一種新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法
【專利摘要】本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N免疫細(xì)胞示蹤方法，所述方法包括以下步驟：(1)提供免疫細(xì)胞；(2)用偶聯(lián)熒光染料的抗體標(biāo)記步驟(1)獲得的免疫細(xì)胞，然后體外檢測(cè)標(biāo)記免疫細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；(3)將標(biāo)記好的免疫細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；(4)采用動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)熒光強(qiáng)度；(5)計(jì)算數(shù)據(jù)，確定免疫細(xì)胞在體內(nèi)的分布、遷徙和存活時(shí)間。本申請(qǐng)還提供了用于免疫細(xì)胞示蹤方法的試劑盒。本申請(qǐng)的方法及試劑盒不引進(jìn)新的基因、不添加底物，操作簡(jiǎn)便，快捷，可為生命科學(xué)領(lǐng)域特別是免疫學(xué)研究領(lǐng)域深入了解免疫活性細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制以及腫瘤的過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療的基礎(chǔ)科研工作和臨床應(yīng)用提供技術(shù)支持，將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤臨床治療技術(shù)的發(fā)展。
【專利說(shuō)明】
一種新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請(qǐng)屬于免疫醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)免疫細(xì)胞的方法和試劑盒，具體涉 及一種示蹤法檢測(cè)免疫細(xì)胞的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著環(huán)境污染對(duì)人們生存空間和食品安全的影響，以及社會(huì)發(fā)展導(dǎo)致人們生活方 式的改變，心血管疾病、癌癥、糖尿病和慢性肺部疾病等非傳染性疾病引起的死亡率不斷上 升，據(jù)統(tǒng)計(jì)在2012年導(dǎo)致全球死亡總數(shù)的68%，比2000年的60%有所上升。其中，特別是全 球癌癥病例將迅猛增長(zhǎng)，因此抗腫瘤藥物和療法市場(chǎng)極其巨大。
[0003] 傳統(tǒng)的癌癥治療方法化療、放療、手術(shù)治療后因其強(qiáng)烈的副作用和免疫排斥反應(yīng)， 治療效果并不盡人意。免疫細(xì)胞過(guò)繼療法出現(xiàn)后，正方興未艾，因其來(lái)源于患者自體細(xì)胞， 可在一定程度上避免發(fā)生強(qiáng)烈免疫排斥反應(yīng)，因此成為未來(lái)癌癥在治療的新技術(shù)發(fā)展方 向。
[0004] 腫瘤過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療屬于生物治療方法中的一種，它是將體外激活的自體或 異體免疫效應(yīng)細(xì)胞，先進(jìn)行擴(kuò)增和功能的鑒定，最后再輸送到患者體內(nèi)，以殺傷患者體內(nèi)腫 瘤細(xì)胞。過(guò)繼免疫細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮作用受許多因素的影響，其中一個(gè)重要因素就是免疫效 應(yīng)細(xì)胞能否到達(dá)靶器官，實(shí)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞的直接接觸，從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞，因此在過(guò)繼 免疫細(xì)胞療法的臨床前研究中，用快速、方便、低成本的監(jiān)測(cè)方法了解免疫活性細(xì)胞的分 布、迀徙和存活時(shí)間成為限制過(guò)繼免疫細(xì)胞療法的臨床前研究以及癌癥治療新技術(shù)的關(guān)鍵 和重要技術(shù)。
[0005] 當(dāng)前觀察免疫活性細(xì)胞的分布、迀徙和存活時(shí)間的方法包括組織病理學(xué)技術(shù)、核 素成像技術(shù)、磁共振成像技術(shù)、光學(xué)成像技術(shù)。其中，組織病理學(xué)技術(shù)須在不同的時(shí)間點(diǎn)將 組織從活體中取出或者處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)記從而了解細(xì)胞在體內(nèi)的情況，具有不能實(shí)時(shí) 動(dòng)態(tài)觀察同一移植細(xì)胞在體內(nèi)的分布和迀移的缺陷；核素成像技術(shù)即應(yīng)用相機(jī)、單光子發(fā) 射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT)和正電子發(fā)射斷層顯像(PET)等技術(shù)，所需PET和SPECT都是觀察 體內(nèi)細(xì)胞分布方面高靈敏度和高分辨率的儀器，儀器昂貴并且需采取專門措施防護(hù)輻射污 染。磁共振成像技術(shù)即利用人體組織中某種原子核的核磁共振現(xiàn)象，將所得射頻信號(hào)經(jīng)過(guò) 電子計(jì)算機(jī)處理，重建出人體某一層面的圖像的診斷技術(shù)，儀器也較昂貴，且需要造影劑， 造影劑存在一定毒性。
[0006] 最近，運(yùn)用生物發(fā)光劑和內(nèi)源性熒光報(bào)告基因或者是外源性探針檢測(cè)分子和生化 進(jìn)程的光學(xué)成像技術(shù)因其無(wú)放射性污染并且不許昂貴儀器優(yōu)勢(shì)，成為觀察免疫活性細(xì)胞的 分布、迀徙和存活時(shí)間的新發(fā)展方向。但是采用檢測(cè)內(nèi)源性報(bào)告基因示蹤免疫細(xì)胞的方法 由于需要將外源性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，可能存在一些不可預(yù)知的影響。常規(guī)生物發(fā)光劑(如 熒光素酶）需要額外的向體內(nèi)注射發(fā)光底物，且單次注射后持續(xù)發(fā)光時(shí)間短，并且特異性 差，檢測(cè)信號(hào)中包含多種非靶標(biāo)細(xì)胞，影響對(duì)目標(biāo)細(xì)胞種類及含量的正確評(píng)估。
[0007] 因此，在過(guò)繼免疫細(xì)胞治療研究領(lǐng)域，仍然亟待一種新的，簡(jiǎn)便高效，特異性強(qiáng)，可 區(qū)分不同免疫細(xì)胞種類及同種免疫細(xì)胞不同亞群的分布、迀徙和存活時(shí)間的免疫細(xì)胞示蹤 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請(qǐng)的目的是提供一種無(wú)創(chuàng)，簡(jiǎn)便高效，特異性強(qiáng)的免疫細(xì)胞示蹤方法，用于免 疫細(xì)胞示蹤的試劑盒和偶聯(lián)熒光染料的抗體在制備用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒中的用途。
