(gè)結(jié)合MBD蛋白的DNA的通過。電流特征使得能夠沿著單個(gè)分子進(jìn)行甲基化定量以及甲基化位點(diǎn)的作圖。[0055]圖7.(a)示意圖示出了在高pH和低pH下的抗衡離子在孔表面上濃集，假定所述納米孔的等電點(diǎn)為5-7的pH范圍。(b)作為KCl濃度和溶液pH的函數(shù)的18±lnm直徑的石墨烯-Al2O3孔的pH反應(yīng)。(c)孔尺寸的效應(yīng):作為KCl濃度和溶液pH的函數(shù)的8±0.5nm直徑的石墨烯-Al2O3孔的pH反應(yīng)。在兩種情形中都觀察到了強(qiáng)的pH反應(yīng)。[0056]圖8.(a)石墨烯選通的納米孔測(cè)量裝置。使用250nmTi/Au板在所述納米孔基片的邊緣接觸石墨烯層2(g2)。在所有電流測(cè)量中，門極和源極被連在一起。(b)將納米孔基片安裝在PCB上，使用In導(dǎo)線接觸所述Ti/Au板。跨越終端I和2的電阻通?！?kΩ，這確認(rèn)了制造后導(dǎo)電的石墨烯薄片的存在。(c)將具有納米孔基片的PCB安裝在所示的流體性裝置中，所述PCB使所述金屬接觸板與導(dǎo)電溶液分開。[0057]圖9.具有綁定到源極的門極(石墨烯層2)和浮動(dòng)的門極的19nm直徑的石墨烯-Al2O3納米孔的電流-電壓(1-V)特征。三行表示在10.9,7.6和4的固定pH值下進(jìn)行的1-V測(cè)量，三列表示在1M、IOOmM和IOmM的固定KCl濃度下進(jìn)行的1-V測(cè)量。在ρΗΙΟ.9下在探測(cè)所有鹽濃度下觀察到了顯著的電流變化。在PH4下這種效應(yīng)顯著降低。[0058]圖10.用于單分子DNA測(cè)序的具有納米孔的石墨烯納米帶。(a)在圖1所示的體系結(jié)構(gòu)中在石墨烯層2(g2)中加圖案的石墨烯帶的SEM圖像。(1-1ii)用增加的放大倍數(shù)示出了所述帶的SEM圖像。(iv)使用TEM示出了在GNR的中心鉆出的14nm的孔。(b)在具有嵌入的石墨烯門極的固態(tài)納米孔上的石墨烯納米帶的示意圖。所述石墨烯門極可以實(shí)現(xiàn)P-型或η-型行為，用于足夠小的帶并用于用靜電控制移位速率，例如降低ssDNA穿過納米孔的移位速率。所述石墨烯帶可以作為核苷酸讀取器，因?yàn)槊糠N核苷酸獨(dú)特地調(diào)節(jié)其橫向電導(dǎo)。所述納米孔中石墨烯帶邊緣的功能化還可以增強(qiáng)核苷酸特異性的相互作用。[0059]圖11.在納米通道中的惠斯通電橋電極體系結(jié)構(gòu)，用于使用電壓而非電流測(cè)量個(gè)體的DNA和蛋白質(zhì)。(b)該系統(tǒng)的等效電路。[0060]圖12.(a)多層的石墨烯/Al2O3結(jié)構(gòu)，在所述堆疊中有納米孔的圖案。如(b)所示，每個(gè)石墨烯層都有圖案以使各層之間的重疊最小。如(b)所示為所述石墨烯層加偏壓以形成垂直的惠斯通電橋體系結(jié)構(gòu)，使得能夠使用電壓測(cè)量來感測(cè)納米孔中個(gè)體分子。此外，該體系結(jié)構(gòu)幫助沿所述分子長(zhǎng)度靈敏地檢測(cè)地形(topographic)信息。[0061]圖13.納米孔陣列制造(a)i以懸浮的Al203/SiN膜開始，ii使用電子束光刻使ZEP520形成圖案，iii使用RIE將圖案轉(zhuǎn)移到SiN上，iv使用在ICP-RIE中完成的BCl3蝕刻將圖案轉(zhuǎn)移到Al2O3上。(b)來自(a)的i部分的輪廓區(qū)域的SEM橫斷面，示出了Al2O3和SiN層的厚度。(c)使用該方法形成了15nm直徑的孔的陣列。(d)使用該方法形成了小于65nm直徑的孔的陣列。[0062]圖14.在超薄石墨烯/Al2O3膜中單個(gè)納米孔的制造。(a)如(b)的TEM圖像所示，首先形成約300nm直徑的FIB孔。(c)然后轉(zhuǎn)移石墨烯，產(chǎn)生懸浮的單層厚的膜，這通過使用衍射成像(d)和拉曼光譜(e)來確認(rèn)。(f)然后沉積15A厚的Al種子層，然后^60灰的ALDAl2O30(g)使用聚焦的會(huì)聚性電子束在該懸浮的膜中分解性地噴射出單個(gè)納米孔，(h)使用該方法形成的25nm直徑的孔的TEM圖像。[0063]圖15.納米孔DNA分析中的趨勢(shì)。自從該技術(shù)開始以來每一年，對(duì)于α-溶血素和固態(tài)納米孔來說，調(diào)節(jié)DNA移位速率的方法已經(jīng)使DNA移位速率大幅下降。最近生物納米孔的進(jìn)展已經(jīng)使ssDNA轉(zhuǎn)運(yùn)速度低至約0.1nt/ms,并經(jīng)使天然α-溶血素的位點(diǎn)特異性突變、引入DNA處理酶、化學(xué)標(biāo)記核苷酸以及共價(jià)結(jié)合氨基環(huán)糊精銜接體實(shí)現(xiàn)了靈敏度的提高(降至單個(gè)核苷酸)，使得能夠進(jìn)行DNA測(cè)序。用固態(tài)納米孔觀察到了相似的趨勢(shì)；由于溶液條件的優(yōu)化(溫度、粘度、PH)、化學(xué)功能化、表面電荷工程、膜厚度和組成的改變以及更小直徑納米孔的使用(從而增強(qiáng)聚合物-孔的相互作用)而降低移位速率并提高靈敏度。需要DNA速率的進(jìn)一步降低(對(duì)于高分辨率DNA分析來說，l-10nt/ms的速率應(yīng)該是理想的)和靈敏度的大幅提高，以使得能夠使用固態(tài)納米孔進(jìn)行快速的DNA電子測(cè)序。開發(fā)新的傳感形式和體系結(jié)構(gòu)(隧道連接、電容納米孔結(jié)構(gòu)、石墨烯門極等)對(duì)于實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的工作將具有基礎(chǔ)性的重要作用，即使在這些技術(shù)的開發(fā)中仍面臨很大的挑戰(zhàn)(表1)。該圖含有關(guān)鍵的納米孔發(fā)展，已經(jīng)報(bào)告了減慢的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)或增強(qiáng)的靈敏度，但是這決不是窮盡列表。該圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)含有參考文獻(xiàn)號(hào)和在所引用的研究中檢測(cè)到的最短分子。[0064]圖16.用于DNA測(cè)序的生物納米孔(a)1.α-溶血素的構(gòu)造橫斷面。1.4nm的收縮部使得ssDNA能夠通過而dsDNA不能通過，i1.當(dāng)個(gè)體的核苷酸橫向穿過氨基環(huán)糊精修飾的α-溶血素納米孔時(shí)由它們誘導(dǎo)的典型電流阻斷，iii，在優(yōu)化條件下α-溶血素的核苷酸分離效率。提供了與外切核酸酶偶聯(lián)的通過消化方法的測(cè)序(b)，1.MspA的構(gòu)造橫斷面，i1.由雙鏈體間斷的DNA穿過MspA的移位誘導(dǎo)的典型電流阻斷。在雙鏈體間斷的分子中觀察到每個(gè)核苷酸三聯(lián)體的獨(dú)特的電流水平，ii1.直方圖示出了與α-溶血素相比，MspA的提高的分離效率。[0065]圖17.用于DNA分析的固態(tài)納米孔體系結(jié)構(gòu)(a)Al203納米孔，1.使用聚焦的電子束在ALDAl2O3膜中形成納米孔并控制其收縮。實(shí)現(xiàn)了亞納米的精確度。i1.5kbpdsDNA移位穿過5nm直徑的Al2O3孔的散點(diǎn)圖示出了對(duì)應(yīng)于線性、未折疊的dsDNA轉(zhuǎn)運(yùn)的單一阻斷水平，(b)石墨烯納米孔，1.在1-2層石墨烯單層中基于TEM的納米孔形成，i1.散點(diǎn)圖示出了表示移位通過所述孔的不同DNA構(gòu)象(折疊和未折疊的DNA)的獨(dú)特的電導(dǎo)特征，(c)1.在約10層石墨烯單層中形成的階梯狀納米孔的TEM圖像，i1.在單層石墨烯中的納米孔，最初的扶手椅邊緣被多層區(qū)域圍繞，ii1.在多層石墨烯中的納米孔的TEM圖像；在所述孔邊緣的波紋再次示出了階梯狀結(jié)構(gòu)。[0066]圖18.測(cè)序之外的納米孔應(yīng)用(a)從組織中檢測(cè)序列特異性的miRNA:使用探針特異性的雜交從組織樣品分離并濃縮特異性的miRNA，然后基于納米孔進(jìn)行定量。該技術(shù)相對(duì)于常規(guī)的微陣列技術(shù)提供了提高的靈敏度，(b)檢測(cè)SNP:用電泳驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)(Ec0Rl)結(jié)合的dsDNA復(fù)合體移位到約2nm直徑的納米孔，然后如i所示進(jìn)行剪切。通過定量PCR確認(rèn)，將SNP引入結(jié)合蛋白質(zhì)的序列使剪切閾值電壓有可檢測(cè)的偏移(ii)，從而使得能夠靈敏地檢測(cè)SNP，(c)基因分型和基因組作譜:如i所示，PNA標(biāo)記的dsDNA產(chǎn)物在納米孔測(cè)量中產(chǎn)生了獨(dú)特的電流暫停?？梢匀菀椎囟棵總€(gè)分子中PNA標(biāo)記物的數(shù)量，這可幫助對(duì)DNA分子進(jìn)行快速電子作譜。[0067]圖19.雜合生物固態(tài)納米孔(a)發(fā)夾DNA功能化的SiO2納米孔，i1.完全互補(bǔ)的ssDNA(與所述發(fā)夾序列互補(bǔ))相對(duì)于單堿基錯(cuò)配序列(IMM)的移位產(chǎn)生了如圖所示的雙峰分布，從而使得能夠靈敏地檢測(cè)SNP。(b)脂雙層包被的SiN納米孔，流體脂質(zhì)側(cè)壁作為高度靈敏的蛋白質(zhì)檢測(cè)元件起作用，i1.使用該表面功能化的納米孔，電流阻斷直方圖可以用于檢測(cè)和區(qū)分不同的蛋白質(zhì)分析物。(c)α-溶血素直接插入到SiN孔，1.用dsDNA尾化學(xué)修飾的α-溶血素的示意圖，i1.示出了雜合孔形成的三個(gè)階段，最終產(chǎn)生了與脂雙層中α-溶血素一致的電導(dǎo)水平(III)。[0068]圖20.用于測(cè)序的可能的新型納米孔體系結(jié)構(gòu)。(a)嵌入納米孔的隧道檢測(cè)器的橫斷面。所述檢測(cè)器包含兩個(gè)與中間的孔分開的間隔約Inm的電極。所述納米孔幫助經(jīng)過所述檢測(cè)器的ssDNA/核苷酸線性地通過，所述檢測(cè)器被用于通過測(cè)量核苷酸特異性的隧穿電流來解碼序列信息，(插圖)所述隧道電極的俯視圖，有核苷酸位于所述納米間隙中。(b)在具有嵌入的石墨烯門極的固態(tài)納米孔上的石墨烯納米帶。所述石墨烯門極用于對(duì)于足夠小的帶實(shí)現(xiàn)P-型或η-型行為并用于通過靜電減慢ssDNA。所述石墨烯帶可以作為核苷酸讀數(shù)器，每種核苷酸獨(dú)特地調(diào)節(jié)所述石墨烯帶的橫向電導(dǎo)。所述納米孔中石墨烯帶邊緣的功能化還可以增強(qiáng)核苷酸特異性的相互作用。[0069]圖21A為用于表征生物分子的膜和相關(guān)組件的一個(gè)實(shí)施方案的不意圖。圖21B與圖21A相似，在所述門極處也有偏移。[0070]圖22為隧道檢測(cè)器的閉路示意圖，所述檢測(cè)器包含一對(duì)彼此相對(duì)的電極，所述電極的方向與由虛線箭頭指示的生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔的方向是橫切的。在這種配置中，所述裝置可被表征為核苷酸讀數(shù)器?！揪唧w實(shí)施方式】[0071]本文廣泛使用的“生物分子”是指生物系統(tǒng)相關(guān)的分子。該術(shù)語包括例如多核苷酸、DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)及其結(jié)合物。所述生物分子可以是天然存在的或可以是工程化的或合成的?！吧锓肿訁?shù)”是指所述生物分子的可測(cè)量或可定量的性質(zhì)。所述參數(shù)可以是所述生物分子的常量，例如序列或序列部分。對(duì)于具體的生物分子，所述參數(shù)根據(jù)生物分子的狀態(tài)或情況可以不同，例如生物分子參數(shù)為甲基化狀態(tài)、結(jié)合事件和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)?！半妳?shù)”是指可在電學(xué)上測(cè)量或確定并與所述生物分子參數(shù)有關(guān)的參數(shù)。因此，電參數(shù)可以本質(zhì)上為電的，或本身可以為非電的參數(shù)，所述非電參數(shù)可基于本質(zhì)為電的基礎(chǔ)參數(shù)來確定，例如轉(zhuǎn)運(yùn)或移位時(shí)間、通量或移位頻率。[0072]“甲基化”是指具有一個(gè)或多個(gè)甲基化的殘基的DNA。例如，在所有脊椎動(dòng)物基因組中一些胞嘧啶殘基為甲基化的。DNA甲基化可以影響基因表達(dá)，并且對(duì)于一些基因來說其為癌癥的表觀遺傳標(biāo)記。DNA甲基化的兩個(gè)不同方面可以是重要的:甲基化水平或含量以及甲基化模式。本文廣泛使用的“甲基化狀態(tài)”是指從實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)、疾病狀態(tài)或DNA狀態(tài)的立場(chǎng)感興趣的甲基化的任何方面，包括甲基化含量、分布、模式、密度和其沿著DNA序列的空間差異。經(jīng)納米孔檢測(cè)甲基化還論述于美國公開文本N0.2012/0040343(168-08)。[0073]另外，生物分子參數(shù)是指可測(cè)量且受所述生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過納米孔影響的定量變量，例如，穿過納米孔的移位速度，當(dāng)所述生物分子進(jìn)入并經(jīng)過所述孔時(shí)所述納米孔中電參數(shù)的變化(例如電場(chǎng)、離子電流、電阻、阻抗、電容、電壓的變化)、從所述生物分子與用化學(xué)部分功能化的納米孔表面區(qū)域之間的生物化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的變化，例如焦磷酸的釋放、pH的變化(包括經(jīng)具有外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶功能的化學(xué)部分產(chǎn)生的變化)。[0074]“電介質(zhì)”是指不導(dǎo)電的或絕緣的材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，無機(jī)電介質(zhì)包含基本沒有碳的電介質(zhì)材料。無機(jī)電介質(zhì)材料的具體實(shí)例包括但不限于氮化硅、二氧化硅、氮化硼和招、鈦、鉭或鉿的氧化物?！案遦電介質(zhì)”是指具體的一類電介質(zhì)材料，例如在一個(gè)實(shí)施方案中這些電介質(zhì)材料的介電常數(shù)高于二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，高k電介質(zhì)的介電常數(shù)是二氧化娃的至少2倍?？捎玫母遦電介質(zhì)包括但不限于Al203、Hf02、Zr02、HfSi04、ZrSiO4以及這些的任意組合。在一個(gè)方面，任何本文提供的方法和裝置具有Al2O3電介質(zhì)。[0075]“導(dǎo)體-電介質(zhì)堆疊”是指多層，至少一層包含電導(dǎo)體，另外的層包含電介質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，層可以在幾何上形成圖案或沉積，例如在納米帶結(jié)構(gòu)中，包括為導(dǎo)電納米帶的導(dǎo)體層，導(dǎo)電納米帶的縱向與所述納米孔形成的通道是橫切的。