使用桿狀病毒載體的膀胱癌治療方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年4月10日提交的美國臨時申請第61/622, 376號的優(yōu)先權(quán)和 權(quán)益，其內(nèi)容通過引用納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及使用桿狀病毒載體治療或預(yù)防膀胱癌的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 膀胱癌是尿道中最常見的惡性腫瘤形式。在美國，2011年預(yù)計有69, 000例新增病 例和近15, 000人死亡（Siegel R等，2011)。在新加坡，膀胱癌是男性中第9大常見癌癥。
[0006] 幾乎所有膀胱癌都是從變移上皮產(chǎn)生的且因此稱為變移細(xì)胞癌（TCC)。大部分的 膀胱TCC在初始診斷中是淺表性的、非肌肉浸潤性的。然而，尿道切除后表面TCC的復(fù)發(fā)率 可以高達(dá)70 %，必需進(jìn)行輔助治療以控制復(fù)發(fā)和進(jìn)展。
[0007] 輔助治療通常使用卡介苗（BCG)以膀胱內(nèi)免疫治療的形式給予具有中度或高度 癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者。BCG由減毒的活牛結(jié)核菌生成并可激活CD4+Thl細(xì)胞因子（如白介 素2(幾-2)、幾-12、幾-18和干擾素丫（1即-丫））介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答。然而，由于此6難治 性、耐藥性、復(fù)發(fā)或不耐受，多達(dá)40%的患者會在第一年中發(fā)生BCG免疫治療失敗（Zlotta AR等，2009 ;Chiong和Esuvaranathan，2010)。因此，存在開發(fā)新的輔助療法以提高淺表性 膀胱癌患者治療結(jié)果的需要。
[0008] 已被開發(fā)作為可能的膀胱癌輔助治療的基于病毒載體的基因治療包括疫苗病 毒（Lee SS 等，1994;Gomella LG 等，2001;Siemens DR 等，2003;Fodor I 等，2005)、腺病 毒（Morris BD 等，1994;Sutton MA 等，2007;Kuball J 等，2002;Siemens DR 等，2003; Pagliaro LC 等，ZOOSiMalmstrdmFlU等，2010)、金絲雀痘病毒（Siemens DR 等，2003)、呼 腸孤病毒（Hanel EG等，2004)、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Shiau AL等，2001 ;Kimura T 等，2003 ;Dumey N 等，2005 ;Kikuchi E等，2007)、慢病毒（Kikuchi E等，2004)和水泡性口炎病毒（Hadaschik BA等，2008)。已報道了至少5個臨床實驗，其涉及使用復(fù)制型疫苗病毒和腺病毒載體治療 膀胱癌（Gomella LG 等，2001 ;Kuball J 等，2002 ;Pagliaro LC 等，2003 ;Burke J，2010; Malmstrdm PU 等，2010)。
[0009] 經(jīng)測試用于癌癥基因治療的多種類型病毒載體中有反轉(zhuǎn)錄病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒的生 命周期包括宿主基因組中的整合狀態(tài)，從而允許治療基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。關(guān)于反轉(zhuǎn)錄 病毒使用的一個主要問題是這些載體優(yōu)先整合至基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，這會導(dǎo)致插入突 變、癌基因激活和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。進(jìn)行SCID-Xl的基因治療后法國和英國數(shù)名兒童發(fā)生白血病 (Hacein-Bey-Abina等，2003)使得病毒載體相關(guān)的潛在風(fēng)險受到嚴(yán)格審查。
[0010] 腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV)來源的病毒載體具有低得多的插入突變風(fēng)險且已經(jīng) 過癌癥基因治療的測試（Cross和Burmester，2006 ;Palmer等，2006)。還在動物模型和至少 4個早期臨床試驗中對腺病毒載體進(jìn)行了膀胱癌基因治療的廣泛測試（Kuball J等，2002; Pagliaro LC 等，2003 ;Burke J，2010 ;Malmstr0m I3U 等，2010)。然而，作為感染性人病毒， 腺病毒和 AAV 激活人免疫系統(tǒng)（CalcedoR 等，2009 ;Huang 和 Yang，2009 ;Nayak 和 Herzog， 2010)。