[0009] 本申請(qǐng)根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)以及抗體結(jié)合的熒光物質(zhì)的激發(fā)光和發(fā)射 光靠近偏紅外，可穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到的原理，采用偶聯(lián)熒光染料的特異性熒光抗 體標(biāo)記免疫細(xì)胞，將熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物體內(nèi)，用小動(dòng)物活體成像 儀檢測(cè)注射部位熒光信號(hào)強(qiáng)弱情況，確定免疫細(xì)胞的分布情況和數(shù)量。
[0010] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N免疫細(xì)胞示蹤方法，所述方法包括以下步驟：（1)提供免疫細(xì) 胞；（2)用偶聯(lián)熒光染料的抗體標(biāo)記步驟（1)獲得的免疫細(xì)胞，然后體外檢測(cè)標(biāo)記免疫細(xì)胞 的熒光強(qiáng)度；（3)將標(biāo)記好的免疫細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；（4)采用動(dòng)物活體成像儀檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)熒光強(qiáng)度；（5)計(jì)算數(shù)據(jù)，確定免疫細(xì)胞在體內(nèi)的分布、迀徙和存活時(shí)間。在一 些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、造血母細(xì) 胞。在一些實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞包括⑶3+、⑶4+;所述B細(xì)胞包括⑶19+;所述NK細(xì)胞包括 CD3-/CD(16+56) + ;所述免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞包括CD4+/CD29+;所述造血母細(xì)胞包括CD33+和CD34 +。在一些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞為T細(xì)胞，所述T細(xì)胞為CD3+。在一些實(shí)施方案中，所述 熒光抗體上偶聯(lián)的熒光染料選自共輒結(jié)合探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染 料、細(xì)胞功能探針、熒光蛋白和其他探針。在一些實(shí)施方案中，所述共輒結(jié)合探針包括 Allophycocyanin(APC)、Texas Red;所述Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系 列熒光染料包括Cy3.5;所述細(xì)胞功能探針包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、 EYFP和Topaz。在一些實(shí)施方案中，所述熒光抗體為別藻藍(lán)蛋白-抗CD3抗體(APC anti-human CD3)。在一些實(shí)施方案中，所述步驟(2)是將免疫細(xì)胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下 孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量為0.2~7.8yL，所述免疫細(xì)胞的用量為1 ~15X10 6個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育時(shí)間為5mins~60mins，結(jié)合熒光 抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為〇. Is~200s。在一些實(shí)施方案中，所述步驟(2)是將 免疫細(xì)胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量 為1~6yL，所述免疫細(xì)胞的用量為3~7 X106個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育 時(shí)間為18mins~40mins，所述結(jié)合焚光抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為0.1 s~80s。 在一些實(shí)施方案中，所述步驟(3)中，將熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射入小動(dòng)物體內(nèi)遵守如 下操作要求:A、所述小動(dòng)物包括裸鼠，兔子，狗、貓，綿羊;B、熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射 入小動(dòng)物體內(nèi)的部位選自腹部皮內(nèi)注射，背部皮內(nèi)注射，體內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射中的一種;C、接 受所述熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射的小動(dòng)物年齡為整個(gè)存活周期，優(yōu)選存活中期;D、所 述注射深度為皮下〇~lcm組織。
[0011] 在本申請(qǐng)的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，免疫細(xì)胞為CD3+T細(xì)胞。
[0012]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一些具體實(shí)施例中，熒光抗體是APC anti-human CD3〇
[0013]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為0.2此。
[0014]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為1此。
[0015]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為3yL。
[0016]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為4.6yL。
[0017]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為5.4此。
[0018]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為6.6此。
[0019]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，APC anti-human⑶3的 用量為7.8此。
[0020] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，T細(xì)胞的用量為3X106 個(gè)細(xì)胞。
[0021] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，T細(xì)胞的用量為5X106 個(gè)細(xì)胞。
[0022] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，T細(xì)胞的用量為7X106 個(gè)細(xì)胞。
[0023] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，T細(xì)胞的用量為9X106 個(gè)細(xì)胞。
[0024] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié) 合的孵育時(shí)間為18mins。
[0025] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié) 合的孵育時(shí)間為30mins。
[0026] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié) 合的孵育時(shí)間為60mins。