在一個(gè)方面，所述堆疊包含2或更多層，3或更多層，或者層的范圍為大于或等于5層，且小于或等于20層。在一個(gè)方面,相鄰導(dǎo)體層被電介質(zhì)層彼此分開。在一個(gè)方面，最外層為導(dǎo)電層、電介質(zhì)層，或者一個(gè)最外層為電介質(zhì)，在所述堆疊的另一末端的另一最外層為導(dǎo)體。在一個(gè)方面，通過選擇性地在覆蓋下面的通電導(dǎo)體層的電介質(zhì)層上形成圖案，可以在所述膜表面的附近施加并控制局部電場(chǎng)。任何本文提供的方法和裝置具有石墨烯導(dǎo)電層。如本文所示，術(shù)語石墨烯可以按照需要被其他原子薄的電學(xué)上的導(dǎo)電層代替，例如MoS2、摻雜硅、硅烯或超薄金屬。[0076]“流體連通”或“流體連接”是指納米通道使電解質(zhì)，具體為所述電解質(zhì)中的離子，能夠從所述膜的一側(cè)(例如第一流體區(qū)室)流動(dòng)到所述膜的另一側(cè)(例如第二流體區(qū)室)，或者反之亦然。在一個(gè)方面，在未施加用于幫助轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔的電場(chǎng)的情況下，所述流體連通連接不足以使生物分子在兩側(cè)之間轉(zhuǎn)運(yùn)。這可以通過納米孔幾何形狀(例如直徑)、納米孔表面功能化、施加的穿過納米孔的電場(chǎng)以及生物分子和流體選擇的結(jié)合來控制。[0077]“特異性結(jié)合”是指兩種組分之間的相互作用，其中一種組分具有靶向的特征。結(jié)合僅在一種組分具有所述靶向的特征時(shí)發(fā)生，沒有所述靶向的特征的情況下基本沒有結(jié)合發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向的特征為核苷酸類型(例如A、T、G、C)、核苷酸的特異序列或氨基酸。[0078]通過如下非限制性實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明。本文引用的所有參考文獻(xiàn)以引用的方式納入本文，只要其不與因此而公開的內(nèi)容相矛盾。雖然本文的描述含有許多具體性，但是其不應(yīng)被解釋為是限制本發(fā)明的范圍，而應(yīng)解釋為僅僅是提供了一些本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方案的示例。例如，因此本發(fā)明的范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書及其等效物確定，而不是由給出的實(shí)施例確定。PCT公開文本N0.W02010/080617(Attyref.168-08W0)、美國專利公開文本N0.2012/0040343和美國專利公開文本N0.2011/0226623(Attyref.56-09，2010年12月17日提交)具體地以引用的方式納入本文，只要不與本文相矛盾，為的是其中提供的系統(tǒng)、裝置和方法，這與通過生物分子在施加的電場(chǎng)下轉(zhuǎn)運(yùn)穿過納米孔的生物分子表征有關(guān)。[0079]實(shí)施例1:石墨烯-Al2O3納米孔[0080]石墨烯——碳原子密集填充到二維的蜂窩晶格中形成的原子薄薄片——擁有驚人的機(jī)械、電學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)。與ssDNA中核苷酸之間的0.32-0.52nm間隔相當(dāng)?shù)氖﹩螌雍穸?，使得該材料?duì)于電子DNA測(cè)序尤其具有吸引力。該實(shí)施例描述了開發(fā)和表征用于分析DNA和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的新型基于石墨烯的Al2O3納米孔傳感器。所述納米孔在石墨烯-電介質(zhì)-石墨烯-電介質(zhì)堆疊中制造，所述堆疊可幫助為每個(gè)石墨烯層獨(dú)立地加偏壓。該結(jié)構(gòu)在機(jī)械上是堅(jiān)固的，在離子溶液中展示出穩(wěn)定的導(dǎo)電性，具有PH敏感性并且與用于基于石墨烯的納米孔DNA測(cè)序的石墨烯納米帶和隧道電極的整合相容。另外，該平臺(tái)對(duì)于溶液PH的顯著反應(yīng)使得能夠單獨(dú)使用離子電流通過合成方法進(jìn)行測(cè)序。該平臺(tái)還由于所證明的單個(gè)蛋白質(zhì)敏感性而良好地適用于診斷中，特別是在本文所示的甲基化檢測(cè)中，適用于癌癥診斷。[0081]石墨烯-Al2O3納米孔的制造。首先使用聚焦離子束(FIB)工具在獨(dú)立式的Al2O3膜中形成300nm直徑的孔(圖la)。然后，將經(jīng)化學(xué)氣相沉積(CVD)生長(zhǎng)的石墨烯轉(zhuǎn)移到跨越所述300nmAl2O3孔的該基底上(圖lb)。該層被稱為石墨稀I或gl。石墨稀生長(zhǎng)條件如下:CVD石墨烯在1.4mil銅箔上生長(zhǎng)。在Ar/H2流下使所述箔退火45分鐘,在1000°C、約500mTorr下在CH4/H2流下生長(zhǎng)石墨烯20分鐘。在Ar流下以約20°C/min的速率將產(chǎn)生的Cu/石墨烯基底冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移到接收基底如下進(jìn)行:將石墨烯用雙層PMMA(495K和950K)包覆，在O2等離子體中除去所述銅箔上的后部石墨烯，然后在IMFeCl3溶液中蝕刻后部的銅。將產(chǎn)生的PMMA/石墨烯薄膜鋪到(wick)玻璃載玻片上，在DI水中漂洗，在DI中的10%HC1中漂洗以除去殘留的金屬顆粒，然后鋪到接收基底上。所述石墨烯在接收基底上干燥后，在1:1的亞甲基氯:甲醇溶液中除去PMMA。將轉(zhuǎn)移的薄膜在400°C在Ar/H2流下在CVD爐中退火，以除去任何殘留的PMMA。在所述退火步驟之后，使用電子衍射成像和拉曼光譜評(píng)估石墨烯的質(zhì)量(圖1b右欄)。然后，將1.5nm的金屬鋁蒸發(fā)到石墨烯上以形成粘附層，然后經(jīng)原子層沉積(ALD)沉積6.5nm的Al2O3(電介質(zhì)層I或dl)。再一次重復(fù)處理步驟Ib和lc，即生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)移第二石墨烯層(g2)并重復(fù)AVAl2O3沉積(d2)，產(chǎn)生如圖1c所示的石墨烯/Al2O3/石墨烯/Al2O3堆疊。注意，使用金板在g2的邊緣接觸g2層，使得向?qū)щ姷膅2層施加門極電位。最后，如圖1d所示，使用場(chǎng)發(fā)射槍TEM在該堆疊中形成納米孔。[0082]石墨烯-Al2O3納米孔的電學(xué)表征。在圖2中示出了對(duì)于在IMKClUOmMTris、ImMEDTA，pH8中的不同尺寸的孔的石墨烯-Al2O3納米孔的電流-電壓特征。通常觀察到線性的IV曲線，表明如之前對(duì)Al2O3納米孔所報(bào)道的對(duì)稱納米孔結(jié)構(gòu)。在圖2中示出了四個(gè)具有不同直徑的孔的IV特征。還示出了與使用數(shù)值模擬所構(gòu)建的數(shù)據(jù)擬合。圖2還示出了作為時(shí)間的函數(shù)的這些相同的孔的電導(dǎo)穩(wěn)定性。在多于60分鐘的時(shí)間內(nèi)獲得了穩(wěn)定的電導(dǎo)值，這確認(rèn)了這些孔在離子流體中的穩(wěn)定性。如圖2b(實(shí)心方塊)中所見，鉆納米孔后的電導(dǎo)值比沒有孔的石墨烯-Al2O3膜的電導(dǎo)高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。[0083]使用石墨烯-Al2O3納米孔檢測(cè)dsDNA。為研究石墨烯-Al2O3納米孔的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)，進(jìn)行了涉及λ-DNA移位的實(shí)驗(yàn)，所述λ-DNA為從質(zhì)粒提取并純化的48.5kbp長(zhǎng)的dsDNA片段?？紤]到dsDNA的相對(duì)小的相關(guān)長(zhǎng)度(54±2nm)，預(yù)期λ-DNA在高鹽溶液中會(huì)成為高度卷曲的球的形狀，回轉(zhuǎn)半徑為I.33,，如圖3a(i)所示。如部分(ii)所示，一旦在納米孔中捕獲，就發(fā)生延伸和穿入過程。圖3b示出了當(dāng)λ-DNA在IMKClUOmMTris>ImMEDTAρΗΙΟ.4中在施加的400mV電壓下移位穿過11.3nm直徑的孔時(shí)由其誘導(dǎo)的相應(yīng)電流阻斷。這些實(shí)驗(yàn)中使用的λ-DNA濃度為IOOng/μI。使用了高pH緩沖液以使所述納米孔的底部石墨烯表面和帶負(fù)電的dsDNA分子之間的靜電相互作用最小。同樣，重要的是注意Al2O3在該pH值下帶負(fù)電(Al2O3的等電點(diǎn)為8-9)，因此不會(huì)靜電結(jié)合DNA。因此，這些實(shí)驗(yàn)條件得到可重復(fù)的DNA移位穿過石墨烯-Al2O3納米孔。[0084]如圖3b和如圖3c的電流阻斷直方圖所示，在λ-DNA移位實(shí)驗(yàn)中觀察到了兩個(gè)不同的阻斷水平，淺的阻斷對(duì)應(yīng)于線性dsDNA轉(zhuǎn)運(yùn)，較深的阻斷水平對(duì)應(yīng)于折疊的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)。注意到，此處ΛI(xiàn)代表在特定電壓下(這種情況下為400mV)由dsDNA誘導(dǎo)的相對(duì)于基線電流的電流阻斷。從562個(gè)單獨(dú)的DNA移位事件構(gòu)建了圖3c的電流直方圖。為了確認(rèn)這些事件確實(shí)是由于DNA移位而不是簡(jiǎn)單地由于與所述孔表面的相互作用，探測(cè)了電壓對(duì)移位時(shí)間的效應(yīng)。觀察到了電壓依賴的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)，隨著電壓增加(對(duì)應(yīng)于電泳驅(qū)動(dòng)力的增加)而移位時(shí)間tD降低。移位時(shí)間的測(cè)量值為在400mV時(shí)，tD=l.81±2.77ms(圖3(e))，在250mV時(shí)來自n=1119個(gè)事件的tD=2.66±4.08ms(圖3(e)插圖)。移位時(shí)間的廣泛分布代表涉及與孔表面的顯著相互作用的移位。[0085]該實(shí)施例中描述的λ-DNA移位實(shí)驗(yàn)顯示，所述石墨烯-Al2O3納米孔不僅可以高度靈敏地檢測(cè)單分子的存在，還可以區(qū)別其精細(xì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(折疊的或未折疊的)。的確，該系統(tǒng)可以讀出蛋白質(zhì)結(jié)合DNA片段的地形結(jié)構(gòu)和/或ssRNA中形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。下文描述了涉及雌激素受體α與其同源的結(jié)合序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。[0086]實(shí)施例2:以單個(gè)蛋白質(zhì)分辨率檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體:[0087]在圖4中示出了蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體以單個(gè)蛋白質(zhì)的分辨率移位穿過石墨烯/Al2O3納米孔。在這些研究中使用的模型DNA-蛋白質(zhì)系統(tǒng)為與含有單個(gè)ERE的50bp長(zhǎng)的探針結(jié)合的ERa，所述ERE為ERa蛋白的同族結(jié)合序列。DNA-結(jié)合的ERα主要作為成核因子，用于募集蛋白質(zhì)復(fù)合體并參與關(guān)鍵的生物過程，包括氧化性應(yīng)激反應(yīng)、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。在圖4a和4b中的示意圖分別示出了ERα與含有單個(gè)ERE的dsDNA的結(jié)合以及ERE序列本身。圖4c示出了凝膠遷移測(cè)定，僅在低鹽濃度下觀察到了ERa/ERE結(jié)合。如圖4d所示，使用納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體與檢測(cè)dsDNA相似。值得注意的是，ERa/ERE復(fù)合體在80mMKCl中轉(zhuǎn)運(yùn)穿過約14nm直徑的孔產(chǎn)生了電流增加(圖4e)，可能是由于在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中濃集在所述復(fù)合體上的抗衡離子局部地增加了孔電導(dǎo)，如之前報(bào)告的在低鹽下的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)研究一樣。圖4f示出了移位時(shí)間相對(duì)于電流增加的散點(diǎn)圖。以單個(gè)結(jié)合的ERa蛋白，該50bp長(zhǎng)的DNA探針在500mV下的最可能的移位時(shí)間為約3ms，比單獨(dú)的50bpdsDNA的評(píng)估的移位時(shí)間慢兩個(gè)數(shù)量級(jí)。[0088]另外的系統(tǒng)檢查了重組蛋白A，已知其在鎂和ATPYS的存在下在雙鏈DNA上形成穩(wěn)定的核蛋白絲。該模型蛋白在原核生物中的同源重組和DNA修復(fù)中起著核心作用。使用記載的方法(Smeetsetal.NanoLett.2008，9:3089-3095)制備了RecA包覆的DNA分子，由NABsys(Providence,RI,USA)提供。該蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)穿過石墨烯-Al2O3納米孔應(yīng)該會(huì)誘導(dǎo)比天然dsDNA顯著更深的電流阻斷，因?yàn)樵摵说鞍捉z的有效直徑為7.5±0.5nm。圖4g示出了8kbp長(zhǎng)的RecA包覆的dsDNA分子在IMKClUOmMTrisUmMEDTA,pH8電解質(zhì)中在施加的500mV電壓下轉(zhuǎn)運(yùn)穿過23nm直徑的石墨烯-Al2O3納米孔的納米孔電流相對(duì)于時(shí)間的變化。在所述核蛋白絲移位穿過所述孔的過程中觀察到了深的電流阻斷，同時(shí)具有比天然dsDNA顯著更高的信噪比(SNR)(圖4j中示出了更高時(shí)間分辨跡線)。圖4h示出了從1368個(gè)個(gè)體RecA相關(guān)的移位事件構(gòu)建的電流阻斷相對(duì)于移位時(shí)間(tD)的事件密度圖；在圖4i中示出了相應(yīng)的事件幅度直方圖。兩類轉(zhuǎn)運(yùn)事件是清晰可辨的:如之前在SiN納米孔中所示，快速、低幅度的事件對(duì)應(yīng)于未結(jié)合或游離的RecA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，較慢的、較高幅度的電流阻斷事件對(duì)應(yīng)于單個(gè)RecA包覆的DNA分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。