一種用于膀胱癌的檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種用于膀胱癌的檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌是中國泌尿生殖系最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率仍呈上升趨勢。早 期診斷患者的預(yù)后良好，術(shù)后5年生存率可達(dá)94%。
[0003]膀胱癌的診斷主要依賴膀胱鏡檢查和尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查。膀胱鏡檢是膀胱癌診 斷的主要手段，但侵入性檢查導(dǎo)致患者痛苦大，依從性差，且費(fèi)用較高，可發(fā)生尿道感染、出 血等并發(fā)癥，約有10%的病灶被漏診，且其診斷原位癌的敏感度很低。尿細(xì)胞學(xué)是膀胱癌診 斷和術(shù)后隨診的主要方法之一，但檢查結(jié)果回報(bào)慢，且受檢查員的主觀影響大，其診斷膀胱 癌敏感度僅為35%，易產(chǎn)生假陽性，據(jù)推測，尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查會漏診約60%的高級別 膀胱癌。
[0004]國內(nèi)外很多研究致力于尋找更理想的膀胱癌早期診斷標(biāo)志物，以期減少膀胱鏡的 使用，并補(bǔ)充、替代尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查，以提高診斷準(zhǔn)確性，協(xié)助疾病風(fēng)險(xiǎn)評估，監(jiān)測腫瘤 的惡性程度，預(yù)測腫瘤進(jìn)展，使膀胱癌的診斷更為準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)。
[0005] 目前發(fā)現(xiàn)的主要膀胱癌腫瘤標(biāo)志物包括BAT、NMP22、FDP、CK、EpCAM等。
[0006] BAT(膀胱腫瘤抗原）又被稱為補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白，對膀胱腫瘤診斷的準(zhǔn)確率中 等，易隨尿液狀態(tài)的改變而出現(xiàn)假陽性，如濃縮尿、血尿、行侵入性檢查及經(jīng)BCG治療后。還 不能代替尿細(xì)胞學(xué)檢查，也不能單獨(dú)應(yīng)用于膀胱癌診斷。
[0007] NMP22(核基質(zhì)蛋白22)可用于膀胱癌的早期篩查，但假陽性率較高，泌尿系統(tǒng)感 染、結(jié)石、前列腺增生、放療、BCG治療、泌尿系腔內(nèi)器械操作等均會增加NMP22的假陽性率， 減弱了NMP22的臨床實(shí)用性。
[0008] FDP(纖維蛋白降解產(chǎn)物），膀胱癌的臨床分期越高，尿FDP的濃度越高，尿FDP水 平檢測對判斷膀胱癌的復(fù)發(fā)具有參考價(jià)值，可以用于膀胱癌的診斷及是否復(fù)發(fā)的判斷。高 分級的腫瘤更易引起FDP的漏檢，所以FDP對高分級的腫瘤預(yù)測價(jià)值更好。
[0009]CK(細(xì)胞角蛋白），與膀胱癌診斷、檢測復(fù)發(fā)及預(yù)后關(guān)系最相關(guān)的主要有CK19、 CK20,需通過外周血檢測，可監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。
[0010] EpCAM(Epithelialcelladhesionmolecule，上皮細(xì)胞黏附分子），膀胱癌患者 EpCAM含量與正常對照組相比明顯升高，且EpCAM含量的升高對于分級為3級及以上和T2+ 膀胱癌具有特異性。
[0011] 以上膀胱癌腫瘤標(biāo)記物中，通過對EpCAM蛋白進(jìn)行檢測，不僅可以實(shí)現(xiàn)膀胱癌的 快速靈敏診斷，而且針對EpCAM蛋白檢測，可以檢測膀胱癌的侵略性水平，對患者的診斷和 病情風(fēng)險(xiǎn)分級具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0012] 本實(shí)用新型需要解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是：現(xiàn)有的用于膀胱癌檢測的試劑盒，只 用于檢測是否患有癌癥，無法確定癌癥侵略性水平，而且檢測靈敏度和特異性低。
[0013] 為了解決上述問題，本實(shí)用新型提供了如下技術(shù)方案：