AAV載體有效地激活B細(xì)胞（Huang和Yang，2009)且根據(jù)年齡組和地理位置，在35 至80%的個體中檢測到了針對AAV2的特異性抗體（Calcedo R等，2009)。雖然處于非常低 的頻率，AAV衣殼特異性⑶8+記憶T細(xì)胞存在于人中并可在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后被重新激活（Nayak 和Herzog，2010)。針對腺病毒的預(yù)存免疫甚至是更普遍的（Bessis N等，2004 ;Nayak和 Herzog，2010)。在超過97 %的人中檢測到了針對C群腺病毒的預(yù)存抗體，并在約50 %的人 中檢測到了通常用于產(chǎn)生腺病毒載體的針對血清型2腺病毒的預(yù)存抗體（Nayak和Herzog， 2010)。對于T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，在人外周血中檢測到了針對不同腺病毒血清型的CD4+和 CD8+交叉反應(yīng)性T細(xì)胞（Nayak和Herzog，2010)。
[0011] 鑒于可能的不希望發(fā)生的排斥反應(yīng)，對于在基因治療中使用人感染性病毒來源的 載體，預(yù)存免疫是一個問題。在預(yù)存抗病毒免疫不會引起嚴(yán)重病理變化的情況下，仍能夠使 病毒載體失活，從而影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在沒有預(yù)存免疫的患者中，由于腺病毒是高度免疫原性 的，腺病毒載體會在第一次給藥后迅速發(fā)揮強(qiáng)的抗病毒免疫性。該反應(yīng)會阻止載體的進(jìn)一 步使用或使得后續(xù)使用的有效性較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 已在腫瘤模型中對病毒（復(fù)制型病毒或復(fù)制缺陷型重組病毒載體）進(jìn)行了膀胱癌 治療的測試。然而，作為膀胱療法的人感染性病毒具有顯著的缺點，包括預(yù)存免疫和強(qiáng)免疫 原性相關(guān)的問題。相反地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)基于昆蟲桿狀病毒的載體可為膀胱癌治療提供合適 的載體。
[0013] 因此，本文所述復(fù)發(fā)涉及使用桿狀病毒治療膀胱癌，包括作為輔助治療以在淺表 性腫瘤切除后防止或降低膀胱癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險。由于目前病毒載體系統(tǒng)的有效性和安全性方 面的限制，桿狀病毒載體提供了一種可行的替代方案，用于作為輔助治療以誘導(dǎo)免疫或作 為載體以遞送治療性核酸。
[0014] 發(fā)明人證明，經(jīng)膀胱內(nèi)遞送的桿狀病毒載體能夠有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)正常的（非癌癥攜帶 的）小鼠膀胱。在病毒基因組中整合有哺乳動物表達(dá)盒（包含人巨細(xì)胞病毒即時早期基因 啟動子）、土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件以及來自1型人T細(xì)胞白血病病毒的長末端重復(fù) 的R片段和一部分U5序列的桿狀病毒載體可提供高水平的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0015] 而且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)單獨的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（桿狀病毒載體中不包括任何治療性轉(zhuǎn)基 因）可刺激抗腫瘤免疫。通過使用鼠細(xì)胞因子/趨化因子抗體陣列以分析收集自接受膀胱 內(nèi)給予不含任何轉(zhuǎn)基因的桿狀病毒的小鼠的膀胱組織提取物，陣列中59 %的蛋白顯示超過 2倍的表達(dá)增加，包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子和皮膚T細(xì)胞 虜獲趨化因子的上調(diào)。發(fā)現(xiàn)使用桿狀病毒治療能夠延長具有原位膀胱癌小鼠的存活，50% 的動物存活了超過6個月。
[0016] 通過使用桿狀病毒載體以將CD40配體基因遞送至具有侵略性原位膀胱癌發(fā)展的 小鼠的膀胱中，觀察到腫瘤的優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)以及隨后腫瘤生長和平均膀胱重量的降低。
[0017] 因此，直接經(jīng)膀胱內(nèi)灌注桿狀病毒和桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移載體能為膀胱癌提供全新 的治療方案。
[0018] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種向膀胱細(xì)胞遞送核酸分子的方法，包括使膀胱細(xì) 胞接觸桿狀病毒載體。