所描述的兩種事件分類的移位時(shí)間范圍與在SiN納米孔中在RecA-DNA移位實(shí)驗(yàn)中報(bào)告的一致(Smeetsetal.;Kowalczyketal.NanoLett.200910:324-328)。有趣的是，在圖4i中還觀察到電流阻斷值為約18nA的第三高幅度的峰。這可能對(duì)應(yīng)于多個(gè)RecA包覆的DNA分子同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過納米孔。[0089]該實(shí)施例確認(rèn)了多層的石墨烯/Al2O3納米孔可以測(cè)量與結(jié)合至dsDNA的單個(gè)蛋白質(zhì)相關(guān)的生物參數(shù)，并可以應(yīng)用于檢測(cè)DNA分子上的單個(gè)結(jié)合蛋白質(zhì)并為其在空間上作圖。[0090]實(shí)施例3:甲基化分析。[0091]目前基于基因的甲基化分析方法是勞動(dòng)力高度密集的，需要大樣品體積，每次運(yùn)行成本高，并且在大多數(shù)情況下缺少得出有用的臨床結(jié)果所需的靈敏度。相反，用于早期癌癥檢測(cè)的基于納米孔的甲基化分析方法，雖然與目前的臨床范例大相徑庭，但是可以達(dá)到提取與患者結(jié)果相關(guān)的有用臨床信息所需的靈敏度和速度?；诩{米孔的技術(shù)良好地適用于基于基因的甲基化分析，這是因?yàn)樗鼈兡軌?(1)從微小樣品體積中檢測(cè)極低濃度的靶分子，(2)跨越多個(gè)基因檢測(cè)甲基化畸變的組合(在監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和預(yù)后中很重要)，(3)檢測(cè)在使用批量整體平均方法例如PCR和凝膠電泳不能檢測(cè)的跨越等位基因的甲基化模式中的細(xì)微變化，(4)進(jìn)行快速的甲基化分析(在幾分鐘內(nèi)分析同一基因的數(shù)百個(gè)拷貝)，(5)降低成本(需要小的試劑體積)，(6)通過除去麻煩的PCR、DNA測(cè)序和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟而簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)和分析步驟。[0092]使用電流光譜學(xué)分析與蛋白質(zhì)結(jié)合的甲基化DNA。在圖5中示出了基于納米孔的甲基化分析方法。首先，使甲基化的DNA分子與甲基-CpG結(jié)合蛋白結(jié)合以形成蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA復(fù)合體(圖5b和5c)。甲基-CpG-結(jié)合蛋白家族(MBD)由五種蛋白質(zhì)MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4組成，其每種含有使其能與甲基化的DNA結(jié)合的甲基-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)。使用這些中的任一個(gè)來標(biāo)記甲基化的CpG二核苷酸。[0093]選擇了MeCP、MBDl和MBD2，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w外特異性且排他性地與單個(gè)甲基化的CpG二核苷酸結(jié)合，并已被鑒定為轉(zhuǎn)錄抑制中的關(guān)鍵組分。這些蛋白質(zhì)的特異性被用于沿著甲基化的DNA分子標(biāo)記甲基化位點(diǎn)。如圖5d所示，將MBD-DNA復(fù)合體引入到所述納米孔流體性裝置的順側(cè)區(qū)室。在施加的電位下，這些蛋白質(zhì)結(jié)合的、甲基化的DNA片段移位穿過所述孔，產(chǎn)生了表示所述分子的甲基化狀態(tài)的特征性電流阻斷。[0094]甲基化確定:使用基于納米孔的電流光譜學(xué)方法從未甲基化的長(zhǎng)度相等的DNA片段中確定單個(gè)甲基化的DNA分子(圖6)。如圖6a所示，未甲基化的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔僅在基線電流中產(chǎn)生微小的偏差。但是MBD蛋白結(jié)合的DNA片段轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔產(chǎn)生了非常不同的電流特征(圖6b)。因?yàn)榭纂娏鞯南陆蹬c移位分子的橫截面有關(guān)，所以當(dāng)大的結(jié)合蛋白橫貫所述孔時(shí)觀察到了更深的阻斷。出現(xiàn)了兩種不同的阻斷水平，第一種對(duì)應(yīng)于不含結(jié)合的蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域(IDNA)，第二種對(duì)應(yīng)于含有所述MBD蛋白的區(qū)域(1_)。凝膠遷移測(cè)定已經(jīng)顯示，具有多個(gè)結(jié)合MBD蛋白(對(duì)應(yīng)于多個(gè)甲基化的CpG二核苷酸)的片段在凝膠中遷移更慢，并可以以單個(gè)蛋白質(zhì)的分辨率分辨。此外，每個(gè)額外的結(jié)合蛋白顯著地降低了所述復(fù)合體在凝膠中的遷移率。這歸因于兩個(gè)因素:(1)相對(duì)于短的DNA片段，MBD2有高分子量，(2)在pH8.0緩沖液中MBD2帶正電(等電點(diǎn)為9.1)。因此，在正常的孔操作條件下(pH7-8)，MBD結(jié)合的DNA的移位是預(yù)料之中的。[0095]甲基化定量和作圖:電流光譜學(xué)使得能夠沿著具體的DNA片段對(duì)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行作圖并定量總的甲基化水平。圖6c中示出了該方法。存在沿著單個(gè)DNA分子的多個(gè)完全甲基化的CpG二核苷酸幫助每個(gè)DNA結(jié)合多個(gè)MBD蛋白，每個(gè)甲基化的CpG二核苷酸在移位過程中產(chǎn)生深的電流阻斷。如圖6所示，具有多個(gè)結(jié)合蛋白質(zhì)的片段的移位產(chǎn)生了與沿著所述片段的蛋白質(zhì)的空間分布相似的電讀出結(jié)果。然后，這可用于確定沿著所檢測(cè)的DNA片段的甲基化的CpG二核苷酸的分布?；诿總€(gè)事件的深電流阻斷的數(shù)量，所述電流特征還可以用于定量甲基化的程度。[0096]這提出了該技術(shù)的空間分辨率的問題。DNA酶I足跡法確認(rèn)了，MeCP2的MBD可保護(hù)單個(gè)甲基化的CpG對(duì)周圍的總共12-14個(gè)核苷酸。因?yàn)镸eCP2的MBD和MBD2同源，發(fā)明人預(yù)期MBD2—旦結(jié)合也會(huì)覆蓋約12-14bp的DNA。在這12_14bp結(jié)構(gòu)域內(nèi)的另外的甲基CpG二核苷酸不能夠與其他MBD2分子結(jié)合，從而限制了該技術(shù)的空間分辨率。因此，考慮到所述納米孔平臺(tái)高的信噪比，期望它能夠以好的分辨率分辨位于沿著單個(gè)DNA鏈的個(gè)體MBD分子。在該實(shí)施例中描述的縱向地形讀取方法使得能夠定量甲基化水平，并沿著單個(gè)DNA片段對(duì)甲基化分布進(jìn)行作圖，并可以擴(kuò)展到對(duì)具體基因的分析?；谠摳叨褥`敏的納米孔的甲基化分析技術(shù)可用于醫(yī)學(xué)診斷。[0097]實(shí)施例4:pH依賴的石墨烯-Al2O3納米孔的反應(yīng)。[0098]因?yàn)榧{米孔有高的表面體積比，在低鹽濃度下表面可能對(duì)孔電導(dǎo)有非常大的影響。石墨烯-Al2O3納米孔的表面電荷特征和pH反應(yīng)具體地可以通過在使用DNA聚合酶納入核苷酸的過程中通過監(jiān)測(cè)由H+離子釋放導(dǎo)致的pH局部變化而幫助通過合成方式測(cè)序。在高鹽濃度下，溶液中的載荷子支配著穿過所述孔的離子電流。如實(shí)驗(yàn)中觀察到的，電導(dǎo)范圍與載荷子的數(shù)量成線性，并且表面電荷的影響可忽略。但是，在低KCl濃度下，穿過所述納米孔的總電流為溶液中離子的體積濃度與屏蔽表面電荷的抗衡離子(電滲流)的貢獻(xiàn)的結(jié)合。如圖7a所示，在高于Al2O3的等電點(diǎn)時(shí)(約PH8-9)，所述孔中的表面電荷為負(fù)，產(chǎn)生了雙層的濃集K離子，在低于所述等電點(diǎn)時(shí)，所述表面電荷為正，產(chǎn)生了雙層的濃集Cl抗衡離子。在圖7b和7c中分別對(duì)于18±lnm直徑和8±0.5nm直徑的石墨烯-Al2O3納米孔,示出了作為KCl濃度和pH的函數(shù)的孔電導(dǎo)。可以清楚地看見，石墨烯-Al2O3納米孔的電導(dǎo)強(qiáng)烈地受局部pH影響。[0099]在ρΗΙΟ.9下，當(dāng)鹽濃度下降時(shí)清楚地觀察到了電導(dǎo)飽和，表明了在這些高pH條件下存在高度帶電的、負(fù)的孔表面。相反，在PH4時(shí)，即使在非常低的KCl濃度下，也沒有觀察到電導(dǎo)飽和(圖7)，表明了在該pH下所述孔僅微弱地帶電。pH為4的反應(yīng)更密切地類似于表面電荷對(duì)通道電導(dǎo)的影響最小時(shí)的整體行為。圖7c示出了具有較小的8±0.5nm直徑的孔的pH反應(yīng)。在圖7b中觀察到了相似的趨勢(shì)，在較低的pH下觀察到了較低的孔電導(dǎo)。有趣的是，在以IOmM開始的KCl濃度下觀察到了pH為10.9時(shí)電導(dǎo)的飽和/平穩(wěn)狀態(tài)，所述KCl濃度比圖7b中高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。預(yù)期這種結(jié)果與Debye層重疊，在較小的孔中在較高鹽濃度下表面效應(yīng)將開始起支配作用。在IOmMKCl中Debye屏蔽長(zhǎng)度為約3nm，因此與圖7c中8nm直徑的孔相當(dāng)。因此，預(yù)期在這種相對(duì)高的鹽濃度下表面電荷的效應(yīng)是顯著的。[0100]石墨烯-Al2O3納米孔的pH反應(yīng)比SiN和TiO2納米孔以及SiO2納米通道的pH反應(yīng)明顯更顯著。這可能部分是由于存在與Al2O3的高表面電荷密度結(jié)合的石墨烯。使用溶液PH調(diào)節(jié)所述納米孔的表面電位確實(shí)可以調(diào)節(jié)所述孔的電導(dǎo)。該平臺(tái)適合于在使用DNA聚合酶納入單個(gè)核苷酸的過程中監(jiān)測(cè)局部的PH，幫助通過合成方式的測(cè)序。[0101]實(shí)施例5:石墨烯選通的納米孔和塑性的石墨烯層。[0102]已經(jīng)論述了電選通的固態(tài)納米孔的概念，但是使用石墨烯作為門極材料以及實(shí)現(xiàn)這樣的系統(tǒng)在之前沒有被證明。嵌入納米孔中的第三電極尤其有吸引力，因?yàn)槠淇捎糜诟淖兯隹字械碾妶?chǎng)并可用于減慢或捕獲移位的DNA分子，這是實(shí)現(xiàn)納米孔測(cè)序的關(guān)鍵步驟。已經(jīng)描述了絕緣的第三電極(30nm厚的TiN層)對(duì)納米通道和納米孔的電導(dǎo)的影響。但是，該實(shí)施例論述了，使用厚度僅為幾個(gè)單層的石墨烯作為納米孔電極或門極。這種結(jié)構(gòu)的實(shí)現(xiàn)涉及對(duì)圖8a示出(還在圖1c中示出)的體系結(jié)構(gòu)的修改。這些修改包括用250nm蒸發(fā)的Ti/Au板接觸圖1中的石墨烯層2(g2)，然后進(jìn)行電介質(zhì)2(d2)的原子層沉積，如圖1c所示。然后，在接觸的堆疊中鉆出納米孔。如圖8b所示，在鉆出所述孔后，使納米孔基片環(huán)繞在定制設(shè)計(jì)的PCB中，并使用銦導(dǎo)線將接觸所述石墨烯門極的Ti/Au板連接到外部的PCB板(I和2)。圖21B示出了獨(dú)立地可通電且可檢測(cè)的石墨烯門極，其通過所述Ti/Au板連接到電力供應(yīng)和檢測(cè)器。在連接所述基片后跨越板I和2的電阻通常為5-15kQ的范圍，確認(rèn)了在制造后在所述納米孔基片上存在導(dǎo)電的石墨烯薄片。然后，如圖8c所示，將安裝到PCB的納米孔基片插入到定制設(shè)計(jì)的流體性裝置中。小心操作以確保所述Ti/Au板與流體分離，以防止泄漏電流。[0103]如圖8a的示意圖所示，通過將門極節(jié)點(diǎn)綁定到源極來進(jìn)行用所述石墨烯門極的納米孔測(cè)量。綁定所述源和門極以防止泄漏電流從所述源和門極節(jié)點(diǎn)之間的流動(dòng)。即使石墨烯技術(shù)上應(yīng)該作為非法拉第電極，在低的施加偏壓下在離子溶液中有非常少的電子交換發(fā)生，但是缺陷和晶界的存在(CVD培養(yǎng)的石墨烯的特征)可能導(dǎo)致這種泄漏電流。[0104]圖9示出了在多種鹽條件和pH值下,在石墨烯-Al2O3納米孔中連接石墨烯門極(綁定的門極-源極)相對(duì)于使所述門極浮動(dòng)的效應(yīng)。[0105]在ρΗΙΟ.9和pH7.6下，使用連接的門極相對(duì)于浮動(dòng)的情況觀察到了更高的電導(dǎo)水平。相反地，在PH4下，使用連接的門極相對(duì)于浮動(dòng)的門極的情況觀察到了更低的電導(dǎo)。雖然當(dāng)鹽濃度降低時(shí)(表明有靜電效應(yīng))這種電流增加和減少更明顯，但是這種結(jié)果不能僅歸因于所述孔中的場(chǎng)的靜電調(diào)節(jié)?？赡艿氖?，還有流過所述接觸的g2層的電化電流，這在較高PH下更顯著。這可能解釋了在IMKCl，ρΗΙΟ.9條件下觀察到的顯著的電流放大，即使在該濃度下的Debye屏蔽長(zhǎng)度僅為約0.3nm。這與如下想法一致，即在高pH下,OH-可以打破石墨烯的SP2結(jié)合，導(dǎo)致在石墨烯流體界面的電荷轉(zhuǎn)移。這種效應(yīng)在低PH值下不會(huì)發(fā)生，這與發(fā)明人實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到電流增加相一致。通過所述具有連接的門極的孔的電流調(diào)節(jié)也不能僅歸因于泄漏電流。觀察到了在電壓范圍中(-1OOmV-1OOmV)作為pH的函數(shù)的泄漏電流中的小差異，這與選通的納米孔測(cè)量中探測(cè)到的相同。在該應(yīng)用中描述的結(jié)果還表明，考慮到在該界面觀察到顯著的電流轉(zhuǎn)移，所述g2層實(shí)際上可以用作所述孔中的反側(cè)電極。該層可以作為后續(xù)DNA移位實(shí)驗(yàn)中的靈敏電極。通過該第三電極在所述孔中施加局部電位還可用于減慢或捕獲孔中的DNA分子。[0106]用于DNA檢測(cè)和測(cè)序的石墨烯納米帶-納米孔:最近證明了使用其中有納米孔的石墨烯納米帶(GNR)進(jìn)行核苷酸分辨的僅在理論上的可行性。在這些理論研究中報(bào)告了穿過所述帶的核苷酸特異性的橫向電流。該實(shí)施例使用類似的體系結(jié)構(gòu)，用于單分子DNA測(cè)序。圖1Oa的一系列SEM圖像示出了制造GNR和直接在所述帶中形成納米孔。注意到所述GNR通過在圖1示出的g2層上形成圖案來形成。圖1Ob和20b示出了ssDNA測(cè)序的方法。通過測(cè)量在ssDNA通過過程中通過帶132的橫向電流，所述GNR可以作為核苷酸讀取器。嵌入的石墨烯門極(層gl)602提供了用于為所述GNR加偏壓用于ρ-型或η-型行為的裝置并可以通過靜電減慢DNA移位。[0107]納米通道中的納米電極作為電壓傳感器。