[0027] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，結(jié)合熒光抗體的免疫細(xì) 胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為1 s。
[0028] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，結(jié)合熒光抗體的免疫細(xì) 胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為50s。
[0029] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中，結(jié)合熒光抗體的免疫細(xì) 胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為200s。
[0030] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞活體示蹤方法的一實(shí)施方式中，小動(dòng)物為裸鼠。
[0031 ]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞活體示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中熒光抗體標(biāo)記的免 疫細(xì)胞從腹部皮內(nèi)注射入小動(dòng)物體內(nèi)。
[0032]本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞活體示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中熒光抗體標(biāo)記的免 疫細(xì)胞從背部皮內(nèi)注射入小動(dòng)物體內(nèi)。
[0033] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞示蹤方法的一個(gè)具體實(shí)施例中熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì) 胞經(jīng)尾靜脈注射入小動(dòng)物體內(nèi)。
[0034] 本申請(qǐng)的新穎的免疫細(xì)胞活體示蹤方法的一具體實(shí)施例中，免疫細(xì)胞注射深度為 皮下0 ? 5cm。
[0035] 本申請(qǐng)的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述小動(dòng)物是裸鼠。
[0036] 本申請(qǐng)還提供了一種用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒，包括偶聯(lián)熒光染料的抗體和緩 沖液，其中，所述熒光抗體上偶聯(lián)的熒光染料包括共輒結(jié)合探針、Alexa Fluor系列熒光染 料、Cy系列熒光染料、細(xì)胞功能探針、熒光蛋白，所述緩沖液為磷酸緩沖液(PBS)。
[0037] 本申請(qǐng)還提供了偶聯(lián)熒光染料的抗體在制備用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒中的用 途，當(dāng)使用所述試劑盒時(shí)，包括以下步驟：（1)提供免疫細(xì)胞；（2)用偶聯(lián)熒光染料的抗體標(biāo) 記步驟（1)獲得的免疫細(xì)胞，然后體外檢測(cè)標(biāo)記免疫細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；（3)將標(biāo)記好的免疫 細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；（4)采用動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)熒光強(qiáng)度；（5)計(jì)算 數(shù)據(jù)，確定免疫細(xì)胞在體內(nèi)的分布、迀徙和存活時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞選 自T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、造血母細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述T細(xì) 胞包括CD3+、CD4+;所述B細(xì)胞包括CD 19+;所述NK細(xì)胞包括CD3-/CD (16+56) + ;所述免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞包括⑶4+/⑶29+;所述造血母細(xì)胞包括⑶33+和⑶34+。在一些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì) 胞為T細(xì)胞，所述T細(xì)胞為CD3+。在一些實(shí)施方案中，所述熒光抗體上偶聯(lián)的熒光染料選自共 輒結(jié)合探針、A1 exa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染料、細(xì)胞功能探針、熒光蛋白和其他 探針。在一些實(shí)施方案中，所述共輒結(jié)合探針包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red;所述 Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、 Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系列焚光染料包括Cy3.5;所述細(xì)胞功能探針 包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。在一些實(shí)施方案中，所述熒光 抗體為別藻藍(lán)蛋白 -抗CD3抗體(APC anti-human CD3)。在一些實(shí)施方案中，所述步驟(2)是 將免疫細(xì)胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用 量為0.2~7.8yL，所述免疫細(xì)胞的用量為1~15 X106個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié) 合的孵育時(shí)間為5mins~60mins，結(jié)合焚光抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為0 . Is~ 200s。在一些實(shí)施方案中，所述步驟(2)是將免疫細(xì)胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下孵育， 所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量為1~6yL，所述免疫細(xì)胞的用量為3~7 X106個(gè) 細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育時(shí)間為18mins~40mins，所述結(jié)合熒光抗體的 免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為〇. Is~80s。在一些實(shí)施方案中，所述步驟(3)中，所述步驟 (3)中，熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射入小動(dòng)物體內(nèi)的方式包括但不限于腹部皮內(nèi)注射，背 部皮內(nèi)注射，體內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射。