[0014] 本實(shí)用新型提供了一種用于膀胱癌的檢測試劑盒，包括設(shè)有凹槽的盒體1，其特征 在于：所述盒體1內(nèi)設(shè)置有酶標(biāo)板2和試劑瓶3;
[0015] 所述酶標(biāo)板2包括包被有抗EpCAM抗體的反應(yīng)槽21;
[0016] 所述試劑瓶3包括酶標(biāo)瓶、抗EpCAM標(biāo)記抗體瓶。
[0017] 優(yōu)選的，所述酶標(biāo)瓶為辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素酶標(biāo)瓶。
[0018] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)槽的數(shù)量為96或48個(gè)。
[0019] 優(yōu)選的，所述試劑瓶3還包括標(biāo)準(zhǔn)品瓶、稀釋液瓶、洗滌液瓶、底物液瓶和終止液 瓶。
[0020] 優(yōu)選的，所述底物液瓶包括顯色液A瓶和顯色液B瓶。
[0021] 優(yōu)選的，所述酶標(biāo)瓶：抗EpCAM標(biāo)記抗體瓶：所述稀釋液瓶：洗滌液瓶：終止液瓶： 顯色液A瓶：顯色液B瓶：標(biāo)準(zhǔn)品瓶的容積比為：5-10:5-10:10-20:30-50:5-10:5-10:5-10 :1-2〇
[0022] 優(yōu)選的，所述酶標(biāo)瓶的容積為5-10ml、抗EpCAM標(biāo)記抗體瓶的容積為5-10ml、所 述稀釋液瓶的容積為10_20ml、所述洗滌液瓶的容積為30-50ml、所述終止液瓶的容積為 5-10ml、所述顯色液A瓶的容積為5-10ml、所述顯色液B瓶的容積為5-10ml、所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶 的容積為l_2ml。
[0023] 本試劑盒的檢測原理為：采用抗體-抗原-抗體雙抗體夾心法對膀胱癌的腫瘤標(biāo) 記物EpCAM蛋白進(jìn)行檢測，檢測相抗體經(jīng)生物素（biotin)標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記的抗體 先后加入酶標(biāo)板的反應(yīng)槽反應(yīng)后，采用PBST洗滌。隨后加入辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的 鏈霉親和素反應(yīng)；經(jīng)過PBST的徹底洗滌后用底物3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB)顯色。 TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，其顏色的 深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān)。
[0024] 其中，所述酶標(biāo)板、試劑瓶的數(shù)量和容積不受限制，可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整。
[0025] 采用不同濃度的EpCAM抗體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量測定，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢 測的結(jié)果，進(jìn)行線性范圍的計(jì)算得到檢測范圍，EpCAM的檢測范圍為25pg/ml~1000pg/ml。 選用不含EpCAM的空白樣本，測定均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算EpCAM的檢測限為lpg/ml。
[0026] 本實(shí)用新型的有益效果是：
[0027] (1)本試劑盒通過檢測結(jié)果可以判斷癌癥侵略性水平，即惡性程度，指導(dǎo)醫(yī)生進(jìn)行 檢查和治療，有助于調(diào)整和加快患者治療。
[0028] (2)本試劑盒靈敏度高，早期診斷不漏診，防止治療延誤，可以用于對新發(fā)患者進(jìn) 行檢測，也可以用于對復(fù)發(fā)患者進(jìn)行檢測。
[0029] (3)使用尿液作為檢測標(biāo)本，具有采集方便，操作無創(chuàng)，采集的標(biāo)本量大，易獲得對 照人群的標(biāo)本等優(yōu)勢。
[0030] (4)酶聯(lián)免疫法技術(shù)操作簡便，結(jié)果回報(bào)快，費(fèi)用低。