納米通道中的如下電極體系結(jié)構(gòu)(惠斯通電橋)可以幫助以非常高的空間分辨率感測(cè)個(gè)體DNA分子和DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體，幫助使用電壓感測(cè)方法進(jìn)行長(zhǎng)范圍的DNA單體型作圖和測(cè)序。本文描述的體系結(jié)構(gòu)在圖1la示出并且包含三個(gè)置于納米通道中的電極，所述納米通道在所述電極之上或之下通過。在中心電極(電極3)上施加AC信號(hào)，左電極(電極I)和右電極(電極2)接地。電極I和3之間的阻抗通過Zl給出，電極2和3之間的阻抗通過Ζ2給出。在沒有DNA和其他種類的溶液中，由于所述體系結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性，Zl和Ζ2是平衡的，產(chǎn)生的輸出電位Vout=Vl-V2=0。在圖1lb中示出了等效電路。引入DNA或蛋白質(zhì)導(dǎo)致如下結(jié)果:當(dāng)DNA分子或蛋白質(zhì)通過電極I和3之間的區(qū)域時(shí)，其調(diào)節(jié)/改變Zl并且在輸出電壓中作為電壓峰被檢測(cè)到。類似地，當(dāng)所述分子通過電極3和2之間的區(qū)域時(shí)，其調(diào)節(jié)Z2并產(chǎn)生相反極性的電壓峰。這使得當(dāng)移位分子通過納米通道時(shí)對(duì)其進(jìn)行兩次計(jì)數(shù)。還通過比較峰的幅度并在納米尺度下控制電極間距，可以沿著DNA分子的長(zhǎng)度分辨靈敏的地形信息，例如適體或結(jié)合的蛋白質(zhì)。這種體系結(jié)構(gòu)還可以沿著所述通道的長(zhǎng)度排列以提供對(duì)單分子進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立的計(jì)數(shù)，用于差錯(cuò)校驗(yàn)?zāi)康囊约疤峁┛v向的地形信息。[0108]納米孔中的石墨烯納米電極作為電壓傳感器。該實(shí)施例將兩層石墨烯/電介質(zhì)體系結(jié)構(gòu)擴(kuò)展為三層，用于例如圖12a示出的應(yīng)用。參照?qǐng)D12(a)，膜100包含導(dǎo)電層(即石墨烯)140和電介質(zhì)(該實(shí)施例中為Al2O3)150層的多層堆疊130。第一表面110和第二表面120限定為堆疊130的頂部和底部，其分別面向第一流體區(qū)室和第二流體區(qū)室。納米孔160從第一表面110到第二表面120通過膜100。如圖12b所示，每個(gè)石墨烯層有重疊區(qū)域的圖案，其中鉆有納米孔(圖12b中電介質(zhì)未示出)。參照?qǐng)D12b，納米孔160限定了納米孔通過方向162。每個(gè)石墨烯層140按需形成圖案，包括作為納米帶石墨烯層132形成圖案，所述納米帶石墨烯層132沿著縱軸522(對(duì)應(yīng)于每個(gè)納米帶的長(zhǎng)邊方向)定向并具有由箭頭標(biāo)記164指示的納米帶寬度。從圖12b應(yīng)該理解，任何納米帶的縱向可被表征為與納米孔通過方向162橫切或垂直。所述石墨烯層彼此之間可具有角度偏移，在該實(shí)施方案中相鄰層彼此具有90°的角度偏移。所述重疊區(qū)域的面積為IOOnmXIOOnm的數(shù)量級(jí)，有圖案的石墨烯層會(huì)再次被經(jīng)ALD沉積的薄的電介質(zhì)層隔開。如圖12b所示為石墨烯層加偏壓，例如用于實(shí)現(xiàn)垂直的惠斯通電橋體系結(jié)構(gòu)(相對(duì)于圖11示出的水平結(jié)構(gòu))。再次對(duì)所述中心電極施加AC信號(hào)，并再次跨越電極I和2測(cè)量輸出電位。當(dāng)分子通過所述納米孔時(shí)，應(yīng)該可通過測(cè)量Zl(跨越電極I和3的阻抗)和Z2(跨越電極2和3的阻抗)的調(diào)節(jié)，使用電阻抗進(jìn)行分子的檢測(cè)和空間作圖。本文示出的垂直結(jié)構(gòu)具有額外的優(yōu)勢(shì)，即可在埃尺度上精確控制電極間間隔，使得能夠相對(duì)于圖11示出的平面體系結(jié)構(gòu)更靈敏地沿著分子進(jìn)行地形測(cè)量。[0109]參考文獻(xiàn)[0110]ffanunu,M.&Meller,A.ChemicallyModifiedSolid-StateNanopores.NanoLetters7,1580-1585(2007).[0111]Nam,S.-ff.,Rooks,M.J.,Kim,K._B.&Rossnagel,S.M.1onicFieldEffectTransistorswithSub-1OnmMultipleNanopores.NanoLetters9,2044-2048(2009).[0112]Stein,D.,Kruithof,M.&Dekker,c.Surface-Charge-GovernedionTransportinNanofluidicChannels.PhysicalReviewLetters93,035901(2004).[0113]Karnik,R.etal.ElectrostaticControlof1nsandMoleculesinNanofluidicTransistors.NanoLetters5,943-948(2005).[0114]Nelson,T.,Zhang,B.&Prezhdo,0.v.DetectionofNucleicAcidswithGrapheneNanopores:AhInitioCharacterizationOfaNovelSequencingDevice.NanoLetterslO,3237-3242(2010).[0115]實(shí)施例6:用于DNA和DNA—蛋白質(zhì)復(fù)合體的靈敏檢測(cè)的納米制造的石墨墨烯-Al2O3納米孔和納米孔陣?yán)齕0116]該實(shí)施例描述了制造用于靈敏檢測(cè)單獨(dú)DNA分子和DNA和DNA—蛋白質(zhì)復(fù)合體的納米孔和納米孔陣列。使用電子束光刻和反應(yīng)性離子蝕刻步驟在SiNAl2O3膜中制造約15nm直徑的納米孔的高密度陣列，以幫助進(jìn)行單個(gè)DNA分子的高通量分析。還報(bào)告了在超薄石墨烯/Al2O3膜中制造單個(gè)納米孔，用于檢測(cè)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。證明了在低鹽濃度下的單個(gè)蛋白質(zhì)的分辨率。[0117]納米孔DNA分析是新出現(xiàn)的技術(shù)，其涉及通過電泳驅(qū)動(dòng)DNA分子在溶液中穿過納米級(jí)的孔并監(jiān)測(cè)相應(yīng)的離子孔電流的改變。這種通用方法使得能夠以亞納米的分辨率對(duì)長(zhǎng)度范圍為單核苷酸至千堿基的長(zhǎng)基因組DNA片段的帶電聚合物(單鏈DNA、雙鏈DNA和RNA)進(jìn)行無需標(biāo)記、無需擴(kuò)增的分析。納米孔最近的進(jìn)展表明，該低成本、可高度擴(kuò)展的技術(shù)可適用于開發(fā)第三代DNA測(cè)序技術(shù)，有希望在1000美元以下對(duì)人雙倍體基因組進(jìn)行快速且可靠的測(cè)序。但是，為了能夠使用固態(tài)納米孔進(jìn)行高通量的多路測(cè)序，需要制造高密度的納米孔陣列。該實(shí)施例證明了一種優(yōu)化的方法，其用于使用電子束光刻和干蝕刻方法在懸浮的AlA/SiN膜中制造約15nm直徑的納米孔的陣列，這是一種良好適用于平行DNA分析的平臺(tái)技術(shù)。將石墨烯納入固態(tài)納米孔中也有很大前景。與單鏈DNA(ssDNA)中核苷酸之間的0.32-0.52nm間隔相當(dāng)?shù)氖﹩螌雍穸?，使得該材料?duì)于應(yīng)用電子DNA測(cè)序進(jìn)行單個(gè)核苷酸檢測(cè)尤其具有吸引力。該實(shí)施例描述了在堅(jiān)固的超薄石墨烯/Al2O3膜中制造單個(gè)納米孔并使用該體系結(jié)構(gòu)用于高度靈敏地檢測(cè)單DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。這些研究中使用的模型蛋白質(zhì)-DNA系統(tǒng)為與50堿基對(duì)(bp)長(zhǎng)的含有其同源結(jié)合序列(雌激素反應(yīng)元件)的探針結(jié)合的雌激素受體a(ERa)。這些研究證明了，該體系結(jié)構(gòu)的單個(gè)蛋白質(zhì)的靈敏度并可以擴(kuò)展至檢測(cè)多種其他的DNA結(jié)合蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、核酸酶和組蛋白。[0118]納米孔傳感的原理與庫爾特粒度儀相似。在將兩個(gè)填充有導(dǎo)電電解質(zhì)的區(qū)室隔開的絕緣膜中形成了納米級(jí)的孔或納米孔。在固態(tài)膜的情形中，使用聚焦的會(huì)聚電子束經(jīng)分解性衍射以形成橫斷面直徑與雙鏈(ds)DNA的2.2nm橫斷面直徑相當(dāng)?shù)目?，來形成納米孔。將帶電的分子(例如DNA)插入到所述流體區(qū)室之一，并在施加的電位下通過電泳驅(qū)動(dòng)其穿過所述孔，從而調(diào)節(jié)穿過所述孔的離子電流。相應(yīng)的電子特征揭示了關(guān)于移位分子的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)的有用信息。這種觀念可被擴(kuò)展至測(cè)序，因?yàn)槿绻鹲sDNA中每個(gè)通過的核苷酸產(chǎn)生特征性的殘留離子電流，那么該電流跡線可被用于提取序列信息。[0119]實(shí)驗(yàn)。納米孔陣列制造。使用以前記載的制造方法形成獨(dú)立式的Al203/SiN膜。所述膜包含經(jīng)原子層沉積(ALD)沉積的350A厚的Al2O3層，然后經(jīng)等離子體增強(qiáng)的化學(xué)氣相沉積(PECVD)沉積的覆蓋430人厚的SiN層。首先，將以ZEP520:苯甲醚(2:3)的比例溶解于苯甲醚的ZEP520電子束抵抗劑旋轉(zhuǎn)涂布到所述獨(dú)立式的膜上(2000rpm持續(xù)60秒)，優(yōu)化至750人的最終厚度用于約IOnm的特征分辨率。然后，在200°C烘烤所述ZEP520包覆的基片約2分鐘，然后使用JE0LJBX-6000FS電子束光刻(用量=10000μC/cm2)進(jìn)行電子束曝露。在二甲苯中30秒然后IPA30秒來使陣列圖案顯影。然后，使用反應(yīng)性離子蝕刻(RIE)步驟來將ZEP520中的陣列圖案轉(zhuǎn)移到SiN中。在60sccmCF4:6sccmCHF3中在60W電力和80mTorr的壓力下中完成蝕刻。相對(duì)于ZEP520的約200Ak/min，在這些條件下測(cè)量到約6004/min的蝕刻速率。ZEP520和SiN蝕刻窗口作為干蝕刻Al2O3的遮蔽物(mask)，在PlasmaThermSLR-770InductiveIyCoupledPlasma(ICP)Reactive1nEtcher(電感稱合等離子體(ICP)反應(yīng)性離子蝕刻機(jī))中完成。在IOsccmBC13:40sccmAr中在200W的ICP電力、20W的電極臺(tái)板電力下，在約65V的DC偏壓下完成蝕刻，。相對(duì)于SiN的90人/min、ZEP520的200?/min，在這些條件下觀察到了約220A/min的Al2O3蝕刻速率。[0120]在石墨烯/Al2O3膜中單個(gè)納米孔的制造。使用以前記載的膜制造方法再次形成獨(dú)立式的Al203/SiN膜。使用FEIDB235聚焦離子束(FIB)工具在這些膜中磨出約300nm的直徑的大孔。使用Etamota化學(xué)氣相沉積(CVD)系統(tǒng)在購自BasicCopper的1.4mil銅箔上生長(zhǎng)石墨烯薄膜。使所述箔在Ar/H2流下退火45分鐘,石墨烯在CH4/H2/Ar流下,在1000°C、約500mTorr下生長(zhǎng)20分鐘。在Ar流下以約20°C/min的速率使產(chǎn)生的銅/石墨烯基底冷卻至室溫。將石墨烯轉(zhuǎn)移到接收基底如下進(jìn)行:將石墨烯用雙層PMMA(495K和950K)包覆，O2等離子體中將所述銅箔上的后部石墨烯除去，然后在IMFeCl3溶液中蝕刻后部的銅。將產(chǎn)生的PMMA/石墨烯薄膜鋪到(wick)玻璃載玻片上，在DI水中漂洗，在DI水中的10%HC1中漂洗以除去殘留的金屬顆粒，然后進(jìn)行最后的DI漂洗，并鋪到接收的基底上。所述石墨烯在接收的基底上干燥后，在1:1的亞甲基氯:甲醇溶液中除去PMMA。將轉(zhuǎn)移的薄膜在400°C在氬/H2流下在CVD爐中退火，以除去任何殘留的PMMA。然后，使用CHASEC-600E-BeamEvaporator將種子層例如包含15A的金屬Al的金屬種子層蒸發(fā)到石墨烯包覆的基片上。該層在空氣中完全氧化并作為ALDAl2O3的種子層。然后，使用ALD沉積60人的Al2O315使用來自JE0L2010FFEG-TEM的聚焦的會(huì)聚電子束，用與在純Al2O3膜中鉆孔類似的電子束條件，在石墨烯/Al2O3膜中鉆出納米孔。[0121]結(jié)果和討論。圖13a示出了納米孔陣列制造方法。通過首先使用電子束光刻在ZEP520電子束抵抗劑上形成圖案，然后使用一系列反應(yīng)性離子蝕刻步驟將該圖案轉(zhuǎn)移到SiN和Al2O3層中，來形成陣列。如圖13c所示，優(yōu)化的方法使得能夠以IOOnm的間距平行制造約15nm直徑的納米孔。類似地，如圖13d所示，可以相對(duì)容易地制造更大的陣列。由于ZEP520電子束抵抗劑相對(duì)于PMMA具有高的干蝕刻選擇性以及清除所需的約十分之一的更低的電子用量，所以該應(yīng)用中選擇ZEP520電子束抵抗劑，使得能夠進(jìn)行快速的大晶片規(guī)模的納米孔陣列制造。在懸浮的膜中進(jìn)行陣列制造之前，在平板基底上使用一系列測(cè)試曝露來優(yōu)化電子劑量，以實(shí)現(xiàn)小于IOnm的分辨率。本文提供的方法可幫助使用CF4/CHF3混合物以3:1的SiN:ZEP520蝕刻選擇性在SiN中進(jìn)行高度各向異性的具有小于20nm寬的特征的干蝕刻。對(duì)于這種配方，Al2O3作為堅(jiān)固的蝕刻終止物。使用BCl3=Ar蝕刻配方以2.5:1的Al2O3=SiN測(cè)量選擇性實(shí)現(xiàn)將圖案轉(zhuǎn)移到A1203。如圖13a(iv)示意圖所示,觀察到Al2O3中的錐形蝕刻剖面，錐度為約54°，使得Al2O3中的最終孔直徑顯著小于ZEP520中圖案的孔直徑。該特征可能非常有用，因?yàn)槠淇梢詭椭贏l2O3中制造小于IOnm直徑的納米孔陣列。將納米級(jí)電極整合進(jìn)這種體系結(jié)構(gòu)以形成個(gè)體尋址的納米孔陣列，這使得能夠進(jìn)行個(gè)體DNA分子的高通量檢測(cè)，用于測(cè)序應(yīng)用。[0122]圖14示出了在超薄石墨烯/Al2O3膜中制造個(gè)體納米孔。首先使用聚焦的離子束工具在獨(dú)立式的SiNAl2O3膜中形成單個(gè)約300nm的孔。如所述實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)敘述的那樣，然后將CVD生長(zhǎng)的石墨烯轉(zhuǎn)移到含有所述FIB孔的基底上。轉(zhuǎn)移后，使用TEM衍射成像和拉曼光譜儀在納米和微米級(jí)下檢查所述石墨烯的完整性。在衍射圖案中(圖14d)從跨越所述FIB孔的石墨烯膜觀察到六角對(duì)稱性，可能表明了單層石墨烯，這還被其中/(G’)/f(G)>2的圖14e的拉曼光譜的峰強(qiáng)度所支持。