[0038] 以上本申請(qǐng)的免疫細(xì)胞示蹤方法，用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒和偶聯(lián)熒光染料的 抗體在制備用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒中的應(yīng)用才用到的免疫細(xì)胞注射操作，為免疫研究 實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域普通的熟練技術(shù)人員按照有關(guān)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)和實(shí)驗(yàn)室制定的操作規(guī)程如國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物規(guī)范中心發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)手冊(cè)》(http://www.dxy.cn/bbs/topic/5936828)、《動(dòng)物 免疫技術(shù)操作規(guī)程》或操作注意事項(xiàng)都能容易掌握的一種常規(guī)操作技術(shù)。注射免疫細(xì)胞到 小動(dòng)物體內(nèi)的操作不存在個(gè)體差異，能重復(fù)再現(xiàn)，是能夠產(chǎn)業(yè)化的。
[0039] 本申請(qǐng)的有益效果是，本申請(qǐng)的基于熒光抗體的新穎免疫細(xì)胞示蹤方法及試劑盒 能實(shí)現(xiàn)特異性強(qiáng)，快速、準(zhǔn)確對(duì)特定種類免疫細(xì)胞及其細(xì)分亞群和免疫細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和 特定分子在不同發(fā)育時(shí)期，各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的分布、迀徙和存活時(shí)間、含量進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的 觀察，并且不引進(jìn)新的基因、不添加底物，可為生命科學(xué)領(lǐng)域特別是免疫學(xué)研究領(lǐng)域深入了 解免疫活性細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制以及腫瘤的過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療的基礎(chǔ)科研工作和 臨床應(yīng)用提供技術(shù)支持，將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤臨床治療技術(shù)的發(fā)展。
[0040] 本申請(qǐng)的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說(shuō)明書中闡述，并且，部分地從說(shuō)明書中變 得顯而易見(jiàn)，或者通過(guò)實(shí)施本申請(qǐng)而了解。本申請(qǐng)的目的和其他優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)在說(shuō)明書、權(quán)利 要求書以及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與本 申請(qǐng)的實(shí)施例一起用于解釋本申請(qǐng)的技術(shù)方案，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的限制。
[0042] 圖1 .T細(xì)胞經(jīng)APC anti-human⑶3標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；
[0043] A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)APC anti-human⑶3標(biāo)記的T細(xì)胞的散點(diǎn)圖 [0044](橫坐標(biāo):前向角散射，縱坐標(biāo):側(cè)向角散射）
[0045] B.P1門樣品（多通道)檢測(cè)直方圖
[0046] (橫坐標(biāo):別藻藍(lán)蛋白A濃度，縱坐標(biāo):T細(xì)胞和別藻藍(lán)蛋白A標(biāo)記的T細(xì)胞計(jì)數(shù)）
[0047] 圖2.不同體積APC anti-human⑶3標(biāo)記3 X 106個(gè)細(xì)胞后檢測(cè)到的光子數(shù)。橫坐標(biāo) 為APC Anti-human CD3體積(此），縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(光子/s);
[0048] 圖3.以測(cè)得的APC anti-human CD3標(biāo)記T細(xì)胞的最適比例，即5yL/3X106個(gè)細(xì)胞 標(biāo)記小動(dòng)物后檢測(cè)熒光強(qiáng)度(光子/s)和細(xì)胞數(shù)的關(guān)系。橫坐標(biāo)為細(xì)胞個(gè)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光 強(qiáng)度，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2;
[0049] 圖4.96孔板檢測(cè)不同濃度的APC anti-human⑶3標(biāo)記T細(xì)胞產(chǎn)生熒光，其中孔A1、 3、5細(xì)胞數(shù)為9X106,孔A7、9、ll細(xì)胞數(shù)為7X106,孔Cl、3、5細(xì)胞數(shù)為5X10 6,孔C7、9、ll細(xì)胞 數(shù)為3 X 106，孔E1、3、5細(xì)胞數(shù)為1 X 106，孔E7、9、11細(xì)胞數(shù)為9 X 105，孔G1、3、5細(xì)胞數(shù)為7 X 105，孔G7、9、11細(xì)胞數(shù)為5 X 105?？譌12為陰性對(duì)照，細(xì)胞數(shù)為1 X 107;
[0050] 圖5 ?以APC anti-human CD3標(biāo)記T細(xì)胞的最適比例，即5yL/3X106個(gè)細(xì)胞標(biāo)記5X 1〇5個(gè)細(xì)胞后檢測(cè)熒光強(qiáng)度(光子/s)隨時(shí)間的變化。橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng) 度(光子/s)，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3;
[00511圖6 .為APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞體外檢測(cè)和經(jīng)腹部皮內(nèi)注射體內(nèi)檢測(cè)（左側(cè)為對(duì)照 鼠，右側(cè)為實(shí)驗(yàn)鼠）:A為APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞體外檢測(cè);B為A中APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞經(jīng)皮內(nèi) 注射后體內(nèi)檢測(cè);C將B圖中小鼠翻轉(zhuǎn)時(shí)候熒光檢測(cè);D為B中小鼠次日熒光檢測(cè)圖；E為在體 夕Kin vitro)和體內(nèi)第1天（in vivol)和第2天（in vivo2)光子/s隨細(xì)胞數(shù)的變化關(guān)系坐 標(biāo)圖，其中縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。