[0031]下面結(jié)合附圖和各個(gè)【具體實(shí)施方式】，對本實(shí)用新型及其有益技術(shù)效果進(jìn)行詳細(xì)說 明。
【附圖說明】
[0032]圖1為實(shí)施例一的用于膀胱癌的檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，1為盒體，2為酶 標(biāo)板，3為試劑瓶。
[0033] 圖2為實(shí)施例一所述的試劑盒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的俯視圖，其中12為酶標(biāo)板槽，13為試劑 瓶槽。
[0034]圖3為實(shí)施例一所述的試劑盒的酶標(biāo)板的結(jié)構(gòu)示意圖，其中21為反應(yīng)槽。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 如上所述，本實(shí)用新型的目的在于：提供一種用于膀胱癌檢測的試劑盒，實(shí)現(xiàn)膀胱 癌的高靈敏度和高特異性檢測，不僅用于膀胱癌的檢測，同時(shí)用于檢測膀胱癌的侵略性水 平。
[0036] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本實(shí)用新型作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。其中，實(shí)施例中，所用 各試劑的廠家如下：
[0037] EpCAM標(biāo)準(zhǔn)品，廠家：上海華壹生物科技有限公司
[0038] 抗EpCAM多克隆抗體，廠家：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司
[0039] 生物素標(biāo)記試劑盒，廠家：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司
[0040] 鏈酶親和素-HRP，廠家：上海華壹生物科技有限公司
[0041] 3, 3'，5, 5'，-四甲基聯(lián)苯胺（TMB)，廠家：上海華壹生物科技有限公司，作為實(shí)施 例中的底物液A和底物液B用。
[0042]牛血清白蛋白（BSA)，廠家：天津希恩思生化科技有限公司
[0043] 聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯（TWEEN20,吐溫20)，廠家：天津開發(fā)區(qū)樂泰化工有 限公司
[0044] 磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、濃硫酸等常用試劑 均購自于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司
[0045] 其中，各試劑的配制方法如下：
[0046] 1)稀釋液（PBS):氯化鈉8g，氯化鉀0? 2g，磷酸氫二鈉2. 7g，磷酸二氫鉀0? 2g，加 蒸饋水至l〇〇〇ml，pH:7. 4。
[0047] 2)包被液（0. 05M碳酸鹽緩沖液）：碳酸鈉1. 59克，碳酸氫鈉2. 93克，加蒸餾水至 1000ml，pH9. 6〇
[0048] 3)洗滌液（PBST):含0. 05 %吐溫-20的PBS溶液（1LPBS中加入 500ylTween-20,充分混勻）。
[0049] 4)封閉液：牛血清白蛋白（BSA) 5克，加洗滌緩沖液至100ml。
[0050] 5)終止液：雙蒸水180ml，加濃硫酸至200ml。
[0051]6)生物素標(biāo)記EpCAM抗體：按照生物素標(biāo)記試劑盒的操作步驟，制備得到生物素 標(biāo)記的抗EpCAM抗體。
[0052] 實(shí)施例一
[0053]一、試劑盒
[0054] 實(shí)施例一提供了一種用于膀胱癌的檢測試劑盒，所述試劑盒包括帶有凹槽的盒 體1，所述盒體1內(nèi)設(shè)置有酶標(biāo)板2和放置于凹槽上的試劑瓶3,所述酶標(biāo)板包括包被有抗 EpCAM的多克隆抗體的反應(yīng)槽21，所述試劑瓶3包括酶標(biāo)瓶、抗EpCAM標(biāo)記抗體瓶，如圖1 所示。所述試劑盒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的俯視圖，如圖2所示，其中12為酶標(biāo)板槽，13為試劑瓶槽， 分別用于放置酶標(biāo)板和試劑瓶。
[0055] 其中，所述試劑盒含酶標(biāo)瓶1瓶，其容積為10ml，其中裝有辣根過氧化物酶標(biāo)記的 鏈酶親和素8ml。