[0123]已經(jīng)報(bào)告了使用本文所采用的CVD方法生長(zhǎng)主要是單層的石墨烯。注意到，在圖14e中觀察到的D峰是CVD石墨烯的特征并由裂縫產(chǎn)生。然后將15A厚的Al種子層蒸發(fā)到所述石墨烯層上，然后進(jìn)行60A的Al2O3的ALD沉積，給出小于Snm的總膜厚度。如圖14g和14h(TEM圖像)所示，使用聚焦的會(huì)聚電子束在該超薄石墨烯/Al2O3膜中形成單個(gè)納米孔。這些納米孔非常堅(jiān)固并展示出線性的IV特征。[0124]圖4示出了蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體移位穿過石墨烯/Al2O3納米孔。這些研究中的模型DNA-蛋白質(zhì)系統(tǒng)為與含有單個(gè)ERE的50bp長(zhǎng)的探針結(jié)合的ERa，所述ERE為ERa蛋白的同源結(jié)合序列。DNA-結(jié)合的ERa主要作為成核因子用于募集蛋白質(zhì)復(fù)合體并參與關(guān)鍵的生物過程，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。在圖4a和4b中的示意圖分別示出了ERα與含有單個(gè)ERE的dsDNA和ERE序列本身的結(jié)合。圖4c示出了凝膠遷移測(cè)定，僅在低鹽濃度下觀察到了ERa/ERE結(jié)合。使用納米孔檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體與如圖4d所示的dsDNA檢測(cè)相似。值得注意的是，所述ERa/ERE復(fù)合體在80mMKCl中轉(zhuǎn)運(yùn)穿過約14nm直徑的孔導(dǎo)致電流增加(圖4e)，可能是由于抗衡離子濃集所述復(fù)合體上，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中局部地增加了孔電導(dǎo)，如之前報(bào)告的在低鹽下的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)研究一樣。在圖4f中示出了移位時(shí)間相對(duì)于電流增加的散點(diǎn)圖。該50bp長(zhǎng)的具有單個(gè)結(jié)合的ERa蛋白的DNA探針在500mV下的最可能的移位時(shí)間為約3ms，比僅50bp的dsDNA所估計(jì)的移位時(shí)間慢了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。本文提供的工作確認(rèn)了石墨烯/Al2O3納米孔可以在空間上分辨與dsDNA結(jié)合的單個(gè)蛋白質(zhì)。[0125]證明了用于靈敏地電檢測(cè)單DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的納米孔和納米孔陣列的制造。制造方法使得能夠形成具有約15nm直徑的納米孔及更大的納米孔的高密度陣列，使用電子束光刻和反應(yīng)性離子蝕刻步驟在懸浮的SiNAl2O3膜中制造。所述方法還可以包括用納米級(jí)電極對(duì)這些孔進(jìn)行單獨(dú)尋址，以幫助進(jìn)行高通量的DNA分析，應(yīng)用于DNA測(cè)序。還證明了在超薄石墨烯/Al2O3膜中制造單個(gè)納米孔以及檢測(cè)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，特別是ERa/ERE。重要的是，使用該平臺(tái)在低鹽濃度下達(dá)到了單蛋白質(zhì)的空間分辨率。[0126]參考文獻(xiàn)[0127]Venkatesan,B.M.&Bashir,R.NanoporeSensorsforNucleicAcidAnalysis.Nat.Nanotechnol.,6:615-624(AvailableonlineSept.18,2011).[0128]Branton,D.etal.Thepotentialandchallengesofnanoporesequencing.Nat.Biotechnol.26,1146(2008).[0129]Venkatesan,B.M.etal.HighlySensitive,MechanicallyStableNanoporeSensorsforDNAAnalysis.Adv.Mater.21,2771-2776(2009).[0130]Venkatesan,B.M.etal.LipidbilayercoatedA1203nanoporesensors:towardsahybridbiologicalsolid-statenanopore.Biomed.Microdevices,1-12(2011).[0131]Venkatesan,B.M.,Shah,A.B.,Zuo,JM.&Bashir,R.DNASensingUsingNanocrystalIineSurFace-EnhancedA1203NanoporeSensors.Adv.Funct.Mater.20，1266-1275(2010).[0132]Li,x.etal.Large-AreaSynthesisofHigh-QualityandUniformGrapheneFilmsonCopperFoils.Science324,1312-1314(2009).[0133]實(shí)施例7:用于核酸分析的納米孔傳感器[0134]納米孔DNA分析是新出現(xiàn)的技術(shù)，其涉及通過電泳驅(qū)動(dòng)DNA分子穿過溶液中的納米級(jí)的孔并監(jiān)測(cè)相應(yīng)的離子孔電流的改變。這種通用方法使得能夠以亞納米的分辨率對(duì)長(zhǎng)度范圍為單核苷酸至千堿基長(zhǎng)的基因組DNA片段的帶電聚合物(單鏈DNA、雙鏈DNA和RNA)進(jìn)行無需標(biāo)記、無需擴(kuò)增的分析。納米孔最近的進(jìn)展表明，該低成本、可高度擴(kuò)展的技術(shù)可適用于開發(fā)第三代DNA測(cè)序技術(shù)，有希望在1000美元以下對(duì)人雙倍體基因組進(jìn)行快速且可靠的測(cè)序。在該實(shí)施例中描述了納米孔在測(cè)序、基因組作譜、表觀遺傳學(xué)分析和醫(yī)學(xué)診斷中的新興作用。[0135]對(duì)人基因組測(cè)序已經(jīng)幫助進(jìn)一步理解疾病、遺傳和個(gè)體性?；蚪M測(cè)序已經(jīng)在孟德爾病(與復(fù)雜的人疾病相關(guān)的遺傳危險(xiǎn)因素)的鑒定中起關(guān)鍵作用，并繼續(xù)在治療和個(gè)性化用藥中具有新的作用。對(duì)更廉價(jià)且更快速的基因組測(cè)序的需求增長(zhǎng)已經(jīng)促使開發(fā)在速度和成本方面勝過常規(guī)的Sanger鏈終止法的新技術(shù)。這些新的第二和第三代測(cè)序技術(shù)，受美國國立衛(wèi)生研究院在2004年提出的1000美元基因組挑戰(zhàn)的鼓舞，期望革新基因組醫(yī)學(xué)。納米孔DNA測(cè)序是這種目前隨時(shí)準(zhǔn)備迎接該重大挑戰(zhàn)的技術(shù)之一。[0136]納米孔DNA測(cè)序是有吸引力的，因?yàn)槠涫菬o需標(biāo)記、無需擴(kuò)增的單分子方法，并可被擴(kuò)大用于高通量的DNA分析。該技術(shù)通常需要低的試劑體積，得益于相對(duì)低的成本并支持長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度，可能能夠進(jìn)行從頭測(cè)序和長(zhǎng)范圍的單體型作圖。納米孔傳感的原理與庫爾特粒度儀類似。在將兩個(gè)填充有導(dǎo)電電解質(zhì)的區(qū)室隔開的絕緣膜中形成納米級(jí)的孔或納米孔。在施加的電位下使帶電的分子通過電泳驅(qū)動(dòng)其穿過所述孔，從而調(diào)節(jié)穿過所述孔的離子電流。相應(yīng)的電子特征揭示了關(guān)于移位分子的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)的有用信息。如Deamer、Branton和Church在90年代首次提出的那樣，這種觀念可被擴(kuò)展至測(cè)序，因?yàn)槿绻麊捂淒NA(ssDNA)中每個(gè)通過的核苷酸產(chǎn)生特征性的殘留離子電流，那么該電流跡線可被用于提取序列信息。[0137]最近生物納米孔的發(fā)展表明，納米孔測(cè)序是確實(shí)可行的。使用生物α-溶血素和MspA納米孔的原理循證實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示出在該方向的顯著進(jìn)步。該實(shí)施例描述了該領(lǐng)域最近的進(jìn)步以及固態(tài)和混合納米孔技術(shù)中的新進(jìn)展，尤其是納入了石墨烯使得能夠分辨單核苷酸并進(jìn)行超快測(cè)序。還檢查了減慢DNA移位的工作(圖15)以及為所述納米孔添加功能的新傳感體系結(jié)構(gòu)和形態(tài)(modality)(表I)。簡(jiǎn)要提供了這些新技術(shù)用于測(cè)序及相關(guān)挑戰(zhàn)的應(yīng)用。最后，論述了納米孔在測(cè)序外的領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是該技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷中的新作用。[0138]離子電流方法已經(jīng)在原理循證的測(cè)序?qū)嶒?yàn)，尤其是在通過外切核酸酶消化的測(cè)序和DI測(cè)序中顯示出顯著的成功。基于納米孔的光學(xué)方法也顯示出前景，但是需要DNA的大規(guī)模轉(zhuǎn)換。計(jì)算研究表明，橫向電子隧穿和電容納米孔方法還可有助于超快測(cè)序，雖然在實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)這些技術(shù)仍然懸而未決。[0139]生物納米孔:重建到脂雙層中的生物納米孔提供了用于單分子DNA分析的有吸引力的選擇。它們的通用性可歸因于幾個(gè)因素:首先，性質(zhì)提供了用于以半導(dǎo)體工業(yè)仍不能復(fù)制的原子水平的精確度大量制造生物納米孔的細(xì)胞狀機(jī)械結(jié)構(gòu)；能夠獲得以埃水平的分辨率揭示孔結(jié)構(gòu)的X-射線晶體信息；技術(shù)例如定點(diǎn)誘變可被用于定制孔的物理和化學(xué)性質(zhì)；以及，在尺寸和組成方面在孔中觀察到顯著的異質(zhì)性。DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過生物納米孔的體外研究按照慣例已經(jīng)涉及α-溶血素，該七聚體蛋白孔的結(jié)構(gòu)示于圖16a。所述通道由與長(zhǎng)度約為5nm的跨膜β-桶連接的3.6-nm孔腔組成,其含有1.4nm的收縮部,該收縮部允許通過單鏈DNA但不能通過雙鏈DNA(dsDNA)οKasianowicz首先證明了個(gè)體ssDNA和ssRNA分子穿過α-溶血素的電泳轉(zhuǎn)運(yùn)。具體地，早期結(jié)果證明了天然α-溶血素區(qū)分自由移位的胞苷酸和腺苷酸的RNA同聚物以及區(qū)分ssDNA的poly(dA)和poly(dC)鏈的能力，表明了α-溶血素作為下一代DNA測(cè)序工具的潛力。但是，已經(jīng)證實(shí)實(shí)現(xiàn)這種工具是具有挑戰(zhàn)性的，主要是由于ssDNA在通常的實(shí)驗(yàn)條件下移動(dòng)穿過所述孔的速率非常高(估計(jì)為約I個(gè)核苷酸/μS)，如圖15所示?？紤]到核苷酸中存在的熱力學(xué)波動(dòng)(所述孔中載荷子的數(shù)目和核苷酸的位置的統(tǒng)計(jì)差異)以及細(xì)微的化學(xué)差異，一種令人畏縮的主張是，在這些快速的時(shí)間范圍下，在孔中能夠獲得少至約100個(gè)離子以正確鑒定移位的核苷酸。因此已經(jīng)證實(shí)不可能使用α-溶血素對(duì)自由移位的ssDNA進(jìn)行測(cè)序。[0140]目前大多數(shù)納米孔測(cè)序策略已經(jīng)尋求在進(jìn)行電子讀出之前主動(dòng)或被動(dòng)地減慢ssDNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。主動(dòng)方法通常納入酶，以調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔。與納米孔偶聯(lián)的酶馬達(dá)因?yàn)槿缦聝蓚€(gè)理由是有吸引力的:(I)在總體溶液中形成酶-DNA復(fù)合體，使其能夠在電泳過程中在所述孔中被捕獲和，(2)當(dāng)酶持續(xù)地使DNA底物步進(jìn)穿過所述孔時(shí)觀察到相對(duì)慢且受控制的移動(dòng)。這種方法精巧地展示了通過DNA聚合酶催化使ssDNA—個(gè)堿基一個(gè)堿基地以棘輪方式穿過α-溶血素。僅在互補(bǔ)核苷酸組的存在下才從電學(xué)上觀察到單核苷酸引物延伸事件，使得能夠進(jìn)行測(cè)序。最近，Liebermanetal.使用phi29DNA聚合酶展示了ssDNA在α-溶血素上持續(xù)復(fù)制。除了能夠分辨?zhèn)€體催化循環(huán)外，還可使用離子電流辨別聚合酶動(dòng)力學(xué)(dNTP結(jié)合、聚合酶手指開合)。Deamer提供了關(guān)于使用DNA處理酶控制DNA轉(zhuǎn)運(yùn)穿過α-溶血素的綜述。更簡(jiǎn)單地，也存在減慢DNA的被動(dòng)方法，例如使用核苷酸標(biāo)記、具有DNA發(fā)夾的單鏈DNA的末端終止、通過用帶正電的殘基使跨膜結(jié)構(gòu)域排成一排，而將分子制動(dòng)器納入所述孔，等等，但是沒有出現(xiàn)一種方法能夠解決高度受控的定向分子轉(zhuǎn)運(yùn)的重大挑戰(zhàn)。核苷酸標(biāo)記是非常有吸引力的，因?yàn)闃?biāo)記物的化學(xué)性質(zhì)、電荷和大小可以不同，有可能能夠?qū)崿F(xiàn)“飛速的”測(cè)序，但是在大的基因組片段中標(biāo)記鄰近的核苷酸存在挑戰(zhàn)。最近，Bayley組展示了更通用的、無需標(biāo)記的測(cè)序方法。在該研究中，Clarkeetal.證明了使用電阻電流測(cè)量能夠連續(xù)地分辨通過α-溶血素的天然單核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)。通過在跨膜結(jié)構(gòu)域的β桶內(nèi)共價(jià)地結(jié)合氨基環(huán)糊精適體來修飾突變的α-溶血素孔而實(shí)現(xiàn)堿基選擇性，從而在增強(qiáng)傳感器的化學(xué)特異性的同時(shí)使所述通道收縮。在最佳操作條件下讀取自然的單核苷酸具有超過99%的可信性。通過經(jīng)由化學(xué)連接或基因融合將該堿基鑒定平臺(tái)與高度持續(xù)的外切核酸酶整合，通過消化方法的基于納米孔的單分子測(cè)序可確實(shí)可行。這種方法形成了OxfordNanopore(Oxford,UK)進(jìn)行商業(yè)測(cè)序工作的基礎(chǔ)。[0141]雖然在過去α-溶血素已經(jīng)在生物納米孔測(cè)序的橫向領(lǐng)域中大大占據(jù)主要地位，但是用于測(cè)序的更有效的生物納米孔已經(jīng)開始出現(xiàn)。α-溶血素的結(jié)構(gòu)缺陷涉及其約5nm長(zhǎng)的圓筒狀β桶，其每次可調(diào)節(jié)最高達(dá)約10個(gè)核苷酸。