[0019] 該細(xì)胞可以是膀胱癌細(xì)胞或健康的非癌膀胱細(xì)胞，并且可以是體外或體內(nèi)細(xì)胞， 包括在需要膀胱癌治療的對象中。當(dāng)該細(xì)胞是對象中的細(xì)胞時，接觸可包括通過膀胱內(nèi)灌 注向該對象給予桿狀病毒載體。
[0020] 該桿狀病毒載體還包括用于在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，其可操作地連接至驅(qū) 動該轉(zhuǎn)基因在膀胱細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。例如，該轉(zhuǎn)基因可以是用于治療膀胱癌的治療性 轉(zhuǎn)基因，包括例如編碼⑶40L或IL-15的治療性轉(zhuǎn)基因。
[0021] 在該桿狀病毒載體中，啟動子可包括人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子，包括SEQ ID NO: 1所列序列。
[0022] 桿狀病毒載體還可包括來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，位于轉(zhuǎn)基因的3' 非翻譯區(qū)，包括例如SEQ ID N0:2所列序列。
[0023] 桿狀病毒載體還可包括來自1型人T細(xì)胞白血病病毒的長末端重復(fù)的R片段和至 少一部分U5序列，位于轉(zhuǎn)基因的5'非翻譯區(qū)，包括例如SEQ ID N0:3所列序列。
[0024] 該方法還可包括在使膀胱細(xì)胞接觸桿狀病毒載體之前或同時加入轉(zhuǎn)染試劑。所述 轉(zhuǎn)染試劑可以是例如聚L-賴氨酸、Clorpaction WCS-90、十二烷基-B-dd-麥芽苷（DDM)或 十二烷基硫酸鈉（SDS)或其任何組合。
[0025] 為與本文所述方法保持一致，本發(fā)明提供了桿狀病毒載體的多種用法。
[0026] 因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療需要這類治療的對象中膀胱癌的桿 狀病毒載體，其中用法包括在對象內(nèi)經(jīng)膀胱內(nèi)灌注桿狀病毒載體。
[0027] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于在對象的膀胱中經(jīng)膀胱內(nèi)灌注的桿狀病毒 載體。
[0028] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于通過經(jīng)膀胱內(nèi)灌注桿狀病毒載體來治療需要這 類治療的對象中膀胱癌的桿狀病毒載體的用途。
[0029] 在另一個方面，本發(fā)明提供了桿狀病毒載體的用途，該桿狀病毒載體用于制造通 過經(jīng)膀胱內(nèi)灌注該桿狀病毒載體來治療需要這類治療的對象中膀胱癌的藥物。
[0030] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在對象的膀胱中經(jīng)膀胱內(nèi)灌注的桿狀病毒載體 的用途。
[0031] 在另一個方面，本發(fā)明提供了桿狀病毒載體的用法，該桿狀病毒載體用于制造用 于在對象的膀胱中經(jīng)膀胱內(nèi)灌注的藥物。
[0032] 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明下面的【具體實施方式】的描述以及附圖和表將會明白 本發(fā)明的其它方面和特征。
[0033] 附圖簡要說明
[0034] 下列顯示的附圖和表僅僅是以舉例方式說明了本發(fā)明的實施方式。
[0035] 圖1.在balb/c裸小鼠中經(jīng)膀胱內(nèi)灌注后小鼠膀胱的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。（A).使用 3種不同桿狀病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的代表性動物中熒光素酶報告基因表達(dá)的生物發(fā)光圖像。熱圖 代表轉(zhuǎn)基因表達(dá)區(qū)域且顏色代表強(qiáng)度。左側(cè)顯示了桿狀病毒載體表達(dá)盒的示意性結(jié)構(gòu)?？s 寫：CMV :人巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動子和增強(qiáng)子；WPRE :土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 元件；RU5:來自1型人T細(xì)胞白血病病毒的長末端重復(fù)的R片段和部分U5序列。（B).熒 光素酶報告基因表達(dá)的時程分析。通過測量生物發(fā)光信號對體內(nèi)基因表達(dá)進(jìn)行定量。數(shù)據(jù) 以平均值+偏差的形式顯示，每組η = 3。