[0052]圖7 .APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞體外檢測(cè)和經(jīng)背部皮內(nèi)注射體內(nèi)檢測(cè):A為APC標(biāo)記殺傷 性T細(xì)胞體外檢測(cè);B為A中APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞經(jīng)皮內(nèi)注射裸鼠背部后體內(nèi)檢測(cè);C為B中小 鼠次日熒光檢測(cè)圖;D為在體外(A)和體內(nèi)（B)光子/s隨細(xì)胞數(shù)的變化關(guān)系；
[0053]圖8.在體外（in vitro)和在體內(nèi)檢測(cè)APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞體：左側(cè)為對(duì)照鼠，右 側(cè)為實(shí)驗(yàn)鼠。圖A、B、C:A為尾靜脈注射前;B為尾靜脈注射后立即檢測(cè)；圖C為尾靜脈注射后 lh檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面將以實(shí)施例的方式對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 實(shí)踐本申請(qǐng)。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用其他實(shí)施方式，并且可以做出適當(dāng)?shù)母淖兌黄x本申請(qǐng) 的精神或范圍。為了避免對(duì)于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)不必要的細(xì)節(jié)，說(shuō)明 書可能省略了對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知的某些信息。因此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)以限制 性的意義來(lái)理解，且本申請(qǐng)的范圍僅由所附權(quán)利要求界定。需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況 下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互任意組合。
[0055] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本申請(qǐng)，但并不用來(lái)限制本申請(qǐng)的范圍。
[0056] 下述實(shí)施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。
[0057]實(shí)驗(yàn)儀器：
[0058] 流式細(xì)胞儀 BECKMAM COVLTER Cytollcx 小動(dòng)物活體成像儀 SI Imaging AmiX 離心機(jī) Thermo ST40R 禹心機(jī) .Eppendorl、 5424R 顯微鏡 Nikon ECLIPSE Ty-S % 孔板 Nesi Brolech 滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司 YXQ-LS-100G 注射器 江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司 1ML ( 0.45x 16 )
[0059] 試劑：
[0060] APC anti-human CD3 Biolegend Catalog:300312
[0061] 無(wú)熒光鼠糧 北京科澳協(xié)力飼料有限公司
[0062] 怡美寧(異氟烷） 山東科瀝制藥有限公司
[0063] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
[0064] 裸鼠 斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司
[0065] 實(shí)施例1流式細(xì)胞儀檢測(cè)APC anti-human⑶3標(biāo)記的T細(xì)胞
[0066] 將培養(yǎng)基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取1X106細(xì)胞于lmL離心管中，800g離心6min，將上清棄 去，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄去，用100yL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，取 APC anti-human⑶3抗體lyL加入細(xì)胞中，混勻后冰浴條件下孵育30min，加入600yL預(yù)冷的 PBS重懸細(xì)胞，800g離心6min，將上清棄去，重復(fù)洗滌一次，用100此預(yù)冷的roS重懸，作為實(shí) 驗(yàn)組。在對(duì)照組中用緩沖液代替APC anti-human CD3抗體，其他操作與實(shí)驗(yàn)組完全相 同。流式細(xì)胞儀分析APC anti-human 0)3標(biāo)記的T細(xì)胞(圖1)。
[0067] 從圖1的A和B判斷，APC標(biāo)記人T細(xì)胞后形成APC-Anti-human CD3。
[0068] 實(shí)施例2.APC anti-human CD3標(biāo)記人T細(xì)胞的最適用量
[0069] 用不同體積APC anti-human CD3標(biāo)記3X106個(gè)細(xì)胞，以0.2yL梯度取0-7.8yL間的 40個(gè)點(diǎn)。檢測(cè)空板(background)和加入細(xì)胞后(細(xì)胞+空板)的光子數(shù)(表1)
[0070] 具體步驟如下：將培養(yǎng)基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取1.5 X 108細(xì)胞于50mL離心管中，800g 離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的roS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞至終濃度3 X 107/mL，將細(xì)胞分裝成40管，每管lOOyL，按0、0.2、0.4……7.4、7.6、 7.8yL以0.2yL梯度每管加 APC anti-human CD3抗體(表1)，混勻后冰浴條件下孵育60min， 800g離心6min，將上清棄去，用500此預(yù)冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，用lOOyL 預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于96孔板中，使用小動(dòng)物成像儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。
[0071] 圖2中，熒光強(qiáng)度(光子/s)與APC anti-human⑶3用量呈拋物線趨勢(shì)，二項(xiàng)式曲線 y = -l X 107x2+l X 108x+l X 108，R2 = 0.914,即APC anti-human CD3最適體積為5yL/3 X 106 個(gè)細(xì)胞（圖2)。采用0.2~7.8yL的體積APC anti-human CD3都可獲得可檢測(cè)的標(biāo)記T細(xì)胞， APC anti-human CD3最適體積為5yL/3X106個(gè)細(xì)胞。
[0072] 表1.96孔板對(duì)應(yīng)上樣孔和加入不同體積APC anti-human CD3標(biāo)記3 X 106個(gè)細(xì)胞 后檢測(cè)到的光子數(shù)