位于該β桶中的核苷酸可顯著地調(diào)節(jié)孔電流并隨后在最窄的1.4nm孔收縮部削弱單核苷酸特異性的離子特征，這降低了測(cè)序應(yīng)用中總的信噪比。在納米孔測(cè)序競(jìng)爭(zhēng)領(lǐng)域中相對(duì)新的候選者，通道孔蛋白恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA)克服了這種固有的結(jié)構(gòu)限制。MspA是八聚體蛋白通道，其含有直徑為約1.2nm的單個(gè)收縮部，通道長(zhǎng)度為約0.5nm，形成逐漸變細(xì)的漏斗形(圖16b中示出了結(jié)構(gòu)橫斷面)，這與α-溶血素的圓筒狀結(jié)構(gòu)相反。Derringtonetal.證明了基因工程改造的MspA區(qū)別三核苷酸組(AAA、GGG、TTT、CCC)的能力，其在核苷酸分離效率上相對(duì)于天然的α-溶血素有令人印象深刻的3.5倍增強(qiáng)。有趣的是，在涉及固定化的ssDNA的實(shí)驗(yàn)中，觀察到在MspA的收縮部的內(nèi)部或附近低至三個(gè)核苷酸對(duì)孔電流有貢獻(xiàn)，這相對(duì)于已知的在天然α-溶血素中用約10個(gè)核苷酸來調(diào)節(jié)離子電流的情況有顯著改善。作者假設(shè)，通過定點(diǎn)突變，這可能可以進(jìn)一步改善至單個(gè)核苷酸，這是以后MspA突變體的顯然目標(biāo)。將MspA應(yīng)用到從頭測(cè)序也不是沒有挑戰(zhàn)。未受阻礙的ssDNA移位穿過MspA的速度仍然太快而不能對(duì)ssDNA進(jìn)行“飛速的”測(cè)序。為克服這種限制，最近提出了雙鏈體間斷(DI)的納米孔測(cè)序。DI測(cè)序涉及在分析物DNA分子中每個(gè)核苷酸之間插入“短的”雙鏈DNA片段。當(dāng)雙鏈體轉(zhuǎn)化的DNA被驅(qū)動(dòng)穿過MspA納米孔時(shí),每個(gè)雙鏈體相繼地使移位過程暫停，使單個(gè)分析物核苷酸暴露于受限的納米孔開口，用于使用離子電流進(jìn)行鑒定。雙鏈體解離后，DNA就前進(jìn)，一直到下一個(gè)雙鏈體，此時(shí)確定下一個(gè)分析物核苷酸，等等。這種方法可以最終使得能夠進(jìn)行快速且長(zhǎng)的連續(xù)讀?。坏?，使用這種方法以高保真度轉(zhuǎn)化并讀取大的基因組片段的能力仍有待觀察。DI測(cè)序的替代方法是將酶-馬達(dá)偶聯(lián)到MspA上以使ssDNA受控地步進(jìn)穿過所述孔，在每次步進(jìn)時(shí)進(jìn)行核苷酸鑒定，該方法稱為鏈測(cè)序。適合于該應(yīng)用的候選酶包括T7DNA聚合酶、DNA聚合酶I的Klenow片段和phi29DNA聚合酶，已知后者在施加的高的ISOmV負(fù)荷下非常穩(wěn)定并在α-溶血素開口處高效地催化連續(xù)的核苷酸添加。因此，似乎可能的是，與MspA偶聯(lián)的phi29DNA聚合酶可以使得能夠?qū)﹂L(zhǎng)鏈的DNA進(jìn)行測(cè)序，雖然尚未證明這種系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。[0142]將生物納米孔應(yīng)用于DNA測(cè)序以外的領(lǐng)域也有巨大的潛力。可以用于分子診斷和DNA指紋法的一種具體生物孔是來自噬菌體phi29DNA包裝馬達(dá)的連接器蛋白。該蛋白納米孔的通用性源于其相對(duì)大小，該蛋白質(zhì)孔(hub)由十二個(gè)GPlO亞基組成，所述亞基自組裝形成內(nèi)徑為約3.6nm的通道。有趣的是，在相似條件下該納米孔的開放通道電導(dǎo)是a-溶血素的約5倍，表明篩選較大分析物的可能性，所述分析物包括dsDNA、DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體以及用于蛋白質(zhì)測(cè)序的氨基酸聚合物。最近Wendelletal.展示了dsDNA移位穿過嵌入脂雙層中的遺傳工程改造的連接器通道。觀察到了dsDNA單向轉(zhuǎn)運(yùn)穿過該通道(從N末端入口到C末端出口)，表明所述通道中的天然閥門機(jī)制，其在噬菌體phi29病毒成熟過程中輔助dsDNA包裝。這種令人興奮的蛋白納米孔的能力在未來的幾年內(nèi)會(huì)變得更加明顯。[0143]固態(tài)納米孔。盡管生物納米孔有異質(zhì)性和顯著的靈敏性，但這些傳感器確實(shí)顯示出一些固有缺點(diǎn)。機(jī)械支持的脂雙層的脆弱性質(zhì)、生物孔對(duì)實(shí)驗(yàn)條件(pH、溫度、鹽濃度)的敏感性以及與用于高通量DNA分析/測(cè)序的大范圍陣列整合相關(guān)的挑戰(zhàn)限制了這些生物平臺(tái)的通用性。即使通過在固體和納米多孔性基底上開發(fā)受支持的雙層、改變雙層脂質(zhì)組成以及開發(fā)受束縛的雙層體系結(jié)構(gòu)而使雙層穩(wěn)定性有了持續(xù)改進(jìn)，但是固態(tài)膜的堅(jiān)固性和耐久性使其仍然可顯著地替代其生物的相似物。再加上微制造技術(shù)的進(jìn)步，因此固態(tài)納米孔正快速地成為生物納米孔的廉價(jià)且高度通用的替代物。固態(tài)技術(shù)提供的其他優(yōu)勢(shì)包括以亞納米精確度調(diào)準(zhǔn)納米孔尺寸的能力、制造高密度納米孔陣列的能力、相對(duì)于基于脂質(zhì)的系統(tǒng)具有優(yōu)良的機(jī)械、化學(xué)和熱特性，以及可能的與電和光探測(cè)技術(shù)的整合。[0144]在2001年初首次使用固態(tài)納米孔進(jìn)行DNA感測(cè)的報(bào)告出現(xiàn)于Golovchenko實(shí)驗(yàn)室。使用定制構(gòu)建的反饋控制的離子束雕刻工具(可真正以納米級(jí)控制孔尺寸的方法)，在薄的SiN膜中形成納米孔。當(dāng)今,大多數(shù)小組傾向于使用來自場(chǎng)發(fā)射槍(FEG)TEM的聚焦的會(huì)聚電子束，以在薄的絕緣膜中分解性地噴射出納米孔，這是自從20世紀(jì)80年代發(fā)展的技術(shù)。Healyetal.綜述了在薄的絕緣膜中制造固態(tài)納米孔，Dekker綜述了該技術(shù)應(yīng)用于單分子生物物理學(xué)。SiN由于其高的耐化學(xué)性和低的機(jī)械應(yīng)力，已經(jīng)傳統(tǒng)上成為了納米孔膜材料的選擇，是經(jīng)優(yōu)化的低壓化學(xué)氣相沉積方法來沉積。該方法通常在升高的溫度下(約800°C)進(jìn)行并且在亞納米方案中沒有厚度控制。為有效地以個(gè)體核苷酸的分辨率探測(cè)DNA的局部結(jié)構(gòu)，需要亞納米厚度的絕緣膜。在向該目標(biāo)努力的工作中，提出了使用原子層沉積(ALD)在超薄絕緣Al2O3膜中形成納米孔的方法，這是實(shí)現(xiàn)對(duì)膜厚度的埃水平的控制的方法。使用聚焦的電子束在Al2O3膜中制造納米孔揭示了兩種有趣的現(xiàn)象，用量依賴的Al2O3向金屬Al的轉(zhuǎn)化，適用于直接將納米級(jí)電極“寫”進(jìn)孔中，以及受控的α和Y納米晶體結(jié)構(gòu)域的形成，使得能夠在所述孔/流體界面處進(jìn)行納米級(jí)的表面電荷工程?？紤]到這些參數(shù)對(duì)Ι/f噪音和DNA轉(zhuǎn)運(yùn)速率有影響，控制所述孔中材料的化學(xué)計(jì)量和表面電荷密度是重要的。有趣的是，相對(duì)于具有相似直徑的SiN孔，在Al2O3納米孔中觀察到更慢的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)，歸因于帶正電的Al2O3表面和帶負(fù)電的dsDNA之間的強(qiáng)靜電相互作用。從靜電或化學(xué)上增強(qiáng)這些相互作用可以進(jìn)一步幫助降低DNA轉(zhuǎn)運(yùn)速率，這是用于納米孔測(cè)序的先決條件。該基于ALD的技術(shù)的通用性還使得能夠:1)在多種其他的高k電介質(zhì)材料中形成膜和納米孔，所述材料包括TiO2和HfO2，其每個(gè)具有獨(dú)特的材料性質(zhì)，以及2)由于ALD方法的低溫性質(zhì)(通常<250°C)，直接將金屬觸點(diǎn)和石墨烯層整合到所述膜中。雖然這種方法已經(jīng)顯示出很大前景，但是制造亞納米厚度的堅(jiān)固的絕緣ALD膜已被證實(shí)是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樵诔”∧ぶ杏型ㄟ^小孔的離子電流泄漏。因此，形成亞納米厚度的絕緣膜可能需要新的方法。[0145]石墨烯:石墨烯，碳原子密集填充到二維的蜂窩晶格中形成的原子薄的薄片，其擁有驚人的機(jī)械、電和熱性質(zhì)。與ssDNA中核苷酸之間的0.32-0.52nm間隔相當(dāng)?shù)氖﹩螌雍穸?，使得該材料?duì)于電子DNA測(cè)序尤其具有吸引力。在2008年首次在懸浮石墨烯薄膜中制造單個(gè)納米孔和納米孔陣列的報(bào)告出現(xiàn)在DrndicIab實(shí)驗(yàn)室。隨后，Zettl小組的基于TEM的研究闡明了石墨烯中孔形成的動(dòng)力學(xué)以及原位的石墨烯邊緣穩(wěn)定性(鋸齒形結(jié)構(gòu)與扶手椅結(jié)構(gòu))。但是，直到最近僅證明了使用石墨烯納米孔檢測(cè)個(gè)體dsDNA分子。在獨(dú)立石開究中，Golovchenko(Harvard)、Dekker(Delft)和Drndic(UniversityofPennsylvania)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了基于電子束在懸浮的石墨烯薄膜中制造5-25nm直徑的納米孔，所述薄膜通過化學(xué)氣相沉積(CVD)或從石墨剝落來制備。在少至1-2個(gè)單層的石墨烯中形成了納米孔，膜在高離子強(qiáng)度溶液中展示出顯著的耐久性和絕緣性能。在單層薄的膜中孔的電導(dǎo)展示出一些獨(dú)特的趨勢(shì)。Harvard研究顯示,在單層薄的膜中孔電導(dǎo)與孔直徑(da)有線性比例，這與用厚的SiN膜中的孔通常觀察到的(1Λ2比例相反。提取約0.6nm的有效膜厚度(heff)，用于在石墨烯單層中形成納米孔。該結(jié)果與hrff—O的極限的理論相一致，其中最主要的電阻不是孔電阻本身(Ra)，而是接入電阻(Rsa歸因于從電極到納米孔的電解質(zhì)中的電位下降)，其中Rsa與成相反比例。相比之下，Delft研究顯示，石墨烯單層中納米孔的電導(dǎo)作為(1Λ2的函數(shù)成比例，這是吸引人的結(jié)果，其表明厚度不可忽略的圓筒狀納米孔幾何形狀(Ra>Re入)。這種da2的成比例的成因可能是由于為了減少DNA吸附而在所述石墨烯上引入了聚合物涂層(6-巰基己酸)。此外，Delft小組報(bào)告，在單個(gè)單層中形成的等直徑孔相對(duì)于在具有最高達(dá)8個(gè)單層厚度的膜中形成的孔有相似的電導(dǎo)值。8個(gè)單層厚度的膜的結(jié)果是似乎可信的，因?yàn)橐阎诙鄬邮┲行纬杉{米孔會(huì)誘發(fā)梯田效應(yīng)，其中石墨烯層的數(shù)量單調(diào)地在孔中心的方向上以放射狀減少，在沿著孔的邊緣具有僅為單層厚度的區(qū)域(圖17c)。最近，使用TEM成像分析確認(rèn)了該效應(yīng)，其也見于更早的研究中。可能證實(shí)梯田狀的納米孔體系結(jié)構(gòu)非常有用，因?yàn)橐韵聝蓚€(gè)原因:1)其可能緩解為了制造石墨烯單層納米孔而培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移大面積的單層所受的限制，和2)多層化的支持可能增加石墨烯納米孔傳感器的穩(wěn)定性和壽命。[0146]dsDNA移位穿過石墨烯孔誘導(dǎo)了離子電流的細(xì)微波動(dòng)，其標(biāo)記了折疊的和未折疊的DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)，這與SiN納米孔中DNA誘導(dǎo)的電流阻斷類似。范圍為IO-1OOnt/μs的移位速率對(duì)于個(gè)體核苷酸的電子測(cè)量來說太快。因此，Garaj使用計(jì)算分析探測(cè)了石墨烯單層納米孔的理論間隔分辨率和幾何分辨率。在厚度約0.6nm的2.4nm直徑的石墨烯孔中進(jìn)行的dsDNA的偽靜態(tài)模擬顯示出了約0.35nm的分辨率，這與個(gè)體DNA核苷酸的尺寸相同。這個(gè)令人興奮的結(jié)果表明，如果在石墨烯孔中DNA移位可被充分地減慢，即約lnt/ms，那么單核苷酸檢測(cè)在理論上是可行的，這潛在地有利于電子測(cè)序。但是，為了能夠?qū)崿F(xiàn)這種進(jìn)步，需要更好地理解DNA轉(zhuǎn)運(yùn)的定量方面。例如，仍然不清楚的是，為什么在正常條件下(鹽濃度、電壓)，多層石墨烯(3-15個(gè)單層)中的納米孔相對(duì)于單層石墨烯中的孔給出了更深的DNA誘導(dǎo)的電流阻斷。一個(gè)可能的解釋是之前提到的梯田效應(yīng)，但是需要對(duì)石墨烯納米孔結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和定量DNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行更詳細(xì)的研究。還存在許多涉及測(cè)序的基本問題。例如，不清楚的是，在存在熱動(dòng)力學(xué)波動(dòng)和電噪聲的情況下，單核苷酸的分辨率能否在實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)。此外，嘌呤和嘧啶中的化學(xué)相似性和結(jié)構(gòu)相似性可內(nèi)在地限制僅使用穿過裸的石墨烯孔的離子電流對(duì)個(gè)體核苷酸的鑒定?？赡鼙仨殞?duì)石墨烯孔進(jìn)行表面功能化，以增強(qiáng)核苷酸特異性，但是這種方式可能由于膜加厚而使分辨率有所犧牲。[0147]除DNA測(cè)序外的納米孔應(yīng)用。固態(tài)納米孔的更直接的應(yīng)用可能在醫(yī)學(xué)診斷中?；诩{米孔的診斷工具可以:(1)從微小樣品體積中檢測(cè)極低濃度的靶分子(可能是患者血清中從腫瘤細(xì)胞流出的DNA);(2)同時(shí)篩選多組生物標(biāo)記/基因(在診斷、監(jiān)測(cè)進(jìn)展和預(yù)后中很重要)；(3)以相對(duì)低的成本提供快速分析；和(4)除去麻煩的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化步驟例如PCR、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和Sanger測(cè)序。小RNA(miRNA)表達(dá)作譜是固態(tài)納米孔技術(shù)可以勝出的一種應(yīng)用。檢測(cè)并精確定量這些癌癥生物標(biāo)記將可能具有重要的臨床含義，有助于疾病診斷、分期、進(jìn)展、預(yù)后和治療反應(yīng)。Wanunuetal.最近證明了基于納米孔的方法用于檢測(cè)從細(xì)胞組織富集的特異性小RNA序列，其靈敏度超過了常規(guī)的微陣列技術(shù)(圖19a)。另一個(gè)令人興奮的前景是使用固態(tài)納米孔，用于表觀遺傳學(xué)分析，更具體地用于檢測(cè)異常的DNA甲基化，其為致癌作用中早期頻繁觀察到的事件。