[0036] 圖2.在C57L/B6小鼠中經(jīng)膀胱內(nèi)灌注后小鼠膀胱的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。㈧代表性動 物中熒光素酶報告基因表達(dá)的生物發(fā)光圖像。使用桿狀病毒載體BV-RU5-LUC-WPRE以每只 小鼠 IO8或10 7個病毒顆粒的劑量轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠。（B)熒光素酶報告基因表達(dá)的時程分析。通 過測量生物發(fā)光信號對體內(nèi)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)以平均值+偏差的形式顯示，每 組η = 3。（C)使用針對熒光素酶蛋白的抗體進(jìn)行免疫染色以顯示膀胱內(nèi)的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。 在桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時收集組織切片。顯示了低放大倍數(shù)圖像和高放大倍數(shù)圖像。包 括蘇木精和伊紅的染色以顯示桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后正常膀胱的結(jié)構(gòu)。
[0037] 圖3.桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)使膀胱內(nèi)細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)上調(diào)。（A)收集自C57L/B6 小鼠的樣品的代表性印跡圖像，所述小鼠不接受膀胱內(nèi)灌注（正常）、分別接受膀胱內(nèi)PBS 和BacPAK6灌注。在灌注后48小時收獲膀胱并進(jìn)行勻漿。上清液用于探測細(xì)胞因子/趨 化因子抗體陣列。（B)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后小鼠膀胱內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子的相對上調(diào)。使用 RiiyBioX分析工具分析密度計量數(shù)據(jù)。顯示了倍數(shù)變化（平均信號強(qiáng)度差異）。數(shù)據(jù)以 平均值+偏差的形式顯示，每組η = 3。
[0038] 圖4.桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗腫瘤效果。（A)膀胱內(nèi)接種小鼠膀胱癌細(xì)胞后膀胱中的腫 瘤發(fā)展。以每只動物IO 5個癌細(xì)胞測試了兩種類型的小鼠膀胱癌細(xì)胞ΜΒ49和MB49S1(MB49 細(xì)胞的亞克隆）。在接種后14天收獲膀胱。Η&Ε染色顯示與親本ΜΒ49細(xì)胞接種所形成的 腫瘤相比，MB49S1腫瘤具有緩慢的生長速率。（B) BacPAK6轉(zhuǎn)導(dǎo)延長了具有膀胱癌的小鼠的 存活。在接種IO5個MB49S1細(xì)胞后7天進(jìn)行了 BacPAK6( -種不具有哺乳動物基因表達(dá)盒 的桿狀病毒載體）的膀胱內(nèi)灌注。顯示了直至第95天的存活曲線。每組η = 10。使用對 數(shù)秩檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
[0039] 圖5.桿狀病毒載體調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中的⑶40L表達(dá)。膀胱癌模型中桿狀病毒 載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。（A)桿狀病毒能夠在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞。使用桿狀病毒載體 BV-RU5-Luc-WPRE以轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠 ΜΒ49膀胱癌細(xì)胞、人Τ24膀胱癌細(xì)胞和通過接種ΜΒ49細(xì)胞形 成的小鼠原位膀胱腫瘤。通過使用針對熒光素酶蛋白的抗體進(jìn)行的免疫染色顯示桿狀病毒 轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時收集的細(xì)胞和組織切片中熒光素酶報告基因表達(dá)。Η&Ε染色顯示了膀胱腫瘤 生長。（B)⑶40L的桿狀病毒載體表達(dá)盒的示意性結(jié)構(gòu)。（C) RT-PCR顯示體外BV-⑶40L轉(zhuǎn)導(dǎo) 后24小時ΜΒ49細(xì)胞中的CD40L表達(dá)。⑶通過Western印跡顯示的小鼠 ΜΒ49膀胱腫瘤中 的⑶40L表達(dá)。在接種IO5個MB49細(xì)胞后3天進(jìn)行BV-⑶40L的膀胱內(nèi)灌注。在BV-⑶40L 轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時收集膀胱。
[0040] 圖6.桿狀病毒介導(dǎo)的⑶40L表達(dá)的抗腫瘤效果。在接種2x IO4個DiR標(biāo)記的 MB49細(xì)胞后3天進(jìn)行BV-⑶40L的膀胱內(nèi)灌注。包括膀胱內(nèi)灌注BackPAK6以作為