[0074]實(shí)施例3.以最適體積標(biāo)記人T細(xì)胞后可檢測(cè)到熒光的最小細(xì)胞數(shù) [0075] 以APC anti-human CD3的最適體積標(biāo)記T細(xì)胞，即5yL/3X106個(gè)細(xì)胞。每組設(shè)有三 個(gè)平行孔，1〇〇此細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)分別為5 X 105、7 X 105、9 X 105、1 X 106、3 X 106、5 X 106、7\106、9\106，分別進(jìn)行18、10 8、208、308、508、1008、2008曝光。具體步驟如下：將培養(yǎng) 基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取1X108細(xì)胞于50mL離心管中，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的 PBS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，取APC anti-human CD3抗體167yL加入細(xì)胞中，混勻后冰浴條件下孵育50min，800g離心6min，將上清棄去，用 5mL預(yù)冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，用lmL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞至終濃度IX 108/mL，按下表中的濃度用預(yù)冷的PBS稀釋細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液置于96孔板中，使用小動(dòng)物 成像儀測(cè)定焚光強(qiáng)度。每個(gè)樣做3次重復(fù)。對(duì)照組:未經(jīng)APC an t i -human CD3標(biāo)記的T細(xì)胞。 將分裝好的96孔板，按不同條件曝光后觀察并記錄結(jié)果。
[0076]由圖3可見(jiàn)，結(jié)果都只能在9 X 106、7 X 106、5 X 106和3 X 106個(gè)細(xì)胞處有效檢測(cè)到熒 光（圖3,曝光200s)。在10s到200s曝光條件下的R2值分別為0.975、0.975、0.974、0.973、 0.969和0.961。在Is曝光條件下，在3 X 106~9 X 106個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)光子數(shù)與細(xì)胞個(gè)數(shù)呈良好 的線性關(guān)系R2 = 〇.976(表2和圖4)?？捎行z測(cè)到熒光的最少T細(xì)胞數(shù)為3X106個(gè)細(xì)胞。 [0077] 表2 ?曝光Is條件下，以APC anti-human CD3標(biāo)記T細(xì)胞的最適比例，即5yL/3X106 個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞后檢測(cè)不同細(xì)胞數(shù)的熒光強(qiáng)度(光子/s)
[0079] 實(shí)施例4.以最適體積標(biāo)記人T細(xì)胞后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系
[0080] 以得到的APC anti-human CD3的最適體積標(biāo)記T細(xì)胞，即5yL/3X106個(gè)細(xì)胞。每組 設(shè)三個(gè)平行孔，每個(gè)孔有5 X 106個(gè)細(xì)胞。分別在標(biāo)記0、2、4……18、20、25……50、55、60min 進(jìn)行Is曝光(表3)。
[0081 ] 具體步驟如下：將培養(yǎng)基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取1.5 X 107細(xì)胞于50mL離心管中，800g 離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的roS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，取APC anti-human CD3抗體25此加入細(xì)胞中，混勻后冰浴條件下孵育40min， 800g離心6min，將上清棄去，用500此預(yù)冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，用300此 預(yù)冷的重懸細(xì)胞至終濃度5X10 7/mL，按表3中的濃度用預(yù)冷的roS稀釋細(xì)胞后，將細(xì)胞 懸液置于96孔板中，使用小動(dòng)物成像儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。
[0082] 由圖5可知，在APC anti-human⑶3與免疫細(xì)胞孵育0至60min光子數(shù)無(wú)明顯變化， 都可有效檢測(cè)到熒光。
[0083] 表3 ?曝光Is條件下，以APC anti-human CD3標(biāo)記T細(xì)胞的最適比例，即5yL/3X106 個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記5X105個(gè)細(xì)胞后檢測(cè)熒光強(qiáng)度(光子/s)隨時(shí)間的變化
[0085]實(shí)施例5裸鼠體內(nèi)檢測(cè)APC標(biāo)記殺傷性T細(xì)胞
[0086] 以APC anti-human CD3的最適體積標(biāo)記細(xì)胞，即5yL/3X106個(gè)細(xì)胞。
[0087]經(jīng)皮內(nèi)注射裸鼠腹部
[0088]皮內(nèi)注射裸鼠腹部具體步驟如下：將培養(yǎng)基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取7X 107細(xì)胞于50mL 離心管中，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的roS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄 去，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，取APC anti-human⑶3抗體110.5yL加入細(xì)胞中，混勻后冰浴避 光條件下孵育25min，800g離心6min，將上清棄去，用5mL預(yù)冷的PBS重懸，800g離心6min，將 上清棄去，用7mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞至終濃度1 X l〇VmL。分成3組，每組分別取重懸液lmL、 2mL和-LdOOg離心6min，將上清棄去，每組用200yL預(yù)冷的roS重懸細(xì)胞。每組細(xì)胞重懸液 用規(guī)格為0.45X16的無(wú)菌注射器經(jīng)皮內(nèi)注射lOOiiL，使用小動(dòng)物成像儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。
[0089] 在5\106、1\107和2乂107個(gè)細(xì)胞注射的部位均可見(jiàn)到形狀規(guī)則的熒光信號(hào)，在曝 光時(shí)間相同的條件下(曝光50s)，這與體外檢測(cè)結(jié)果基本一致（圖6A、B)，將小鼠翻轉(zhuǎn)之后沒(méi) 有檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)（圖6C)。次日，對(duì)經(jīng)皮內(nèi)注射的裸鼠腹部進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，腹部仍可 檢測(cè)到形態(tài)規(guī)則的熒光信號(hào)（圖6D)。
[0090] 經(jīng)皮內(nèi)注射裸鼠背部