特定基因的啟動(dòng)子序列中的低甲基化和超甲基化在許多腫瘤類型中作為強(qiáng)烈的癌癥生物標(biāo)記(例如在超過90%的前列腺癌病例中觀察到GSTPl啟動(dòng)子超甲基化)以及作為疾病嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)移可能性的指示。Timp和Drndic實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明了基于納米孔的甲基化分析的初步進(jìn)展，其涉及甲基化的和羥甲基化的DNA的檢測(cè)。[0148]涉及檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的遺傳分析是適合于納米孔的另一種重要的診斷應(yīng)用。SNP和點(diǎn)突變與多種孟德爾疾病例如囊性纖維化病和亨廷頓氏病以及更多復(fù)雜疾病表型有聯(lián)系。在原理循證實(shí)驗(yàn)中，Zhao及其同事證明了使用約2nm直徑的SiN納米孔靈敏地檢測(cè)SNP。使用納米孔作為局部的力執(zhí)行器，可以辨別DNA結(jié)合蛋白和其同源序列的結(jié)合能相對(duì)于SNP序列的結(jié)合能(圖19b)。這種方法可被擴(kuò)展至篩選多種其他DNA結(jié)合蛋白(包括轉(zhuǎn)錄因子、核酸酶和組蛋白)的同源序列中的突變。使用固態(tài)納米孔的Meller實(shí)驗(yàn)室活躍于從事另外的方向；病毒和人病原體的快速基因分型。使用一種涉及引入高度侵入性的肽核酸(PNA)探針的創(chuàng)新方法來以高親和力和序列特異性標(biāo)記靶基因組，在分子中形成了局部膨脹(P-環(huán))。該標(biāo)記分子的移位產(chǎn)生了第二DNA-PNA阻斷水平(圖19c)，這有效地用條形碼顯示了靶基因組。在需要進(jìn)一步的研究來確定該技術(shù)最終的空間分辨率的同時(shí)，這種方法潛在地使得能夠快速、精確且無需擴(kuò)增地鑒定小的5-10kb的病毒基因組，包括丙型肝炎病毒、登革熱病毒和西尼羅河病毒。[0149]雜合的生物/固態(tài)納米孔。目前，固態(tài)納米孔技術(shù)的主要缺點(diǎn)是不能從化學(xué)上區(qū)分具有相同的近似尺寸的分析物?？梢越?jīng)結(jié)合特異性的識(shí)別序列和受體，本質(zhì)上形成雜合結(jié)構(gòu)，來對(duì)所述孔進(jìn)行表面修飾，以克服這種化學(xué)特異性的不足?；瘜W(xué)上靈敏的納米孔可能在測(cè)序應(yīng)用中對(duì)獨(dú)特地鑒定核苷酸是必需的，或者對(duì)在診斷應(yīng)用中對(duì)區(qū)分和定量靶蛋白是必需的。最近Siwy證明了化學(xué)品的功能化及其對(duì)聚合物納米孔的電性能的影響。表面功能化還可用于引入DNA序列特異性。在涉及DNA發(fā)夾功能化的SiO2納米孔的研究中觀察到了，相對(duì)于單堿基錯(cuò)配的探針(1MM)，完美互補(bǔ)(PC)的ssDNA的通過有更高通量和更短的移位時(shí)間，這是高度靈敏的檢測(cè)SNP的策略(圖19a)。此外，在SiN中功能化的仿生納米孔已經(jīng)使得能夠在單分子水平研究核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象。改變孔表面的化學(xué)還可有助于蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)和辨別。Mayer實(shí)驗(yàn)室因?yàn)閺睦ハx觸角的脂質(zhì)包覆的嗅覺感受器得到靈感，最近證明了使用流體脂雙層包覆的SiN納米孔鑒定蛋白質(zhì)(圖1%)。在所述雙層中包括移動(dòng)的配體，將化學(xué)特異性引入了所述孔，減慢了靶蛋白的移位，防止孔的堵塞并消除了非特異性結(jié)合，從而解決了固態(tài)納米孔固有的許多問題。該性質(zhì)的脂雙層包覆的納米孔體系結(jié)構(gòu)(在SiN或Al2O3中)還使得能夠以后與生物納米孔整合，以形成堅(jiān)固的納米孔測(cè)序元件。[0150]最近，Dekker及其同事通過將基因工程改造的α-溶血素直接插入到2.4-3.6nm直徑的SiN納米孔，而使雜合生物固態(tài)納米孔的理念前進(jìn)了一步。設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單但巧妙的策略以控制固態(tài)孔中α-溶血素的定向。如圖19c所示，通過以化學(xué)方式將長(zhǎng)的dsDNA尾連接到所述蛋白質(zhì)孔，可以通過電泳引導(dǎo)該工程化的α-溶血素通道進(jìn)入SiN納米孔，以形成同軸排列的結(jié)構(gòu)。雜合孔的電導(dǎo)和ssDNA移位事件持續(xù)時(shí)間與嵌入脂雙層中的α-溶血素具有良好的一致性。有趣的是，穿過雜合孔的ssDNA阻斷幅度顯著低于α-溶血素-雙層系統(tǒng)，這歸因于當(dāng)插入到固態(tài)孔時(shí)所述生物孔的變形以及其本體周圍的泄漏電流。同樣地，在雜合結(jié)構(gòu)中觀察到了電噪聲的增加。這些參數(shù)可能需要優(yōu)化，以比得上氨基環(huán)糊精修飾的α-溶血素的單核苷酸靈敏性。然而，該雜合的體系結(jié)構(gòu)通過將α-溶血素或MspA的單核苷酸識(shí)別能力與單獨(dú)尋址的固態(tài)納米孔的晶片規(guī)模的陣列偶聯(lián)，開創(chuàng)了令人興奮的高通量測(cè)序的可能性。[0151]本文描述的進(jìn)展表明，在將來的幾年內(nèi)納米孔在醫(yī)學(xué)診斷和DNA測(cè)序中將可能起越來越大的作用。隨著用于新的檢測(cè)和測(cè)序DNA分子的光學(xué)和電子方法的出現(xiàn)，所述方法包括在納米區(qū)室的陣列中通過合成測(cè)序的方法進(jìn)行單分子的漸逝場(chǎng)檢測(cè)(PacificBiosciences)、在自組裝的DNA納米陣列上通過連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序(CompleteGenomics)以及在在硅場(chǎng)效晶體管上在通過合成測(cè)序的過程中檢測(cè)從多個(gè)聚合酶-模板反應(yīng)中釋放的H+離子(1nTorrent),使用生物或固態(tài)納米孔直接“飛速地”讀取單分子的測(cè)序結(jié)果的目標(biāo)仍然是有高度吸引力的重大挑戰(zhàn)。以快速且經(jīng)濟(jì)的方式在未標(biāo)記的ssDNA分子上進(jìn)行長(zhǎng)堿基讀取的令人興奮的可能性可以改革基因組學(xué)和個(gè)性化醫(yī)學(xué)。這種美好前景繼續(xù)驅(qū)動(dòng)在學(xué)術(shù)和商業(yè)環(huán)境中的創(chuàng)新，包括來自NIH的大規(guī)模投資以及來自公司(包括Roche/IBM、OxfordNanopore和NABsys)的私營部門投資。目前的趨勢(shì)表明，已經(jīng)解決了阻礙測(cè)序中使用生物納米孔的顯著障礙(高移位速率、缺乏核苷酸特異性)。類似地，如果DNA移位穿過固態(tài)納米孔可被減慢至約3人/ms(單核苷酸在I毫秒中穿過傳感器區(qū)域移動(dòng)的長(zhǎng)度，此時(shí)空間分辨率為約3A)并且如果可以用電子特征獨(dú)特地鑒定核苷酸，那么可在少于20分鐘內(nèi)對(duì)一百萬堿基長(zhǎng)的分子進(jìn)行測(cè)序。將該技術(shù)擴(kuò)大為平行運(yùn)行的100000個(gè)單獨(dú)尋址的納米孔陣列，使得能夠在少于I小時(shí)內(nèi)以50倍的覆蓋度對(duì)30億bp的人基因組進(jìn)行測(cè)序。[0152]為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，可能需要在納米孔界面添加功能性的新的體系結(jié)構(gòu)，例如本文提供的電選通的納米孔和納米通道，整合單壁的碳納米管，以及嵌入納米孔中的石墨烯納米帶和納米間隙。IBM使用DNA納米孔晶體管體系結(jié)構(gòu)測(cè)序的方法同樣令人感興趣。使用分子動(dòng)力學(xué)，IBM小組證明了，ssDNA在使用的跨越金屬層施加的交替電場(chǎng)下受控地一個(gè)堿基一個(gè)堿基地以棘輪方式步進(jìn)穿過在多層金屬氧化物膜中形成的納米孔。但是，還沒有見到該結(jié)果的實(shí)驗(yàn)證明。最近使用掃描隧道顯微鏡的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展也是令人興奮的，并表明使用電子隧穿(與A、C、G、T的HOMO-LUMO間隙中的差異有關(guān)的核苷酸特異性的隧穿電流)鑒定核苷酸以及對(duì)DNA低聚物進(jìn)行部分測(cè)序的可能性。使用納米制造的金屬間隙連接來測(cè)量核苷酸特異性的電子隧穿電流是尤其吸引人的，因?yàn)槿绻蓪⒃撔再|(zhì)的隧道檢測(cè)器嵌入納米孔中并且DNA可被充分地減慢，那么固態(tài)納米孔測(cè)序的目標(biāo)就可實(shí)現(xiàn)。用于測(cè)序的示例性納米孔體系結(jié)構(gòu)在圖20示出，與嵌入的石墨烯層的電接觸604用于經(jīng)電連接的電力源和檢測(cè)器測(cè)量橫向電流(圖20a)。圖20b示出了納米帶石墨烯層132和嵌入的門極602(為嵌入的石墨稀層)。[0153]目前正在進(jìn)行制造納米間隙-納米孔隧道檢測(cè)器的工作，但是考慮到所述納米孔內(nèi)堿基的熱波動(dòng)(在ssDNA中的個(gè)體核苷酸或連續(xù)核苷酸)以及電噪聲，通向測(cè)序的道路是不平凡的。因此，可能需要一種包括每個(gè)核苷酸/分子的許多重復(fù)采樣事件的統(tǒng)計(jì)方法，以獲得序列信息。另外，因?yàn)樗泶╇娏饕灾笖?shù)方式依賴于勢(shì)魚(barrier)寬度和高度(基于有效的隧道距離和分子定向)，所以兩點(diǎn)測(cè)量可能內(nèi)在地僅提供受限的信息?？赡苄枰愃朴?點(diǎn)探針的測(cè)量裝置，但是以亞納米精度可靠地制造這種結(jié)構(gòu)仍然是困難的工作。還應(yīng)注意至IJ，對(duì)于特定應(yīng)用，可能不一定需要獨(dú)特地鑒定全部4個(gè)堿基。研究者已經(jīng)使用核苷酸序列的二進(jìn)制轉(zhuǎn)換(A/T=0，G/C=l)成功地在基因組中為短DNA和RNA片段作圖，用于標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)和基因組改變的鑒定。因此，即使用納米孔以dsDNA中的核苷酸對(duì)的二進(jìn)制鑒定來直接進(jìn)行測(cè)序也可具有重大的預(yù)后和診斷價(jià)值。[0154]總之，在過去數(shù)年中，對(duì)于無需標(biāo)記的“飛速地”對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序來說，在生物納米孔和固態(tài)納米孔領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展。毋庸置疑，納米孔在朝向負(fù)擔(dān)得起且個(gè)性化的DNA測(cè)序的比賽中將是第三代測(cè)序技術(shù)的重要的促成者。[0155]圖21A、21B和22中提供了一些裝置和方法的示例性實(shí)施方案。參照?qǐng)D21B，膜100包含由多層石墨烯層140形成的堆疊130,石墨烯層140彼此被電介質(zhì)層150隔開。第一表面110形成第一流體區(qū)室200的一個(gè)表面，第二表面120形成第二流體區(qū)室300的一個(gè)表面。納米孔160穿過膜100流體性地連接第一和第二流體區(qū)室200和300。電力供應(yīng)400和檢測(cè)器500用于為系統(tǒng)供電和測(cè)量納米孔中的電參數(shù)，包括獨(dú)立地有嵌入的門極602經(jīng)門極600連接到電力供應(yīng)和檢測(cè)器。源極700和漏極800可以為所述第一和第二流體區(qū)室相對(duì)于彼此加偏壓。電導(dǎo)線410可以連接各個(gè)電組件。[0156]參照?qǐng)D22，在納米孔中通過彼此相對(duì)的電極對(duì)512和514形成了隧道檢測(cè)器510，其定向?yàn)?20的方向，該方向與納米孔軸向162橫切或正交，如虛線箭頭所指示。在一個(gè)方面，電極對(duì)512和514從石墨烯層140形成。門極600例如Ti/Au板被連接到隧道檢測(cè)器，以提供與隧道檢測(cè)器的電接觸，所述隧道檢測(cè)器與與其他層電隔離的嵌入石墨烯層通信。以這種方式，經(jīng)監(jiān)測(cè)反映生物分子參數(shù)的電參數(shù)，可表征與納米孔相互作用或從第一流體區(qū)室200至第二流體區(qū)室300轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)過納米孔的生物分子。為了清晰起見，圖22沒有按比例繪制，因?yàn)橄鄬?duì)的電極對(duì)可被定位為這樣，即使得單鏈DNA以一個(gè)堿基一個(gè)堿基移位的方式通過尖端之間，使得所述隧道檢測(cè)器能夠測(cè)量所述生物分子中個(gè)體堿基的電參數(shù)，從而提供所述生物分子的序列信息(還見于圖20(a))。[0157]參考文獻(xiàn)[0158]Thomas,P.D.&Kejariwal,A.Codingsingle-nucleotidepolymorphismsassociatedwithcomplexvs.Mendeliandisease:Evolutionaryevidencefordifferencesinmoleculareffects.Proc.NatlAcad.Sc1.USAlOlj15398-15403(2004).[0159]TheInternationalHapMapjc.Ahaplotypemapofthehumangenome.Nature437,1299-1320(2005).[0160]MardisjE.R.Next-GenerationDNASequencingMethods.Annu.Rev.Genom.HumanGenet.9，387-402(2008).[0161]MetzkerjM.L.Sequencingtechnologies-thenextgenerationNat.Rev.Genet.11，31-46(2010).[0162]http://WWW.genome,gov/12513210.[0163]Coulter,W.H.Meansforcountingparticlessuspendedinafluid.USpatentn0.2656508(1953).[0164]Church，G.，DeamerjD.W.，Branton，D.，BaldarelIi,R.&Kasianowicz,J.Characterizationofindividualpolymermoleculesbasedonmonomer-1nterfaceinteractions.USpatentn0.5，795，782(1995).[0165]DeamerjD.W.&Branton，D.CharacterizationofNucleicAcidsbyNanoporeAnalysis.Acc.Chem.Res.35，817-825(2002).[0166]RheejM.&Burns,M.A.Nanoporesequencingtechnology:researchtrendsandapplications.TrendsBiotechnol.24，580-586(2006).