[0091] 皮內(nèi)注射裸鼠背部具體步驟如下:將培養(yǎng)基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取4X107細(xì)胞于50mL 離心管中，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的roS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄 去，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，取APC anti-human CD3抗體66.5yL加入細(xì)胞中，混勻后冰浴避 光條件下孵育30min，800g離心6min，將上清棄去，用lmL預(yù)冷的PBS重懸，800g離心6min，將 上清棄去，用4mL預(yù)冷的roS重懸細(xì)胞至終濃度1 X l〇VmL。分成3組，每組分別取重懸液600y L、1.4mL和SmLSOOg離心6min，將上清棄去，每組用200yL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。每組細(xì)胞重 懸液用規(guī)格為0.45 X 16的無(wú)菌注射器經(jīng)皮內(nèi)注射lOOyL，使用小動(dòng)物成像儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。 [0092]在7 X 106和1 X 107個(gè)細(xì)胞注射部位均可見(jiàn)到形狀規(guī)則的熒光信號(hào)，在曝光時(shí)間相 同的條件下（曝光50s)，這與體外檢測(cè)結(jié)果基本一致（圖7A、B)。次日，對(duì)經(jīng)皮內(nèi)注射的裸鼠 背部進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，背部檢測(cè)不到形態(tài)規(guī)則的熒光信號(hào)（圖7C)。與APC anti-human⑶3標(biāo) 記的T細(xì)胞經(jīng)皮內(nèi)注射在裸鼠背部相比，皮內(nèi)注射在裸鼠腹部熒光持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。
[0093]經(jīng)尾靜脈注射裸鼠體內(nèi)
[0094]具體步驟如下：將培養(yǎng)基中T細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取2X107細(xì)胞于50mL離心管中，800g離 心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預(yù)冷的roS重 懸細(xì)胞，取APC anti-human CD3抗體33.5yL加入細(xì)胞中，混勻后冰浴避光條件下孵育 30min，800g離心6min，將上清棄去，用lmL預(yù)冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，200ii L預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。細(xì)胞重懸液用規(guī)格為0.45X16的無(wú)菌注射器經(jīng)皮內(nèi)注射100yL，使用 小動(dòng)物成像儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。
[0095] 以APC anti-human CD3的最適體積標(biāo)記細(xì)胞，即5yL/3X106個(gè)細(xì)胞。1X107個(gè)細(xì) 胞，在腹部左下處檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖8B)，lh后檢測(cè)到熒光信號(hào)形態(tài)變規(guī)則（圖8C)。
[0096]由本實(shí)施例可知，經(jīng)腹部、背部尾部皮內(nèi)注射APC anti-human CD3標(biāo)記的免疫細(xì) 胞，都可采用小動(dòng)物成像儀檢測(cè)熒光信號(hào)形態(tài)變了解到免疫細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的分布和迀徙 及數(shù)量信息。本申請(qǐng)為研究免疫細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的分布和迀徙及數(shù)量信息提供了一種簡(jiǎn)單 有效及特異性強(qiáng)的方法。
[0097]雖然本申請(qǐng)所揭露的實(shí)施方式如上，但所述的內(nèi)容僅為便于理解本申請(qǐng)而采用的 實(shí)施方式，并非用以限定本申請(qǐng)。任何本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員，在不脫離本申請(qǐng)所揭 露的精神和范圍的前提下，可以在實(shí)施的形式及細(xì)節(jié)上進(jìn)行任何的修改與變化，但本申請(qǐng) 的專利保護(hù)范圍，仍須以所附的權(quán)利要求書所界定的范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種免疫細(xì)胞示蹤方法，所述方法包括以下步驟： (1) 提供免疫細(xì)胞； (2) 用偶聯(lián)熒光染料的抗體標(biāo)記步驟（1)獲得的免疫細(xì)胞，然后體外檢測(cè)標(biāo)記免疫細(xì)胞 的熒光強(qiáng)度； (3) 將標(biāo)記好的免疫細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)； (4) 采用動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)熒光強(qiáng)度； (5) 計(jì)算數(shù)據(jù)，確定免疫細(xì)胞在體內(nèi)的分布、迀徙和存活時(shí)間。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK 細(xì)胞、DC細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、造血母細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述T細(xì)胞包括CD3+、CD4+;所述B細(xì) 胞包括CD19+;所述NK細(xì)胞包括CD3-/CD( 16+56) +;所述免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞包括CD4+/CD29+;所述 造血母細(xì)胞包括⑶33+和⑶34+。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述免疫細(xì)胞為T細(xì)胞，所述T細(xì)胞 為CD3+。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述熒光抗體上偶聯(lián)的熒光染料選 自共輒結(jié)合探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染料、細(xì)胞功能探針、熒光蛋白和 其他探針。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述共輒結(jié)合探針包括 Allophycocyanin(APC)、Texas Red;所述Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系 列熒光染料包括Cy3.5;所述細(xì)胞功能探針包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、 EYFP和Topaz。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述熒光抗體為別藻藍(lán)蛋白-抗CD3 抗體(APC anti-human CD3)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述步驟(2)是將免疫細(xì)胞與熒光 抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量為0.2~7. SyL，所 述免疫細(xì)胞的用量為1~15 X IO6個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育時(shí)間為 5mins~60mins，結(jié)合焚光抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為0.1 s~200s。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述步驟(2)是將免疫細(xì)胞與熒光 抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量為1~6yL，所述免 疫細(xì)胞的用量為3~7 X IO6個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育時(shí)間為18mins~ 40mins，所述結(jié)合焚光抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為0.1 s~80s。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞示蹤方法，其中，所述步驟(3)中，將熒光抗體標(biāo)記 的免疫細(xì)胞注射入小動(dòng)物體內(nèi)遵守如下操作要求： A、 所述小動(dòng)物包括裸鼠，兔子，狗、貓，綿羊； B、 熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射入小動(dòng)物體內(nèi)的部位選自腹部皮內(nèi)注射，背部皮內(nèi)注 射，體內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射中的一種； C、 接受所述熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射的小動(dòng)物年齡為整個(gè)存活周期，優(yōu)選存活中 期； D、所述注射深度為皮下O~Icm組織。11. 一種用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒，包括偶聯(lián)熒光染料的抗體和緩沖液，其中，所述 熒光抗體上偶聯(lián)的熒光染料包括共輒結(jié)合探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染 料、細(xì)胞功能探針、熒光蛋白，所述緩沖液為磷酸緩沖液(PBS)。12. 偶聯(lián)熒光染料的抗體在制備權(quán)利要求11的用于免疫細(xì)胞示蹤的試劑盒中的用途， 當(dāng)使用所述試劑盒時(shí)，包括以下步驟： (1) 提供免疫細(xì)胞； (2) 用所述偶聯(lián)熒光染料的抗體標(biāo)記步驟(1)獲得的免疫細(xì)胞;然后體外檢測(cè)標(biāo)記免疫 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度； (3) 將標(biāo)記好的免疫細(xì)胞注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)； (4) 采用小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)熒光強(qiáng)度； (5) 計(jì)算數(shù)據(jù)，確定免疫細(xì)胞在體內(nèi)的分布、迀徙和存活時(shí)間。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì) 胞、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、造血母細(xì)胞。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中，所述T細(xì)胞包括⑶3+、CD4+;所述B細(xì)胞包括⑶19 + ;所述NK細(xì)胞包括⑶3-/⑶（16+56) + ;所述免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞包括⑶4+/⑶29+;所述造血母細(xì)胞 包括 CD33+和 CD34+。15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述免疫細(xì)胞為T細(xì)胞，所述T細(xì)胞為CD3+。16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述熒光抗體上偶聯(lián)的熒光染料選自共輒結(jié)合 探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染料、細(xì)胞功能探針、熒光蛋白和其他探針。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中，所述共輒結(jié)合探針包括Al Iophycocyanin (APC)、Texas Red;所述Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系列焚光染料包括 Cy3.5;所述細(xì)胞功能探針包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。18. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述熒光抗體為別藻藍(lán)蛋白-抗CD3抗體(APC anti-human CD3)〇19. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述步驟(2)是將免疫細(xì)胞與熒光抗體混勻后 冰浴條件下孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量為〇. 2~7. SyL，所述免疫細(xì)胞 的用量為1~15\106個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育時(shí)間為51^1^~6〇1^11 8， 結(jié)合熒光抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為0.1s~200s。20. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述步驟(2)是將免疫細(xì)胞與熒光抗體混勻后 冰浴條件下孵育，所述孵育反應(yīng)體系中，所述熒光抗體的用量為1~6yL，所述免疫細(xì)胞的用 量為3~7\10 6個(gè)細(xì)胞，所述熒光抗體和免疫細(xì)胞結(jié)合的孵育時(shí)間為181^1^~4〇11^1^，所述 結(jié)合熒光抗體的免疫細(xì)胞體外檢測(cè)的曝光時(shí)間為0.1s~80s。21. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述步驟(3)中，熒光抗體標(biāo)記的免疫細(xì)胞注射 入小動(dòng)物體內(nèi)的方式包括但不限于腹部皮內(nèi)注射，背部皮內(nèi)注射，體內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK105929146SQ201610237612
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月15日
【發(fā)明人】宮健, 劉書磊, 徐義, 韓化敏
【申請(qǐng)人】拜西歐斯（北京）生物技術(shù)有限公司