[0167]DekkerjC.Solid-statenanopores.Nat.Nanotechnol.2，20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è)要素、一個(gè)限制因素或多個(gè)限制因素的情況下實(shí)施。[0274]表1.納米孔測(cè)序技術(shù)和潛在的挑戰(zhàn):[0275]【權(quán)利要求】1.一種表征生物分子參數(shù)的方法，所述方法包括如下步驟:在包含導(dǎo)體-電介質(zhì)堆疊的膜中提供納米孔，其中所述膜將第一流體區(qū)室與第二流體區(qū)室分開，所述納米孔流動(dòng)性地連接所述第一和所述第二流體區(qū)室，所述導(dǎo)體包含石墨烯或二硫化鑰(MoS2)、摻雜硅、硅烯或超薄金屬的原子薄的導(dǎo)電層；提供生物分子至所述第一流體區(qū)室；跨越所述膜施加電場(chǎng)；在所述施加的電場(chǎng)下驅(qū)動(dòng)所述生物分子穿過所述納米孔至所述第二流體區(qū)室；和當(dāng)所述生物分子經(jīng)過所述納米孔時(shí)，跨越所述膜或沿著由所述膜形成的平面監(jiān)測(cè)電參數(shù)，從而表征所述生物分子參數(shù)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子參數(shù)選自:多核苷酸序列；修飾核苷酸的存在；多核苷酸甲基化狀態(tài)；多核苷酸羥甲基化狀態(tài)；與多核苷酸序列上一個(gè)或多個(gè)甲基化或羥甲基化的位點(diǎn)結(jié)合的甲基依賴的或羥甲基依賴的結(jié)合蛋白；蛋白質(zhì)-多核苷酸結(jié)合事件的存在；多肽序列；生物分子二級(jí)結(jié)構(gòu)；和氨基酸序列。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述多核苷酸包含有機(jī)體的或合成的核酸。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述導(dǎo)體-電介質(zhì)堆疊包含:多個(gè)石墨烯層，其中相鄰石墨烯層被電介質(zhì)層隔開。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述石墨烯層的一個(gè)或多個(gè)包含石墨烯微米帶、石墨烯納米帶或石墨烯納米間隙，所述納米孔以與所述石墨烯微米帶、石墨烯納米帶或石墨烯納米間隙的縱向橫切的方向橫貫穿過所述石墨烯微米帶、石墨烯納米帶或石墨烯納米間隙，所述方法還包括:在所述生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔過程中，沿著所述石墨烯微米帶或石墨烯納米帶或跨越所述石墨烯納米間隙測(cè)量電位或橫向電流的時(shí)間過程，從而表征所述生物分子的序列、組成、通量、持續(xù)時(shí)間或長(zhǎng)度；并且其中所述測(cè)量是在移位生物分子的不同位置的多個(gè)同時(shí)測(cè)量。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法,還包括獨(dú)立地為所述導(dǎo)電層的一個(gè)或多個(gè)在電學(xué)上加偏壓，以提供所述納米孔的電選通。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述加偏壓通過將電極與嵌入所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊中的個(gè)體石墨烯層在電學(xué)上連接來進(jìn)行，并且所述加偏壓改變了所述納米孔中由跨越所述膜施加的電場(chǎng)生成的電場(chǎng)。8.權(quán)利要求1-5或7的任一項(xiàng)的方法，其中所述電介質(zhì)層包含氧化鋁、氧化鉭、氧化鈦、二氧化硅、氧化鉿、氧化鋯、氮化硼、氮化硅、它們的納米薄片或其任意組合。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述電參數(shù)選自以下的一個(gè)或多個(gè):穿過所述納米孔的電流或電流阻斷；跨越所述納米孔的隧穿電流；穿過橫向電極的電化電流；電導(dǎo)；電阻；阻抗；電位；所述生物分子穿過所述納米孔的移位時(shí)間；和生物分子通量或移位頻率。10.權(quán)利要求1的方法，還包括通過將化學(xué)部分結(jié)合到暴露的納米孔石墨烯邊緣，而使所述納米孔中暴露的石墨烯邊緣功能化的步驟；其中所述化學(xué)部分對(duì)所述生物分子的一部分具有親和力，并且當(dāng)所述生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔時(shí)，與所述生物分子的部分相互作用的化學(xué)部分改變了被監(jiān)測(cè)的電參數(shù)。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述化學(xué)部分選自以下:具有可與所述生物分子中的序列結(jié)合的序列的蛋白質(zhì)、多肽和多核苷酸；和對(duì)多核苷酸生物分子中的特異性核苷酸具有結(jié)合親和力的化學(xué)構(gòu)建體。12.權(quán)利要求11的方法，其中將所述生物分子中的特異性核苷酸用重原子、化學(xué)官能團(tuán)或標(biāo)記物標(biāo)記，以增強(qiáng)所述化學(xué)部分和特異性核苷酸之間的親和力。13.權(quán)利要求1的方法，還包括將具有多核苷酸序列的生物分子消化為多個(gè)較小序列的步驟，該步驟通過使所述生物分子與錨定到所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊的外切核酸酶接觸，從而通過消化進(jìn)行測(cè)序。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述多個(gè)較小序列的至少一部分對(duì)應(yīng)于個(gè)體堿基。15.權(quán)利要求1的方法，還包括以下步驟:通過向正轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔的生物分子添加核苷酸來合成多核苷酸序列，從而通過合成進(jìn)行測(cè)序。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述通過合成測(cè)序是通過錨定到所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊的聚合酶，所添加的核苷酸和試劑來自所述第一或第二流體區(qū)室的核苷酸源。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述通過合成測(cè)序還包括在向正轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔的生物分子添加核苷酸的過程中檢測(cè)釋放的H+或焦磷酸的步驟。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述檢測(cè)釋放的H+或焦磷酸是通過測(cè)量納米孔電流的改變。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述納米孔是包含具有內(nèi)部通道的蛋白質(zhì)復(fù)合體的生物納米孔，所述內(nèi)部通道為所述納米孔，所述蛋白質(zhì)選自=DNA結(jié)合蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、核酸酶和組蛋白溶血素；恥垢分枝桿菌孔蛋白A和GP10。20.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中最上層的石墨烯層與所述第一和/或第二流體區(qū)室中的流體有流體接觸和電接觸，所述電參數(shù)來自當(dāng)所述生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述孔時(shí)通過所述石墨烯層與所述第一和/或第二流體區(qū)室中的流體進(jìn)行流體接觸和電接觸獲得的電化學(xué)測(cè)量結(jié)果。21.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述電參數(shù)是通過與所述流體區(qū)室和納米孔中的流體電絕緣的石墨烯層通過場(chǎng)效應(yīng)選通或場(chǎng)效應(yīng)感測(cè)來測(cè)量。22.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子為雙鏈多核苷酸序列，所述方法還包括以下步驟:解開所述雙鏈多核苷酸序列和驅(qū)動(dòng)所述雙鏈多核苷酸序列的單鏈穿過所述納米孔，從而對(duì)所述生物分子進(jìn)行測(cè)序。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述解鏈?zhǔn)峭ㄟ^錨定到所述石墨烯-電介質(zhì)堆疊的解旋酶。24.權(quán)利要求4的方法，其中埋入的石墨烯層測(cè)量穿過另外的石墨烯層的電化電流。25.一種用于表征生物分子參數(shù)的裝置，所述裝置包含:膜，其包含:第一表面和與所述第一表面相對(duì)的第二表面，其中所述膜使包含所述第一表面的第一流體區(qū)室與包含所述第二表面的第二流體區(qū)室隔開；位于所述第一表面和所述第二表面之間的石墨烯/電介質(zhì)/石墨烯/電介質(zhì)堆疊；和穿過所述流體連接所述第一區(qū)室和所述第二區(qū)室的所述膜的納米孔；與所述膜有電接觸以提供所述第一流體區(qū)室和所述第二流體區(qū)室之間的電位差的電力供應(yīng)；和當(dāng)生物分子在施加的所述第一和第二流體區(qū)室之間的電位差下轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔時(shí)檢測(cè)穿過所述納米孔的電流的檢測(cè)器。26.權(quán)利要求25的裝置，還包括一個(gè)或多個(gè)門極，其中所述一個(gè)或多個(gè)門極中的每個(gè)為所述堆疊中的石墨烯層。27.權(quán)利要求26的裝置，其中所述石墨烯層在所述納米孔處的厚度小于或等于3nm，并且所述電接觸包含與所述石墨烯層有電接觸的金屬板，其中所述金屬板與所述第一和第二流體區(qū)室的任一個(gè)電隔離。28.權(quán)利要求27的裝置，其中所述門極在電學(xué)上與由所述電力供應(yīng)供電的源極連接。29.權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)的裝置，其中所述石墨烯層的一個(gè)或多個(gè)包含納米帶，所述納米孔以與所述納米帶縱軸橫切的方向穿過所述納米帶。30.權(quán)利要求29的裝置，其中所述納米帶還包含電觸點(diǎn)，用于在生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔過程中測(cè)量沿著所述納米帶的橫向電流，另一所述石墨烯層與門極連接，以在電學(xué)上為所述石墨烯層加偏壓。31.權(quán)利要求29的裝置，其中納米孔的直徑大于所述納米帶寬度的5%，或選自所述納米帶寬度的5%-95%的范圍內(nèi)。32.權(quán)利要求25的裝置，其中所述檢測(cè)器為隧道檢測(cè)器，其包含一對(duì)彼此相對(duì)的石墨烯電極，并以與所述生物分子在納米孔中的轉(zhuǎn)運(yùn)方向橫切的方向位于所述納米孔的中心，其中所述生物分子在所述電極對(duì)之間轉(zhuǎn)運(yùn)。33.一種制造用于表征生物分子參數(shù)的包含納米孔的膜的方法，所述方法包括如下步驟:在獨(dú)立式的電介質(zhì)膜上形成通道；經(jīng)化學(xué)氣相沉積生長(zhǎng)石墨烯層；使所述石墨烯層的一部分轉(zhuǎn)移到所述獨(dú)立式的電介質(zhì)膜上；在所述轉(zhuǎn)移的石墨烯層上形成電介質(zhì)層；重復(fù)所述石墨烯層步驟以生成第二石墨烯層；重復(fù)所述電介質(zhì)層形成步驟以生成第二電介質(zhì)層；形成從所述膜的第一表面延伸至所述膜的第二表面的納米孔，其中所述納米孔橫貫每個(gè)所述石墨烯層和電介質(zhì)層，從而制造在石墨烯/電介質(zhì)/石墨烯/電介質(zhì)堆疊中包含納米孔的膜。34.權(quán)利要求33的方法，還包括獨(dú)立地在電學(xué)上使所述第一石墨烯層、所述第二石墨烯層或所述第一石墨烯層和所述第二石墨烯層兩者與電觸點(diǎn)接觸以提供電選通的納米孔。35.權(quán)利要求33的方法，其中重復(fù)所述重復(fù)步驟以生成三個(gè)或更多的石墨烯層，相鄰石墨烯層被電介質(zhì)層隔開。36.權(quán)利要求35的方法，還包括在電學(xué)上使一個(gè)或多個(gè)所述石墨烯層與電觸點(diǎn)接觸以提供電選通的納米孔。37.權(quán)利要求33的方法，還包括將門極嵌入所述納米孔膜中以改變所述納米孔中及其相鄰的局部電場(chǎng)。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述嵌入的門極包含所述膜的任何石墨烯層。39.權(quán)利要求33的方法，其中所述電介質(zhì)層包含通過原子層沉積而沉積的電介質(zhì)。40.權(quán)利要求33或39的方法，其中所述電介質(zhì)層包含氧化鋁、氧化鉭、氧化鉿、氧化鋯、二氧化硅或氮化硅或其組合。41.權(quán)利要求33的方法，還包括在惠斯通電橋配置中在電學(xué)上連接所述石墨烯層，用于測(cè)量所述納米孔中的電參數(shù)，其中所述電參數(shù)為以下的一個(gè)或多個(gè):差分阻抗、隧穿電流、電阻、電容、電流或電壓。42.權(quán)利要求33的方法，還包括在電學(xué)上用AC電壓信號(hào)為一個(gè)或多個(gè)石墨烯層加偏壓。43.權(quán)利要求42的方法，還包括監(jiān)測(cè)中心石墨烯層和外層石墨烯層之間的阻抗，或測(cè)量石墨烯層之間的阻抗電流或電壓。44.一種鑒定、表征或定量生物分子的甲基化或羥甲基化狀態(tài)的方法，所述方法包括以下步驟:在隔開第一流體區(qū)室與第二流體區(qū)室的懸浮的膜中提供納米孔，所述膜包含氧化鋁、氧化鉭、氧化鈦、二氧化硅、氧化鉿、氧化鋯、氮化硼、氮化硅、石墨烯或它們的納米薄片，或其任意組合；使特異性的蛋白質(zhì)、寡核苷酸或化學(xué)標(biāo)記物與靶生物分子上的甲基化或羥甲基化位點(diǎn)結(jié)合；和跨越所述膜從所述第一流體區(qū)室到第二流體區(qū)室施加電場(chǎng)，以驅(qū)動(dòng)所述生物分子穿過所述納米孔。45.權(quán)利要求44的方法，其中通過監(jiān)測(cè)離子電流、隧穿電流、電壓、電導(dǎo)或阻抗的改變來檢測(cè)所述生物分子上的所述結(jié)合的蛋白質(zhì)或標(biāo)記物。46.權(quán)利要求44的方法，還包括在所述生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述納米孔時(shí)相繼地從所述生物分子剪切結(jié)合的蛋白質(zhì)或標(biāo)記物的步驟?！疚臋n編號(hào)】H01L29/66GK104011866SQ201280046866【公開日】2014年8月27日申請(qǐng)日期:2012年7月26日優(yōu)先權(quán)日:2011年7月27日【發(fā)明者】R·貝希爾,B·M·文卡特桑申請(qǐng)人:伊利諾伊大學(xué)評(píng)議會(huì)